CN102876773A - 一种快速鉴定瓜类疫霉对caa类杀菌剂抗药性的方法及专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速鉴定瓜类疫霉对CAA类杀菌剂产生抗药性的核苷酸点突变方法及专用引物。属于分子生物技术领域。该特异性引物对由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的DNA分子组成。本发明提供的检测瓜类疫霉对CAA类杀菌剂产生抗药性的分子检测方法，简单快速、敏度度高、稳定性好，可以有效地监测和早期预警田间瓜类疫霉对CAA类杀菌剂的抗性发生发展动态，指导制定科学的病害管理策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。

Description

一种快速鉴定瓜类疫霉对CAA类杀菌剂抗药性的方法及专用引物

技术领域

本发明涉及瓜类疫霉纤维素合酶相关基因CesA3的克隆及其在CAAs杀菌剂抗性监测中的应用，具体公开一种快速鉴定瓜类疫霉CesA3基因的核苷酸点突变及其对CAA类杀菌剂抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。

背景技术

由瓜类疫霉侵染黄瓜导致的黄瓜疫病在我国黄瓜产区的一种常见病害，在北京、上海、南京、杭州和武汉郊区的黄瓜种植区尤为常见。该病害可以对黄瓜产量造成严重损失，甚至可以减产80％。瓜类疫霉还可以侵染葫芦科作物，包括黄瓜、西葫芦、哈密瓜、冬瓜、葫芦等作物，引起产量损失。

目前化学防治仍是植物病害防治过程中使用的重要手段。用于防治瓜类疫霉等植物病原卵菌引起的病害的杀菌剂主要有以甲霜灵为代表的苯酰胺类杀菌剂，然而病原卵菌对该类杀菌剂广泛产生抗药性，因此在生产实践中主要以复配方式使用苯酰胺类杀菌剂。羧酸酰胺类杀菌剂(Carboxylic acid amide，CAAs)是一类新型用于卵菌病害防治的杀菌剂，其中主要代表有烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺以及异丙菌胺等。然而在使用该类杀菌剂若干年之后，已经在田间采集的葡萄霜霉病菌中检测到对CAA类杀菌剂产生抗性的群体。

植物病原菌抗药性检测方法有以下几种：菌落生长测定法、菌丝干重测定法，这两种方法能准确反映杀菌剂对菌体生长的抑制作用；孢子萌发测定法适用于测定容易产生孢子的病原菌，如小麦锈病和黄瓜霜霉病菌；还有琼脂展布法、抑菌圈测定法等。但是这些方法都需要通过测定药剂对病原菌的EC₅₀来比较敏感和抗性菌株的差异，试验需要多个处理，多次重复，因此检测周期长、工作量大、消耗的人力资源和材料较多。而且上述常规方法检测灵敏度低，抗药性菌株的突变频率在1％以上才能被检测到。由于病原菌的繁殖、传播速度一般都很快，在自然界存在的数量又很大，因此经过几次药剂选择后，抗药性病原菌亚群体可能会成为致病病原群体的主体，造成病害大流行。

随着分子生物学技术的飞速发展及其应用范围的不断扩展，分子技术开始在病原菌抗药性检测中应用。与传统的检测方法比较，不但节省了检测时间、提高了工作效率，而且提高了检测的灵敏度，检测频率在10^-5～10^-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早起诊断的理想方法。可以预测，分子检测技术将在病害的可持续管理系统中发挥愈来愈重要的作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测瓜类疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法及其专用引物对。

本发明提供的检测或辅助检测瓜类疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测瓜类疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为497bp的片段，则所述待测瓜类疫霉中CesA3基因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点指瓜类疫霉中CesA3基因的自5’末端起第3455位核苷酸为C。

所述CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3455位核苷酸也就是SEQ ID NO：7中自5’末端起第3455位核苷酸。

上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为68.5℃。

本发明所提供的检测或辅助检测瓜类疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示DNA分子组成。

本发明的另一个目的是提供瓜类疫霉中CesA3基因或蛋白的突变位点。

本发明所提供的瓜类疫霉中CesA3基因的一个突变位点，为瓜类疫霉中CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3455位核苷酸为C。所述CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3455位核苷酸也就是SEQ ID NO：7中自5’末端起第3455位核苷酸。

本发明所提供的瓜类疫霉中CesA3蛋白的一个突变位点，为瓜类疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1109位氨基酸为亮氨酸。所述CesA3蛋白的自N端起第1109位氨基酸也就是SEQ ID NO：6中自N端起第1109位氨基酸。

上述任一所述突变位点在鉴定瓜类疫霉抗药性中的应用也属于本发明的保护范围；所述抗药性为抗CAA类杀菌剂。

所述CAA类杀菌剂为氟吗啉、烯酰吗啉、异丙菌胺、双炔酰菌胺。

上述应用中，存在所述突变位点的瓜类疫霉具有或候选具有抗药性。

SEQ ID NO：6所示蛋白或SEQ ID NO：7所示基因也属于本发明的保护范围。

本发明提供的检测瓜类疫霉对CAA类杀菌剂产生抗药性的点突变的方法，可以用于快速、灵敏地检测田间瓜类疫霉对CAA类杀菌剂的抗性发生发展动态，及时调整病害防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。

本发明方法具有以下技术优势和特点：

结果可靠：用本发明建立的分子检测方法检测菌株DNA，所有的抗性菌株都能与敏感菌株区分开来，其结果可靠性有保证。

简单快速：传统的生物学测定方法从病菌分离，到敏感性检测，至少需要6-8天时间，工作量大，周期长。而分子检测从提DNA到PCR分析，最多需2天时间，省时省工。

附图说明

图1为PCR检测瓜类疫霉抗CAA类杀菌剂突变体。A：不同的AS-PCR引物进行温度梯度PCR的结果，表明各个引物的特异性存在差异；B：PMF+PMR1109B检测瓜类疫霉敏感菌株和对CAA类杀菌剂的抗性菌株。其中TX21、TX33、TJ90和TJ12为敏感菌株；F58-4、I63-2、D63-1，F63-11和D70-3为抗药性菌株；CK为空白对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

文中“抗性菌株”均指对CAA类杀菌剂抗性的瓜类疫霉菌；“敏感菌株”均指对CAA类杀菌剂敏感的瓜类疫霉菌。其中，CAA类杀菌剂可为氟吗啉、烯酰吗啉、异丙菌胺、双炔酰菌胺。

下述实施例中使用的瓜类疫霉菌株为：抗性菌株F58-4、I63-2、D63-1，F63-11和D70-3；敏感菌株TX21、TX33、TJ90和TJ12。

上述菌株分别采自：TX21、TX33、F58-4、F63-11(天津市西青区)，TJ90、TJ12(天津市河西区)，I63-2、D63-1、D70-3(美国)，经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定为瓜类疫霉。上述各个菌株均经过菌落生长测定法进行抗药性验证。

实施例1、瓜类疫霉对CAA类杀菌剂氟吗啉、烯酰吗啉和异丙菌胺的敏感性测定

五株瓜类疫霉抗性菌株，菌株编号分别为F58-4、I63-2、D63-1，F63-11和D70-3；四株瓜类疫霉敏感菌株，菌株编号分别为TX21、TX33、TJ90和TJ12。

白云豆培养基：白云豆粉60g，琼脂粉7g，蒸馏水定容至1L，121℃湿热灭菌20分钟。

1、实验步骤如下：

1)将氟吗啉、烯酰吗啉和异丙菌胺分别用甲醇配成10⁵μg/ml的母液。对于四株瓜类疫霉敏感菌株的敏感性测定，将氟吗啉逐级稀释成500μg/mL、700μg/mL、900μg/mL、1.00×10³μg/mL、1.25×10³μg/mL、1.50×10³μg/mL的浓度梯度，将烯酰吗啉稀释成100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL的浓度梯度，将异丙菌胺稀释成200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL的浓度梯度；对于五株瓜类疫霉抗性菌株的敏感性测定，氟吗啉、烯酰吗啉和异丙菌胺三种供试药剂均被逐级稀释成5×10³μg/mL、1×10⁴μg/mL、2×10⁴μg/mL、4×10⁴μg/mL、8×10⁴μg/mL、1×10⁵μg/mL的浓度梯度。

2)用移液枪吸取组合物药液60μl加入已灭菌的冷却至45℃的60ml白云豆培养基中，使溶剂含量为1‰，混匀，将带药的培养基倒入直径为9cm的培养皿中，设只加60μl甲醇的处理为空白对照，每个复配比例药剂设3次重复。

3)瓜类疫霉在白云豆平板上培养5天后，沿菌落边缘用打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤2)中的带药和对照培养基中，置于28℃培养箱中黑暗培养，4d后测量菌落直径。

4)十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各复配比例对供试菌株的菌丝生长的抑制率。然后将抑制率转化成机率值(Y)，药剂浓度转换成以10为底的对数值(X)，在Microsoft Excel中作回归直线，分别求出两单剂及其各配比混剂对水稻纹枯病菌的毒力回归曲线方程Y＝a+bX，以及相关系数r和有效抑制中浓度EC₅₀值。

2.结果

表1  9株瓜类疫霉菌株对氟吗啉、烯酰吗啉和异丙菌胺的敏感性

敏感性测定结果表明，氟吗啉、烯酰吗啉和异丙菌胺分别对敏感菌株TX21、TX33、TJ90和TJ12对的EC₅₀均小于2μg/mL，而对抗性菌株F58-4、I63-2、D63-1，F63-11和D70-3的EC₅₀均大于20μg/mL，有的甚至大于100μg/mL。

实施例2、瓜类疫霉中CesA3基因和CesA3蛋白突变位点的发现

1、菌株：抗性菌株为F58-4，敏感菌株为TX21。

2、方法：

1)菌株培养：用白云豆培养基(白云豆粉60g，琼脂粉7g，蒸馏水定容至1L，121℃湿热灭菌后备用)于28℃培养瓜类疫霉病菌。将预培养的瓜类疫霉菌接种在铺有玻璃纸的白云豆培养基上，28℃黑暗培养5d后收集菌丝，液氮冰冻后于-80℃保存，用于提取基因组DNA。

2)分别提取抗性菌株和敏感菌株的基因组DNA。

3)纤维素合酶CesA3基因的PCR扩增

引物：PmA3F1(5’-TCTCGTGTCGGACGGACCAA-3’)和PmA3R1(5’-TCTGCATGTCCAGCCTTCC-3’)；

PCR反应体系如下：

50-μl的PCR体系：

PCR反应条件如下：

4)测序

将PCR产物进行测序。抗性菌株的纤维素合酶CesA3基因全长共3550bp，序列如SEQ ID NO：7所示，其中包含130bp的内含子序列，cDNA编码1139个氨基酸。

序列如SEQ ID NO：6所示。

5)序列比对

将抗性菌株和敏感菌株的序列进行比对。结果表明：与敏感菌株相比，抗性菌株中基因组基因CesA3自5’末端起第3455位核苷酸由G突变为C，对应基因CesA3的cDNA序列3325位。该点碱基突变导致氨基酸序列在1109位氨基酸发生突变，由缬氨酸(V，Val)突变为亮氨酸(L，Leu)。

PCR产物测序结果表明，抗性菌株在3455位都发生突变并由G突变为C，分析测序的峰线图，可发现该位点峰线图清晰单一明确，表明该位点的突变为纯合突变。因此，该位点的突变与瓜类疫霉对CAA类杀菌剂产生抗性相关。

实施例3、检测瓜类疫霉中突变位点的方法

一、引物设计

菌株为实施例1中所用菌株。

引物如表2.

表2.PCR检测瓜类疫霉对CAA类杀菌剂的抗性菌株中使用的引物

Primers	Sequence(5’-3’)
		PMF	ATCTACGCTCGCGGTACCAAG(序列1)
PMR1109A	CGAACACCACGATGTACACCAG(序列2)
		PMR1109B	CGAACACCACGATGTACACCTG(序列3)
PMR1109C	CGAACACCACGATGTACACCCG(序列4)
		PMR1109D	CGAACACCACGATGTACACCGG(序列5)

PCR反应体系如下：

50-μl的PCR体系：

PCR反应条件如下：

结果如图1A所示。结果表明：当退火温度为68.5℃时，引物对PMF和PMR1109B能够从抗性菌株的基因组DNA中扩增出497bp的片段，而不能从敏感菌株中扩增出相应的片段，表明该引物可以用来检测突变位点。引物PMR1109A在50-70℃的退火温度下均能从敏感菌株和抗性菌株的基因组DNA中扩增出497bp的片段，表明引物PMR1109A不能用来检测突变位点。而引物PMR1109C和引物PMR1109D的特异性不如引物PMR1109B好。

将引物对PMF和PMR1109B对抗性菌株的扩增产物进行测序，结果PCR产物序列为SEQ ID NO：7中自5’末端起第2980至3476位核苷酸序列。

二、检测突变位点

以待测瓜类疫霉的基因组DNA为模板，用引物对PMF和PMR1109B进行PCR扩增，若得到497bp的片段，则判定所检测的瓜类疫霉中基因CesA3自5’末端起第3455位核苷酸为C(即SEQ ID NO：7中自5’末端起第3455位核苷酸为C)，进一步判定所述菌株为抗性菌株；若得不到497bp的片段，则判定所检测的瓜类疫霉中基因CesA3自5’末端起第3455位核苷酸为G(即SEQ ID NO：7中自5’末端起第3455位核苷酸为G)，进一步判定所述菌株为敏感菌株。

PCR扩增体系及反应条件与实验一中一致，退火温度为68.5℃。

待测菌株为：抗性菌株F58-4、I63-2、D63-1，F63-11和D70-3，敏感菌株TX21、TX33、TJ90和TJ12。

结果如图1B所示。结果表明，仅能从抗性菌株F58-4、I63-2、D63-1，F63-11和D70-3中扩增出目标片段，而不能从敏感菌株TX21、TX33、TJ90和TJ12中扩增出片段。因此采用引物PMR和PMR1109B，在退火温度为68.5℃时进行PCR扩增，可以用于有效检测瓜类疫霉病菌是否对CAA类杀菌剂产生了抗药性。

Claims (9)

1.一种检测或辅助检测瓜类疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测瓜类疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为497bp的片段，则所述待测瓜类疫霉中CesA3基因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点指瓜类疫霉中CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3455位核营酸为C。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中，退火温度为68.5℃。

3.一种检测或辅助检测瓜类疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示DNA分子组成。

4.瓜类疫霉中CesA3基因的一个突变位点，为瓜类疫霉中CesA3基因的自5’末端起第3455位核苷酸为C。

5.瓜类疫霉中CesA3蛋白的一个突变位点，为瓜类疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1109位氨基酸为亮氨酸。

6.权利要求4或5所述突变位点在鉴定瓜类疫霉抗药性中的应用；所述抗药性为抗CAA类杀菌剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：具有所述突变位点的瓜类疫霉具有具有抗药性。

8.SEQ ID NO：6所示蛋白。

9.SEQ ID NO：7所示基因。