CN103184287B - 水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法及miRNA172a的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法及miRNA172a基因位点的应用,属于生物技术领域。所述方法包括:接种待测水稻和感病水稻;分离待测水稻和感病水稻中miRNA基因;检测miRNA172a基因位点的表达;判定待测植株是否抗白叶枯病。所述的miRNA172a基因位点在鉴定水稻的白叶枯病抗性中的应用。本发明首次利用miRNA172a基因位点的转录鉴定水稻是否具有白叶枯病抗性,并获得了成功,本发明提供的miRNA172a基因位点的转录是建立在表达水平上的检测,避免了由白叶枯病的抗性基因沉默而造成的误判,本发明的鉴定方法未利用常规的DNA连锁标记法,避免了由于DNA连锁不紧密造成的误判,提高检测的准确性,避免了不必要的生产损失。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法及miRNA172a的应用。
背景技术
水稻是我国最主要的粮食作物,白叶枯病是水稻两大主要病害之一,属世界性病害,以亚洲稻区发生为重。白叶枯病发病率高、传染快,发病稻田减产20-30%,甚至能够达到50%。
培育并利用抗病品种是解决白叶枯病造成的粮食减产最经济、最有效的手段,因此,需要对所栽培的水稻白叶枯病抗性进行鉴定。目前,鉴定水稻白叶枯病的方法通常采用DNA(Deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)分子标记,利用DNA连锁标记的原理,鉴定水稻是否带有白叶枯病抗性基因,与传统应用的常规遗传标记相比,分子标记具有不受季节、环境限制、不存在表达与否及基因组DNA变异及其丰富等优点。
在实现本发明的过程中,发明人发现现有技术至少存在以下问题:
即便患病的植株中存在抗性基因也不代表该抗性基因具有活性,如果该抗性基因沉默了,那么在生产时依旧会表现为感病,干扰实验人员的判断,若直接投入到生产中,会给粮食生产带来损失。
发明内容
为了解决利用DNA分子标记鉴定水稻是否抗白叶枯病不够准确的缺点,本发明实施例提供了一种水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法及miRNA172a的应用。所述技术方案如下:
一方面,本发明提供了一种水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法,包括以下步骤:
将白叶枯菌系P6分别接种于待测水稻和感病水稻上;
分离所述待测水稻和所述感病水稻中的miRNA;
检测所述miRNA中的miRNA172a的表达;
根据所述miRNA172a的表达检测结果,判定所述待测植株是否抗白叶枯病,若所述感病水稻的miRNA172a的表达和所述待测水稻的miRNA172a的表达相等,则所述待测水稻感病;若所述感病水稻的miRNA172a的表达大于所述待测水稻的miRNA172a的表达,则所述待测水稻抗病;
所述miRNA172a的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
进一步地,所述接种的部位为所述待测水稻和所述感病水稻的叶片。
具体地,接种后2-6小时,分离所述miRNA。
进一步地,采用miRNA分离试剂盒分离所述miRNA。
具体地,采用液相Northern杂交法检测所述miRNA172a的表达。
进一步地,所述液相Northern杂交法所用的探针的序列如序列表中SEQ IDNO:2所示,所述探针的5’端标记有荧光素FITC。
另一方面,本发明提供了一种miRNA172a在鉴定水稻的白叶枯病抗性中的应用。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:miRNA与普通RNA基因不一样,其序列较短,不容易降解,因此,已经在人类疾病如癌症检测中得到了应用,但利用miRNA检测与诊断植物疾病例子很少,主要是因为植物miRNA的研究相对落后于人类miRNA的研究,通过大量样本的水稻miRNA与白叶枯抗性关系的研究,发明人发现miRNA172a基因的表达与白叶枯抗性密切相关,由此,首次提出miRNA172a基因具有检测水稻白叶枯抗性的能力,本发明检测待测水稻和感病水稻中miRNA172a的表达,通过结果的比对,鉴定待测水稻是否抗白叶枯病,本发明利用miRNA172a鉴定水稻是否具有白叶枯病抗性,并获得了成功,本发明提供的miRNA172a的转录是建立在表达水平上的检测,避免了由白叶枯病的抗性基因沉默而造成的误判,本发明未利用常规的DNA连锁标记法,避免了由于DNA连锁不紧密造成的误判,提高了检测的准确性,避免了不必要的生产损失。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的电泳图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。本发明中所用的试剂均为市售试剂。
实施例
本发明通过将水稻的miRNA与标记好miRNA172a基因的探针混合杂交,并通过非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测结果,并将待测水稻和感病水稻的结果进行比对,进而判断待测水稻是否抗白叶枯病,其具体实验过程如下。
感病水稻:选取生长正常且表面没有明显病虫害的,标号为9311的不抗白叶枯病的水稻种子。
待测水稻:选取标号为9311的抗白叶枯病的水稻种子。
其中,抗白叶枯病的水稻种子中具有抗性基因Xa23。
种子的前处理:用浓度为70%的酒精浸泡2分钟,再用去离子水洗2次,在30℃的水中浸泡过夜,在30℃的温度下对种子进行催芽,待芽长出来后,播种于秧田中,秧田管理与普通栽培习惯相同,待秧苗长到4-5个叶片时,移栽至大田中,大田管理与普通栽培习惯相同。
白叶枯菌系培养:选用对水稻具有强致病性的白叶枯菌系P6(Xanthomonasoryzae pv.oryzae Philippine race 6),该白叶枯菌系P6来源于中国科学院遗传与发育生物学研究所,将白叶枯菌系P6于培养温度为30℃的条件下,于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato-Dextrose-Agar,PSA)培养基上进行培养,培养基的成份如下:质量体积比为1%的蔗糖、质量体积比为1%的蛋白胨、质量体积比为0.1%的谷氨酸盐和质量体积比为1.5%的琼脂。培养时间为2-5天,将白叶枯菌系P6培养至肉眼可以观察到的菌浓为止。
白叶枯菌浓度测定:在接种水稻的叶片前,将白叶枯菌系P6溶解于水中,利用分光光度计(美国Quawell公司生产,型号为Q5000)测定600nm处的吸光OD600值,并将菌液稀释到OD600值为0.5,此时菌液的浓度大约为5×108cfu/ml左右,用于接种水稻的叶片。
白叶枯菌系接种:在待测水稻和感病水稻抽穗前,分别接种白叶枯菌系P6,接种方法为剪叶接种,具体地,将剪刀浸入OD600值为0.5的白叶枯菌系P6的菌液中1-2秒,再用沾有菌液的剪刀从距叶片顶部1-2cm处剪去叶片,此时,计为接种0小时,在接种2-6小时后,分别取待测水稻和感病水稻接种部位的叶片各0.5克左右,分别装入容积为1.5ml的离心管中,并立即投入液氮中保存,且待测水稻和感病水稻至少分别取3份样本材料做重复实验。
miRNA的提取:利用miRNA分离试剂盒(miRNA分离试剂盒为市售,货号:R6727,生产公司:Omega,该试剂盒具体包括:RNA离心柱、基因组DNA去除离心柱、收集管、MCL裂解缓冲液、XD结合缓冲液、RNA洗脱液II、DEPC水)分离待测水稻和感病水稻叶片中的miRNA,具体操作方法如下:从液氨中分别取出待测水稻和感病水稻的叶片,并将两组叶片分别置于两个研钵中,立即向研钵中倒入液氮,并充分研磨,各取大约100mg研磨好的粉未置于1.5ml的离心管中,加700μL的裂解液,涡旋30秒以混匀样品,55℃保温30分钟,在离心力为12000×g的室温条件下离心5分钟,将上清液转移至离心柱中离心,用于去除基因组中的DNA,12000×g室温离心2分钟,并将流出的液体转移至一个新的1.5mL的离心管中,向液体中加入该液体体积1.1倍的无水乙醇并涡旋20秒混匀,将液体转移至RNA离心柱中12000×g室温离心1分钟,弃离心液,加入500μL浓度为96-100%的乙醇到RNA离心柱中,再12000×g室温离心1分钟,弃离心液,加入500μL XD结合缓冲液到RNA离心柱中,12000×g室温离心1分钟,弃离心液,加入750μL RNA洗脱液II到RNA离心柱中,12000×g室温离心1分钟,弃离心液,再加入750μL RNA洗脱液II到RNA离心柱中,12000×g室温离心1分钟,弃离心液。将RNA离心柱在大于12000×g的最大速度下,室温离心2分钟,向RNA离心柱中加入30-50μL DEPC水,室温下放置5分钟,大于12000×g的最大速度下,室温,离心1分钟,离心获得的液体即为miRNA溶液,将该溶液保存于-70℃。
miRNA定量:利用分光光度计(美国Quawell公司生产,型号为Q5000)测定获得的miRNA的浓度。
miRNA172a的序列:5’-agaaucuuga ugaugcugca u-3’。
miRNA172a的杂交探针:设计miRNA172a的DNA探针为5’-atgcagcatcatcaagattc t-3’,其中,该探针的5’端标记有荧光素FITC。该探针标记与合成由上海Invitrigen公司完成。
配制杂交缓冲液:其成份如下:30mM pH 8.0的磷酸钠缓冲液,0.3M NaCl溶液和10mM EDTA,配制好后,用浓度为0.1%的DEPC(diethyl pyrocarbonate;焦碳酸二乙酯)37℃处理12小时后,120℃灭菌20分钟待用。
液相Northern杂交:用两个PCR管,分别取5μg的待测水稻和感病水稻的叶片的miRNA溶液、5μl的杂交缓冲液和1ul 10pM/ul的miRNA172a的杂交探针,混合均匀,制成液相Northern杂交液,在42℃保温1小时后加入5ul 2000U/ml的DNase I(由NEB公司生产,商品货号为M0303)消化2小时。其中,采用液相Northern杂交法,在探针的5’端有一个FITC标记,该标记在紫外照射下即可发光,所以,电泳完成后,直接放在紫外线下照射即可看到条带,并不需要放射自显影这些麻烦的步骤,也不需要3’端进行标记,其方法简单。另外,那些在液体中没有被杂交上的探针被DNA酶消化掉了,并不影响最后的结果。
浓度为6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶的制备:取20mL ACT:Bis=29:1的浓度为30%的非变性聚丙稀酰胺凝胶母液(武汉谷歌生物科技有限公司生产),加浓度为1倍的TBE缓冲液(上海迪申生物技术有限公司生产,货号为B1610733)80mL,配制成浓度为6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶溶液,取配制好的浓度为6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶溶液16mL,加16μL浓度为浓度为10%的过硫酸铵和160μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED),其中TEMED的浓度>99.0%,将上述溶液混合均匀后,迅速灌胶于胶板之中(灌胶装置由北京六一仪器设备厂生产,型号为DYCZ-24DN),并室温于放置2小时后即可使用。
电泳检测:将上述液相Northern杂交液加上2ul 10×的电泳缓冲液(美国Lifetechnology公司生产,商品货号为AM8556),利用浓度为6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶在100V的电压下电泳30分钟,于紫外线下观察并照相,结果见附图1。
由图1可知,图中左侧的条带为感病水稻,右侧的条带为待测水稻,其中,左侧的条带宽度大于右侧的条带的宽度,所以,感病水稻的miRNA172a的表达大于待测水稻的miRNA172a的表达,则待测水稻抗病。
按前述的方法接种P6白叶枯菌的感病水稻和待测水稻的在大田中继续生长15天后,测量枯萎叶片长度,结果表明感病水稻枯萎叶片长度分别大于10cm,而待测水稻的枯萎叶片长度分别小于1cm,表明栽种的感病水稻表现为感病,栽种的待测水稻检测出来为抗病,与实验结果一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
将白叶枯菌系P6分别接种于待测水稻和感病水稻上;
分离所述待测水稻和所述感病水稻中的miRNA;
检测所述miRNA中的miRNA172a的表达;
根据所述miRNA172a的表达检测结果,判定所述待测植株是否抗白叶枯病,若所述感病水稻的miRNA172a的表达和所述待测水稻的miRNA172a的表达相等,则所述待测水稻感病;若所述感病水稻的miRNA172a的表达大于所述待测水稻的miRNA172a的表达,则所述待测水稻抗病;
所述miRNA172a的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述接种的部位为所述待测水稻和所述感病水稻的叶片。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,接种后2-6小时,分离所述miRNA。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,采用miRNA分离试剂盒分离所述miRNA。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,采用液相Northern杂交法检测所述miRNA172a的表达。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述液相Northern杂交法所用的探针的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示,所述探针的5’端标记有荧光素FITC。
7.一种miRNA172a在鉴定水稻的白叶枯病抗性中的应用。
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