CN101956023B

CN101956023B - 检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片

Info

Publication number: CN101956023B
Application number: CN2010102829834A
Authority: CN
Inventors: 周常勇; 王雪峰; 李中安; 杨方云; 宋震; 周彦; 唐科志; 刘金香; 刘科宏
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2010-09-16
Filing date: 2010-09-16
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2030-09-16
Also published as: CN101956023A

Abstract

本发明公开了一种检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的特异性寡核苷酸探针，其特征在于：固定在所述固相载体上的特异性寡核苷酸探针具有SEQIDNO：1-SEQIDNO：10所示的寡核苷酸序列或者与SEQIDNO：1-SEQIDNO：10所示的寡核苷酸序列互补的DNA或RNA。本发明方法设计合理，能够提高检测柑桔主要病害病原的敏感性、特异性及准确性；高通量，一次检测即能检出十种柑桔病害，十种病毒基本概括了柑桔主要病害病原；能够发现各种柑桔病原物的混合感染。

Description

检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片

技术领域

本发明属于一种基因芯片，具体的说，涉及一种检测主要的十种柑桔病害病原的基因芯片。

背景技术

柑桔是世界第一大水果，我国柑桔栽培面积和产量均居世界首位，在国民经济中占有十分重要的地位。近几年来，随着我国柑桔产业的发展和优势产业带的确立，柑桔的种植区域更趋集中，面积亦进一步扩大，而病害问题日益引起生产者的重视。随着国际柑桔贸易的持续增长及种质资源交换的日益频繁，各种检疫性柑桔病害传入我国的机率不断加大。

柑桔麻风病是由柑桔麻风病毒（Citrus leprosis virus, CiLV）引起的一类重要柑桔病毒病害，于20世纪20年代首次在巴拉圭发现，主要由短须螨（Brevipalpus spp.）传播。目前该病主要分布于巴西、阿根廷、巴拿马、委内瑞拉等南美洲国家，严重威胁到北美和加勒比地区的柑桔产业，最近在美国佛罗里达州已检测到该病。柑桔鳞皮病是由一种多分体单链RNA病毒—柑桔鳞皮病毒(Citrus psorosis virus，CPV)引起的病害，主要分布于阿根廷、巴西、意大利、西班牙以及美国等国家，对柑桔产业造成十分严重的为害。柑桔杂色褪绿病是由木质部难养菌（Xyllela fastidiosa）引起的一种细菌性病害，于1987年首次在巴西的圣保罗和Minas Gerais地区发现，由带病苗木和叶蝉、沫蝉等昆虫介体传播。迄今，该病已蔓延到巴西的各个柑桔产区和阿根廷、巴拉圭等南美国家。柠檬枝枯病(Mal secco)是由桔茎点霉(Phoma tracheiphila)引起的是一种检疫性真菌病害，主要分布在地中海、黑海地区，对许多沿海周边国家的柑桔生产尤其是柠檬生产造成了一定的经济损失。目前以上四种病害在我国尚未发生，但我国存在传播柑桔麻风病毒和木质部难养菌的的虫媒，柑桔鳞片病毒和桔茎点霉亦在我国部分柑桔产区存在定殖扩展的生境，因此检疫是杜绝该类病害在我国发生的重要手段。柑桔黄龙病和溃疡病是国内重要的检疫对象，柑桔衰退病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔裂皮病类病毒和温州蜜柑萎缩病毒亦是我国发生的主要病毒类病害。

迄今为止，由于高特异性和灵敏性，PCR和RT-PCR是检测以上柑桔病害最为高效的方法，由于柑桔病害种类多，对每种病害进行检测较费时费力，不宜在我国出入境检验检疫中推广应用。因此建立新的检验检疫技术手段已迫在眉睫。

基因芯片是90年代中期以来发展极为迅速和活跃的技术。其原理是将大量DNA探针片段有序的固化于支持物表面，然后与标记的生物样品中的DNA分子杂交，再对杂交信号进行检测分析。基因芯片在核酸序列测定、基因图片检测、基因表达等领域中得到广泛应用。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种检测柑桔主要病害病原的基因芯片，达到快速、准确、高通量检测10种主要柑桔病害病原，以及它们的混合感染，可用于口岸检验检疫。

本发明目的是这样实现的：

一种检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的特异性寡核苷酸探针，固相载体为光学级醛基基片，其关键在于：固定在所述固相载体上的特异性寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：1- SEQ ID NO：10所示的寡核苷酸序列或者与SEQ ID NO：1- SEQ ID NO：10所示的寡核苷酸序列互补的DNA或RNA。

上述固相载体上固定有阴性对照和作为荧光标记对照的SEQ ID NO：11所示的序列。

基因芯片的制备方法：

1．设计病原特异性探针：选择柑桔病原（病毒、细菌、真菌）保守序列基因为靶标序列，及上述SEQ ID NO：1- SEQ ID NO：11的特异性探针序列。

从GenBank中公布的十种病原中选择保守基因的为靶序列，从中选取特异性探针，并通过Blast比对验证。所述的探针见序列表所示。

2. 合成探针：使用上海生物工程有限公司合成仪合成。

3. 探针处理：5’端加T到40个碱基并在5’端氨基修饰，使它能够固化在醛基基片上；

4. 基因芯片的制备：使用点样仪在基片上按预先设定好的顺序进行电样，将点好的基片在紫外交联仪下进行交联，80℃干烤2小时备用。

5、杂交及检测：取杂交液9μl和加Cy3标记PCR产物混合物9μl，42℃恒温水浴杂交2小时，洗片扫描观察结果。

检测时

1）提取待检柑桔样品总核酸备用；

2）Cy3标记的PCR或RT-PCR扩增：在PCR反应管中加入Cy3-dCTP, 在扩增过程中渗入Cy3-dCTP；

3）杂交及检测：取杂交液9μl和加Cy3标记PCR产物混合物9μl，42℃恒温水浴杂交2小时，洗片扫描观察结果（有无荧光反应）。

表1为基因芯片上所有探针及其检测作用

有益效果：

本发明方法设计合理，能够提高检测柑桔主要病害病原的敏感性、特异性及准确性；

高通量，一次检测即能检出十种柑桔病害，十种病毒基本概括了柑桔主要病害病原。

能够发现各种柑桔病原物的混合感染。

附图说明

图1 本发明十种柑桔病原基因芯片扫描图谱。

具体实施方式

实施例1

1．设计病原特异性探针：

2. 合成探针：使用上海生物工程有限公司合成仪合成。

5. 总核酸提取：称取5-10㎎柑桔皮、叶或果皮装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入60μL TES缓冲液和60μL饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀。70℃水浴5~10分钟。室温下13 000rpm离心5 分钟，吸取40μL上清液加入由Sephadex G-50-80构成的微柱中，置于一新的无菌离心管，5 000rpm离心4 分钟，收集洗脱液。

6. Cy3标记PCR和RT-PCR扩增：十种柑桔病害病原PCR和RT-PCR反应的特异性引物分别为：柑桔衰退病毒（上游引物：5’-TGA ATT ATG GAC GAC GAA A-3’,下游引物：5’-TCA ACG TGT GTT GAA TTT CCC-3’）、柑桔麻风病毒（上游引物：5’-TGT ATA CCA AGC CGC CTG TGA ACT-3’，下游引物：5’-GCG TAT TGG CGT TGG ATT TCT GAC-3’）、柑桔碎叶病毒（上游引物：5’- CCC TCT CAG CTA GAA TTG AA-3’，下游引物：5’- AGA GTG GAC AAA CTC TAG AC-3’）、柑桔裂皮病类病毒（上游引物：5’- GGA AAC CTG GAG GAA GTC GAG-3’，下游引物：5’-CCG GGG ATC CCT GAA GGA CTT-3’）、柑桔鳞片病毒（上游引物：5’- GCA ACT CCT GAA TCC CTG ATG-3’，下游引物：5’-TTC CAT TGT CCC TCC ATT GT-3’）、温州蜜柑萎缩病毒（上游引物：5’- TAG GAG CAT CTA AGA CTG G-3’，下游引物：5’-CAA CAA GAG TAA ATA GGA GG-3’）、柑桔溃疡病菌（上游引物：5’- CTT CAA CTC AAA CGC CGG AC-3’，下游引物：5’-CAT CGC GCT GTT CGG GAG-3’）、柑桔黄龙病菌（上游引物：5’- GCG CGT ATG CAA TAC GAG CGG CA-3’，下游引物：5’-GCC TCG CGA CTT CGC AAC CCA T-3’）、木质部难养菌（上游引物：5’-CTG CAC TTA CCC AAT GCA TC-3’，下游引物：5’-AGG AAT GCT CTC CGA AGC GGC-3’）、桔茎点霉（上游引物：5’-ATCAGAAGGCGGTATGCG-3’，下游引物: 5’-AGGCTATCTCGTCGTCCAA-3’）。柑桔衰退病毒、柑桔麻风病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔裂皮病类病毒、柑桔鳞片病毒、温州蜜柑萎缩病毒进行RT-PCR扩增，RT反应程序为42℃ 30min，94℃ 2min； PCR反应中加入Cy3-dCTP，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 30s, 共35个循环；最后72℃延伸7min。柑桔溃疡病菌、柑桔黄龙病菌、木质部难养菌和桔茎点霉进行PCR扩增渗入Cy3标记，程序如上所述。

7. 杂交：取杂交液9μl和加Cy3标记PCR产物混合物9μl，42℃恒温水浴杂交2小时，洗片扫描观察结果如图1所示。

序列表

<110>西南大学

<120>检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片

<160> 11

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank公布的柑桔衰退病毒（Citrus tristeza virus）序列设计的互补序列

<400> CGCCTTCTTT CGTTTCCTTG

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank公布的柑桔麻风病毒（Citrus leprosis virus）序列设计的互补序列

<400> TCAGAGGAGT GGTGAGTGAC

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank公布的柑桔碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus）序列设计的互补序列

<400> AGAAGTRGCA GCAAAGGTTT

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank公布的柑桔裂皮病类病毒（Citrus excortis viroid）序列设计的互补序列

<400> TCGACTTCCT CCAGGTTTCC

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank公布的柑桔鳞皮病毒（Citrus psorosis virus）序列设计的互补序列

<400> CATCAGGGAT TCAGGAGTTG

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank公布的温州蜜柑萎缩病毒（Satsuma dwarf virus）序列设计的互补序列

<400> CGTATGGTCT CATCAAGCTG

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank公布的柑桔溃疡病菌（Xanthomonas citri pv. citri）序列设计的互补序列

<400> TCTGATCTCC CTCGTGCGTT

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank公布的柑桔黄龙病菌（Candidatus liberibacter asiaticus）序列设计的互补序列

<400> AACTTAATCG CCGCCTACGC

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank公布的木质部难养菌（Xylella fastidiosa）序列设计的互补序列

<400> ATTTAGATGA GTGGCGGCTG

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank公布的桔茎点霉（Phoma tracheiphila）序列设计的互补序列

<400> CTACCGTGGG ACTTCACGTT

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>荧光标记对照

<400> GGCTCTGACG CGATATACGG T

Claims

1.一种检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的特异性寡核苷酸探针，其特征在于：固定在所述固相载体上的特异性寡核苷酸探针为SEQ ID NO：1- SEQ ID NO：10所示的寡核苷酸序列或者与SEQ ID NO：1- SEQ ID NO：10所示的寡核苷酸序列互补的DNA或RNA；所述检测的十种主要柑桔病害病原为柑桔衰退病毒、柑桔麻风病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔裂皮病类病毒、柑桔鳞皮病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑桔溃疡病菌、柑桔黄龙病菌、木质部难养菌和桔茎点霉。

2.根据权利要求1所述检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片，其特征在于：所述固相载体上固定有阴性对照和作为荧光标记对照的SEQ ID NO：11所示的序列。