KR101018631B1 - 감자걀쭉바이로이드 피시알 검사 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발병은 가지과 작물에 발생하는 감자걀쭉바이로이드(PSTVd)를 진단하기 위한 피시알(PCR) 검사시스템에 관한 것이다. 지금까지 알려진 PSTVd 모든 계통들에 대하여 가장 우수한 PCR 반응강도를 보이며, 비특이적 반응 없이 진단이 가능하다. 본 발명의 피시알 검사시스템은 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장 및 임상진단에서 식물체로부터 PSTVd의 검사에 이용할 수 있을 것이다.

Description

감자걀쭉바이로이드 피시알 검사 시스템{PCR detection system for Potato spindle tuber viroid}
본 발병은 포도 등에 발생하고 있는 감자걀쭉바이로이드(Potato spindle tuber viroid, 이하, 'PSTVd'이라 한다)를 진단하기 위한 피시알(PCR) 검사시스템에 관한 것이다.
피시알 검사시스템은 PSTVd 진단용 최적 프라이머 조합과 예비용 프라이머 조합 및 양성대조구를 포함하고 있다.
PPSTVd는 접촉, 종자, 곤충 등에 의해 전염되는 바이로이드로 주로 가지과 식물에 병을 일으키며, 우리나라에서는 검역대상 병원체이다. PSTVd는 감염성 RNA로만 구성되어 있기 때문에 혈청학적 진단은 거의 불가능하다. PSTVd의 게놈은 359bp의 RNA 단편으로 환상구조를 가지고 있으며, 식물체내에서는 단단한 이차구조를 형성하기 때문에 RT-PCR 진단시 프라이머의 결합능력이 떨어진다. 이러한 이유로 PSTVd는 RT-PCR에서 반응강도가 낮고 많은 비특이적 밴드를 형성하여 진단에 어려움이 있다. 기존 특허출원된 프라이머는 PSTVd를 선상구조로 판단하여 설계되었기 때문에 다양한 프라이머의 설계와 조합을 이룰 수 없어 최적의 프라이머의 선발 이 어려웠다.
바이로이드 진단법으로 과거에는 식물체에서의 병징과 감염성 핵산의 분리 및 전자현미경 등을 사용하였으나 정밀하고 신속한 진단법으로 사용하기는 어렵다. 현재 PSTVd의 진단은 특이 프라이머를 이용한 RT-PCR을 주로 사용하고 있다. 종래기술로서 PSTVd 진단용 프라이머(한국등록특허 10-0840736)는 게놈을 선상구조로 가정하여 알려진 염기서열의 5’ 및 3’ 말단 영역에서 프라이머를 합성하여 진단에 사용하였다. 이 경우 다양한 프라이머의 설계와 프라이머 조합이 곤란하여 단단하고 복잡한 이차구조를 형성하는 PSTVd에 대하여 최적의 진단용 프라이머 조합의 선발이 불가능하였다. 또한 포스피바이로이데의 다른 바이로이드와 비교분석이 생략되어 있어 종 특이적 진단이 불가능할 수 있다. 그리고 본 발명에서의 프라이머는 논문(문헌 1, 문헌 2, 문헌 3)에서 보고된 프라이머와는 다른 서열을 가지고 있다.
[문헌 1] Boonham, N. et al. 2004. Development of a real-time RT-PCR assay for the detection of Potato spindle tuber viroid. Journal of Virological Methods 116: 139-146.
[문헌 2] Bostan, H. et al. 2004. An RT-PCR primer pair for the detection of Pospiviroid and its application in surveying ornamental plants for viroids. Journal of Virological Methods 116: 189-193.
[문헌 3] Shamloul, A. M. et al. 2002. A novel multiplex RT-PCR probe capture hybridization(RT-PCR-ELISA) for simultaneous detection of six viroids in four genera: Apscaviroid, Hostuviroid, Pelamoviroid, and Pospiviroid. Journal of Virological Methods 105: 115-121.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로, 검출한계가 높고 현재까지 알려진 모든 PSTVd 계통과 반응할 수 있으며, 양성 및 음성 반응을 모두 검정할 수 있는 감자걀쭉바이로이드(PSTVd)의 PCR 시스템을 제공한다.
본 발명은 서열번호 3과 8로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 3과 9로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 4와 8로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 4과 9로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 5와 8로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 5와 9로 표시되는 프라이머 조합;으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 감자걀쭉바이로이드 진단용 프라이머를 제공한다.
바람직하게, 서열번호 3과 9로 표시되는 프라이머 조합 및 서열번호 4와 9로 표시되는 프라이머 조합으로 이루어진 감자걀쭉바이로이드 진단용 프라이머를 제공한다.
더욱 바람직하게, 상기 서열번호 3과 9로 표시되는 프라이머 조합합의 RT-PCR 산물을 상기 서열번호 4과 9로 표시되는 프라이머 조합으로 검정하는 감자걀쭉바이로이드 진단용 프라이머를 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 바이로이드 샘플의 게놈 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 감자걀쭉바이로이드 진단방 법을 제공한다.
바람직하게, 바이로이드 샘플의 게놈 RNA을 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 RNA을 주형으로 하고, 청구항 제1항의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 상기 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 감자걀쭉바이로이드 진단방법을 제공한다.
또한, 바람직하게 상기 PT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계 후에 상기 서열번호 4와 9로 검정용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 더 포함하는 감자걀쭉바이로이드 진단방법을 제공한다.
더 바람직하게, 상기 PCR을 수행하는 단계에서 양성대조구로서 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 이용하는 감자걀쭉바이로이드 진단방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 청구항 제1항의 프라이머를 포함하는 감자걀쭉바이로이드 진단 키트를 제공한다.
바람직하게, 상기 감자걀쭉바이로이드 진단 키트는 서열번호 11로 표시되는 양성 대조구를 더 포함한다.
PSTVd 종(species) 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통(strain) 또는 분리주(isolate)들이 존재한다. 그리하여 분리주 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경우는 진단에 실패할 위험이 있다.
본 발명에서의 PSTVd 진단용 프라이머는 지금까지 알려진 PSTVd 모든 계통들 과 반응할 수 있게 개발되었으며, PSTVd를 가장 효과적으로 진단하기 위하여 이차구조 형성능력이 상대적으로 약한 염기서열 영역에서 설계하였다. PSTVd 게놈의 환상구조를 착안하여 기존 특허출원된 프라이머와는 구별되는 다양한 프라이머의 설계하고 조합을 분석하였다. 또한 분류학적으로 유사한 포스피바이로이데(Pospiviroidae)의 다른 바이로이드와의 비교분석으로 PSTVd만이 가지는 종 특이적 프라이머를 개발하였다. 아울러 검역현장에서 사용되는 PCR 반응조건과 동일성을 갖게 하여 다른 병원체와 동시진단이 가능하도록 하였으며, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우 또는 비특이적 반응을 대비하여 예비용 프라이머 조합을 추가하였다. 또한 프라이머 설계 영역을 클로닝한 플라스미드를 제조하여 양성대조구를 확보하고 염기서열을 결정하여 양성반응을 확인할 수 있게 하였다.
감자걀쭉바이로이드(PSTVd) 피시알 검사 시스템은 식물체 종자와 조직 등으로부터 PSTVd를 기존 사용된 프라이머와 비교하여 더 높은 반응강도로 비특이적 반응 없이 진단할 수 있다. 피시알 검사 시스템에 포함된 PSTVd 진단용 프라이머는 지금까지 알려진 PSTVd 모든 계통들과 반응하며 유사 바이로이드와는 반응하지 않게 개발되었다. 본 발명에서는 예비용 프라이머 조합과 양성대조구로 사용가능한 플라스미드를 공급함으로써 PCR 반응에 대한 양성 및 음성 반응의 검증할 수 있게 하였다. 본 발명의 검사 시스템은 병원체 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장에서 PSTVd의 검사에 이용할 수 있을 것이다.
본 발명의 진단법을 실시할 경우 박과 작물 종자 또는 식물체로부터 PSTVd 감염여부를 정밀하게 진단할 수 있다. 또한 식물 바이러스에 대한 RT-PCR 진단키트의 산업화가 가능하다. 본 발명을 실시함으로써 국내 박과 작물에서 PSTVd의 피해를 최소화할 수 있을 것이며, 국경 검역현장에서 손쉽게 활용할 수 있어 외국으로부터 PSTVd에 감염된 박과 식물 종자의 유입을 효과적으로 차단할 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 실시예로서 더 상세히 설명한다.
[실시예 1] PSTVd 진단용 프라이머의 설계 및 조합
PSTVd는 한가닥 RNA로 구성되며, 단백질은 가지고 있지 않다. PSTVd의 게놈은 359bp의 RNA 단편으로 환상구조를 가지고 있다. 분류학적으로 포스피바이로이데(Pospiviroidae) 포스피바이로이드(Pospiviroid) 속(genus)에 속한다. PSTVd는 주로 접촉, 종자, 곤충 등에 의해 전염된다. 자연상태에서 대부분의 기주는 감자, 토마토 등의 가지과 식물과 관련이 있다. 진단용 프라이머의 설계는 PSTVd가 환상구조라는 점과 식물체에서 단단한 이차구조를 가진다는 점(도 1)을 고려하여 게놈 전체 영역에서 이차구조 형성능력이 약한 염기서열 영역을 이용하여 이루어졌다.
PSTVd 공통염기서열 탐색은 지금까지 알려진 6가지 PSTVd 분리주의 염기서열(표 1)을 다중 비교하여 이루어졌다. 이렇게 선발된 공통염기서열은 PSTVd와 분류학적으로 유사한 포스피바이로이드(Pospiviroid) 7종의 바이로이드 염기서열(표 2)과 비교하여 종 특이적인 서열을 탐색하였다. 이러한 종 특이적 염기서열들 중에서 프라이머 조건을 충족시키며 이차구조 형성능력이 약한 영역에서 진단용 프라이 머 9가지를 설계하였다(표 3).
[표 1] 공통염기서열 분석에 사용한 PSTVd 분리주 염기서열
분리주 또는 계통 Genbank ac. no. 크기(bp)
PSTVd AJ515261 360
PSTVd AY152840 359
PSTVd-Ar21 DQ308555 364
PSTVd-Niva-95 EF044302 359
PSTVd-KF440-2 X58388 359
PSTVd-SXIII-VI-106 Y08852 359
[표 2] 종 특이적 염기서열 분석에 이용한 포스피바이로이드 염기서열
바이러스 Genbank ac. no. 크기(bp)
Chrysanthemum stunt viroid (CSVdB) X16407 354
Citrus exocortis viroid (CEVd) K00964 371
Columnea latent viroid (CLVd) X15663 370
Iresine viroid (IVd) X95734 370
Tomato apical stunt viroid (TASVd) X06390 363
Tomato planta macho viroid TPMVd) K00817 360
Mexican papita viroid (MPVd) L78460 359
[표 3] PSTVd 종 공통 염기서열로부터 설계된 진단용 프라이머
서열 서열번호 길이 위치*
정방향 PSTVd-N10 CGCAGTTGGTTCCTCGGAACTAA 1 23 346-9
PSTVd-N15 TGACCTCCTGAGCAGAAAAGAAAA 2 24 35-58
PSTVd-N20 AAAAGGACGGTGGGGAGTGC 3 20 120-139
PSTVd-N30 TTCCTCGCGCCCGCAGGA 4 18 205-222
PSTVd-N40 GACCACCCCTCGCCCCCTTT 5 20 221-240
PSTVd-N50 TGCTTCGGGGCGAGGGTGTTTA 6 22 313-334
역방향 PSTVd-C10 GGTGGTCCTGCGGGCGC 7 17 211-227
PSTVd-C20 GAATTACTCCTGTCGGCCGCT 8 21 142-162
PSTVd-C30 TGAACCACAGGAACCACGAGTTTA 9 24 7-30
PSTVd-C40 CGAGTTTAGTTCCGAGGAACCAACT 10 25 349-14
위치*: Genbank ac. no. Y08852을 기준으로 작성.
설계한 프라이머의 위치는 도 2와 같다. 이들 프라이머를 이용하여 20가지의 프라이머 조합을 만들었으며, RT-PCR 예상산물은 표 4과 같다.
[표 4] PSTVd 진단용 프라이머 조합과 RT-PCR 예상 산물
조합 역방향 위치* 정방향 위치* 산물(bp)
1 PSTVd-C10 211-227 PSTVd-N10 346-9 241
2 PSTVd-N20 120-139 108
3 PSTVd-N30 205-222 X
4 PSTVd-N40 221-240 X or 366
5 PSTVd-N50 313-334 274
6 PSTVd-C20 142-162 PSTVd-N10 346-9 156
7 PSTVd-N20 120-139 23
8 PSTVd-N30 205-222 317
9 PSTVd-N40 221-240 301
10 PSTVd-N50 313-334 209
11 PSTVd-C30 7-30 PSTVd-N10 346-9 44
12 PSTVd-N20 120-139 270
13 PSTVd-N30 205-222 184
14 PSTVd-N40 221-240 168
15 PSTVd-N50 313-334 77
16 PSTVd-C40 349-14 PSTVd-N10 346-9 X
17 PSTVd-N20 120-139 254
18 PSTVd-N30 205-222 169
19 PSTVd-N40 221-240 153
20 PSTVd-N50 313-334 61
* 프라이머의 위치는 Genbank ac. no. Y08852을 기준으로 작성.
[실시예 2] PSTVd 진단용 프라이머 조합 구축 및 최적 프라이머 조합의 선발
표 4과 같이 설계한 PSTVd 프라이머들은 20가지로 조합하여, PSTVd 및 여러 가지 관련 바이러스와의 RT-PCR 검정을 통하여 진단에 가장 효과적인 프라이머 조합을 선발하였다. 최적 진단용 프라이머 조합의 선발은 2가지 단계로 이루어졌다. 첫 번째는 PSTVd 감염식물체와의 RT-PCR을 통한 선발이며, 두 번째는 PSTVd의 기주인 가지과 식물에 감염되는 바이러스와의 RT-PCR 분석을 통한 선발이다.
본 발명에서 사용한 전체 RNA 분리 및 RT-PCR 방법은 다음과 같다.
(1) 전체 RNA 분리 : 상업적으로 시판되는 total RNA 분리 키트(페놀을 이용한 방법(Promega), TRIzol(Invitrogen Co.), easy-spin TM Total RNA Kit(iNtRON Co.))를 이용하여 분리하였다.
(2) RT-PCR : 역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5㎕, 12.5pmole 다운스트림 프라이머(downstream primer), 5배 역전사 완충액(250mM Tris-HCl, 150mM KCl, 40mM MgCl2, 5mM DTT, pH 8.5) 1㎕, 10mM dNTP 0.5㎕, 10U RNase inhibitor, 그리고 2U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5㎕를 42℃에서 1시간 항온 처리하여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사 반응액 5㎕에 12.5pmole 업스트림프라이머(upstream primer), 1.25U Taq DNA polymerase, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100mM Tris-HCl, 500mM KCl, 15mM MgCl2, pH 8.3) 2㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25㎕로 만들었다. 이 반응액을 95℃ 45 초, 55℃ 60 초, 72℃ 60 초로 40회 증폭시켰으며 마지막에는 72℃에서 7 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5× TBE 완충액과 1.5% 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다.
도 3은 표 4의 20가지 프라이머 조합의 PSTVd와의 특이성을 검정한 것이다. 도 2의 상단의 숫자는 조합의 번호를 의미한다. RT-PCR 주형으로 PSTVd에 감염된 감자 잎 조직으로부터 추출된 전체 RNA를 사용하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, PSTVd 감염식물체와의 RT-PCR 검정에서 20가지 프라이머 조합 중에서 반응강도가 뛰어나고 진단에 장해가 되는 비특이적 반응을 보이지 않는 6가지(조합 12, 13, 14, 17, 18, 19) 프라이머 조합을 선발하였다.
도 4는 선발된 PSTVd 진단용 프라이머 조합과 기주 관련 바이러스의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. PSTVd 기주인 가지과 식물과 관련된 17가지 바이러스와의 RT-PCR 분석 결과 2가지(조합 17, 조합 18) 프라이머 조합을 최종적으로 선발하였다. 선발된 프라이머 조합 18은 조합 17에 대한 검증용 피시알(nested PCR) 기능을 수행할 수 있는 영역에 위치한다.
기주 관련 바이러스 및 그와의 비특이적 반응 분석에 이용된 17가지 바이러스는 다음 표 5와 같다. 번호는 도 4의 레인 번호이다.
번호 바이러스 번호 바이러스
1 otato spindle tuber viroid(PSTVd) 2 Alfalfa mosaic virus (AMV)
3 Arracacha B virus (AVB) 4 Carnation mottle virus (CarMV)
5 Cherry leaf roll virus (CLRV) 6 Cowpea mild mottle virus (CPMMV)
7 Cucumber mosaic virus (CMV) 8 Pepper mottle virus (PepMoV)
9 Pepper veinal mottle virus (PVMV) 10 Potato Y virus (PVY)
11 Ribgrass mosaic virus (RMV) 12 Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV)
13 Tobacco necrosis virus (TNV) 14 Tobacco streak virus (TSV)
15 Tomato black ring virus (TBRV) 16 Tomato bushy stunt virus (TBSV)
17 Tomato mosaic virus (ToMV) 18 Tomato spotted wilt virus (TSWV)
[실시예 3] PSTVd의 진단 및 검증의 예
검사현장에서 PSTVd 진단용 최적 프라이머로 조합 17을 이용하여 1차적인 진단한다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 PSTVd로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 한다. 여기서, 조합 13에 대한 검정용 프라이머 조합은 조합 18(MNS-C08/N53)이다.
이때 RT-PCR 반응 결과가 PSTVd 유래에서 비롯되었다면 도 5에서와 같이, 검정용 PCR에서 양성반응을 나타낸다.
부가적으로 이러한 본 발명의 PSTVd 프라이머 조합으로부터 유래된 PCR 산물을 쉽게 확인할 수 있도록 프라이머가 설계된 전체 영역을 포함하는 양성 대조구(PSTVd-C30/N15)로서 도 6의 염기서열(서열번호 11)을 제조하였다.
이 양성 대조구는 PCR 검사시 양성대조구로 이용가능하며, 또한 확인인 필요한 PCR 산물의 염기서열을 쉽게 비교할 수 있도록 양성대조구 플라스미드의 삽입된 영역의 염기서열을 결정하여 제공하였다.
도 6는 PSTVd 양성대조구로부터의 유래한 진단용 프라이머 조합의 PCR 산물을 나타낸다. 도 6에서, M은 size marker를 나타낸다. 1 레인은 양성 대조군에 삽입된 PSTVd DNA 단편의 PCR 결과(서열번호 11; 354bp), 2 레인은 진단용 프라이머 조합 17의 PCR 결과(319bp), 3 레인은 진단용 프라이머 조합 18의 PCR 결과(169bp)를 나타낸다.
도 1은 감자걀쭉바이로이드(PSTVd)의 예상 이차구조. PSTVd를 선상 RNA로 가정하고 LaserGeneTM (DNASTAR Inc.)의 GeneQuest 프로그램을 이용하여 분석한 것이다.
도 2는 감자걀쭉바이로이드(PSTVd) 프라이머 위치를 나타낸 것이다. 위치는 Genbank ac. no. Y08852을 기준으로 작성하였다.
도 3은 감자걀쭉바이로이드(PSTVd)에 대한 20가지 프라이머 조합의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 선발된 프라이머 조합과 기주 관련 바이러스의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 감자걀쭉바이로이드(PSTVd) 양성대조구로부터 유래한 진단용 프라이머 조합의 PCR 산물을 나타낸 것이다.
도 6은 양성대조구에 삽입된 감자걀쭉바이로이드(PSTVd)의 염기서열이다(1,609bp).
<110> the Republic of Korea <120> PCR detection system for Potato spindle tuber viroid <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 1 cgcagttggt tcctcggaac taa 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 2 tgacctcctg agcagaaaag aaaa 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 3 aaaaggacgg tggggagtgc 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 4 ttcctcgcgc ccgcagga 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 5 gaccacccct cgcccccttt 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 6 tgcttcgggg cgagggtgtt ta 22 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 7 ggtggtcctg cgggcgc 17 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 8 gaattactcc tgtcggccgc t 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 9 tgaaccacag gaaccacgag ttta 24 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 10 cgagtttagt tccgaggaac caact 25 <210> 11 <211> 354 <212> DNA <213> Potato spindle tuber viroid <400> 11 tgacctcctg agcagaaaag aaaaaagaag gcggctcgga ggagcgcttc agggatcccc 60 ggggaaacct ggagcgaact ggcaataagg acggtgggga gtgcccagcg gccgacagga 120 gtaattcccg ccgaaacagg gttttcaccc ttcctttctt cgggtgtcct tcctcgcgcc 180 cgcaggacca cccctcgccc cctttgcgct gtcgcttcag ctactacccg gtggaaacaa 240 ctgaagctcc cgagaaccgc tttttctcta acttctttgc ttcggggcga gggtgtttag 300 cccttggaac cgcagttggt tcctcggaac taaactcgtg gttcctgtgg ttca 354

Claims (9)

  1. 서열번호 3과 8로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 3과 9로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 4와 8로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 4과 9로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 5와 8로 표시되는 프라이머 조합; 서열번호 5와 9로 표시되는 프라이머 조합;으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 감자걀쭉바이로이드 진단용 프라이머.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 3과 9로 표시되는 프라이머 조합 및 서열번호 4와 9로 표시되는 프라이머 조합으로 이루어진 감자걀쭉바이로이드 진단용 프라이머.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 서열번호 3과 9로 표시되는 프라이머 조합합의 RT-PCR 산물을
    상기 서열번호 4과 9로 표시되는 프라이머 조합으로 검정하는 것을 특징으로 하는 감자걀쭉바이로이드 진단용 프라이머.
  4. 바이로이드 샘플의 게놈 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 감자걀쭉바이로이드 진단방법.
  5. 제4항에 있어서,
    바이로이드 샘플의 게놈 RNA을 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 RNA을 주형으로 하고, 제1항의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
    상기 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 감자걀쭉바이로이드 진단방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 PT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계 후에 상기 서열번호 4와 9로 표시되는 검정용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 감자걀쭉바이로이드 진단방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 PCR을 수행하는 단계에서 양성대조구로서 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 이용하는 것을 특징으로 하는 감자걀쭉바이로이드 진단방법.
  8. 제1항의 프라이머를 포함하는 감자걀쭉바이로이드 진단 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 감자걀쭉바이로이드 진단 키트는 서열번호 11로 표시되는 양성 대조구 를 더 포함하는 것을 특징으로 감자걀쭉바이로이드 진단 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Virol. Methods, Vol. 116, pp. 139~146 (2004)
J. Virol. Methods, Vol. 80, No. 2, pp. 145~155 (1999)
Korean J. Plant Pathol., Vol. 13, No. 4, pp. 205~209 (1997)

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