ES2627961T3 - Métodos de diagnóstico basados en un reordenamiento adquirido somáticamente - Google Patents

Abstract

Un método para controlar un cáncer de mama, comprendiendo el método: controlar los cambios en los niveles de ácido nucleico que contiene un reordenamiento genómico y/o cuantificar los niveles de ácido nucleico que contiene un reordenamiento genómico, en donde el reordenamiento genómico es una mutación adquirida somáticamente asociada a la progresión o la gravedad del cáncer de mama en un paciente, y en donde la identificación del reordenamiento se ha llevado a cabo por análisis genómico amplio del ácido nucleico de ese paciente o se lleva a cabo por análisis genómico amplio del ácido nucleico de ese paciente, y en donde dicho control es un ensayo de PCR hibridada que se lleva a cabo en el ácido nucleico de un fluido corporal, en donde dicho fluido corporal es sangre, suero o plasma

Description

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DESCRIPCION

Metodos de diagnostico basados en un reordenamiento adquirido somaticamente

La asistencia sanitaria individualizada es un objetivo principal para la medicina en los proximos 5-10 anos. Se necesitan numerosos avances para alcanzar es te objetivo, incluyendo el desarrollo de biomarcadores sensibles y especlficos para medir la carga de enfermedad.

A modo de ejemplo, la medicina para el cancer personalizada depende de la implementacion de diagnosticos personalizados. Como el cancer, en su centro, es dirigido por una mutacion somatica, es probable que la exploracion genomica detallada tenga un papel central facilitando las elecciones terapeuticas individuales. Como la variedad de farmacos y otras terapias del cancer sigue aumentando, existe la necesidad cada vez mas urgente de medidas sensibles y especlficas de la carga de enfermedad para guiar los reglmenes de tratamiento.

En los canceres hematologicos malignos, hay una rutina de cuantificacion de niveles de enfermedad residuales mediante ensayos por reordenamientos genomicos recurrentes. Esto ha sido posible por el descubrimiento de que las leucemias se asocian con reordenamientos genomicos caracterlsticos que no necesitan la exploracion amplia del genoma ni el desarrollo de ensayos especlficos del paciente. En los tumores solidos, sin embargo, los metodos para cuantificar la carga de enfermedad son menos sensibles y menos especlficos. Las imagenes radiologicas se utilizan de manera rutinaria para estadificar lo pacientes, pero solo se pueden detectar lesiones grandes de > 1 cm de tamano, que representan ya muchos millones de celulas cancerosas. Los marcadores sericos, tales como el PSA para el cancer prostatico, pueden ser utiles, pero no estan disponibles para muchos tipos de tumor y frecuentemente tienen problemas de falta de especificidad. La deteccion inmunologica de celulas tumorales circulantes tiene una sensibilidad por debajo de 1 celula cancerosa en miles de celulas normales, pero solo detecta las celulas presentes en la sangre y puede dar como resultado falsos positivos por las celulas no malignas que expresan el marcador de interes.

Las celulas tumorales liberan ADN desnudo en el plasma segun se necrosan o sufren apoptosis, y el nivel de ADN libre circulante se correlaciona con la carga de enfermedad. Es to se puede utilizar para controlar los niveles de mutaciones puntuales especlfica del tumor o cambios epigeneticos en los oncogenes con algun valor pronostico. Sin embargo, la fraccion de ADN desnudo circulante que deriva de las celulas tumorales es del 0,01 % o menor en muchos casos, y los metodos actuales para discriminar una unica base mutada en su profundidad son inadecuados. Por lo tanto, las estrategias existentes, que se basan en las mutaciones puntuales o los cambios epigeneticos en el ADN plasmatico, tienen poca sensibilidad y carecen de especificidad.

La presente invencion se dirige al problema de detectar y controlar enfermedades para apoyar una estrategia de medicina personalizada.

Declaraciones de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo para controlar un cancer de mama, como se expone en la reivindicacion 1.

En un aspecto adicional la invencion se refiere a un metodo para evaluar la eficacia de un tratamiento, como se expone en la reivindicacion 9.

Figuras

Figura 1 Ilustra la deteccion cuantitativa de reordenamientos genomicos en el ADN plasmatico

Figura 2 Ilustra el analisis de muestras seriadas

Descripcion detallada

La presente invencion en general se refiere a la deteccion de reordenamientos en el acido nucleico que esta asociado con un estado del cancer de mama de un paciente por analisis genomico amplio del acido nucleico de ese paciente. Actualmente estan disponibles tecnologlas que permiten el mapeo de muchos puntos de ruptura de acido nucleico en una muestra tisular, a lo largo de un genoma. Una vez que los biomarcadores de reordenamiento adecuados se han identificado en un paciente, se puede seguir la progresion de la enfermedad controlando el aumento o disminucion de los niveles de acido nucleico que contiene dichos puntos de ruptura respecto al tiempo en ese paciente. Cuando el acido nucleico que tiene el reordenamiento es detectable en la sangre o el plasma, entonces se pueden muestrear las muestras de sangre o plasma para controlar facilmente la progresion de la enfermedad. Los tratamientos de la enfermedad en un paciente pueden pararse una vez que se detiene la progresion de la enfermedad, o se revierte, o no es detectable, segun se evalua mediante los niveles de biomarcador de reordenamiento. Los reglmenes de tratamiento se pueden alterar o terminar si la carga de enfermedad no se reduce, segun se evalua mediante los niveles de biomarcadores de reordenamiento. Los efectos,

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y por lo tanto la idoneidad, de diferentes tratamientos se pueden evaluar tambien.

El metodo de la invencion se puede utilizar tambien para determinar si se ha producido una recalda, para permitir que se reinicie el tratamiento, si fuera necesario.

En el ejemplo del cancer, las exploraciones de reordenamientos son potencialmente aplicables a todos los tipos tumorales en los que se puede acceder a la muestra diagnostica por exploracion genomica. La mayorla de los pacientes con tumores solidos se someten a biopsia o reseccion quirurgica completa de su cancer durante el curso de su terapia, lo que significa que el acceso al ADN tumoral habitualmente se puede conseguir. En la experiencia de los inventores hasta ahora, mas del 99 % de las muestras analizadas, a lo largo de una amplia variedad de tipos tumorales, han tenido al menos un reordenamiento genomico especlfico del tumor que se puede identificar.

Por lo tanto, en un primer aspecto la invencion se refiere a un metodo para controlar un cancer de mama como se expone en la reivindicacion 1.

Una enfermedad, como se desvela en el presente documento, puede ser cualquier enfermedad asociada con un reordenamiento somatico. Las enfermedades pueden incluir, por ejemplo, canceres, tales como tumores solidos, hemoglobinuria paroxlstica nocturna, neurofibromatosis 1 y 2, de McCune-Albright, incontinencia pigmentaria, y slndrome Proteus.

El acido nucleico que comprende el reordenamiento es detectable en una muestra de fluidos corporales tales como la sangre, el suero o el plasma.

Los reordenamientos asociados con estados de enfermedad del presente documento, tales como el cancer, no necesariamente causan la enfermedad, aunque pueden producir o contribuir al fenotipo de la enfermedad. Sin embargo, solo es necesario que el reordenamiento se asocie con la enfermedad de manera que el control del reordenamiento pueda permitir que se siga la progresion o gravedad de la enfermedad. Se desvela en el presente documento el control que utiliza los reordenamientos que no son los causantes de la enfermedad, o no solamente producen la enfermedad.

El acido nucleico se toma directamente de la sangre o el plasma o el suero, que no se sabe si esta enfermo en si mismo, pero de un paciente que se sabe que tiene la enfermedad. Los reordenamientos genomicos adquiridos somaticamente tambien son utiles como un marcador de enfermedad en dicho caso, en el que se asume que la mutacion se asocia con el estado de enfermedad.

El acido nucleico puede ser un ADN o un ARN.

El analisis genomico amplio como se desvela en el presente documento es un analisis de todo o una parte significativa del genoma de un individuo para identificar mutaciones en forma de reordenamientos que se encuentran en el tejido enfermo del individuo, tal como un tumor. El analisis genomico amplio es la identificacion de mutaciones de reordenamiento de un individuo que se correlacionan con la enfermedad mediante el analisis de fragmentos o regiones aleatorios de acido nucleico de ese individuo, adecuadamente sin el uso de sondas o cebadores que se conozca que son especlficos del acido nucleico de ese individuo. Por lo tanto, no es necesario tener una cobertura completa de un genoma, aunque se prefieren las tecnicas que permiten el analisis del genoma completo, al menos las que se basan en un analisis estadlstico de la cobertura.

Los reordenamientos genomicos adquiridos somaticamente pueden incluir eliminaciones, inversiones, translocaciones, y amplificaciones. Los reordenamientos pueden ser detectables por un cambio en la longitud de un fragmento de restriccion en el que se localiza la mutacion, en comparacion con el genoma normal (no mutado) del paciente.

En un aspecto el analisis se lleva a cabo por secuenciacion del ADN, por ejemplo, la secuenciacion de fragmentos generados aleatoriamente del ADN de un individuo. En un aspecto la secuenciacion es la secuenciacion de una biblioteca de fragmentos de ADN modificados de tamano tal como de 400-500 pb. En un aspecto la tecnica que se utiliza es la secuenciacion masiva paralela, como se describe en el presente documento, y tambien en Campbell et al Nature Genetics, Vol. 40, numero 6, Junio de 2008, pagina 722 - 729.

Las plataformas de secuenciacion masiva paralela adecuadas incluyen tambien la plataforma SOLiD (Applied Biosystems) y el uso del secuenciador 454 (Roche).

En un aspecto la secuenciacion se lleva a cabo utilizando una secuenciacion de extremo emparejado. Se generan lecturas emparejadas del orden de 60 millones de fragmentos, que generalmente es suficiente para identificar > 50 % de los reordenamientos genomicos somaticos presentes en la muestra.

Los metodos de secuenciacion de extremo emparejados se desvelan, por ejemplo, en Genome Res. 2009. 19: 521532.

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Los reordenamientos genomicos pueden priorizarse. La priorizacion puede ser, por ejemplo, incluyendo 1 o mas de las siguientes etapas:

• > 2 lecturas abarcan el mismo reordenamiento;

• mapeo de alta confianza de ambos extremos;

• mapeo de las lecturas < 100 kb separados en el mismo cromosoma;

• mapeo de ambos extremos a 100 kb de un punto de cambio de numero de copia identificado por el algoritmo de segmentacion.

La etapa de control de los cambios de los niveles de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico es una estrategia de hibridacion PCR. La referencia del presente documento a PCR se refiere en general a tecnologlas de amplificacion de ADN, incluyendo especlficamente la reaccion en cadena de la polimerasa. Se utilizan cebadores disenados adecuadamente para identificar especlficamente el reordenamiento de acido nucleico en el procedimiento de amplificacion.

En un aspecto el procedimiento PCR se lleva a cabo en una muestra de acido nucleico que se obtiene de la sangre, o el suero.

En un aspecto, el tamano del producto de PCR inicial es menor de < 200 pb, preferentemente menor de 190 pb, 180 pb, 170 pb, 160 pb, 150 pb.

Los ensayos adecuados para controlar el nivel de un reordenamiento especlfico son preferentemente sustancialmente cuantitativos.

Los cambios en los niveles del acido nucleico se pueden hacer por mediciones absolutas o relativas. Por ejemplo, se puede utilizar la relacion del nivel de ADN genomico 'normal' vs ADN genomico mutado. De manera alternativa, se puede medir la cantidad absoluta de ADN mutado, por ejemplo, de ADN por ml de plasma. La medicion del cambio de los nieles de acido nucleico, o la cuantificacion de niveles de acido nucleico, pueden ser mediante la medicion de la relacion o la concentracion absoluta.

En un aspecto el ensayo de la invention para controlar los cambios en los niveles de acido nucleico en un paciente en la etapa linealmente cuantificable hasta un nivel de 25 pg de ADN por ensayo.

En un aspecto un aumento de un log en la cantidad absoluta de ADN detectado con el reordenamiento se considera que es un aumento significativo en la carga de enfermedad, y puede necesitar tratamiento.

En un aspecto de la invencion se controlan multiples reordenamientos genomicos, para proporcionar una huella genetica de un individuo.

Se desvela en el presente documento un metodo de tratamiento medico que comprende el control de la invencion, y que comprende adicionalmente la etapa de tratar al paciente cuando sea necesario, o cambiar el tratamiento, o detener el tratamiento si el tratamiento esta en curso, dependiendo de la gravedad o progresion de la enfermedad segun se indique por el nivel de acido nucleico que contiene el reordenamiento informativo.

Se desvela en el presente documento el uso de un reordenamiento genomico especlfico del paciente como un biomarcador de la progresion de la enfermedad en el paciente.

Se apreciara que la progresion de una enfermedad se puede seguir controlando el cambio de un marcador identificado con el tiempo. La gravedad de una enfermedad se puede evaluar por una medicion de un biomarcador en un punto unico de tiempo cuya presencia o concentracion sean indicativas de la gravedad de la enfermedad. Por ejemplo, la presencia en la sangre de un reordenamiento de ADN somatico identificado en un tumor solido puede indicar la progresion de un cancer mas alla de un cierto estado de enfermedad.

Se desvela en el presente documento un metodo para determinar un estado de enfermedad, comprendiendo el metodo la identification de un reordenamiento genomico adquirido somaticamente asociado con un estado de enfermedad en un paciente en el que la identificacion se lleva a cabo por analisis genomico amplio del acido nucleico de ese paciente. El reordenamiento genomico se identifica adecuadamente en un paciente en un tejido o fluido, tal como sangre o plasma o suero. Preferentemente, el reordenamiento genomico se identifica en un sitio, o en un organo, tejido o fluido, distinto del tejido enfermo primario a partir del cual se lleva a cabo el analisis genomico amplio.

Por ejemplo, un tumor solido puede representar un tejido enfermo primario, y la presencia de un reordenamiento genomico adquirido somaticamente en la sangre u otro fluido corporal puede ser indicativo de una cierta progresion de la enfermedad cancerosa, y permite que se determine un tratamiento terapeutico.

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Se desvela en el presente documento un metodo para determinar un regimen de tratamiento para una enfermedad, comprendiendo el metodo cuantificar el nivel de reordenamiento genomico adquirido somaticamente asociado con un estado de enfermedad en un paciente en un tejido o fluido, preferentemente distinto del tejido enfermo primario, en el que la identificacion se lleva a cabo por analisis genomico amplio del acido nucleico de ese paciente, y seleccionar un regimen de tratamiento basado en el nivel de dicho reordenamiento genomico.

Se desvela en el presente documento un metodo para evaluar la eficacia de un tratamiento, comprendiendo el metodo:

i Identificar un reordenamiento genomico adquirido somaticamente asociado con un estado de enfermedad en un paciente, en el que la identificacion se lleva a cabo por analisis genomico amplio del acido nucleico de ese paciente, y

ii Controlar los cambios en los niveles de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico como un marcador para la progresion de una enfermedad en ese paciente en respuesta a un tratamiento, evaluando de esta manera la eficacia del tratamiento.

El tratamiento puede ser un nuevo tratamiento, en cuyo caso el metodo de la invencion puede utilizarse no solo para controlar el mejor tratamiento para un paciente, se puede utilizar tambien para determinar en general la eficacia de nuevos reglmenes de tratamiento y nuevos farmacos u otros tratamientos terapeuticos. Esta solicitud no se limita a seres humano, sino que se podrla aplicar tambien a animales. Se desvela en el presente documento un metodo para evaluar la eficacia de un farmaco o regimen de tratamiento, comprendiendo el metodo el tratamiento de un individuo que lo necesita con un farmaco o regimen de tratamiento y luego controlar la progresion o gravedad de la enfermedad tras el tratamiento midiendo los niveles de acidos nucleicos con reordenamientos somaticos como un biomarcador de la enfermedad.

Se desvela en el preste documento un metodo para controlar la destruccion celular, en el que la destruccion de celulas utilizando un farmaco o regimen de tratamiento se controla por la liberacion de acido nucleico que comprende un reordenamiento somatico.

Cancer Res 2007; 67: (19). 1 de octubre de 2007 p 9364 - 9370 desvela el control de destruccion celular en un modelo animal.

Si se esta tratando un paciente con un farmaco u otra terapia, por ejemplo, cirugla, o radioterapia o quimioterapia, se puede controlar la eficacia de ese tratamiento buscando los niveles del acido nucleico que tiene reordenamientos en el paciente.

Los tratamientos adecuados incluyen el uso de cirugla, quimioterapia, radioterapia, anticuerpos monoclonales, terapia hormonal, y terapia direccionada molecularmente o una combinacion de los mismos.

Ademas, cuando un paciente se ha tratado de una enfermedad y esta en remision, entonces se puede controlar el estado de remision continuo, si el paciente sale de la remision (recalda), entonces se puede reiniciar el tratamiento. Por lo tanto, controlando la progresion de la enfermedad, como se hace referencia en el presente documento, tambien incluye el control de recurrencia de la enfermedad despues de la remision, y opcionalmente el tratamiento de la enfermedad despues de la recalda. La presente invencion se puede utilizar para controlar la recalda despues de un periodo, por ejemplo, de horas, dlas, semanas o meses despues de la remision o el ultimo ciclo de tratamiento.

Se desvela en el presente documento un metodo para determinar la progresion del cancer, comprendiendo el metodo:

a) identificar un reordenamiento genomico adquirido somaticamente en un acido nucleico de una muestra tumoral de un paciente por analisis genomico amplio mediante secuenciacion de extremos emparejados.

b) disenar un ensayo cuantitativo para identificar y medir los reordenamientos genomicos adquiridos somaticamente;

c) obtener unas o mas muestras adicionales del paciente durante futuros estadios de terapia;

d) utilizar los ensayos para medir los niveles de acido nucleico con reordenamientos somaticos en las muestras obtenidas durante la etapa (a) y la etapa (c); y opcionalmente

e) determinar la progresion y/o gravedad de la enfermedad del paciente comparando los niveles de acidos nucleicos con reordenamiento somatico que se mide en la etapa (d).

Como se desvela en el presente documento, se puede explorar una mujer embarazada para determinar si han pasado enfermedades hereditarias a sus hijos. Cuando se conoce que un padre tiene una afeccion que esta asociada con un reordenamiento genomico adquirido somaticamente, la presencia de este reordenamiento se puede evaluar, por ejemplo en la sangre o el suero de la madre. Se desvela en el presente documento un metodo adecuado para controlar una enfermedad, comprendiendo el metodo:

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a Identificar un reordenamiento genomico adquirido somaticamente asociado con un estado de enfermedad en un paciente, en el que la identificacion se lleva a cabo por un analisis genomico amplio del acido nucleico de ese paciente, y

b controlar los cambios en los niveles de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico, y/o cuantificar los niveles de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico, en una mujer embarazada como un marcador de la progresion o gravedad de una enfermedad en el feto.

Para evitar dudas, los terminos “que comprende”, “comprender” y “comprende” en el presente documento tienen la intencion por los inventores de que sean sustituibles opcionalmente por los terminos “que consisten en”, “consistir en”, y “consiste en”, respectivamente, en cada caso. El termino “aproximadamente” (o “alrededor” en todos los valores numericos permite una variacion del 5 %, es decir, un valor de aproximadamente un 1,25 % signifi carla desde entre 1,19 %-1,31 %.

Se entendera que las realizaciones particulares descritas en el presente documento se muestran a modo de ilustracion y no como limitaciones de la invention. Las caracterlsticas principales de la presente invention se pueden emplear en distintas realizaciones sin alejarse del alcance de la invencion. Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de determinar utilizando no mas de estudio de rutina, numerosos equivalentes de los procedimientos especlficos descritos en el presente documento. Dichos equivalentes se considera que estan en el alcance de la presente invencion y estan cubiertos por las reivindicaciones. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la tecnica al que pertenece la presente invencion.

El uso de la palabra “un” o “una” cuando se utiliza en conjuncion con la expresion “que comprende” en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar “uno”, pero tambien es consistente con el significado de “uno o mas”, “al menos uno”, y “uno o mas de uno”. El uso del termino “o” en las reivindicaciones se utiliza para significar “y/o” a menos que se indique expllcitamente que hace referencia a alternativas solamente o alternativas que son mutuamente excluyentes, aunque la divulgation soporta una definition que se refiere solamente a las alternativas y “y/o”. A lo largo de la presente solicitud, el termino “aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye una variacion inherente de error para la medicion, empleandose el metodo para determinar el valor, o la variacion que existe entre los sujetos de estudio. Como se utiliza en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, las expresiones “que comprende” (y cualquier forma de que comprende, tal como “comprender” y “comprende”), “que tiene” (y cualquier forma de que tiene, tal como “tener” y “tiene”), “que incluye” (cualquier forma de que incluye, tal como “incluye” e “incluir”) o “que contiene” (y cualquier forma de que contiene, tal como “contiene” y “contener”) son inclusive y de extremos abiertos y no excluyen elementos adicionales, no mencionados o etapas del metodo.

La expresion “o combinaciones de los mismos” como se utiliza en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los artlculos enumerados que preceden la expresion. Por ejemplo, “A, B, C, o combinaciones de los mismos tiene la intencion de incluir al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC, o ABC, y si el orden es importante en un contexto en particular, tambien BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, o CAB. Continuando con este ejemplo, estan expresamente incluidas las combinaciones que contienen repeticiones de uno o mas de los artlculos o terminos, tal como BB, AAA, AAAABCCCC, CBBAAA, CABABB, y asl. El experto entendera que normalmente no hay llmite en el numero de artlculos o terminos en cualquier combination, a manos de que sea aparente otra cosa por el contexto.

Todas las composiciones y/o metodos desvelados y reivindicados en el presente documento se pueden fabricar y ejecutar sin experimentation innecesaria a la luz de la presente divulgacion. Mientras las composiciones y metodos de la presente invencion se han descrito en terminos de realizaciones preferidas, sera aparente para los expertos en la tecnica que se pueden aplicar variaciones se pueden aplicar a las composiciones y metodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del metodo descrito en el presente documento.

La presente invencion se ejemplifica ahora en referencia a los siguientes ejemplos, que no son limitantes de la invencion.

Metodos

Las siguientes etapas se emplean en el presente ejemplo de la invencion

1. Identificacion de reordenamientos genomicos especlficos de un tumor por secuenciacion masiva paralela.

2. Mapear los reordenamientos en cuanto a resolution de pares de bases.

3. Disenar ensayos basados en PCR para la cuantificacion sensible y especlfica de la carga tumoral.

4. Extraction de ADN libre del suero y cuantificacion de la carga tumoral con controles apropiados.

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Identificacion de reordenamientos especfficos de un tumor por secuenciacion masiva paralela

El ADN genomico se extrae de la muestra tumoral utilizando la extraccion con fenol-cloroformo u otros protocolos convencionales. Se preparan bibliotecas a partir del ADN tumoral de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante de la plataforma de secuenciacion masiva paralela que se va a utilizar. Para la plataforma de secuenciacion Solexa (Genome Analyzer, Illumina, San Diego CA), el ADN genomico (5 pig) se corta aleatoriamente utilizando el nebulizador suministrado con el instrumento Analizador de Genoma de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN fragmentado se repara en sus extremos utilizando la T4 ADN polimerasa y la Klenow polimerasa con la T4 polinucleotido cinasa para fosforilar los extremos 5'. Se crea una protuberancia A 3' utilizando un fragmento Klenow deficiente en exonucleasa 3'-5', y se ligan los oligonucleotidos adaptadores de finales emparejados a los extremos pegajosos creados de esta manera. La mezcla de union se somete a electroforesis en un gel de agarosa y se selecciona por tamano escindiendo los fragmentos de ADN de 400-500 pares de bases de longitud. El ADN se extrae del gel y se enriquece con los fragmentos con los cebadores Solexa en cada extremo por una reaccion PCR de ciclo limitado, siguiendo las instrucciones del fabricante.

La celda de flujo del Analizador de Genoma de extremos emparejados se prepara en la estacion de agrupamiento que se proporciona de acuerdo con el protocolo del fabricante. Entonces los agrupamientos de colonias de PCR se secuencian en la plataforma del Analizador de Genoma utilizando los protocolos recomendados por el fabricante. La secuenciacion de extremos emparejados de al menos 35 pb de cada extremo proporciona la cobertura optima para identificar reordenamientos, aunque se pueden con lecturas de longitudes mas largas, lecturas de extremo unico. Las imagenes del aparato se procesan utilizando el software del fabricante para generar archivos de secuencias FASTQ.

La mayorla de la generacion actual de plataformas de secuenciacion masiva paralela se puede utilizar para identificar reordenamientos genomicos, incluyendo la plataforma SOLiD (Applied Biosystems) y el secuenciador 454 (Roche). El tamano de las inserciones mas grandes aumenta la cobertura, y permite una mayor fiabilidad de reconocimiento de agrupamientos de reordenamientos. Cuando los datos de secuenciacion del ADN constitucional (llnea germinal) del mismo paciente estan disponibles, se pueden utilizar para ayudar a la distincion entre la llnea germinal y los reordenamientos somaticos.

Los datos de secuencia se alinean con el genoma humano de referencia, utilizando cualquiera de los paquetes disponibles libremente. Los inventores utilizaron el algoritmo v0.43 MAQ (disponible en
http://maa.sourceforge.net/maa-man.shtml). Las lecturas en las que falla el alineamiento de los dos extremos con el genoma en la orientacion correcta y distancia de separacion se exploraron adicionalmente con el algoritmo SSAHA.

Retirada de artefactos

Las lecturas en las que los dos externos se mapean a 500 pb entre ellos, pero uno de los dos extremos esta en la orientacion incorrecta se excluyen del analisis, ya que es probable que sean artefactos debido a su mal cebamiento en la colonia de PCR o reordenamientos intra-moleculares generados durante la amplificacion de la biblioteca. Las lecturas que tienen duplicados exactos entre ellos (creados durante la etapa de enriquecimiento por PCR) se identifican por el hecho de que los dos extremos de las secuencias se mapean en localizaciones genomicas identicas: solo se retiene el fragmento con la mayor calidad de mapeo. El mapeo de ADN enganoso por huecos de secuencia en el genoma de referencia se reduce excluyendo las regiones a 1 Mb de huecos de secuencia centromericas o telomericas del analisis del numero de copias y el analisis de reordenamiento (vease una lista de los huecos actuales, por ejemplo, en:
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables).

Algoritmo de numero de copias

Para corregir la variacion de niveles de singularidad a lo largo del genoma, se lleva a cabo una simulacion in silico de cortas lecturas de extremos emparejados creando secuencias emparejadas de 35 bases cada extremo, separados 500 pb (o el equivalente si se han utilizado diferentes bibliotecas), con parejas simuladas localizadas cada 35 pb a lo largo del genoma. Estas lecturas simuladas se mapean en el genoma utilizando el algoritmo MAQ. Basandose en esto, el genoma se divide en ventanas de anchura desigual, sin solapamiento que contienen un numero constante de lecturas in silico mapeadas con alta singularidad. Una vez fijados lo llmites de la ventana, se cuentan las lecturas de extremos emparejados que se mapean unicamente en cada ventana. Esto forma la entrada en bruto en un algoritmo de segmentacion circular binario desarrollado originalmente para los datos de micromatriz de hibridacion genomica. Este algoritmo, implementado en R como la biblioteca de copias de ADN del proyecto Bioconductor (vease
http://www.bioconductor.org/), identifica los puntos de cambio en el numero de copias por segmentacion binaria iterativa. Los inventores utilizaron a = 0,01, junto con un parametro de alisado de 2 y 2 desviaciones estandar para eliminar los falsos positivos probables tras la segmentacion, aunque el modelado generalmente da resultados similares para diferentes elecciones de parametros.

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Mapeo de reordenamientos para la resolucion de pares de bases

Se utilizaron los siguientes criterios para priorizar las lecturas de mapeo incorrectas para la exploracion de confirmacion:

1. > 2 lecturas que abarquen el mismo reordenamiento;

2. Mapeo de alta confianza para ambos extremos;

3. Mapeo de lecturas separadas < 100 kb en el mismo cromosoma;

4. Mapeo de ambos extremos a 100 kb de un punto de cambio en el numero de copias identificado por el algoritmo de segmentacion.

Los cebadores se disenan para abarcar el posible punto de ruptura localizandolos en las lecturas de extremos pareados en el lado exterior de 1 kb, para un tamano del producto maximo de 1 kb. Se llevaron a cabo las reacciones PCR en el ADN genomico y tumoral para cada grupo de cebadores. Los productos que producen una banda se secuencian por metodos de capilaridad de Sanger y se comparan con la secuencia de referencia para identificar puntos de ruptura. Los reordenamientos adquiridos somaticamente, especlficos de un tumor se definen como las reacciones PCR que dan una banda convincente en el ADN tumoral con una banda no coincidente de ADN normal, que se ve al menos en dos reacciones por separado, junto con los datos de mapeo de secuencia inequlvoco que sugieran un reordenamiento.

De manera alternativa, los reordenamientos se pueden mapear por ensamblaje de novo a lo largo del punto de ruptura. Esto se consigue extrayendo las lecturas de extremos emparejados en las que uno extremo se mapea en la localization del punto de ruptura. Estas lecturas se pueden ensamblar en contiguas mas largas, que se pueden alinear con el genoma de referencia para identificar la localizacion exacta de las rupturas.

Diseno de ensayos basados en PCR para la cuantificacion de reordenamientos especfficos de un tumor

Los inventores han descubierto que la PCR hibridada es un metodo sensible y especlfico para la amplification de reordenamientos genomicos especlficos de un tumor.

Cada reordenamiento somatico estructural confirmado se evalua por su idoneidad como marcador de ADN.

Cambio del numero de copias

Es importante seleccionar los marcadores de ADN presentes en la mayorla de las celulas tumorales. Las exploraciones de reordenamientos se llevan a cabo en ADN tumoral derivado de una poblacion de celulas, por lo que el resultado del experimento de secuenciacion es una media de reordenamiento en la poblacion celular tumoral. Los inventores buscaban utilizar los reordenamientos que i) sean prevalentes en los datos de secuenciacion y ii) tengan claros cambios del numero de copias, ya que estos estaran presentes en la mayorla (o todas) las celulas tumorales.

Singularidad del ADN circundante

Cada ensayo debe ser especlfico de un reordenamiento particular. La naturaleza repetitiva del genoma significa que las secuencias no unicas repetitivas estan localizadas en multiples posiciones a lo largo del genoma. Con el fin de obtener ensayos altamente especlficos, las secuencias repetitivas que rodean cada punto de ruptura se enmascaran utilizando un software de enmascaramiento repetido (
www.repeatmasker.org). Esto excluye una proportion de punto se ruptura adquiridos somaticamente de analisis posteriores debido a las repeticiones circundantes cercanamente. Para algunas uniones de punto de ruptura, no se desenmascaran o solamente los tramos cortos de nucleotidos. Esto permite que se disenen ensayos especlficos para estos reordenamientos si se evitan las secuencias repetidas.

Numero de ensayos

Los inventores tenlan como objetivo disenar sondas para 3-4 reordenamientos especlficos de un tumor por paciente. Tener multiples ensayos por paciente aumenta la confianza en el resultado final, aunque no siempre es posible identificar este numero adecuado de reordenamientos en cada paciente. Los ensayos especlficos tumorales se llevan a cabo junto con 4 ensayos de control que se disenan para reconocer las regiones de tipo silvestre del genoma.

Ensayo I diseno de oligos

Los inventores utilizan una estrategia de PCR hibridada para identificar reordenamientos especlficos de cancer a partir del alto fondo de ADN circulante derivado de celulas normales. Los cebadores se disenan utilizando el cebador 3 (
http://frodo.wi.mit.edu/) para evitar la secuencia repetitiva y abarcar el punto de ruptura del reordenamiento. El tamano del producto de PCR inicial deberla mantenerse en un mlnimo (< 200 pb) debido a que el ADN tumoral circulante tiende a ser mas abundante en este intervalo de tamano. La secuencia amplificada en la 1a ronda de PCR

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se utiliza como matriz para disenar un ensayo de PCR cuantitativa estilo sonda de ADN marcada doblemente (“taqman”) utilizando el software Beacon Designer (Premier Biosoft International). Este programa selecciona los cebadores y una sonda de ADN marcada doblemente [5' FAM, 3' BHQ1]. Debido a las restricciones de tamano estrictas, a veces se necesita el solapamiento entre los cebadores en tiempo real y de la 1a ronda.

Extraccion del ADN del plasma/suero y cuantificacion de la carga tumoral

Extraction de ADN

Los residuos se eliminan del plasma o suero del paciente por centrifugacion a 16.000 g durante 10 minutos. El ADN se extrae de los 2-20 ml del sobrenadante resultante utilizando un kit QIAamp MinElute Virus Vacuum (Qiagen). El ADN se eluye en 20 pl del tampon de elucion suministrado y se utiliza el volumen completo como matriz de la siguiente PCR.

PCR multiple

La cantidad de ADN completa extralda de los 2-20 ml de plasma del paciente (o la dilucion en serie de 10 veces derivada de este) se combina con todos los cebadores de la 1a ronda de PCR junto con los cebadores de la 1a ronda de la region de control y se someten a 20 ciclos en una PCR multiple. La combination de todos los cebadores asegura que este disponible la mayor cantidad de ADN posible para cada grupo de cebadores.

PCR en tiempo real

Se hicieron diluciones seriadas de 10 veces del producto PCR hibridado y se utilizaron 5 pl como matriz en reacciones PCR en tiempo real individuales utilizando los cebadores y sondas especlficos de reordenamiento.

Cuantificacion

La utilization de diluciones en serie del ADN tumoral del paciente en ADN normal (o agua) permite la production de una curva de referencia, ya que la cantidad de ADN tumoral (en pg) es conocida. La utilizacion de la curva de mejor ajuste aplicada a las referencias permite entonces la interpolation de la cantidad de ADN tumoral presente en el volumen de plasma/suero conocido. En la experiencia de los inventores, la PCR en tiempo real hibridada es capaz de detectar hasta 1 copia del reordenamiento diana presente en el volumen completo de plasma analizado.

Resultados

Los inventores investigaron dos pacientes con cancer de mama metastatico. Se utilizo la secuenciacion masiva paralela de extremos emparejados para identificar los reordenamientos genomicos adquiridos somaticamente a partir de los genomas de ambos canceres primarios y se disenaron los ensayos de PCR para la amplification a lo largo de multiples reordenamientos de cada genoma (vease la Figura 1 posteriormente). Los productos de la PCR se secuenciaron para identificar los puntos de ruptura con una resolution de par de bases. Despues, los inventores disenaron los ensayos PCR en tiempo real para amplificar y cuantificar la cantidad de ADN tumoral. Tras confirmar el exito del diseno de PCR en el ADN del cancer, los inventores examinaron entonces las muestras de plasma que se tomaron en la primera presentation de la enfermedad en ambos casos. El ADN se extrajo a partir de 2 ml de plasma se analizo por los ensayos en tiempo real especlficos del paciente que disenaron. La Figura 1 muestra los resultados de las reacciones pCr en tiempo real. Las curvas muestran la cantidad de fluorescencia generada por las sondas (Taqman) en tiempo real en el eje y con el numero de ciclos de PCR en el eje x. La llnea oscura horizontal aproximadamente en la mitad de cada grafico de la figura 1 marca el nivel de fluorescencia en el que se considera que la reaction alcanza la positividad, de manera que cuanto antes (mas a la izquierda) la curva cruce el umbral, mayor es la cantidad de ADN diana en la reaccion. Las curvas derivadas del ADN plasmatico de individuos normales (el control negativo de la reaccion) y las curvas que muestran las diluciones en serie de 10 veces del plasma del paciente en agua se identifican por flechas separadas en la Figura 1. El grafico de la izquierda de cada paciente muestra los resultados de los reordenamientos especlficos del tumor. Claramente, las muestras de plasma del paciente son positivas, mientras que el plasma de control negativo (de un individuo normal) es completamente negativo. El grafico de la derecha para cada paciente muestra el resultado de una region normal del genoma (control positivo) que, como se esperaba, es positivo tanto en pacientes como en el control normal.

Figura 1: Detection cuantitativa de reordenamientos genomicos en el ADN plasmatico de pacientes con cancer de mama: se identificaron los reordenamientos genomicos adquiridos somaticamente se identificaron en los canceres de mama primarios dedos pacientes con enfermedad metastatica por secuenciacion masiva paralela. El ADN extraldo de 2 ml de plasma tomados en el momento del diagnostico, y las diluciones en serie de 10 veces se exploraron por PCR hibridada con una ronda final de PCR en tiempo real. La deteccion robusta de los reordenamientos (1 mostrados y 2 otros no mostrados de cada paciente) era posible en ambos pacientes. La comparacion de reacciones especlficas del tumor y de control en las series de dilucion sugieren que en cada paciente la relation de ADN especlfico del tumor respecto al ADN total en el plasma es de 1:10, la cantidad total del ADN plasmatico extraldo era ~ 100 x mayor para el paciente PD3722a que para el PD3770a.

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Los resultados muestran que estos reordenamientos somaticos pueden detectarse cuantitativamente en el ADN plasmatico. En particular, se pueden demostrar las siguientes caracteristicas clave del ensayo a partir de los analisis:

• El ensayo es altamente sensible, ya que los analisis eran positivos incluso con una dilucion del plasma (1:10 de dilucion para el primer paciente, y 1:1000 para el segundo paciente, equivalente a la deteccion de una senal en el ADN a partir de solo 2 pl de plasma, aunque el volumen de partida era de 2 ml).

• El ensayo es altamente especifico, ya que el ADN de plasma normal no revelaba senal, incluso con la PCR hibridada.

• El ensayo es cuantitativo, ya que las diluciones de plasma mostraban aumentos lineales en el Ct, con una fuerte separacion entre las curvas.

Posteriormente los inventores analizaron las muestras en serie de un tercer paciente con cancer que se habia sometido a quimioterapia (Figura 2 posteriormente). Como hicieron los inventores con los dos primeros pacientes, se llevo a cabo la exploracion genomica amplia de reordenamientos utilizando secuenciacion masiva paralela para identificar los reordenamientos adquirida somaticamente. Dos de estos se seleccionaron para el diseno del ensayo. Las diluciones en serie de ADN tumoral se hicieron en ADN normal.

La Figura 2A muestra el analisis de los reordenamientos 1 y 2 en reacciones duplicadas por medio de una serie de dilucion de ADN tumoral en ADN normal. Cuando el Ct < 27, la cantidad absoluta de ADN tumoral se puede estimar a partir de la linea de mejor ajuste. Para el Ct > 27, la enfermedad solo se puede clasificar como detectable o indetectable. Sin embargo, el ensayo parece capaz de detectar una unica copia del reordenamiento presente en la reaccion. La Figura 2B muestra la cantidad estimada de ADN tumoral por ml de suero de 6 muestras recolectadas en puntos de tiempo senalados en el curso clinico del paciente.

El panel A de la Figura 2 muestra la comprobacion de los ensayos en experimentos replicados de las diluciones en serie. Los resultados demuestran que los analisis son robustos, reproducibles y cuantificables linealmente hasta aproximadamente 25 pg de ADN por reaccion. Dado que una celula humana diploide contiene ~ 6,75 pg de ADN, esto es equivalente a ~ 4 genomas por reaccion. Con cantidades menores de ADN tumoral en la reaccion (5 pg y 10 pg por reaccion), los inventores descubrieron que las reacciones son o positivas o negativas (que se muestran como puntos en la parte derecha del grafico). Esto implica que en las reacciones negativas, no estaban presentes copias de reordenamiento, mientras que en las reacciones positivas estaban presentes 1 o 2 copias. Un hallazgo principal por lo tanto es que el ensayo de PCR en tiempo real hibridada seria capaz de detectar una unica copia del reordenamiento presente en muchos mililitros de sangre.

A continuacion los inventores exploraron muestras de suero en serie del paciente recolectadas en puntos de tiempo durante su quimioterapia (Figuras 2B y 2C). Desafortunadamente, no habia disponibles muestras de antes de comenzar la terapia. Sin embargo desde el punto medio de su quimioterapia de primera linea hasta el final de la quimioterapia de la segunda linea, la enfermedad residual era detectable en el suero en los Kmites de deteccion del ensayo. Desafortunadamente ella sufrio la progresion clinico al mes o dos de completar la quimioterapia, y se asocio con un aumento en los niveles de enfermedad detectables en su suero. En el momento de programar la quimioterapia de ultimo recurso, los niveles de enfermedad aumentaron adicionalmente.

Estos analisis en serie demuestran que el ensayo es capaz de detectar la enfermedad incluso cuando esta presente en cantidades minimas clinicamente, y que la cuantificacion de la carga de enfermedad se correlaciona con la progresion de la enfermedad.

Estudios futuros

Objetivos:

Los inventores tenian la intencion de medir la significacion pronostica de los reordenamientos especificos del tumor cuantificados en el ADN plasmatico para:

1. 100 pacientes con cancer de mama no metastatico tratado en un cuadro de terapia adyuvante;

2. 100 pacientes con un estadio III o estadio II avanzado de carcinoma colorrectal.

Cancer de mama no metastatico

El cancer de mama es responsable del 16 % de muertes por cancer en mujeres en el RU. Para los pacientes sin metastasis distal conocida en el momento del diagnostico, el tratamiento en general se suministra en un intento curativo, pero las tasas de recaida varian entre un 20-40 % a los 5 anos dependiendo de la implicacion ganglionar localizada, el tamano del tumor primario y el estado del receptor de estrogenos. Sigue habiendo muchas preguntas sin respuesta respecto al uso de terapia adyuvante en este cuadro clinico, y seria de incalculable valor un metodo preciso para cuantificar la carga de enfermedad para establecer regimenes de tratamiento personalizado y optimizar la intensidad de tratamiento y la duracion.

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Cancer colorrectal de estadio III y estadio II de alto riesgo

El cancer colorrectal es responsable del 10 % de todas las muertes por cancer en el RU. Casi la mitad de los pacientes presentan una enfermedad en estadio II de alto riesgo o estadio III, y este grupo tiene una supervivencia total en 5 anos del 33 %-75 % dependiendo de la extension en el intestino local y la implicacion ganglionar. Por esta razon, los metodos para estadificar los pacientes con precision en las categorlas de riesgo basandose en la persistencia de la enfermedad tras la cirugla deberla ser particularmente util para el manejo cllnico.

Plan de investigacion

Inscripcion de pacientes y recoleccion de muestras

Los pacientes con cancer de mama en estadio temprano que se van a tratar con cirugla y terapia adyuvante se inscribiran en el ensayo. Dichas mujeres se revisaron en una cllnica oncologica pre-quirurgica, y aqul donde se abordaron, consintieron e inscribieron en el estudio. En la cirugla, se tomara la muestra de cancer de mama por la enfermera de investigacion para el laboratorio de Patologla, donde se congelo inmediatamente una parte del tumor que no se necesitaba para fines diagnosticos para la extraccion posterior de ADN. Se extraeran muestras en serie de 20 ml y se congelaran en senalizaciones importantes durante la ruta de atencion al cancer del paciente: pre- cirugla; post-cirugla (cllnica de planificacion de terapia adyuvante); final de la quimioterapia (para pacientes negativos al ER) o durante la terapia hormonal (positivos al ER); cada 6 meses durante el seguimiento; en el momento de la remision cllnica. Las muestras se recolectaran para la evaluation de las celulas tumorales circulantes por metodos inmunologicos tras la cirugla y al final de la quimioterapia. El ADN normal se extraera de los leucocitos de sangre completa.

Los pacientes con cancer colorrectal es estadio III o estadio II de alto riesgo sometidos a resection del tumor primario en un intento curativo se inscribiran en el ensayo. Dichos pacientes se manejan por un equipo multidisciplinario especlfico, que incluye cirujanos, medicos oncologos y enfermeras especialistas, para todas las fases de estadificacion/diagnostico, cirugla, terapia adyuvante y seguimiento post-tratamiento. Los pacientes consentiran y se inscribiran en el estudio en la revision pre-quirurgica. En el momento de la cirugla, la muestra de cancer colorrectal se tomara por la enfermera de investigacion para el laboratorio de Patologla, donde una parte del tumor no necesaria para fines diagnosticos se congelara inmediatamente para la extraccion posterior de ADN. Se extraeran muestras en serie de 20 ml de plasma y se congelaran en senalizaciones importantes durante la ruta de atencion del cancer del paciente; pre-cirugla; post-cirugla (cllnica de planificacion de terapia adyuvante); final de la quimioterapia; cada 6 meses durante el seguimiento; en la remision cllnica. El ADN normal se extraera de los leucocitos de la sangre completa.

Secuenciacion de extremos emparejados

En resumen, los protocolos convencionales que se han descrito anteriormente se seguiran para generar bibliotecas de fragmentos de 400-500 pb para iniciar la secuenciacion utilizando lecturas de extremos emparejados de 37 pb. Estos se utilizaran para la secuenciacion masiva paralela con el fin de generar lecturas emparejadas de 60 millones de fragmentos, lo que es suficiente segun la experiencia de los inventores para identificar > 50 % de reordenamientos genomicos somaticos presentes en la muestra. Utilizando algoritmos establecidos, los inventores priorizaran los reordenamientos para la PCR de confirmation y la secuenciacion capilar del punto de ruptura - esta etapa incluye la PCR a lo largo de la muestra de ADN normal del paciente para probar que el reordenamiento esta adquirido somaticamente.

Cuantificacion de reordenamientos especfficos de un tumor en el ADN plasmatico

Inicialmente, se tomaran 4 reordenamientos adquiridos somaticamente directamente para el diseno del ensayo. Estos se escogeran basandose en:

• Presencia en la mayorla de celulas tumorales - esto se estima mejor tomando los reordenamientos que demarcan cambios integrales en el numero de copias (permitiendo la contamination celular normal).

• Unico ADN presente en el punto de ruptura - la ausencia de repeticiones en los amplicones de PCR mejorara la especificidad del ensayo.

• Implicacion de genes cancerosos, si es posible - por ejemplo, las eliminaciones de CDKN2A o el primer reordenamiento en la amplification ERBB2 es mas probable que esten presentes en todas las celulas, incluyendo las que en ultimo termino recaen.

Los ensayos se basaran inicialmente en una primera ronda de 20 ciclos de PCR con cebadores disenados para amplificar un producto no mayor de 200 pb (debido al pequeno tamano de los fragmentos de ADN tumoral circulante), seguido por una segunda ronda hibridada de PCR en tiempo real con una sonda Taqman. Las series de dilution de ADN tumoral y los amplicones de control se utilizaran para estimar la fraction relativa de ADN plasmatico que deriva de las celulas tumorales, as! como la cantidad total (vease la figura para los ejemplos). Los inventores han descubierto que esta estrategia da una cuantificacion lineal precisa, reproducible.

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El ADN se extrajo en lotes de las muestras de plasma congeladas utilizando los protocolos establecidos y se analizan en lotes con las referencias cuantitativas descritas anteriormente. La amplificacion de regiones normales de control del genoma se utilizara para estimar la cantidad total de ADN desnudo que esta presente en el plasma. Es probable que los inventores expresen la cuantificacion del ADN tumoral como una fraccion del ADN desnudo del plasma, aunque puede ser posible cuantificar el ADN tumoral circulante como una concentracion absoluta.

Correlacion con el resultado cllnico y calculos de potencia

El analisis estadlstico se enfocara en tres cuestiones: Significacion pronostica de mediciones individuales en puntos de tiempo senalizados (presentacion, post-cirugla, y terminacion de la terapia); capacidad para cuantificar la destruccion celular inducida por farmacos por evaluation de los aumentos transitorios y posterior calda del ADN plasmatico especlfico del tumor; y fiabilidad para predecir la recalda latente mediante la identification de niveles crecientes antes de que se desarrollen complicaciones, cllnicas. Los calculos de potencia muestran que por comparacion de dos grupos de 25 pacientes estadificados en una estimation ctADN, se podrla detectar una relation de riesgo de 2,2 con un 80 % de potencia (basandose en un estudio de 60 meses con una mediana de supervivencia libre de enfermedad de 30 meses en el grupo de peor pronostico). Seran posibles analisis pronosticos adicionales con el grupo de datos, tales como la correlacion de marcadores de inestabilidad genomica total con resultado y asociacion de patrones particulares del reordenamiento genomico con la supervivencia.

Declaraciones de la invencion

A Un metodo adecuado para controlar una enfermedad, comprendiendo el metodo:

a) identificar un reordenamiento genomico adquirido somaticamente asociada con un estado de enfermedad en un paciente, en el que la identificacion se lleva a cabo por analisis genomico amplio del acido nucleico del paciente, y

b) controlar los cambios en los niveles de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico y/o cuantificando los niveles de acido nucleico que contiene el reordenamiento, como un marcador de la progresion o gravedad de una enfermedad en ese paciente.

B Un metodo de acuerdo con la declaration A en el que la enfermedad es un cancer.

C Un metodo de acuerdo con la declaracion B en el que la enfermedad es un tumor solido.

D Un metodo de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores en el que el analisis de acido nucleico en (a) se lleva a cabo en tejido tumoral de biopsia o resecado quirurgicamente.

E Un metodo de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores en el que el analisis genomico amplio se lleva a cabo por secuenciacion del ADN.

F Un metodo de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores en el que el analisis genomico amplio es un metodo de secuenciacion masivo paralelo.

G Un metodo de acuerdo con la declaracion E o la declaracion F en el que la secuenciacion se lleva a cabo utilizando secuenciacion de extremos emparejados.

H Un metodo de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores en el que la etapa de control de (b) es un ensayo de PCR.

I Un metodo de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores en el que la etapa de control de (b) se lleva a cabo en el acido nucleico de un fluido corporal.

J Un metodo de acuerdo con la declaracion A que comprende adicionalmente la etapa de tratar el paciente cuando sea necesario, o parar el tratamiento cuando sea necesario, como se indique por el nivel o cambio del nivel de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico.

K Un metodo de acuerdo con la declaracion A que comprende adicionalmente la etapa de determinar un regimen de tratamiento para tratar un paciente basandose en el nivel o cambio en los niveles de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico.

L El uso de un reordenamiento genomico especlfico del paciente como un biomarcador de la progresion de la enfermedad en ese paciente.

M El uso de un procedimiento de control de acuerdo con la declaracion A en la evaluacion de la eficacia de un farmaco u otro tratamiento terapeutico.

N El uso de un procedimiento de control de acuerdo con la declaration M en la evaluation de la eficacia de la resection quirurgica de tejido canceroso.

O Un metodo para controlar una enfermedad, comprendiendo el metodo el control de los cambios en los niveles 5 de acido nucleico que contiene un reordenamiento genomico, y/o cuantificar los niveles de acido nucleico que contienen un reordenamiento genomico, en el que el reordenamiento genomico es una mutation adquirida somaticamente asociada con una progresion o gravedad de la enfermedad de un paciente, y en el que la identification del reordenamiento se ha llevado a cabo por analisis genomico amplio del acido nucleico del paciente.

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P Un metodo de acuerdo con la declaracion A u O en el que el control de cambios en los niveles del acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico, y/o la cuantificacion de los niveles de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico, se llevan a cabo en una muestra de un paciente en remision.

15 Q Un metodo o uso de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores en el que se controlan multiples reordenamientos genomicos adquiridos somaticamente.

R Un metodo de tratamiento medico, comprendiendo el metodo tratar con un tratamiento adecuado, o cambiar el tratamiento, o parar el tratamiento de un paciente en el que se ha identificado un cambio en el nivel de acido 20 nucleico que contiene un reordenamiento genomico identificado de acuerdo con las declaraciones A u O.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para controlar un cancer de mama, comprendiendo el metodo:

   controlar los cambios en los niveles de acido nucleico que contiene un reordenamiento genomico y/o cuantificar los niveles de acido nucleico que contiene un reordenamiento genomico, en donde el reordenamiento genomico es una mutacion adquirida somaticamente asociada a la progresion o la gravedad del cancer de mama en un paciente, y en donde la identificacion del reordenamiento se ha llevado a cabo por analisis genomico amplio del acido nucleico de ese paciente o se lleva a cabo por analisis genomico amplio del acido nucleico de ese paciente, y en donde dicho control es un ensayo de PCR hibridada que se lleva a cabo en el acido nucleico de un fluido corporal, en donde dicho fluido corporal es sangre, suero o plasma.
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el analisis de acido nucleico se lleva a cabo en un tejido tumoral de biopsia o resecado quirurgicamente.
3. 3. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior en el que el analisis genomico amplio se lleva a cabo por secuenciacion de ADN.
4. 4. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior en el que el analisis genomico amplio es un metodo de secuenciacion masiva paralela.
5. 5. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4 en el que la secuenciacion se lleva a cabo utilizando secuenciacion de extremos emparejados.
6. 6. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 que comprende adicionalmente la etapa de tratar al paciente cuando sea necesario, o parar el tratamiento del paciente cuando sea necesario, segun lo indique el nivel o el cambio de nivel de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico.
7. 7. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 que comprende adicionalmente la etapa de determinar un regimen de tratamiento para tratar a un paciente basandose en el nivel o el cambio en los niveles de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico.
8. 8. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el control del cancer de mama se controla en cuanto a la progresion del cancer de mama.
9. 9. El uso in vitro de un metodo de control de acuerdo con la reivindicacion 1 en la evaluacion de la eficacia de un farmaco u otro tratamiento terapeutico, tal como en la evaluacion de la eficacia de la reseccion quirurgica del tejido canceroso.
10. 10. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el control de los cambios del acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico, y/o la cuantificacion de los niveles de acido nucleico que contiene el reordenamiento genomico, se llevan a cabo en una muestra de un paciente en remision.
11. 11. Un metodo o un uso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior en el que se controlan los reordenamientos genomicos adquiridos somaticamente.