KR20100082966A - 무잎끝황화바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도 - Google Patents

무잎끝황화바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 45로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 RYEV 진단용 프라이머 조합, 상기 프라이머 조합을 포함하는 RYEV 진단용 키트, 및 상기 프라이머 조합을 이용하여 RYEV를 종 특이적으로 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 피시알 검사 시스템은 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장 및 임상진단에서 식물체로부터 RYEV의 검사에 이용할 수 있을 것이다.
진단법, 무잎끝황화바이러스, RT-PCR, 무, Nested PCR, 양성대조구, 진단시스템, 식물검역

Description

무잎끝황화바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도{Primer combination for diagnosing Radish yellow edge virus and uses thereof}
본 발명은 무에 발생하는 무잎끝황화바이러스(Radish yellow edge virus, RYEV)를 진단하기 위한 피시알(PCR) 검사시스템에 관한 것이다. 피시알 검사시스템은 RYEV 진단용 최적 프라이머쌍 및 이에 부합하는 검정용 프라이머쌍(nested primer)과 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이 프라이머 은행 및 양성대조구를 포함하고 있다.
바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법(ELISA)을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA 방법은 가장 일반적으로 사용하여온 진단 방법이나 피시알 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다.
현재 RNA 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법을 가장 일반적으로 사용하고 있다. 병원체의 피시알 진단을 위해서는 종 특이 프라이머의 개발이 가장 중요하다. RYEV를 진단하기 위한 특이 프라이머는 특허 출원된 바 없다.
RYEV는 자연상태에서 무에 발생하고 있으며, 즙액에 의해서 전염되지 않으며, 알려진 매개충도 없다. RYEV의 전염은 종자를 통해서만 이루어지는 것으로 알려져 있다. RYEV는 검역대상 병원체로서 수입되는 무로부터 이를 검출할 수 있는 진단법을 필요로 한다. 지금까지 RYEV를 진단하기 위하여 ELISA 방법, dsRNA 분석, 전자현미경 분석 등을 사용한다. ELISA 방법은 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단하는 경우가 종종 있다. 또한 검사할 종자에서 RYEV의 감염율이 낮을 경우 ELISA 진단법으로는 검사에 실패할 가능성이 높다. 그리하여 이런 종자에서 바이러스를 검출하기 위해서는 일반적으로 ELISA 진단법보다 검출감도가 1000배 정도 높은 피시알 진단법이 필요하다. 또한 dsRNA 분석과 전자현미경 검경은 식물체로부터 직접적인 RYEV의 검출에 사용하기는 분석절차의 복잡함과 많은 분석 소요시간 등의 이유로 사용하기 어렵다. 검역현장에서는 하나의 검사시료에 대하여 다양한 병원체의 진단을 수행하여야 됨으로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사비용이 소요된다. 그래서 각각의 병원체에 대하여 동일한 검사법의 개발이 필요하다. 피시알 검사법으로 진단할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비하여 병원체별 진단용 프라이머 은행의 구축과 피시알 양성 및 음성 반응을 검정할 수 있는 시스템을 필요로 한다. 한편, 분리주 특이적 프라이머를 진단에 사용할 경우 검사에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, RYEV 종(species) 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통(strain) 또는 분리주(isolate)들이 존재한다. 그리하여 분리주 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경우는 진단에 실패할 위험이 있다. 다시 말해서 바이러스 진단용 프라이머는 바이러스 각각에 대하여 종 특이적으로 작동하여야 한다. 본 발명에서의 프라이머는 종 특이적으로 작동하도록 설계하였다. 즉, 종 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색하였다. 그리고 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발하였다. 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하였다. 설계한 프라이머들은 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 검출력이 우수한 조합을 최종적으로 선발하였다. 그리고 최종 선발된 프라이머 조합에 대하여 검정용 프라이머(nested primer)를 함께 개발하였다. 또한 RYEV에 대한 다양한 진단용 프라이머 조합을 확보하여 피시알 양성반응 및 음성반응을 검정할 수 있는 프라이머 은행을 구축하였다. 그리고 RYEV의 프라이머 설계 영역을 클로닝한 플라스미드를 제조하여 양성대조구를 확보하였으며, 염기서열을 결정하여 양성반응을 확인할 수 있게 하였다. 아울러 피시알 반응조건을 모든 바이 러스 및 프라이머 조합에서 동일하게 개발하여 검역현장에서 검사효율을 높일 수 있게 하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 45로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 RYEV 진단용 프라이머 조합을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 조합을 포함하는 RYEV 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 조합을 이용하여 RYEV를 종 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 무잎끝황화바이러스(RYEV) 피시알 검사 시스템은 식물체 종자와 조직 등으로부터 RYEV를 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상 검출한계를 가지고 진단할 수 있다. 피시알 검사 시스템에 포함된 RYEV 진단용 프라이머는 지금까지 알려진 RYEV 모든 계통들과 반응할 수 있게 개발되었으며, 또한 양성 및 음성 반응의 검증을 위한 도구를 포함하고 있다. 본 발명의 검사 시스템은 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장에서 RYEV의 검사에 이용할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 45로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 RYEV 진단용 프라이머 조합을 제공한다.
본 발명의 RYEV 진단용 프라이머 조합에서, 정방향 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되고, 역방향 프라이머는 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 44 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 다만, 본 발명의 프라이머 조합에서, 정방향 프라이머는 역방향 프라이머보다는 5'쪽에 위치해야 한다.
본 발명의 RYEV 진단용 프라이머 조합은 바람직하게는 서열번호 1 및 20의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 8); 서열번호 2 및 20의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 9); 서열번호 1 및 18의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 17); 서열번호 3 및 18의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 19); 서열번호 4 및 18의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 20); 서열번호 2 및 17의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 23); 서열번호 3 및 17의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 24); 서열번호 1 및 16의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 27); 서열번호 3 및 16의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 29); 서열번호 2 및 15의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 34); 서열번호 3 및 15의 프라이머 조합(dsRNA 1 에 대한 프라이머 조합 35); 서열번호 28 및 31의 프라이머 조합(dsRNA 2에 대한 프라이머 조합 22); 서열번호 28 및 30의 프라이머 조합(dsRNA 2에 대한 프라이머 조합 26); 서열번호 29 및 30의 프라이머 조합(dsRNA 2에 대한 프라이머 조합 27); 서열번호 39 및 45의 프라이머 조합(dsRNA 6에 대한 프라이머 조합 13); 서열번호 38 및 44의 프라이머 조합(dsRNA 6에 대한 프라이머 조합 15); 및 서열번호 40 및 44의 프라이머 조합(dsRNA 6에 대한 프라이머 조합 17)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 RYEV 진단용 프라이머 조합은 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및 18의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 17); 서열번호 28 및 30의 프라이머 조합(dsRNA 2에 대한 프라이머 조합 26); 및 서열번호 38 및 44의 프라이머 조합(dsRNA 6에 대한 프라이머 조합 15)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1 및 18의 프라이머 조합(dsRNA 1에 대한 프라이머 조합 17); 서열번호 28 및 30의 프라이머 조합(dsRNA 2에 대한 프라이머 조합 26); 및 서열번호 38 및 44의 프라이머 조합(dsRNA 6에 대한 프라이머 조합 15)을 포함할 수 있다. 3개의 프라이머 조합을 동시에 이용하면 RYEV를 더욱 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명의 RYEV 진단용 프라이머 조합은 또한 서열번호 2 및 20의 프라이머 조합; 서열번호 29 및 31의 프라이머 조합; 및 서열번호 40 및 45의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 RYEV dsRNA 1에 대한 진단용 프라이머 조합 17의 RT-PCR 산물에 대한 검증기능 을 가진 프라이머 RYEV1-C60/N20 조합, RYEV dsRNA 2에 대한 진단용 프라이머 조합 26의 RT-PCR 산물에 대한 검증기능을 가진 프라이머 RYEV2-C20/N70 조합, 그리고 RYEV dsRNA 6에 대한 진단용 프라이머 조합 15의 RT-PCR 산물에 대한 검증기능을 가진 프라이머 RYEV6-C30/N50 조합을 추가로 포함할 수 있다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 RYEV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 RYEV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성반응을 나타낼 것이다 (도 10, 11, 12 참고).
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 45의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(25개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머(25개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가 닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 조합; 및 서열번호 49, 서열번호 50 및 서열번호 51의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 DNA 단편을 포함하는, RYEV 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 RT-PCR 에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 키트에 포함되는 서열번호 49, 서열번호 50 및 서열번호 51의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 DNA 단편은 RYEV 진단용 프라이머 조합을 이용한 RT-PCR 또는 PCR 반응에 대한 양성대조구의 기능을 가진 플라스미드로서 이용될 수 있다 (도 13, 15, 17 참고). 즉, 서열번호 49의 염기서열로 이루어진 DNA 단편은 양성대조구에 삽입된 RYEV dsRNA1 염기서열이며, 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 DNA 단편은 양성대조구에 삽입된 RYEV dsRNA2 염기서열이며, 서열번호 51의 염기서열로 이루어진 DNA 단편은 양성대조구에 삽입된 RYEV dsRNA6 염기서열이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
무 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, RYEV를 종 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.
무 시료에서 전체 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 조합을 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출 하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: RYEV 진단용 프라이머의 설계 및 조합
Radish yellow edge disease는 두 가지 바이러스(Raphanus sativus cryptic virus 1과 Raphanus sativus cryptic virus 2)와 관련되어 있다. 여기서는 Radish yellow edge virus(RYEV)로 기록되어온 Raphanus sativus cryptic virus 1을 진단대상으로 한다. RYEV는 두 가닥 RNA의 단편들로 구성되어 있으며, 입자는 직경 30nm의 구형 바이러스이다. 분류학적으로 파티티비리대(Partitiviridae)의 알파크립토바이러스(Alphacryptovirus) 속에 포함된다. RYEV는 즙액으로 전염되지 않으며, 매개충도 확인되지 않았다. 그러나 종자를 통해서는 매우 효과적으로 전염된다. 자연상태에서 RYEV는 무에서 발생하고 있다. 진단용 프라이머의 설계는 염기서열이 알려진 dsRNA 1, dsRNA 2, dsRNA 6을 사용하여 이루어졌다. RYEV 특이적 프라이머 설계에 사용된 염기서열은 표 1과 같으며, 이들로부터 선발된 프라이머 합성후보 염기서열은 RYEV와 분류학적으로 유사한 알파크립토바이러스 2종의 염기서열(표 2)과 비교하여 종 특이적인 서열을 탐색하였다. 이들 중에서 프라이머로서의 조건을 충족시키는 진단용 프라이머를 dsRNA 1에서 22개(표 3), dsRNA 2에서 13개(표 4), dsRNA 6에서 13개(표 5)를 설계하였다. 설계한 프라이머의 위치는 도 1(dsRNA 1), 도 2(dsRNA 2), 도 3(dsRNA 6)에 각각 나타내었다. 이들 프라이머를 이용하여 총 111개의 프라이머 조합, 즉 dsRNA 1 60개 조합(표 6), dsRNA 2 27개 조합(표 7), dsRNA 6 24개 조합(표 8)을 만들었다.
표 1. 공통 염기서열 분석에 사용한 RYEV 분리주 염기서열
분리주 또는 계통 Genbank accession no. 크기(bp) 분석 게놈
RYEV-dsRNA1 AY949985 1866 dsRNA1
RYEV-dsRNA1 AY748911 1866 dsRNA1
RYEV-dsRNA2 DQ181926 1791 dsRNA2
RYEV-dsRNA6 DQ181927 1778 dsRNA6
표 2. 종 특이적 염기서열 분석에 이용한 알파크립토바이러스 바이러스 염기서열
바이러스 Genbank accession no. 크기(bp) 분석 게놈
White clover cryptic virus1 RNA1 AY705784 1955 RNA-1
White clover cryptic virus1 RNA2 AY705785 1708 RNA-2
Vicia cryptic virus RNA1 AY751737 2012 RNA-1
Vicia cryptic virus RNA2 AY751738 1779 RNA-2
표 3. RYEV-RNA1 종 공통 염기서열로부터 설계된 진단용 프라이머
프 라 이 머 서 열 서열번호 길이 위치a
정방향 RYEV1-N10 GCTGATGAAGACACCGCTGAACAAT 1 25 254-278
RYEV1-N20 CTGCTCCTATTCACCCTGTCCATTT 2 25 372-396
RYEV1-N30 GTTCACGCACGACCCTTTACTCA 3 23 448-470
RYE-N20 GCGCGACCCGTAACTCTGC 4 19 590-608
RYEV1-N40 AACACCGCTGCTATGGAACTATGAA 5 25 757-781
RYEV1-N50 ACTAACCCTCAGAGACTCCAAAATC 6 25 983-1,007
RYEV1-N60 TTTTCGGAATCCTCAAGCACATAC 7 24 1,224-1,247
RYEV1-N70 AATTCACGGTGCCCAAGTTCTCAG 8 24 1,348-1,371
RYE-N40 CCAAGCGGGATTCAAACCAACT 9 22 1,395-1,416
RYE-N50 CCAAAAATTCGCCCGATCTGTAACC 10 25 1,511-1,535
역방향 RYE-C10 GGTCGCGAGGCCAGTAGAGTGCT 11 23 1,705-1,727
RYEV1-C10 CTTCTTTTGGATTTGCGGTGTAGTC 12 25 1,668-1,692
RYEV1-C20 GATCGGGCGAATTTTTGGGTCTC 13 23 1,506-1,528
RYE-C30 GCGGCGTCGTGCTTCGGTAGAG 14 22 1,282-1,303
RYEV1-C30 TTTCGAAATGGGTATGTGCTTGAG 15 24 1,235-1,258
RYEV1-C40 AGTGCTTCTAGGGTGGTGACAAC 16 23 1,148-1,170
RYE-C40 CTTTGCCGGTCGTGGTAGTA 17 20 1,048-1,067
RYEV1-C50 TTTGGAGTCTCTGAGGGTTAGTTCG 18 25 980-1,004
RYE-C50 TAGTTCGGCATGTGGGGTAAGTCC 19 24 963-986
RYEV1-C60 CAGAAGCTTTGCCATTGTTGATAGA 20 25 819-843
RYEV1-C70 CATAGTTCCATAGCAGCGGTGTTTC 21 25 755-779
RYEV1-C80 ACACGGTTCTGATCTTTGGAGGTTC 22 25 653-677
a 위치는 Genbank accession no. AY949985를 기준으로 작성되었음.
표 4. RYEV-RNA2 종 공통 염기서열로부터 설계된 진단용 프라이머
프 라 이 머 서 열 서열번호 길이 위치a
정방향 RYEV2-N10 CTGCCCCTGACCTAGAGACTGCT 23 23 304-326
RYEV2-N20 CCAACTTCACTTCCGCCTTCTACTA 24 25 394-418
RYEV2-N30 ACTGGACAAACAACTGCTCTGGATG 25 25 457-481
RYEV2-N40 GCCCAACTCTGAACTATCCCATCTC 26 25 566-590
RYEV2-N50 TAGTTCGACACCTCCCTCACATACC 27 25 775-799
RYEV2-N60 AAGCCCGCTCTCAACTACAAAGGTC 28 25 1,006-1,030
RYEV2-N70 TTTACCGGCTGGCTCAATGGAC 29 22 1,246-1,267
역방향 RYEV2-C10 CTACTCCGGTCACATCTTCGTCATC 30 25 1,627-1,651
RYEV2-C20 TAAGGGCGGATACAGCTGGATAGAC 31 25 1,524-1,548
RYEV2-C30 CGGGGTTGGGATTGGGGTAGTAGTA 32 25 1,329-1,353
RYEV2-C40 CATAGCGGCGAGGGGACTGAAC 33 22 1,115-1,136
RYEV2-C50 ACAAATGTGGCCAAAAAGTTCTGAT 34 25 899-923
RYEV2-C60 TTGAAGAGGACGAAAGGCAGTGAT 35 24 666-689
a 위치는 Genbank accession no. DQ181926을 기준으로 작성되었음.
표 5. RYEV-RNA6 종 공통 염기서열로부터 설계된 진단용 프라이머
프 라 이 머 서 열 서열번호 길이 위치a
정방향 RYEV6-N10 CACCCCAAACTTTTCCACCTCTTAT 36 25 379-403
RYEV6-N20 GCTGGCCTTCTTGAACCTAACTCTG 37 25 542-566
RYEV6-N30 GCAACGGCGCTACTGAAGACTC 38 22 834-855
RYEV6-N40 AAACTTGCTTCTGCTCGCCTCTC 39 23 992-1,014
RYEV6-N50 CACCGATGTCTCTGATAACTGGA 40 23 1,051-1,073
RYEV6-N60 GCCACTACAATATGCGCCACAATG 41 24 1,311-1,334
RYEV6-N70 AGGCCACCACTTCTGTTCACGA 42 22 1,350-1,371
역방향 RYEV6-C10 GACGAAACAAAAGAACCGCAAAATA 43 25 1,662-1,686
RYEV6-C20 ATTCGATCCGGGTTTCAGAGTG 44 22 1,547-1,568
RYEV6-C30 ATTGATGTTGTACGTGAGGGCTGAG 45 25 1,393-1,417
RYEV6-C40 TCGGGAGGAGTGAAGATGTTTGTG 46 24 1,228-1,251
RYEV6-C50 GTCGGATCGTTCTGAAAAGCCTAAA 47 25 1,081-1,105
RYEV6-C60 AAATGTTAATGTTCGGGAGGTGAGA 48 25 770-794
a 위치는 Genbank accession no. DQ181927을 기준으로 작성되었음.
표 6. RYEV 진단용 프라이머 조합과 RT-PCR 예상 산물(RNA1)
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
1 RYEV1-C80 653-677 RYEV1-N10 254-278 424
2 RYEV1-N20 372-396 306
3 RYEV1-N30 448-470 230
4 RYEV1-C70 755-779 RYEV1-N10 254-278 526
5 RYEV1-N20 372-396 408
6 RYEV1-N30 448-470 332
7 RYE-N20 590-608 190
8 RYEV1-C60 819-843 RYEV1-N10 254-278 590
9 RYEV1-N20 372-396 472
10 RYEV1-N30 448-470 396
11 RYE-N20 590-608 254
12 RYE-C50 963-986 RYEV1-N10 254-278 733
13 RYEV1-N20 372-396 615
14 RYEV1-N30 448-470 539
15 RYE-N20 590-608 397
16 RYEV1-N40 757-781 230
17 RYEV1-C50 980-1,004 RYEV1-N10 254-278 751
18 RYEV1-N20 372-396 633
19 RYEV1-N30 448-470 557
20 RYE-N20 590-608 415
21 RYEV1-N40 757-781 248
22 RYE-C40 1,048-1,067 RYEV1-N10 254-278 814
23 RYEV1-N20 372-396 696
24 RYEV1-N30 448-470 620
25 RYE-N20 590-608 478
26 RYEV1-N40 757-781 311
(계속)
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
27 RYEV1-C40 1,148-1,170 RYEV1-N10 254-278 917
28 RYEV1-N20 372-396 799
29 RYEV1-N30 448-470 723
30 RYE-N20 590-608 581
31 RYEV1-N40 757-781 414
32 RYEV1-N50 983-1,007 188
33 RYEV1-C30 1,235-1,258 RYEV1-N10 254-278 1,005
34 RYEV1-N20 372-396 887
35 RYEV1-N30 448-470 811
36 RYE-N20 590-608 669
37 RYEV1-N40 757-781 502
38 RYEV1-N50 983-1,007 276
39 RYE-C30 1,282-1,303 RYEV1-N20 372-396 932
40 RYEV1-N30 448-470 856
41 RYE-N20 590-608 714
42 RYEV1-N40 757-781 547
43 RYEV1-N50 983-1,007 321
44 RYEV1-C20 1,506-1,528 RYE-N20 590-608 939
45 RYEV1-N40 757-781 772
46 RYEV1-N50 983-1,007 546
47 RYEV1-N60 1,224-1,247 305
48 RYEV1-N70 1,348-1,371 181
49 RYEV1-C10 1,668-1,692 RYEV1-N40 757-781 936
50 RYEV1-N50 983-1,007 710
51 RYEV1-N60 1,224-1,247 469
52 RYEV1-N70 1,348-1,371 345
53 RYE-N40 1,395-1,416 298
54 RYE-N50 1,511-1,535 182
55 RYE-C10 1,705-1,727 RYEV1-N40 757-781 971
56 RYEV1-N50 983-1,007 745
57 RYEV1-N60 1,224-1,247 504
58 RYEV1-N70 1,348-1,371 380
59 RYE-N40 1,395-1,416 333
60 RYE-N50 1,511-1,535 217
a 위치는 Genbank accession no. AY949985를 기준으로 작성되었음.
표 7. RYEV 진단용 프라이머 조합과 RT-PCR 예상 산물(RNA2)
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
1 RYEV2-C60 666-689 RYEV2-N10 304-326 386
2 RYEV2-N20 394-418 296
3 RYEV2-N30 457-481 233
4 RYEV2-C50 899-923 RYEV2-N10 304-326 620
5 RYEV2-N20 394-418 530
6 RYEV2-N30 457-481 467
7 RYEV2-N40 566-590 358
8 RYEV2-C40 1,115-1,136 RYEV2-N10 304-326 833
9 RYEV2-N20 394-418 743
10 RYEV2-N30 457-481 680
11 RYEV2-N40 566-590 571
12 RYEV2-N50 775-799 362
13 RYEV2-C30 1,329-1,353 RYEV2-N10 304-326 1,050
14 RYEV2-N20 394-418 960
15 RYEV2-N30 457-481 897
16 RYEV2-N40 566-590 788
17 RYEV2-N50 775-799 579
18 RYEV2-N60 1,006-1,030 348
19 RYEV2-C20 1,524-1,548 RYEV2-N30 457-481 1,092
20 RYEV2-N40 566-590 983
21 RYEV2-N50 775-799 774
22 RYEV2-N60 1,006-1,030 543
23 RYEV2-N70 1,246-1,267 303
24 RYEV2-C10 1,627-1,651 RYEV2-N40 566-590 1,086
25 RYEV2-N50 775-799 877
26 RYEV2-N60 1,006-1,030 646
27 RYEV2-N70 1,246-1,267 406
a 위치는 Genbank accession no. DQ181926을 기준으로 작성되었음.
표 8. RYEV 진단용 프라이머 조합과 RT-PCR 예상 산물(RNA6)
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
1 RYEV6-C60 770-794 RYEV6-N10 379-403 416
2 RYEV6-N20 542-566 253
3 RYEV6-C50 1,081-1,105 RYEV6-N10 379-403 727
4 RYEV6-N20 542-566 564
5 RYEV6-N30 834-855 272
6 RYEV6-C40 1,228-1,251 RYEV6-N10 379-403 873
7 RYEV6-N20 542-566 710
8 RYEV6-N30 834-855 418
9 RYEV6-N40 992-1,014 260
10 RYEV6-N50 1,051-1,073 201
11 RYEV6-C30 1,393-1,417 RYEV6-N20 542-566 876
12 RYEV6-N30 834-855 584
13 RYEV6-N40 992-1,014 426
14 RYEV6-N50 1,051-1,073 367
15 RYEV6-C20 1,547-1,568 RYEV6-N30 834-855 735
16 RYEV6-N40 992-1,014 577
17 RYEV6-N50 1,051-1,073 518
18 RYEV6-N60 1,311-1,334 258
19 RYEV6-N70 1,350-1,371 219
20 RYEV6-C10 1,662-1,686 RYEV6-N30 834-855 853
21 RYEV6-N40 992-1,014 695
22 RYEV6-N50 1,051-1,073 636
23 RYEV6-N60 1,311-1,334 376
24 RYEV6-N70 1,350-1,371 337
a 위치는 Genbank accession no. DQ181927을 기준으로 작성되었음.
실시예 2: RYEV 진단용 프라이머 은행 구축 및 최적 프라이머 조합의 선발
설계한 RYEV 프라이머들은 dsRNA 1, dsRNA 2, dsRNA 6에 대하여 각각 60, 27, 24가지로 조합하여(표 6, 7, 8), RYEV 및 여러 가지 관련 바이러스와의 RT-PCR 검정을 통하여 진단에 가장 효과적인 프라이머 조합을 선발하였다. 최적 진단용 프라이머 조합의 선발은 2가지 단계로 이루어졌다. 첫 번째는 RYEV 감염식물체와의 RT-PCR을 통한 선발이며, 두 번째는 RYEV의 자연기주인 십자화과 식물에 감염되는 바이러스와의 RT-PCR 분석을 통한 선발이다.
본 발명에서 사용한 전체 RNA 분리 및 RT-PCR 방법은 다음과 같다.
전체 RNA 분리: 상업적으로 시판되는 total RNA 분리 키트(페놀을 이용한 방법(Promega), TRIzol(Invitrogen Co.), easy-spin TM Total RNA Kit(iNtRON Co.)를 이용하여 분리하였다.
RT-PCR: 역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5 ㎕, 12.5 pmole 다운스트림 프라이머(downstream primer), 5배 역전사 완충액(250 mM Tris-HCl, 150 mM KCl, 40 mM MgCl2, 5 mM DTT, pH 8.5) 1 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, 10 U RNase inhibitor, 그리고 2 U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5 ㎕를 42℃에서 1 시간 항온 처리하여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사반응액 5 ㎕에 12.5 pmole 업스트림프라이머(upstream primer), 1.25 U Taq DNA polymerase, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 8.3) 2 ㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25 ㎕로 만들었다. 이 반응액을 95℃ 45 초, 55℃ 60 초, 72℃ 60 초로 40 회 증폭시켰으며 마지막에는 72℃에서 7 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5X TBE 완충액과 1.5 % 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 확인하였다.
RYEV 감염식물체와의 RT-PCR 검정에서 dsRNA 1, dsRNA 2, dsRNA 6에 대한 프라이머 조합 60, 27, 24가지 프라이머 조합 거의 모두에서 RYEV 특이적 반응을 확 인할 수 있었다(도 4, 5, 6). 이들 중에서 반응강도가 뛰어나고 진단에 장해가 되는 비특이적 반응을 보이지 않는 프라이머 조합을 dsRNA 1에서 31개 조합(도 4), dsRNA 2에서 3개 조합(도 5), dsRNA 6에서 9개 조합(도 6)를 선발하였다.
위에서 선발된 프라이머 조합은 십자화과 식물과 관련된 6가지 바이러스와의 RT-PCR 분석으로 dsRNA 1에서 11가지 조합(조합 8, 9, 17, 19, 20, 23, 24, 27, 29, 34, 35), dsRNA 2에서 3가지 조합(조합 22, 26, 27), dsRNA 6에서 3가지 조합(조합 13, 15, 17)을 최종적으로 선발하였다. 기주 관련 바이러스와의 비특이적 반응 분석에 이용된 6가지 바이러스는 다음과 같다: Cherry leaf roll virus (CLRV), Cucumber mosaic virus (CMV), Ribgrass mosaic virus (RMV), Tobacco rattle virus (TRV), Turnip mosaic virus (TuMV), Turnip yellow mosaic virus (TYMV).
이러한 결과들을 바탕으로 하여 종자 또는 식물체로부터 RYEV를 진단할 경우, dsRNA 1, dsRNA 2, dsRNA 6 각각에서 최종 선발된 진단용 프라이머를 사용하여 위에서 선발된 우선적으로 RT-PCR를 수행한다. 또한 이 진단 결과가 미흡할 경우 RYEV 진단용 프라이머 은행의 다른 프라이머의 조합을 이용하여 검증이 가능할 것이다.
실시예 3: RYEV의 진단 및 검증의 예
검사현장에서 RYEV 진단용 최적 프라이머로 dsRNA 1에 대해서는 조합 17, dsRNA 2에 대해서는 조합 조합 26, dsRNA 6에 대해서는 조합 15를 사용하여 각각 진단할 수 있다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 추가적인 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 RYEV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 RYEV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성반응을 각각 나타낸다(도 10, 11, 12). 부가적으로 이러한 본 발명의 RYEV 프라이머 은행으로부터 유래된 PCR 산물을 쉽게 확인할 수 있도록 프라이머가 설계된 전체 영역을 포함하는 양성대조구를 제조하였다. 이 양성대조구는 PCR 검사시 양성대조구로 이용가능하며(도 13, 15, 17), 또한 확인이 필요한 PCR 산물의 염기서열을 쉽게 비교할 수 있도록 양성대조구 플라스미드의 삽입된 영역의 염기서열을 결정하여 dsRNA의 종류에 따라 각각 제공하였다(도 14, 16, 18).
본 발명의 진단법을 실시할 경우 무 종자 또는 식물체로부터 RYEV 감염여부를 정밀하게 진단할 수 있다. 또한 식물 바이러스에 대한 RT-PCR 진단키트의 산업화가 가능하다. 본 발명을 실시함으로써 국내 십자화과 작물에서 RYEV의 피해를 최소화할 수 있을 것이며, 국경 검역현장에서 손쉽게 활용할 수 있어 외국으로부터 RYEV에 감염된 무 종자의 유입을 효과적으로 차단할 수 있을 것이다.
도 1은 RYEV-RNA1 프라이머 위치를 나타낸다. 위치는 Genbank accession no. AY949985을 기준으로 작성되었다.
도 2는 RYEV-RNA2 프라이머 위치를 나타낸다. 위치는 Genbank accession no. DQ181926을 기준으로 작성되었다.
도 3은 RYEV-RNA6 프라이머 위치를 나타낸다. 위치는 Genbank accession no. DQ181927을 기준으로 작성되었다.
도 4는 60가지 프라이머 조합의 RYEV-RNA1과의 특이성 검정 결과이다. RT-PCR 주형으로 RYEV에 감염된 무 잎 조직으로부터 추출된 전체 RNA를 사용하였으며, 1-60 프라이머 조합은 표 6을 참조한다.
도 5는 27가지 프라이머 조합의 RYEV-RNA2과의 특이성 검정 결과이다. RT-PCR 주형으로 RYEV에 감염된 무 잎 조직으로부터 추출된 전체 RNA를 사용하였으며, 1-27 프라이머 조합은 표 7을 참조한다.
도 6은 24가지 프라이머 조합의 RYEV-RNA6과의 특이성 검정 결과이다. RT-PCR 주형으로 RYEV에 감염된 무 잎 조직으로부터 추출된 전체 RNA를 사용하였으며, 1-24 프라이머 조합은 표 8을 참조한다.
도 7은 선발된 RYEV-RNA1 진단용 프라이머 조합과 기주 관련 바이러스의 RT-PCR 분석 결과이다. 1:RYEV, 2:CLRV, 3:CMV, 4:RMV, 5:TRV, 6:TuMV, 7:TYMV.
도 8은 선발된 RYEV-RNA2 진단용 프라이머 조합과 기주 관련 바이러스의 RT-PCR 분석 결과이다. 1:RYEV, 2:CLRV, 3:CMV, 4:RMV, 5:TRV, 6:TuMV, 7:TYMV.
도 9는 선발된 RYEV-RNA6 진단용 프라이머 조합과 기주 관련 바이러스의 RT-PCR 분석 결과이다. 1:RYEV, 2:CLRV, 3:CMV, 4:RMV, 5:TRV, 6:TuMV, 7:TYMV.
도 10은 RYEV-RNA1 진단용 최적 프라이머 조합 및 검정용 프라이머 조합의 (RT)PCR 분석 결과이다.
M : size marker
1 : 최적 진단용 프라이머 조합 17 (751bp)
2 : 조합 17에 대한 검정용 프라이머 조합 (RYE1-C60/N20) (472bp)
도 11은 RYEV-RNA2 진단용 최적 프라이머 조합 및 검정용 프라이머 조합의 (RT)PCR 분석 결과이다.
M : size marker
1 : 최적 진단용 프라이머 조합 26 (646bp)
2 : 조합 26에 대한 검정용 프라이머 조합 (RYE2-C20/N70) (303bp)
도 12는 RYEV-RNA6 진단용 최적 프라이머 조합 및 검정용 프라이머 조합의 (RT)PCR 분석 결과이다.
M : size marker
1 : 최적 진단용 프라이머 조합 15 (735bp)
2 : 조합 15에 대한 검정용 프라이머 조합 (RYE6-C30/N50) (367bp)
도 13은 RYEV-RNA1 양성대조구로부터 유래한 진단용 프라이머 조합의 PCR 산물이다.
M : size marker
1 : 양성대조구에 삽입된 RYEV DNA 단편(1,436bp)
2 : RYE1-C50 /N10 (751bp)
도 14는 양성대조구에 삽입된 RYEV dsRNA1 염기서열(1,436bp)을 나타낸다.
도 15는 RYEV-RNA2 양성대조구로부터 유래한 진단용 프라이머 조합의 PCR 산물이다.
M : size marker
1 : 양성대조구에 삽입된 RYEV DNA 단편(646bp)
도 16은 양성대조구에 삽입된 RYEV dsRNA2 염기서열(646bp)을 나타낸다.
도 17은 RYEV-RNA6 양성대조구로부터 유래한 진단용 프라이머 조합의 PCR 산물이다.
M : size marker
1 : 양성대조구에 삽입된 RYEV DNA 단편(1,307bp)
2 : RYE6-C20 /N30 (735bp)
도 18은 양성대조구에 삽입된 RYEV dsRNA6 염기서열(1,307bp)을 나타낸다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer combination for diagnosing Radish yellow edge virus and uses thereof <130> PN08259 <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-N10 primer <400> 1 gctgatgaag acaccgctga acaat 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-N20 primer <400> 2 ctgctcctat tcaccctgtc cattt 25 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-N30 primer <400> 3 gttcacgcac gaccctttac tca 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYE-N20 primer <400> 4 gcgcgacccg taactctgc 19 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-N40 primer <400> 5 aacaccgctg ctatggaact atgaa 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-N50 primer <400> 6 actaaccctc agagactcca aaatc 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-N60 primer <400> 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<211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-C40 primer <400> 16 agtgcttcta gggtggtgac aac 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYE-C40 primer <400> 17 ctttgccggt cgtggtagta 20 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-C50 primer <400> 18 tttggagtct ctgagggtta gttcg 25 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYE-C50 primer <400> 19 tagttcggca tgtggggtaa gtcc 24 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-C60 primer <400> 20 cagaagcttt gccattgttg ataga 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-C70 primer <400> 21 catagttcca tagcagcggt gtttc 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV1-C80 primer <400> 22 acacggttct gatctttgga ggttc 25 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-N10 primer <400> 23 ctgcccctga cctagagact gct 23 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-N20 primer <400> 24 ccaacttcac ttccgccttc tacta 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-N30 primer <400> 25 actggacaaa caactgctct ggatg 25 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-N40 primer <400> 26 gcccaactct gaactatccc atctc 25 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-N50 primer <400> 27 tagttcgaca cctccctcac atacc 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-N60 primer <400> 28 aagcccgctc tcaactacaa aggtc 25 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-N70 primer <400> 29 tttaccggct ggctcaatgg ac 22 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-C10 primer <400> 30 ctactccggt cacatcttcg tcatc 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-C20 primer <400> 31 taagggcgga tacagctgga tagac 25 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-C30 primer <400> 32 cggggttggg attggggtag tagta 25 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-C40 primer <400> 33 catagcggcg aggggactga ac 22 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-C50 primer <400> 34 acaaatgtgg ccaaaaagtt ctgat 25 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV2-C60 primer <400> 35 ttgaagagga cgaaaggcag tgat 24 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV6-N10 primer <400> 36 caccccaaac ttttccacct cttat 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV6-N20 primer <400> 37 gctggccttc ttgaacctaa ctctg 25 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV6-N30 primer <400> 38 gcaacggcgc tactgaagac tc 22 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV6-N40 primer <400> 39 aaacttgctt ctgctcgcct ctc 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYEV6-N50 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ggtgggcagg agcgctgtag cttggggggt ggcaattcca aaactgtcct 180 ttcagaaagt tagctctgtt agctccgtat ggtatgagat tgggatggaa ggtcatagcg 240 gagaacatgt gtgcagaaga gatatcttca atgcaggtac gagcgtcaaa gatgaggacg 300 gggttgggat tgaggtagta gtagccaggt tcggcaatga caggtggggc atcctcgtca 360 gcgggggggt ccataatagg agcggtccat tgagccagcc ggtaaataga ggatccattg 420 agctcattgc aaatcattga gccagcagcg gatccatcag cggggatgga ggagagggga 480 gctgagccat gccaatattg gcagtacttg ttcatcatag cggcgagggg actgaaccat 540 gaatcatcat tgtccaggca gaggaaggag gtccatgtat tgggcactac gtcgttgata 600 gtgagtgcct cagggaagag ggacctttgt agttgagagc gggctt 646 <210> 51 <211> 1307 <212> DNA <213> Radish yellow edge virus <400> 51 caccccaaac ttttccacct cttatcagta cctgaatttg atggatcagt caatgattag 60 cactaaacgc tggacagaca actgtctcgg ctgggctccc ccttactctc agatctacat 120 tggcattcta ggctacattc aaacaatgcg tgccatgaac gccgctggcc ttcttgaacc 180 caactctgaa atttcgagac tactcggaaa tttcatgaaa gtttttcccc tcaaaagcct 240 ttggatcccc ggtccattgg tttcattctt caagagcatt gcctgcttca agccttccgc 300 ctctgaaaaa cacggcatgg tctctcccac tctcccgacc cgccccggct ggtcaagaaa 360 tcgaagatac agaatcgtca ctgacgcttc ttctcacctc ccgaacatta acatttttat 420 ctctagattg agatccattt gtgctgctgc ctcccgcaac ggcgctactg aagactcctt 480 cctgcgagat attgacggtc cgcagtactt ggcgactctt ttcgcccaac cctgctctca 540 cacagccaat gagatagcca atctcatctc tcctggctca aacctctctt actccggaga 600 tctcagactc tggaaacttg cttctgctcg cctctctttc gtcggtccgc tcgctctcct 660 cgactctgcg gtcaccgatg tctctgataa ctggactgcc tttttaggct tttcagacga 720 tccgactggt ttggatcgat aaacgccatg atggttaaat actgccaatt ttggaaaggc 780 tccacaactc tatacgagtg ctcacccgct agctccgccg ctggctcagt ccgctgtatt 840 gcgactgaca caaacatctt cactcctccc gagtggaacg cgcaacaggg tacgcacacg 900 tccttcaccc atggagacgc caaccaagct ggccactaca atatgcgcca caatgctcac 960 ctgacttttc aggccaccac ttctgttcac gagctgccgc tcgcacatta ctactcagcc 1020 ctcacgtaca acatcaatct tgctgagtct gaagctgcta tggccgcgac ctgtcgcggt 1080 actttttgga acatattccc cgatgcctac accaggtctg gaatccagat ctatcccggc 1140 attcctgctt taatagctcg agactaccac tctgaaaccc ggatcgaatc cgagcgtcag 1200 aatgcctaat ctcccccccg ccacctctcc cggagacgtc cgatgatgta aacggagtag 1260 atacttaagt gtattccttc gttattttgc ggttcttttg tttcgtc 1307

Claims (7)

  1. 정방향 프라이머가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되고, 역방향 프라이머가 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 44 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 RYEV 진단용 프라이머 조합.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 20의 프라이머 조합; 서열번호 2 및 20의 프라이머 조합; 서열번호 1 및 18의 프라이머 조합; 서열번호 3 및 18의 프라이머 조합; 서열번호 4 및 18의 프라이머 조합; 서열번호 2 및 17의 프라이머 조합; 서열번호 3 및 17의 프라이머 조합; 서열번호 1 및 16의 프라이머 조합; 서열번호 3 및 16의 프라이머 조합; 서열번호 2 및 15의 프라이머 조합; 서열번호 3 및 15의 프라이머 조합; 서열번호 28 및 31의 프라이머 조합; 서열번호 28 및 30의 프라이머 조합; 서열번호 29 및 30의 프라이머 조합; 서열번호 39 및 45의 프라이머 조합; 서열번호 38 및 44의 프라이머 조합; 및 서열번호 40 및 44의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 RYEV 진단용 프라이머 조합.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 1 및 18의 프라이머 조합; 서열번호 28 및 30의 프라이머 조합; 및 서열번호 38 및 44의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 RYEV 진단용 프라이머 조합.
  4. 제2항에 있어서, 서열번호 2 및 20의 프라이머 조합; 서열번호 29 및 31의 프라이머 조합; 및 서열번호 40 및 45의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 RYEV 진단용 프라이머 조합.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합; 및 서열번호 49, 서열번호 50 및 서열번호 51의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 DNA 단편을 포함하는, RYEV 진단용 키트.
  6. 무 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, RYEV를 종 특이적으로 진단하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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