KR101764321B1 - 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 진단 키트 - Google Patents

중증열성혈소판감소증후군 바이러스 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 진단 키트에 관한 것으로서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함함으로써, 검체 내의 SFTS 바이러스 존재 여부를 높은 민감도로 검출할 수 있는 SFTS 바이러스 진단 키트에 관한 것이다.

Description

중증열성혈소판감소증후군 바이러스 진단 키트 {Kits for diagnosing SFTS virus}
본 발명은 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 진단 키트에 관한 것이다.
중증열성혈소판감소증후군 (Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)는 고열, 구토, 설사, 혈소판감소, 백혈구감소 및 다발성 장기부전과 같은 증상을 동반하며, 치사율이 6-30%에 이르는 심각한 질환이다 (Yu XJ et al., N. Engl. J. Med. 2011; 364:1523-32; Ding F et al Clin Infect Dis 2013; 56: 1682-3). SFTS를 일으키는 바이러스는 Bunyaviridae 과 Phlebovirus 속에 속하는 RNA 바이러스에 의해 야기되며, 2011년에 중국에서 최초로 보고되었다 (Yu XJ et al. ibid).
SFTS 바이러스는 작은소참진드기(Haemaphysalis longicornis)를 매개체로 하는 것으로, 상기 진드기는 한국에도 널리 퍼져 있는 것으로 알려져 있다 (Chae JS et al. J Vet Sci 2008; 9: 285-93; Kim CM et al. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 5766-76).
SFTS 바이러스의 혈청전환 및 바이러스혈증이 염소, 양, 소, 돼지 및 개와 같은 사육동물에서 발견되었으며, 이러한 동물도 SFTS 바이러스가 퍼진 지역에서 중간 매개체로 작용하는 것으로 생각된다 (Zhao L et al. Emerg Infect Dis 2013; 18: 963-5; Niu G et al. Emerg Infect Dis 2013; 19: 756-63).
SFTS 바이러스의 매개체인 작은소참진드기 및 야생동물들은 전국에 퍼져 서식하고 있으며, 등산 및 둘레길 걷기 등의 야외 활동이 점점 증가함에 따라 SFTS 바이러스 감염의 위험성도 높아지고 있다. 이에 따라, 야생에 존재하는 작은소참진드기 및 동물들의 SFTS 바이러스 보유 여부 및 빈도를 확인하기 위한 진단 방법의 개발이 필요하며, 특히 많은 수의 검체를 빠른 시간 내에 진단할 수 있는 진단 키트의 개발이 절실한 실정이다.
공개특허공보 제2015-0042419호 (2015.4.21)
본 발명은 검체의 SFTS 감염 여부를 진단하기 위한 키트 및 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함하는 SFTS 바이러스 진단 키트.
2. 위 1에 있어서, 상기 키트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프로브를 더 포함하는 것인, SFTS 바이러스 진단 키트.
3. 위 2에 있어서, 상기 프로브는 5’말단은 형광물질로 표지되고 3’말단은 소광체로 표지된 것인, SFTS 바이러스 진단 키트.
4. 위 1에 있어서, 상기 프라이머 세트는 진드기, 곤충 또는 인간을 제외한 동물로부터 얻은 검체에 SFTS 바이러스가 포함되어 있는지 여부를 검출하는 것인, SFTS 바이러스 진단 키트.
5. 위 1에 있어서, 상기 SFTS 바이러스는 Bunyaviridae 과 Phlebovirus 속에 속하는 것인, SFTS 바이러스 진단 키트.
6. 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍을 포함하는 SFTS 바이러스 진단 키트용 프라이머 세트.
7. 위 6에 있어서, 상기 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 더 포함하는, SFTS 바이러스 진단 키트용 프라이머 세트.
8. 검체로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하는 단계 및 상기 cDNA와 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트의 존재 하에서 증폭하는 단계를 포함하는 SFTS 바이러스의 진단 방법.
9. 위 8에 있어서, 상기 검체는 진드기, 곤충 또는 인간을 제외한 동물로부터 얻은 것인, SFTS 바이러스의 진단 방법.
10. 위 8에 있어서, 상기 증폭 중 방출되는 형광신호를 실시간으로 검출하는 단계를 더 포함하는, SFTS 바이러스의 진단 방법.
11. 위 8에 있어서, 상기 프라이머 세트와 함께 서열번호 5 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프로브를 사용하는, SFTS 바이러스의 진단 방법.
12. 위 11에 있어서, 상기 프로브는 5’말단은 형광물질로 표지되고 3’말단은 소광체로 표지된 것인, SFTS 바이러스의 진단 방법.
13. 위 8에 있어서, 상기 SFTS 바이러스는 Bunyaviridae 과 Phlebovirus 속에 속하는 것인, SFTS 바이러스의 진단 방법.
본 발명의 진단 키트 및 진단 방법은 검체의 SFTS 바이러스 감염 여부를 진단하기에 적합하다.
본 발명의 진단 키트 및 진단 방법은 검체의 SFTS 바이러스 감염 여부를 높은 민감도로 진단할 수 있다.
본 발명의 진단 키트 및 진단 방법은 검체의 SFTS 바이러스 감염 여부를 높은 정확도로 진단할 수 있다.
본 발명의 진단 키트 및 진단 방법은 검체의 SFTS 바이러스 감염 여부를 빠른 속도로 진단할 수 있다.
도 1은 본 발명의 SFTS 진단 키트에 사용된 프라이머의 SFTS 바이러스 S 유전자 인식 부위를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 SFTS 진단 키트에 의한 Singleplex one step real time RT-PCR 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 SFTS 진단 키트에 의한 2-plex one step real time RT-PCR 결과를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는 SFTS 바이러스 진단 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서의 SFTS 바이러스는 Bunyaviridae 과 Phlebovirus 속에 속하는 RNA 바이러스일 수 있다. 예컨대, 분야바이러스 (Bunyavirus)에 속하는 SFTS 바이러스 HB29 스트레인 및 그와 유사한 변종을 포함할 수 있다. 본 발명에서의 검체는 SFTS 바이러스 전파 매개체의 역할을 할 수 있는 진드기, 곤충 및 동물을 포함할 수 있다. 일 실시예에 따르면 진드기는 작은소참진드기 (Haemaphysalis longicornis)일 수 있다. 일 실시예에 따르면 동물은 멧돼지, 고라니, 사슴, 너구리, 고양이 및 개 등의 야생동물일 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)에 사용될 수 있다. 본 발명에서의 중합효소연쇄반응은 일반적인 중합효소연쇄반응 및 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)을 포함한다.
일 실시예에 따르면, 검체에서 추출한 RNA에 SFTS 바이러스가 존재할 경우, SFTS 바이러스 특이적 프라이머와 역전사효소(reverse transcriptase)의 작용을 통한 역전사(reverse transcription) 반응으로 cDNA를 합성할 수 있다. 합성된 cDNA를 주형(template)으로 하여, SFTS 바이러스와 DNA 중합효소 및 SFTS 바이러스 특이적 프라이머의 작용으로, 중합효소연쇄반응을 통하여 SFTS 바이러스 cDNA의 적어도 일 부분을 증폭할 수 있다. 증폭된 DNA의 존재를 확인하여 SFTS 바이러스의 존재를 확인할 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 SFTS 바이러스의 S 유전자 서열의 적어도 일 부분에 상보적인 프라이머쌍을 적어도 하나 포함한다. 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍이 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다. 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머쌍은 SFTS 바이러스의 S 유전자에 상보적인 서열을 갖는다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 키트는 위의 프라이머 이외에도, 중합효소연쇄반응을 위한 cDNA 템플릿 (template), 중합효소 및 버퍼 등의 반응 시약을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 SFTS 바이러스 특이적인 서열을 포함하는 프로브 (probe)를 추가적으로 포함할 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면 서열번호 5 및 서열번호 6의 프로브가 사용될 수 있다. 서열번호 5의 프로브는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍과 함께 사용될 수 있으며, 서열번호 6의 프로브는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍과 함께 사용될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 각각의 프로브의 5’말단에는 형광물질이 결합되고 3’말단에는 소광체 (quencher)가 결합될 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 각각의 프로브의 5’말단에는 적색 파장을 방출하는 형광물질이 결합되고 3’말단에는 블랙홀 소광체(black hole quencher, BHQ)가 결합될 수 있다.
형광물질과 소광체가 프로브에 결합되어 있는 상태에서는 소광체가 형광물질이 방출하는 빛을 흡수하기 때문에 형광 신호가 검출되지 않는다. 반면, DNA의 합성 및 신장 과정에서 DNA 중합효소의 exonuclease activity에 의해 결합되어 있던 형광물질이 분리되면 형광신호를 검출할 수 있다. 중합효소연쇄반응이 진행되는 동안, 이러한 형광신호를 실시간으로 측정할 수 있으며, 증가한 형광신호를 바탕으로 바이러스 존재 유무를 판별할 수 있다. 이러한 프로브의 사용은 실시간 중합효소연쇄반응에 유용하게 사용될 수 있다.
검체 내에 SFTS 바이러스가 존재하지 않는 경우에는 유전자 증폭이 일어나지 않아 형광이 발생하지 않는데, 중합효소연쇄반응 자체에 문제가 있어서 형광이 발생하지 않는 경우와 구분하기 위하여 인터널 컨트롤 (internal positive control, IPC)을 사용할 수 있다. IPC는 검체 내에 존재하지 않는 외부 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머쌍 및 프로브를 이용하며, IPC의 증폭을 통해 실시간 중합효소연쇄반응 과정의 유효성을 확인할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 역전사 반응은 45℃ 내지 55℃의 온도에서 20분 내지 40분간 수행될 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면 본 발명의 역전사 반응은 50℃의 온도에서 30분간 수행될 수 있다.
역전사 반응이 완료된 후에는, 역전사 반응의 반응물을 90℃ 내지 99℃의 온도에서 5분 내지 20분간 가열하여 역전사 효소를 불활성화(inactivation) 시킬 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 역전사 반응의 반응물을 95℃의 온도에서 10분간 가열하여 역전사 효소를 불활성화 시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응은 90℃ 내지 99℃에서 5 내지 20초간 가열하여 변성한 후 55℃ 내지 65℃에서 30초 내지 100초간 가열하여 신장하는 단계를 35 내지 55 싸이클 반복하여 수행될 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응은 95℃에서 10초간 가열하여 변성한 후 60℃에서 60초간 가열하여 신장하는 단계를 45 싸이클 반복하여 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 예시한 것들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 중증열성혈소판감소증후군 ( SFTS ) 바이러스의 one step real time RT- PCR 진단 키트 시험 분석
SFTS 바이러스의 S 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브와 internal positive control (IPC)로 구성된 2-plex type one step real time RT-PCR 진단 키트를 개발하여, 야생동물에서 분리된 진드기를 검체로 하여 임상시료 분석을 수행하였다.
본 발명의 진단 키트는 역전사 반응 (reverse transcription)과 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR) 반응의 두 단계(2-step)에 의한 것으로, 소량으로 존재하는 핵산을 특이적으로 증폭시키는 one step real time RT-PCR 원리 이용하고, 증폭 시 배출되는 형광신호의 크기를 기준으로 바이러스를 검출하였다.
1st step: 역전사 (Reverse transcription): 검체에서 추출한 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 검체에 SFTS 바이러스가 존재할 경우, 특이적인 프라이머가 바이러스 유전체 상에 결합하고, 역전사효소(reverse transcriptase)의 작용으로 cDNA가 합성된다.
2nd step: 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 (real-time PCR): 합성된 cDNA를 주형(template)으로 하여, SFTS 바이러스와 DNA 중합효소 및 SFTS 바이러스 S 유전자에 상보적인 프라이머의 작용으로, 중합효소연쇄반응을 통하여 SFTS 바이러스 cDNA의 S 유전자를 증폭하였다. 각각의 프로브의 5’말단에는 적색 파장을 방출하는 형광물질 (TexasRed)이 결합되어 있고 3’말단에는 블랙홀 소광체(black hole quencher, BHQ)가 결합되어 있어서, 형광물질과 소광체가 프로브에 결합되어 있는 상태에서는 소광체가 형광물질이 방출하는 빛을 흡수하기 때문에 형광 신호가 검출되지 않고 DNA의 합성 및 신장 과정에서 DNA 중합효소의 exonuclease activity에 의해 결합되어 있던 형광물질이 분리되면 형광신호를 검출할 수 있다. 증가한 형광신호를 PCR cycle 동안 실시간으로 측정하여, 이를 바탕으로 바이러스 유무를 판단하였다.
검체 내에 SFTS 바이러스가 존재하지 않는 경우에는 유전자 증폭이 일어나지 않아 형광이 발생하지 않는데, 중합효소연쇄반응 자체에 문제가 있어서 형광이 발생하지 않는 경우와 구분하기 위하여 인터널 컨트롤 (internal positive control, IPC)을 사용하였다. IPC는 검체 내에 존재하지 않는 외부 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머쌍 및 프로브를 이용하였으며, IPC의 증폭을 통해 실시간 중합효소연쇄반응 과정의 유효성을 확인하였다.
본 발명의 진단 키트의 특이성, 민감도 및 재현도를 검증하기 위한 실험을 진행하였으며, 진드기 검체에 대하여 실험을 진행하였다. 패널 구성은 SFTS 바이러스의 S 유전자 특이적인 프라이머/프로브와 IPC를 포함한 2-plex 형태로 구성하였다.
SFTS 진단 키트의 Detection Mix 에 사용된 형광물질을 아래 표 1에 정리하였다.
SFTS Detection Mix에 사용된 형광물질
검사항목 형광물질
S segment Texas Red
IPC (internal positive control) Cy5
SFTS 진단 키트의 반응 혼합물 20 ㎕ 중의 시약 조성을 아래 표 2에 정리하였다.
SFTS 반응 혼합물의 시약 조성
조성 1 Reaction 당 용량
Detection Mix qRT-PCR 프리믹스 5 ㎕
SFTS 프라이머/프로브 믹스 10 ㎕
Sample SFTS 검체 5 ㎕
전체 부피 20 ㎕
SFTS 진단 키트의 반응조건을 아래 표 3에 정리하였다.
반응조건
구분 온도 시간 사이클 수
Reverse-transcription 50℃ 30분 1
Inactivation/
Pre-denature		 95℃ 10분 1
실시간 PCR 95℃ 10초 45
60℃ 60초
SFTS 진단 키트의 분석적 민감도를 아래 표 4에 정리하였다.
분석적 민감도
Viral RNA LOD
SFTS　(S segment) 102 copies/reaction
SFTS 진단 결과 분석 시 음성 및 양성 판정기준을 아래 표 5에 정리하였다.
음양성 판정기준
Detection Mix TxR Cy5 결과해석
SFTS
Detection Mix		 >40 <35 음성
>40 ≥35 재검
≤40 - SFTS　바이러스 양성
>40 - SFTS　바이러스 양성
SFTS Detection Mix : FAM: SFTS RNA 형광, Cy5: IPC DNA 형광
본 발명의 SFTS 바이러스 진단 키트의 제작을 위하여, SFTS 바이러스의 S 유전자의 nucleoprotein 부분에 대해 2종(NIER_S1, NIER_S2)의 프라이머 및 프로브를 새롭게 제작하였고, 우리나라에서 분리된 바이러스에서 추출한 RNA를 대상으로 conventional RT-PCR을 이용해 primer 적합도를 확인하였다. SFTS 진단 키트에 사용된 프라이머를 표 6과 도 1에 정리하였다. NIER-S1과 NIER-S2는 본 발명자들이 고안한 프라이머쌍이며, Reference (China)는 본 발명의 프라이머쌍의 효능을 평가하기 위한 비교 대상으로 사용된 프라이머쌍이다.
SFTSV 프라이머/프로브 정보
Sequence (5'-3') Dye
Reference (China) Forward GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAA
Reverse TGCCTTCACCAAGACTATCAATGT
Probe TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC TexasRed
NIER-S1 Forward
(서열번호 1)		 GCTGAAGGAGACAGGTGGAG
Reverse
(서열번호 2)		 CCTGATGCCTTGACGATCTT
Probe
(서열번호 5)		 ATCATTGTCTTTGCCCTGAC TexasRed
NIER-S2　 Forward
(서열번호 3)		 CAGGATTGCAGTGGAGTTTG
Reverse
(서열번호 4)		 GCAGGATCAAGGCCTTCATAG
Probe
(서열번호 6)		 CAGCAGCTCAATTTGACTGA TexasRed
SFTS 바이러스 배양액에서 추출한 RNA를 대상으로 singleplex one step real time RT-PCR을 수행한 결과, Reference (China)의 Cycle threshold (CT)는 20.40이었고, NIER-S1의 Cycle threshold (CT)는 13.59, NIER-S2의 Cycle threshold (CT)는 13.57로서, 본 발명자들이 고안한 NIER-S1 및 NIER-S2가 높은 민감도를 보이는 것을 확인하였다. Singleplex one step real time RT-PCR 결과를 도 2에 정리하였다.
SFTS 바이러스의 S 분절 유전자의 nucleoprotein 부분을 삽입한 plasmid DNA (양성대조물질) 및 Internal positive control(IPC) 유전자 부분을 삽입한 plasmid DNA를 대상으로 2-plex one step real time RT-PCR을 수행한 결과, Reference (China)의 Cycle threshold (CT)는 27.83이었고, NIER-S1의 Cycle threshold (CT)는 22.52, NIER-S2의 Cycle threshold (CT)는 21.31로서, 본 발명자들이 고안한 NIER-S1 및 NIER-S2가 높은 민감도를 보이는 것을 확인하였다. 2-plex one step real time RT-PCR 결과를 도 3에 정리하였다.
SFTS 바이러스의 S 분절 유전자의 nucleoprotein 부분을 삽입한 plasmid DNA (양성대조물질)에 대해 10분의 1 희석배수를 이용하여 농도별 분석능을 검증한 결과, NIER-S2에서 가장 높은 민감도를 보이는 것으로 확인되었다. 양성대조물질에 대한 분석적 검출한계능 결과를 아래 표 7, 표 8 및 표 9에 정리하였다.
양성대조물질에 대한 NIER-S1의 분석적 검출한계능
NIER-S1
Conc. (copies) SFTS (TxR) AVE IPC (Cy5) AVE
1000 31.35 31.20 30.95 31.17 25.34 25.42 25.43 25.40
100 35.58 34.57 35.99 35.38 25.48 25.46 25.54 25.49
10 - - - 25.36 25.41 25.36 25.38
5 - - - 25.41 25.47 24.90 25.26
1 - - - 25.42 25.41 25.36 25.40
NTC - 　 　 　 25.21 　 　 　
IC pDNA 1X10^5 copies
양성대조물질에 대한 NIER-S2의 분석적 검출한계능
　NIER-S2
Conc. (copies) SFTS (TxR) AVE IPC (Cy5) AVE
1000 31.57 31.62 31.01 31.40 25.56 25.63 25.50 25.56
100 34.61 34.43 34.78 34.61 25.48 25.47 25.49 25.48
10 38.20 37.79 37.95 37.98 25.37 25.31 25.43 25.37
5 37.34 38.81 38.29 38.15 25.40 25.44 25.46 25.43
1 - 41.46 - 41.46 25.33 25.40 25.46 25.40
NTC - 　 　 　 25.23 　 　 　
IC pDNA 1X10^5 copies
양성대조물질에 대한 Reference (China)의 분석적 검출한계능
Reference (China)
Conc. (copies) SFTS (TxR) AVE IPC (Cy5) AVE
1000 38.53 38.55 38.36 38.48 25.62 25.56 25.27 25.48
100 41.49 40.79 41.91 41.40 25.50 25.42 25.20 25.38
10 - - - 25.39 25.30 25.27 25.32
5 - - - 25.45 25.43 25.34 25.41
1 - - - 25.49 25.44 25.31 25.41
NTC - 　 　 　 25.43 　 　 　
IC pDNA 1X10^5 copies
가장 높은 민감도를 보인 NIER-S2에 대해서, 분석적 검출한계에 대한 3반복 검증 실험을 수행하였으며, NIER-S2 프라이머/프로브가 가장 높은 민감도 (10 copies/reaction)와 증폭값을 나타내어 NIER-S2 프라이머/프로브를 본 발명의 SFTSV 분석 키트 (SFTS multiplex one step real time RT-PCR Kit)에 적용하였다. 분석적 검출한계에 대한 3반복 검증 실험 결과를 아래 표 10에 정리하였다.
양성대조물질에 대한 NIER-S2의 분석적 검출한계능 3반복 검증
NIER-S2
Conc. (copies) SFTS (TxR) AVE IPC (Cy5) AVE
1000 31.56 31.51 31.49 31.52 28.86 28.80 28.74 28.80
100 34.79 34.82 34.88 34.83 28.85 28.96 28.80 28.87
10 38.90 38.43 37.66 38.33 28.77 28.81 28.97 28.85
5 - 38.26 39.44 38.85 28.98 28.83 28.74 28.85
2.5 - 41.98 39.09 40.54 28.79 28.95 28.80 28.85
1 - - 40.74 40.74 28.85 28.93 28.87 28.88
NTC - 　 　 　 29.12 　 　 　
IC pDNA 1X10^4 copies
Reference (China)
Conc. (copies) SFTS (TXR) AVE IPC (Cy5) AVE
1000 38.19 38.53 38.29 38.34 28.97 28.92 28.86 28.91
100 41.25 41.38 41.23 41.29 28.85 28.87 28.96 28.90
10 43.41 - - 43.41 28.99 28.84 28.82 28.88
5 - - - 28.67 28.81 28.80 28.76
2.5 - - - 28.88 28.76 28.66 28.77
1 - - - 28.77 28.92 28.82 28.84
NTC - 　 　 　 28.77 　 　 　
IC pDNA 1X10^4 copies
진드기 검체 시료에 대해 본 발명의 SFTS 바이러스 진단 키트 (SFTS multiplex one step real time RT-PCR Kit)를 사용하여, 임상시료에 대한 효능 검증을 실시하였다. 임상시료에 대한 SFTS 바이러스 진단 키트의 효능 검증 결과를 아래 표 11에 정리하였다.
임상시료에 대한 SFTS 바이러스 진단 키트 효능 검증 결과
NIER-001 NIER-002 NIER-003 NIER-004 NIER-005 NIER-006
음성 음성 음성 음성 양성 음성
NIER-007 NIER-008 NIER-009 NIER-010 NIER-011 NIER-012
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-013 NIER-014 NIER-015 NIER-016 NIER-017 NIER-018
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-019 NIER-020 NIER-021 NIER-022 NIER-023 NIER-024
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-025 NIER-026 NIER-027 NIER-028 NIER-029 NIER-030
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-031 NIER-032 NIER-033 NIER-034 NIER-035 NIER-036
음성 음성 음성 음성 양성 음성
NIER-037 NIER-038 NIER-039 NIER-040 NIER-041 NIER-042
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-043 NIER-044 NIER-045 NIER-046 NIER-047 NIER-048
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-049 NIER-050 NIER-051 NIER-052 NIER-053 NIER-054
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-055 NIER-056 NIER-057 NIER-058 NIER-059 NIER-060
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-061 NIER-062 NIER-063 NIER-064 NIER-065 NIER-066
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-067 NIER-068 NIER-069 NIER-070 NIER-071 NIER-072
양성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-073 NIER-074 NIER-075 NIER-076 NIER-077 NIER-078
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-079 NIER-080 NIER-081 NIER-082 NIER-083 NIER-084
음성 음성 음성 음성 양성 음성
NIER-085 NIER-086 NIER-087 NIER-088 NIER-089 NIER-090
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-091 NIER-092 NIER-093 NIER-094 NIER-095 NIER-096
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-097 NIER-098 NIER-099 NIER-100 NIER-101 NIER-102
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-103 NIER-104 NIER-105 NIER-106 NIER-107 NIER-108
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-109 NIER-110 NIER-111 NIER-112 NIER-113 NIER-114
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-115 NIER-116 NIER-117 NIER-118 NIER-119 NIER-120
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-121 NIER-122 NIER-123 NIER-124 NIER-125 NIER-126
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-127 NIER-128 NIER-129 NIER-130 NIER-131 NIER-132
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-133 NIER-134 NIER-135 NIER-136 NIER-137 NIER-138
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-139 NIER-140 NIER-141 NIER-142 NIER-143 NIER-144
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-145 NIER-146 NIER-147 NIER-148 NIER-149 NIER-150
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-151 NIER-152 NIER-153 NIER-154 NIER-155 NIER-156
음성 음성 음성 음성 음성 양성
NIER-157 NIER-158 NIER-159 NIER-160 NIER-161 NIER-162
음성 음성 음성 음성 양성 음성
NIER-163 NIER-164 NIER-165 NIER-166 NIER-167 NIER-168
음성 음성 음성 음성 양성 음성
NIER-169 NIER-170 NIER-171 NIER-172 NIER-173 NIER-174
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-175 NIER-176 NIER-177 NIER-178 NIER-179 NIER-180
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-181 NIER-182 NIER-183 NIER-184 NIER-185 NIER-186
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-187 NIER-188 NIER-189 NIER-190 NIER-191 NIER-192
음성 음성 음성 음성 음성 음성
NIER-193 NIER-194 NIER-195 NIER-196 NIER-197 NIER-198
음성 양성 음성 음성 음성 음성
NIER-199 NIER-200
음성 음성
<110> National Institute of Environmental Research <120> Kits for diagnosing SFTS virus <130> 15P12032 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NIER-S1 Forward <400> 1 gctgaaggag acaggtggag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NIER-S1 Reverse <400> 2 cctgatgcct tgacgatctt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NIER-S2 Forward <400> 3 caggattgca gtggagtttg 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NIER-S2 Reverse <400> 4 gcaggatcaa ggccttcata g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NIER-S1 Probe <400> 5 atcattgtct ttgccctgac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NIER-S2 Probe <400> 6 cagcagctca atttgactga 20

Claims (13)

  1. 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 SFTS 바이러스 진단 키트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 키트는 서열번호 6의 프로브를 더 포함하는 것인, SFTS 바이러스 진단 키트.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 프로브는 5’말단은 형광물질로 표지되고 3’말단은 소광체로 표지된 것인, SFTS 바이러스 진단 키트.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 진드기, 곤충 또는 인간을 제외한 동물로부터 얻은 검체에 SFTS 바이러스가 포함되어 있는지 여부를 검출하는 것인, SFTS 바이러스 진단 키트.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 SFTS 바이러스는 Bunyaviridae 과 Phlebovirus 속에 속하는 것인, SFTS 바이러스 진단 키트.
  6. 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍을 포함하는 SFTS 바이러스 진단 키트용 프라이머 세트.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 더 포함하는, SFTS 바이러스 진단 키트용 프라이머 세트.
  8. 검체로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하는 단계; 및
    상기 cDNA와 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트의 존재 하에서 증폭하는 단계;
    를 포함하는 SFTS 바이러스의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 검체는 진드기, 곤충 또는 인간을 제외한 동물로부터 얻은 것인, SFTS 바이러스의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 증폭 중 방출되는 형광신호를 실시간으로 검출하는 단계를 더 포함하는, SFTS 바이러스의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 프라이머 세트와 함께 서열번호 6의 프로브를 사용하는, SFTS 바이러스의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 프로브는 5’말단은 형광물질로 표지되고 3’말단은 소광체로 표지된 것인, SFTS 바이러스의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  13. 청구항 8에 있어서, 상기 SFTS 바이러스는 Bunyaviridae 과 Phlebovirus 속에 속하는 것인, SFTS 바이러스의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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