CN102534015B

CN102534015B - 用于柑桔黄龙病菌(亚洲种)检测的lamp引物组

Info

Publication number: CN102534015B
Application number: CN 201210018337
Authority: CN
Inventors: 孔德英; 邓朝晖; 孙涛; 滕少娜; 吴瑜佳; 陆丽华; 赵文军
Original assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority date: 2012-01-20
Filing date: 2012-01-20
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2032-01-20
Also published as: CN102534015A

Abstract

本发明公开了一套用于柑桔黄龙病菌（亚洲种）LAMP检测的引物组，所述引物组由一对外引物和一对内引物组成。本发明还公开了一种利用该引物组检测柑桔黄龙病菌的方法。以本发明所设计的引物采用LAMP方法检测柑桔黄龙病，具有良好的特异性、灵敏度，能快速、方便、高效的检测柑桔黄龙病菌（亚洲种），能满足对柑桔黄龙病菌（亚洲种）快速准确检测的需要。

Description

用于柑桔黄龙病菌(亚洲种)检测的LAMP引物组

技术领域

本发明涉及植物保护领域，提供了利用常温扩增技术对柑桔黄龙病菌（亚洲种）的检测，适用于口岸检验检疫等机构应用。

背景技术

柑桔黄龙病是柑桔生产上的重要病害，被多个国家列入名单的重大检疫性病害。柑桔黄龙病菌（亚洲种）是柑桔黄龙病菌的一个菌系，在我国主要分布于广东、广西、福建、台湾、海南、云南、贵州、四川、浙江、湖南、江西等省，该病对柑桔危害极大，感染后显现绿树冠、中枝梢发黄症状，甚至树亡林毁，幼龄树发病后一般在2～3年死亡，老年树发病则在3～5年内枯死或丧失结果能力，因而也被称为“桔癌”，一直是国际柑桔学界的研究重点。近年来，随着柑桔生产的发展，柑桔黄龙病的发病区域日益扩大，已成为柑桔产业发展的瓶颈。2002年11月，浙江省黄岩桔区首次发现柑桔黄龙病疫情，当年全区只有2镇的36个行政村发生，病树8510株。2003年有7个乡（镇、街道）共99个行政村发病，病树增加到113115株。到2004年，整个黄岩桔区17个乡（镇、街道）都已发生柑桔黄龙病，发病村数为225个，病树达312105株，病株率为1.47%～44.61%。广西柑桔黄龙病年均发病率超过5%，每年造成的直接经济损失超过8.05亿～9.62亿元。近年来，位居世界柑桔产量第一和第三的巴西和美国也正面临柑桔黄龙病的威胁，其柑桔产业大幅度萎缩。

柑桔黄龙病传统的检测技术主要有症状鉴别、显微镜观测、血清学检测和PCR检测等，但这些检测方法均有其不足之处。症状鉴别法仅对发病明显的病株有效，对发病初期的病株往往造成漏检；显微镜观察大多应用电子显微镜观察，由于电镜本身检测技术上的缺点和黄龙病菌在植物体内的菌量低、分布不均等原因，电镜检测技术检测效率只有60%～70%，容易造成漏检；虽然血清学检测已在其它病害的检测上获得了巨大的成功，但对黄龙病病原来讲，至今仍没有得到较好的抗体，在检测的时候容易造成漏检或假阳性；PCR方法虽然特异性高，检测周期短，但其昂贵的仪器设备和较高的假阳性率，也限制了其推广。

本发明应用法LAMP引物将恒温扩增技术运用于柑桔黄龙病菌的快速检测，特异性、灵敏度比普通通变温PCR方法更高，同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

发明内容

本发明的第一目的是提供一组检测柑桔黄龙病菌（亚洲种）LAMP引物组；本发明的第二目的是提供一种利用上述引物组检测柑桔黄龙病菌（亚洲种）的方法。

一种用于柑桔黄龙病菌（亚洲种）检测的LAMP引物组，包括一对外引物和一对内引物，其DNA序列分别为：

SEQ ID NO1：ACGATGAAGATACCGTCAA

SEQ ID NO2：CCGATGTTCTTATAGAAATAACTCT

SEQ ID NO3：GTGTTGTACTTTCACCATGACATTTCTGATGTGCATAACATCAAGC

SEQ ID NO4：ACTTATGTGATTGAAGAAGGTGTCAGCGAATAATTTTTATTACCCACG。

一种利用上述引物组检测柑桔黄龙病菌（亚洲种）的方法，步骤如下：

1）DNA 模板的提取：用市售DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取DNA模板。

2）LAMP扩增体系：10μmol/mL SEQ ID NO1、10μmol/mL SEQ ID NO2 、10μmol/mL SEQ ID NO3和10μmol/mL SEQ ID NO4各1μL；2*reaction mix 12.5μL；Bst DNA聚合酶1μL；步骤1）中获得的DNA 模板2μL；灭菌去离子水5.5μL。

3）LAMP扩增条件：将配制好反应体系的PCR管于62℃水浴锅中恒温反应60min；然后80℃，5min终止反应。

4）检测结果：电泳步骤3）中的LAMP扩增产物，若产生特异梯状条带，则待测样品中含有柑桔黄龙病菌（亚洲种）；若未产生特异梯状条带，则待测样品中不含有柑桔黄龙病菌（亚洲种）。

与现有技术相比，本发明的进步在于：检测时间短，效率高，假阳性率低；检测仪器简单，只需要简单的水浴锅，无需昂贵的PCR仪，降低了实验室投入，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。

附图说明

图1为LAMP引物等温扩增结果；

图中：1-柑桔黄龙病菌（亚洲种）（C. Liberobacter asiaticum）；2-黄单胞菌(Xanthornonas sp.)；3-短小杆菌(Curtobacterium sp.)；4-鞘胺醇单胞菌(Sphingomonassp.)；5-柑桔黄龙病菌（亚洲种）（C. Liberobacter asiaticum）；6-短波单胞杆菌(Brevundimonas sp.)；7-嗜冷杆菌（Psychrobacter sp.）；8-柑桔黄龙病菌（亚洲种）（C. Liberobacter asiaticum）；9-番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)；10-白菜软腐病菌(Erwinia carotovora var .Carotovora ）；11-柑桔黄龙病菌（亚洲种）（C. Liberobacter asiaticum）；12-柑桔溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. Citri）；13-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；14-阴性对照；M-DL2000 DNA 分子量标记。

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。

实施例1，引物的设计与合成

参照GeneBank中柑桔黄龙病菌（亚洲种）基因序列，挑选特异性高的序列（序列号HQ267229.1），采用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4.0设计LAMP引物，利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应进程中的浊度进行实时监控，对不同引物组扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等参数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的一组LAMP引物。引物由上海生工公司合成，其序列分别为：

外引物1 SEQ ID NO1：ACGATGAAGATACCGTCAA；

外引物2 SEQ ID NO2：CCGATGTTCTTATAGAAATAACTCT；

内引物1 SEQ ID NO3：

GTGTTGTACTTTCACCATGACATTTCTGATGTGCATAACATCAAGC；

内引物2 SEQ ID NO4：

ACTTATGTGATTGAAGAAGGTGTCAGCGAATAATTTTTATTACCCACG。

实施例2，样品DNA模板的提取

以1-柑桔黄龙病菌（亚洲种）（C. Liberobacter asiaticum）；2-黄单胞菌(Xanthornonas sp.)；3-短小杆菌(Curtobacterium sp.)；4-鞘胺醇单胞菌(Sphingomonassp.)；5-柑桔黄龙病菌（亚洲种）（C. Liberobacter asiaticum）；6-短波单胞杆菌(Brevundimonas sp.)；7-嗜冷杆菌（Psychrobacter sp.）；8-柑桔黄龙病菌（亚洲种）（C. Liberobacter asiaticum）；9-番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)；10-白菜软腐病菌(Erwinia carotovora var .Carotovora ）；11-柑桔黄龙病菌（亚洲种）（C. Liberobacter asiaticum）；12-柑桔溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. Citri）；13-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为供试样品。用Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit试剂盒提取样品DNA模板，具体操作步骤参照试剂盒说明书。其中1、5，8，11号分别为从柑桔园采集的柑桔黄龙病病叶，然后直接提取总DNA（经普通PCR方法和荧光定量PCR方法检测确定含有柑桔黄龙病菌（亚洲种）DNA），其余菌株均可在国内市场购得。

实施例3，阴性对照的制备

将去离子水高温高压灭菌，作为阴性对照。

实施例4，LAMP扩增液的配制

LAMP具体扩增体系如下。

2*reaction mix 12.5μL

10μmol/mL SEQ ID NO1 1μL

10μmol/mL SEQ ID NO2 1μL

10μmo/mL l SEQ ID NO3 1μL

10μmol/mL SEQ ID NO4 1μL

Bst DNA聚合酶 1μL

灭菌水 5.5μL

DNA模板 2μL。

其中，2*reaction mix 与Bst DNA聚合酶均为Loopamp DNA Amplification Kit试剂盒产品。

依次将上述试剂加入0.2mL的PCR管中，配成LAMP扩增液。

实施例5，LAMP 扩增

将配制好反应体系的PCR管置于62℃水浴锅恒温反应60min；然后80℃，5min终止反应。

实施例6，检测结果

电泳参LAMP 扩增产物，结果参见图1。其中1、5、8和11号样品为柑桔黄龙病菌（亚洲种），均能出现梯状特异性条带，其他泳道均未出现梯状特异性条带，结果表明本发明引物对的特异性强，对其他细菌都没有特异性条带出现。

<110> 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 用于柑桔黄龙病菌（亚洲种）检测的LAMP引物组

<160> 4

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO1

acgatgaaga taccgtcaa 19

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO2

ccgatgttct tatagaaata actct 25

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO3

gtgttgtact ttcaccatga catttctgat gtgcataaca tcaagc 46

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO4

acttatgtga ttgaagaagg tgtcagcgaa taatttttat tacccacg 48

Claims

1.一种用于柑桔黄龙病菌亚洲种检测的LAMP引物组，其特征是：包括一对外引物和一对内引物，其中外引物1的DNA序列为SEQ ID NO1，外引物2的DNA序列为SEQ ID NO2，内引物1的DNA序列为SEQ ID NO3，内引物2的DNA序列为SEQ ID NO4。

2.利用权利要求1所述的引物组检测柑桔黄龙病菌亚洲种的方法，步骤如下：

1）DNA模板的提取：用市售DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取DNA模板；

2）LAMP扩增体系：10μmol/mL SEQ ID NO1、10μmol/mL SEQ ID NO2、10μmol/mL SEQ IDNO3和10μmol/mL SEQ ID NO4各1μL；2*reaction mix12.5μL；Bst DNA聚合酶1μL；步骤1）中获得的DNA模板2μL；灭菌去离子水5.5μL；

3）LAMP扩增条件：将配制好反应体系的PCR管于62℃水浴锅中恒温反应60min；然后80℃，5min终止反应；

4）检测结果：对步骤3）中的LAMP扩增产物进行电泳，若产生特异梯状条带，则待测样品中含有柑桔黄龙病菌亚洲种；若未产生特异梯状条带，则待测样品中不含有柑桔黄龙病菌亚洲种。