CN112111577B - 基于数字pcr技术的atrx和kdm5a突变检测的试剂盒、装置及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测的试剂盒、装置及应用。其中，该试剂盒包括：针对ATRX E10 del、ATRX E11 del、ATRX E9 Ins、ATRX E14 R1426L、ATRX E17 M1571V、ATRX E28 E2074G、KDM5A E27 del、KDM5A E23 P1237S、KDM5A E23 R1217W、KDM5A E19 del、KDM5A E10 del和KDM5A E25 del位点的引物和探针。应用本发明的技术方案，针对这12个特定位点的集合进行检测，可以较好的反映出ATRX和KDM5A的突变情况。
Description
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，具体而言，涉及一种基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测的试剂盒、装置及应用。
背景技术
癌症作为人类健康的头号敌人，是全球最主要的非传染性疾病之一，也是目前致死率最高的慢性疾病。据我国《2018年全国最新癌症报告》，中国2017年新增380.4万例癌症病例，相当于平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟就有7个人被确诊为癌症。
临床上，组织活检作为肿瘤检测的金标准，但由于其样本获取存在依赖影像学、侵入式操作、操作性难、重复性低等问题，使液体活检技术应运而生。液体活检具有非侵入式、操作简便、可重复取样、有效应对肿瘤异质性等优点，近年来研究表明，血浆cfDNA可作为无法获取肿瘤组织时的替代样本，来检测肿瘤突变状态。例如，有研究表明ATRX和KDM5A两基因很可能与癌症的发展有关，因此，可以从患者血浆中提取cfDNA，制备突变检测的反应体系，最后进行芯片阅读并分析结果。通过计算数据中，突变样品的拷贝数与总拷贝数的比值检测待测样品的基因突变频率。
目前基因突变的检测技术主要有两大类：测序类和PCR类。测序类分为一代测序和二代测序等。一代测序检测周期长，灵敏度约10％；而二代测序流程复杂、成本贵、检测周期长且灵敏度约1％。PCR类分为Real-Time PCR检测、ARMS-PCR检测、数字PCR检测等。Real-Time PCR是一种相对定量的方法，所需DNA起始量高，且灵敏度约5％；ARMS-PCR为定性检测，灵敏度约1％。数字PCR无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测，直接检测目标序列的拷贝数，这种检测方式具有约0.1％的高灵敏度和精准性。
发明内容
本发明旨在提供一种基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测的试剂盒、装置及应用，以提供一种能够精准检测ATRX和KDM5A突变的试剂盒及装置。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测的试剂盒。该试剂盒包括：针对ATRX E10 del、ATRX E11 del、ATRX E9Ins、ATRX E14 R1426L、ATRX E17 M1571V、ATRX E28 E2074G、KDM5A E27 del、KDM5A E23P1237S、KDM5A E23 R1217W、KDM5A E19 del、KDM5A E10 del和KDM5A E25 del位点的引物和探针。
进一步地，引物包括上游引物和下游引物，探针包括突变型探针和野生型探针。
进一步地，突变型探针和野生型探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有淬灭基团。
进一步地，突变型探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB；野生型探针的5’端标记的荧光报告基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为MGB。
进一步地，ATRX E10 del位点的上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ IDNO：2所示，突变型探针如SEQ ID NO：3所示，野生型探针如SEQ ID NO：4所示；
ATRX E11 del位点的上游引物如SEQ ID NO：5所示，下游引物如SEQ ID NO：6所示，突变型探针如SEQ ID NO：7所示，野生型探针如SEQ ID NO：8所示；
ATRX E9 Ins位点的上游引物如SEQ ID NO：9所示，下游引物如SEQ ID NO：10所示，突变型探针如SEQ ID NO：11所示，野生型探针如SEQ ID NO：12所示；
ATRX E14 R1426L位点的上游引物如SEQ ID NO：13所示，下游引物如SEQ ID NO：14所示，突变型探针如SEQ ID NO：15所示，野生型探针如SEQ ID NO：16所示；
ATRX E17 M1571V位点的上游引物如SEQ ID NO：17所示，下游引物如SEQ ID NO：18所示，突变型探针如SEQ ID NO：19所示，野生型探针如SEQ ID NO：20所示；
ATRX E28 E2074G位点的上游引物如SEQ ID NO：21所示，下游引物如SEQ ID NO：22所示，突变型探针如SEQ ID NO：23所示，野生型探针如SEQ ID NO：24所示；
KDM5A E27 del位点的上游引物如SEQ ID NO：25所示，下游引物如SEQ ID NO：26所示，突变型探针如SEQ ID NO：27所示，野生型探针如SEQ ID NO：28所示；
KDM5A E23 P1237S位点的上游引物如SEQ ID NO：29所示，下游引物如SEQ ID NO：30所示，突变型探针如SEQ ID NO：31所示，野生型探针如SEQ ID NO：32所示；
KDM5A E23 R1217W位点的上游引物如SEQ ID NO：33所示，下游引物如SEQ ID NO：34所示，突变型探针如SEQ ID NO：35所示，野生型探针如SEQ ID NO：36所示；
KDM5A E19 del位点的上游引物如SEQ ID NO：37所示，下游引物如SEQ ID NO：38所示，突变型探针如SEQ ID NO：39所示，野生型探针如SEQ ID NO：40所示；
KDM5A E10 del位点的上游引物如SEQ ID NO：41所示，下游引物如SEQ ID NO：42所示，突变型探针如SEQ ID NO：43所示，野生型探针如SEQ ID NO：44所示；
KDM5A E25 del位点的上游引物如SEQ ID NO：45所示，下游引物如SEQ ID NO：46所示，突变型探针如SEQ ID NO：47所示，野生型探针如SEQ ID NO：48所示。
进一步地，试剂盒中还包括dNTPs、Taq酶和PCR缓冲液。
进一步地，针对每个位点的引物和探针预混液装为1管。
根据本发明的另一个方面，提供一种上述试剂盒在基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测中的应用。
根据本发明的再一个方面，提供一种基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测的装置。该装置包括：样品采集单元，设置为血浆cfDNA采集单元；基因检测单元，设置为应用上述试剂盒通过数字PCR技术检测ATRX和KDM5A突变；以及数据分析单元，设置为分析基因检测单元的检测数据并进行分析及结果输出。
进一步地，基因检测单元中ATRX E10 del的退火温度设置为60℃，ATRX E11 del的退火温度设置为62℃，ATRX E9 Ins的退火温度设置为56℃，ATRX E14 R1426L的退火温度设置为56℃，ATRX E17 M1571V的退火温度设置为56℃，ATRX E28 E2074G的退火温度设置为56℃，KDM5A E27 del的退火温度设置为62℃，KDM5A E23 P1237S的退火温度设置为56℃，KDM5A E23 R1217W的退火温度设置为56℃，KDM5A E19 del的退火温度设置为56℃，KDM5A E10 del的退火温度设置为60℃，KDM5A E25 del的退火温度设置为56℃。
应用本发明的技术方案，针对ATRX E10 del、ATRX E11 del、ATRX E9 Ins、ATRXE14 R1426L、ATRX E17 M1571V、ATRX E28 E2074G、KDM5A E27 del、KDM5A E23 P1237S、KDM5A E23 R1217W、KDM5AE19 del、KDM5AE10 del和KDM5AE25 del这12个特定位点的集合进行检测，可以较好的反映出ATRX和KDM5A的突变情况，另外，加之利用数字PCR无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测，直接检测目标序列的拷贝数，这种检测方式具有约0.1％的高灵敏度和精准性。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了ATRX E10 del的3D PCR结果示意图；
图2示出了ATRX E11 del的3D PCR结果示意图；
图3示出了ATRX E9 Ins的3D PCR结果示意图；
图4示出了ATRX E14 R1426L的3D PCR结果示意图；
图5示出了ATRX E17 M1571V的3D PCR结果示意图；
图6示出了ATRX E28 E2074G的3D PCR结果示意图；
图7示出了KDM5A E27 del的3D PCR结果示意图；
图8示出了KDM5A E23 P1237S的3D PCR结果示意图；
图9示出了KDM5A E23 R1217W的3D PCR结果示意图；
图10示出了KDM5A E19 del的3D PCR结果示意图；
图11示出了KDM5A E10 del的3D PCR结果示意图；以及
图12示出了KDM5A E25 del的3D PCR结果示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测的试剂盒。该试剂盒包括：针对ATRX E10 del、ATRX E11 del、ATRX E9 Ins、ATRXE14R1426L、ATRX E17 M1571V、ATRX E28 E2074G、KDM5A E27 del、KDM5A E23 P1237S、KDM5A E23 R1217W、KDM5A E19 del、KDM5A E10 del和KDM5A E25 del位点的引物和探针。
应用本发明的技术方案，针对ATRX E10 del、ATRX E11 del、ATRX E9 Ins、ATRXE14 R1426L、ATRX E17 M1571V、ATRX E28 E2074G、KDM5A E27 del、KDM5A E23 P1237S、KDM5A E23 R1217W、KDM5A E19 del、KDM5A E10 del和KDM5A E25 del这12个特定位点的集合进行检测，可以较好的反映出ATRX和KDM5A的突变情况，另外，加之利用数字PCR无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测，直接检测目标序列的拷贝数，这种检测方式具有约0.1％的高灵敏度和精准性。
在一种典型的实施方式中，引物包括上游引物和下游引物，探针包括突变型探针和野生型探针；优选的，突变型探针和野生型探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有淬灭基团，例如，突变型探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB；野生型探针的5’端标记的荧光报告基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为MGB。
在本发明一优选的实施例中，上述12个位点引物和探针信息如表1所示。
表1
为了方便操作，优选的，试剂盒中还包括dNTPs、Taq酶和PCR缓冲液，更优选的，针对每个位点的引物和探针预混液装为1管。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述试剂盒在基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测中的应用。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测的装置。该装置包括：样品采集单元，设置为血浆cfDNA采集单元；基因检测单元，设置为应用上述试剂盒通过数字PCR技术检测ATRX和KDM5A突变；以及数据分析单元，设置为分析基因检测单元的检测数据并进行分析及结果输出。
为了进一步提高检测的灵敏度和准确性，优选的，基因检测单元中ATRX E10 del的退火温度设置为60℃，ATRX E11 del的退火温度设置为62℃，ATRX E9 Ins的退火温度设置为56℃，ATRX E14 R1426L的退火温度设置为56℃，ATRX E17 M1571V的退火温度设置为56℃，ATRX E28 E2074G的退火温度设置为56℃，KDM5A E27 del的退火温度设置为62℃，KDM5A E23 P1237S的退火温度设置为56℃，KDM5A E23 R1217W的退火温度设置为56℃，KDM5A E19 del的退火温度设置为56℃，KDM5A E10 del的退火温度设置为60℃，KDM5A E25del的退火温度设置为56℃。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
在本发明的实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
操作步骤如下：
1)血浆分离并提取cfDNA
利用商业化的cfDNA提取试剂盒进行核酸提取，并用Qubit测量DNA浓度。
2)配制数字PCR反应体系
以步骤1)提取的cfDNA为模板，加入上述所述的试剂盒中的1管引物探针预混液和数字PCR预混液来配制反应体系。
3)芯片上样
将反应体系在芯片上铺开，形成约20000个独立的微反应体系。
4)PCR扩增
将芯片对称的放入PCR扩增仪中，设置好反应程序，开始扩增。
5)数据读取
将PCR扩增仪中的芯片取出，放入芯片阅读仪中，仪器会自动读取并初步分析结果，完成后用U盘将数据导出。
6)数据分析
将数据上传到分析软件中会出现四象限点图，根据突变型模板和野生型模板的拷贝数计算出突变频率。
在本实施例的步骤1)中，待检的样本是12个位点已知突变频率的打断模拟cfDNA片段大小的质粒样本。
试剂信息如下表2：
表2
本实施例具体操作如下：
1.利用荧光定量计(Qubit)进行定量质粒DNA浓度。
2.配制数字PCR反应体系：
在0.2mL PCR管中配制如下表3中的反应液，轻轻涡旋混匀后备用。
表3
3.芯片上样：
1)安装封油注射器，并正确放置芯片、刷头及芯片盖于ThermoFisher公司生产的QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader上，吸取14.5μL上述配制好的数字PCR反应液，全部加入到刷头下部的加样孔中。
2)按压黑色的loading按钮，Chip Loader会将刷头内的反应液均匀的涂抹到芯片上。
3)待刷头涂抹完毕离开芯片后，立即将封油垂直悬空滴加到芯片上，以正好覆盖芯片表面为宜。
4)将Chip Loader臂翻转过来，使得芯片盖接触到芯片，用力按压15～30s后，按压Lid Nest按钮，将Chip Loader臂小心放回原位。
5)将芯片取下，呈一定角度，往右上角的小孔中缓慢推动油封注射器，将油封注入。
6)揭下芯片盖上的贴纸，封住油孔。用力按压直到紧密粘合。记录下样本号与对应的芯片ID。上机前芯片应避光放置。
4.PCR扩增：
将芯片架放在为ThermoFisher公司生产的ProFlexTMBase PCR System上，将制备好的芯片左右对称的放置芯片架上。盖上隔热垫，合上盖子，按如下程序设置好反应程序，开始运行PCR反应。PCR反应条件见表4。
表4
其中，X℃为56℃、60℃或者62℃。下表5为12个位点分别对应的退火温度。
表5
| 序号 | 基因位点 | 退火温度 |
| 1 | ATRX E10 del | 60℃ |
| 2 | ATRX E11 del | 62℃ |
| 3 | ATRX E9 Ins | 56℃ |
| 4 | ATRX E14 R1426L | 56℃ |
| 5 | ATRX E17 M1571V | 56℃ |
| 6 | ATRX E28 E2074G | 56℃ |
| 7 | KDM5A E27 del | 62℃ |
| 8 | KDM5A E23 P1237S | 56℃ |
| 9 | KDM5A E23 R1217W | 56℃ |
| 10 | KDM5A E19 del | 56℃ |
| 11 | KDM5A E10 del | 60℃ |
| 12 | KDM5A E25 del | 56℃ |
5.数据读取：
待PCR反应完成后将芯片从扩增仪中取出，放入芯片阅读仪中，仪器会自动读取Chip ID并自动分析结果。出现分析芯片界面时，可取出芯片，放入下一张芯片自动读取。通过运行历史可以观察到数据分析完成与否，当显示完成则说明仪器分析已经完成，稍等数分钟待结果自动保存到U盘中后，方可将U盘拔出进行后续的分析。
6.数据分析：
登录到ThermoFisher官网的QuantStudioTM 3D AnalysisSuiteTM Software，将数据上传并在Define Chips页面编辑样本信息，在Review Data页面可以看到芯片质控信息和四象限的点图。图中，黄色的点表示该孔内不含有DNA模板，即没有FAM信号也没有VIC信号；蓝色的点表示该孔内含有突变型DNA模板，有FAM信号；红色的点表示该孔内含有野生型DNA模板，有VIC信号；绿色的点表示该孔内同时含有突变型和野生型DNA模板，即有FAM信号也有VIC信号。通过突变样品的拷贝数与总拷贝数的比值检测待测样品的基因突变频率。
本实施例检测突变位点的3D PCR结果示意图；其中，图1示出了ATRX E10 del的3DPCR结果示意图；图2示出了ATRX E11 del的3D PCR结果示意图；图3示出了ATRX E9 Ins的3D PCR结果示意图；图4示出了ATRX E14 R1426L的3D PCR结果示意图；图5示出了ATRX E17M1571V的3D PCR结果示意图；图6示出了ATRX E28 E2074G的3D PCR结果示意图；图7示出了KDM5A E27 del的3D PCR结果示意图；图8示出了KDM5A E23 P1237S的3D PCR结果示意图；图9示出了KDM5A E23 R1217W的3D PCR结果示意图；图10示出了KDM5A E19 del的3D PCR结果示意图；图11示出了KDM5AE10 del的3D PCR结果示意图；以及图12示出了KDM5A E25 del的3D PCR结果示意图。图1-图12四象限点图中，第一象限代表野生型和突变型荧光同时存在，第二象限代表突变型荧光，第三象限代表没有荧光，第四象限代表野生型荧光。本实施例通过对ATRX和KDM5A两基因共12位点涉及特异性引物和探针，可以灵敏的检测出样本中的突变状态。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
与现有技术相比，本发明使用的样本为血浆cfDNA，其来源具有非侵入式、操作简便、可重复取样、有效应对肿瘤异质性等优点。且本发明的核酸起始量更低，检测周期更短，灵敏度也低至0.1％。
与同样使用数字PCR技术相比，本发明通过对ATRX和KDM5A两基因共12位点涉及特异性引物和探针，可以灵敏的检测出样本中的突变状态。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京诺禾致源科技股份有限公司
<120> 基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测的试剂盒、装置及应用
<130> PN1126154TJNH
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 120
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> ATRX E10 del 上游引物
<400> 120
agatggaatc atacctattc tcaggatca 29
<210> 121
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> ATRX E10 del 下游引物
<400> 121
gccttatcta aatcagtgcc tgtca 25
<210> 122
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> ATRX E10 del 突变型探针
<400> 122
tggatgatga tgacgacaa 19
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> ATRX E10 del 野生型探针
<400> 123
tggatgatga tgatgacgac aa 22
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> ATRX E11 del上游引物
<400> 124
cctcatctcc tgggttttct tcatt 25
<210> 125
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> ATRX E11 del下游引物
<400> 125
gatgaggatg gatcttcaga tgatgag 27
<210> 126
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> ATRX E11 del突变型探针
<400> 126
ttttccagtt cttttttc 18
<210> 127
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> ATRX E11 del野生型探针
<400> 127
ttttccagtt ctttttttc 19
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> ATRX E9 Ins上游引物
<400> 128
tcaactgtgc cttctgctga a 21
<210> 129
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> ATRX E9 Ins下游引物
<400> 129
gaagacctca caagaaggat catctg 26
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> ATRX E9 Ins突变型探针
<400> 130
aagagagaga gatcctttct 20
<210> 131
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> ATRX E9 Ins野生型探针
<400> 131
agagagagag actttct 17
<210> 132
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> ATRX E14 R1426L上游引物
<400> 132
ttttcactgg atgaatcttc ttgaacct 28
<210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> ATRX E14 R1426L下游引物
<400> 133
ttggaagaaa atcagcggag ctat 24
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> ATRX E14 R1426L突变型探针
<400> 134
aaaagaaaag gctacgtatt a 21
<210> 135
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> ATRX E14 R1426L野生型探针
<400> 135
aagaaaaggc gacgtatta 19
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> ATRX E17 M1571V上游引物
<400> 136
tcctgaacct ggagatttct ttgttttt 28
<210> 137
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> ATRX E17 M1571V下游引物
<400> 137
cttggacctt taaatttaac ttaatgaagc tgtt 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> ATRX E17 M1571V突变型探针
<400> 138
tcccacacaa actg 14
<210> 139
<211> 16
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> ATRX E17 M1571V野生型探针
<400> 139
aatcccacat aaactg 16
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> ATRX E28 E2074G上游引物
<400> 140
cagtagtgga accatctaaa cggtaa 26
<210> 141
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> ATRX E28 E2074G下游引物
<400> 141
cagagcgata tatcaaattc cttttgtgt 29
<210> 142
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> ATRX E28 E2074G突变型探针
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ccacttcccc ccacctg 17
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> ATRX E28 E2074G野生型探针
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ccacttcccc tcacctg 17
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> KDM5A E27 del上游引物
<400> 144
gctcctgacc agtcatactt tgag 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> KDM5A E27 del下游引物
<400> 145
gcagcatgtc aagatcacag att 23
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<222> (1)..(15)
<223> KDM5A E27 del突变型探针
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tccagcacct tttct 15
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<222> (1)..(15)
<223> KDM5A E27 del野生型探针
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<212> DNA
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tgtcactcct ggtatccctt cag 23
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<211> 15
<212> DNA
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<222> (1)..(15)
<223> KDM5A E23 P1237S突变型探针
<400> 150
ccgtacggac aactt 15
<210> 151
<211> 15
<212> DNA
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<220>
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<222> (1)..(15)
<223> KDM5A E23 P1237S野生型探针
<400> 151
ccgtacgggc aactt 15
<210> 152
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<222> (1)..(25)
<223> KDM5A E23 R1217W上游引物
<400> 152
gggataccag gagtgacaga atagt 25
<210> 153
<211> 27
<212> DNA
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<220>
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<222> (1)..(27)
<223> KDM5A E23 R1217W下游引物
<400> 153
ctggcaagct aaagaagtaa aattcct 27
<210> 154
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> KDM5A E23 R1217W突变型探针
<400> 154
cttcgagacc acatacaa 18
<210> 155
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> KDM5A E23 R1217W野生型探针
<400> 155
tcgagaccgc atacaa 16
<210> 156
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> KDM5A E19 del上游引物
<400> 156
ctgtagttca gccattgctt tctc 24
<210> 157
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> KDM5A E19 del下游引物
<400> 157
tcactttgga tgtcatgaag aagct 25
<210> 158
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> KDM5A E19 del突变型探针
<400> 158
tgccaaccct acccaga 17
<210> 159
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> KDM5A E19 del野生型探针
<400> 159
tgccaaccct accccaga 18
<210> 160
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> KDM5A E10 del上游引物
<400> 160
acatcttctt caatgctgct tacca 25
<210> 161
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> KDM5A E10 del下游引物
<400> 161
tgtagatggt tcccacagaa ctagt 25
<210> 162
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> KDM5A E10 del突变型探针
<400> 162
ccgccaaatt cct 13
<210> 163
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> KDM5A E10 del野生型探针
<400> 163
cgccaaaatt cct 13
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> KDM5A E25 del上游引物
<400> 164
aatgaaggtg ctgtccacat gt 22
<210> 165
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> KDM5A E25 del下游引物
<400> 165
ccagtgtgaa gtcctctagt agtct 25
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> KDM5A E25 del突变型探针
<400> 166
cccaatcttt ttgtgatgaa 20
<210> 167
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> KDM5A E25 del野生型探针
<400> 167
cccaatcttt tttgtgatga a 21
Claims (5)
1.一种基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：针对ATRX E10 del、ATRX E11 del、ATRX E9 Ins、ATRX E14 R1426L、ATRX E17M1571V、ATRX E28 E2074G、KDM5A E27 del、KDM5A E23 P1237S、KDM5A E23 R1217W、KDM5AE19 del、KDM5A E10 del和KDM5A E25 del位点的引物和探针；所述引物包括上游引物和下游引物，所述探针包括突变型探针和野生型探针；所述突变型探针和所述野生型探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有淬灭基团；所述突变型探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB；所述野生型探针的5’端标记的荧光报告基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为MGB；所述ATRX E10 del位点的上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示，突变型探针如SEQ ID NO：3所示，野生型探针如SEQ ID NO：4所示；
所述ATRX E11 del位点的上游引物如SEQ ID NO：5所示，下游引物如SEQ ID NO：6所示，突变型探针如SEQ ID NO：7所示，野生型探针如SEQ ID NO：8所示；
所述ATRX E9 Ins位点的上游引物如SEQ ID NO：9所示，下游引物如SEQ ID NO：10所示，突变型探针如SEQ ID NO：11所示，野生型探针如SEQ ID NO：12所示；
所述ATRX E14 R1426L位点的上游引物如SEQ ID NO：13所示，下游引物如SEQ ID NO：14所示，突变型探针如SEQ ID NO：15所示，野生型探针如SEQ ID NO：16所示；
所述ATRX E17 M1571V位点的上游引物如SEQ ID NO：17所示，下游引物如SEQ ID NO：18所示，突变型探针如SEQ ID NO：19所示，野生型探针如SEQ ID NO：20所示；
所述ATRX E28 E2074G位点的上游引物如SEQ ID NO：21所示，下游引物如SEQ ID NO：22所示，突变型探针如SEQ ID NO：23所示，野生型探针如SEQ ID NO：24所示；
所述KDM5A E27 del位点的上游引物如SEQ ID NO：25所示，下游引物如SEQ ID NO：26所示，突变型探针如SEQ ID NO：27所示，野生型探针如SEQ ID NO：28所示；
所述KDM5A E23 P1237S位点的上游引物如SEQ ID NO：29所示，下游引物如SEQ ID NO：30所示，突变型探针如SEQ ID NO：31所示，野生型探针如SEQ ID NO：32所示；
所述KDM5A E23 R1217W位点的上游引物如SEQ ID NO：33所示，下游引物如SEQ ID NO：34所示，突变型探针如SEQ ID NO：35所示，野生型探针如SEQ ID NO：36所示；
所述KDM5A E19 del位点的上游引物如SEQ ID NO：37所示，下游引物如SEQ ID NO：38所示，突变型探针如SEQ ID NO：39所示，野生型探针如SEQ ID NO：40所示；
所述KDM5A E10 del位点的上游引物如SEQ ID NO：41所示，下游引物如SEQ ID NO：42所示，突变型探针如SEQ ID NO：43所示，野生型探针如SEQ ID NO：44所示；
所述KDM5A E25 del位点的上游引物如SEQ ID NO：45所示，下游引物如SEQ ID NO：46所示，突变型探针如SEQ ID NO：47所示，野生型探针如SEQ ID NO：48所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括dNTPs、Taq酶和PCR缓冲液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，针对每个位点的引物和探针预混液装为1管。
4.一种基于数字PCR技术的ATRX和KDM5A突变检测的装置，其特征在于，所述装置包括：
样品采集单元，设置为血浆cfDNA采集单元；
基因检测单元，设置为应用如权利要求1至3中任一项所述的试剂盒通过数字PCR技术检测ATRX和KDM5A突变；以及
数据分析单元，设置为分析所述基因检测单元的检测数据并进行分析及结果输出。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述基因检测单元中所述ATRX E10 del的退火温度设置为60℃，所述ATRX E11 del的退火温度设置为62℃，所述ATRX E9 Ins的退火温度设置为56℃，所述ATRX E14 R1426L的退火温度设置为56℃，所述ATRX E17 M1571V的退火温度设置为56℃，所述ATRX E28 E2074G的退火温度设置为56℃，所述KDM5A E27 del的退火温度设置为62℃，所述KDM5A E23 P1237S的退火温度设置为56℃，所述KDM5A E23R1217W的退火温度设置为56℃，所述KDM5A E19 del的退火温度设置为56℃，所述KDM5AE10 del的退火温度设置为60℃，所述KDM5A E25 del的退火温度设置为56℃。
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