CN117737119A - 大豆GmWRKY33基因、重组载体及其转化体在提高作物中病程相关蛋白基因PR的表达量中的应用 - Google Patents

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徐鹏飞
张淑珍
孙岩
吴俊江
方馨
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Abstract

本发明提供了大豆GmWRKY33基因、重组载体及其转化体在提高作物中病程相关蛋白基因PR的表达量中的应用,属于生物工程技术领域,所述大豆GmWRKY33基因不仅能够提高作物中病程相关蛋白基因PR的表达量,还能提高作物抗氧化防御系统的关键酶活性,进而提高作物对大豆疫霉根腐病的抗性。本发明能够为抗大豆疫霉根腐病相关机制的研究以及推进植物防御系统的研究和应用提供重要的理论基础和支持,并为培育抗病大豆新品种提供了宝贵的基因资源。

Description

大豆GmWRKY33基因、重组载体及其转化体在提高作物中病程 相关蛋白基因PR的表达量中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,尤其涉及大豆GmWRKY33基因、重组载体及其转化体在提高作物中病程相关蛋白基因PR的表达量中的应用。
背景技术
大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann)侵染引起的严重危害世界大豆生产的土传性卵菌病害。该病菌具有生理小种变化快,毒力结构复杂,容易导致抗病品种的抗性丧失的特点。
当植物受到逆境胁迫时,高温、高盐、干旱、病原菌等逆境信号通过一系列信号转导途径级联放大进入细胞核内,从而激活防御相关基因表达,进而参与到植物对逆境胁迫的应答反应中。其中,MYC、WRKY、ERF、bZIP等家族转录因子在这一系列调控机制中起到非常重要的作用。其中,WRKY家族作为植物特有的转录因子,主要参与并调控植物生长发育、形态建成、代谢调控和抗逆信号转导途径建立的过程,因其蛋白质序列N端的60个氨基酸组成的高度保守结构域WRKYGQK而得名。WRKY家族转录因子在植物各种生命活动进程中广泛存在,暗示其在植物进化历程中发挥着关键作用。
目前研究表明,在多种植物中,WRKY转录因子对不同生物胁迫的防御反应中往往表现出积极的作用。例如:Fan等(Fan S,Fan S,Dong L,et al.GmWRKY31 andGmHDL56Enhances Resistance to Phytophthora sojae by Regulating Defense-Related GeneExpression in Soybean[J].Frontiers in Plant Science,2017,8)在大豆中发现GmWRKY31可与GmHDL56互作,增强了对下游靶基因GmNPR1的激活表达,启动系统获得性免疫反应SAR,正调控大豆对大豆疫霉菌的抗性。此外,GmWRKY53转录因子的表达能够增强大豆对根系猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme)的抗性和防御大豆植株胞囊线虫(Soybean cyst nematode)的危害。在水稻中,OsWRKY6可以通过直接激活自身OsICS1和OsPR10a的表达,从而正调控水稻对白叶枯病菌(Xanthomonas orzae pv.Oryzae,Xoo)的应答反应。在小麦中,过表达TaWRKY70增强了转基因小麦对条锈病菌(Puccinia striiformisf.sp.Tritici,Pst)的抗性。
目前,人们对大豆疫霉菌的分子防御机制尚不明晰。而通过基因工程手段,挖掘抗病相关基因,研究其分子防御机制,对于阐明大豆应答生物胁迫的分子机理及抗病基因工程育种具有重要意义。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供大豆GmWRKY33基因、重组载体及其转化体在提高作物中病程相关蛋白基因PR的表达量中的应用,所述大豆GmWRKY33基因过表达时能够提高大豆中病程相关蛋白基因的表达量及抗氧化防御系统的关键酶活性。
为实现上述目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了大豆GmWRKY33基因在提高作物中病程相关蛋白基因PR的表达量中的应用,在作物中过表达大豆GmWRKY33基因,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了大豆GmWRKY33基因在提高作物抗氧化防御系统的关键酶活性中的应用,在作物中过表达大豆GmWRKY33基因,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体,包括大豆GmWRKY33基因和pCAMBIA3301过表达载体,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了所述过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体的构建方法,包括如下步骤:
(1)对pCAMBIA3301过表达载体进行线性化处理,获得线性化表达载体pCAMBIA3301;
(2)将大豆GmWRKY33基因连接至pMDTM18-T载体上,再转化至大肠杆菌感受态细胞中扩繁,获得pMDTM18-T-GmWRKY33;
(3)以获得的pMDTM18-T-GmWRKY33为模板,设计两端带有载体末端序列的特异性引物,并通过PCR扩增出GmWRKY33基因的目的片段;
(4)将目的片段插入线性化表达载体pCAMBIA3301中,获得过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体。
本发明还提供了所述的重组载体在提高作物对大豆疫霉根腐病抗性中的应用。
本发明还提供了一种过表达大豆GmWRKY33基因的转化体,将过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体导入大肠杆菌中,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
优选的,所述大肠杆菌为Trans1-T1感受态细胞。
本发明还提供了所述的转化体在提高作物对大豆疫霉根腐病抗性中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明通过实验研究发现,大豆GmWRKY33基因不仅能够通过调控PR基因的表达来参与到植物的抗病防御反应中,还能够通过抗氧化防御途径来提高大豆对大豆疫霉菌的抗性。本发明能够为抗大豆疫霉根腐病相关机制的研究提供重要的基因基础及理论支持,为推进植物防御系统的研究和应用以及培育高抗病的大豆新品种提供宝贵的基因资源,在大豆抗病基因工程育种中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为GmWRKY33基因的cDNA扩增电泳图,其中,左侧泳道为DNAMarker,右侧泳道为DL2000;
图2为GmWRKY33基因的核苷酸及编码的蛋白氨基酸序列分析结果;
图3为对GmWRKY33基因的结构域分析结果;
图4为对GmWRKY33基因的系统进化树分析结果;
图5为对GmWRKY33基因编码的蛋白质的二级结构预测分析结果;
图6为对GmWRKY33基因编码的蛋白质的三级结构预测分析结果;
图7为对GmWRKY33基因的氨基酸跨膜结构分析结果;
图8为GmWRKY33蛋白的亚细胞定位结果;
图9为GmWRKY33基因在高抗大豆品种“绥农10”及高感大豆品种“东农50”组织器官中的差异表达量检测结果;
图10为GmWRKY33基因在高抗大豆品种“绥农10”及高感大豆品种“东农50”接种大豆疫霉菌后的差异表达分析结果;
图11为GmWRKY33基因受MeJA(茉莉酸)植物激素诱导的差异表达结果;
图12为GmWRKY33基因受ET(乙烯)植物激素诱导的差异表达结果;
图13为GmWRKY33基因受SA(水杨酸)植物激素诱导的差异表达结果;
图14为GmWRKY33基因受ABA(脱落酸)植物激素诱导的差异表达结果;
图15为GmWRKY33-OE转基因大豆毛状根的GUS染色结果;
图16为GmWRKY33-OE转基因大豆毛状根的qRT-PCR检测结果;
图17为GmWRKY33-OE转基因大豆毛状根蛋白的westernblot检测结果;
图18为GmWRKY33-RNAi转基因大豆毛状根的bar试纸条检测结果;
图19为GmWRKY33-RNAi转基因大豆毛状根的bar基因PCR检测结果;
图20为GmWRKY33-RNAi转基因大豆毛状根的qRT-PCR检测结果;
图21为转基因大豆毛状根接菌后的抗病性鉴定结果;
图22为转基因大豆毛状根接菌后的病斑面积检测结果;
图23为转基因大豆毛状根接菌后的大豆疫霉菌生物量检测结果;
图24为转基因毛状根中PR1、PR2、PR3和PR4基因的表达量检测结果;
图25为转基因毛状根中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定结果;
图26为转基因毛状根中过氧化物酶(POD)活性的测定结果;
图27为转基因毛状根中过氧化氢酶(CAT)活性的测定结果;
图28为转录组测序差异表达基因的火山图;
图29为GmWRKY33-OE转基因大豆毛状根中胁迫相关基因的表达检测结果;
图30为GmWRKY33-RNAi转基因大豆毛状根中胁迫相关基因的表达检测结果;
图31为酵母单杂交试验验证GmWRKY33直接结合GmERF1B和GmWRKY72启动子;
图32为双荧光素酶报告系统验证GmWRKY33激活GmERF1B和GmWRKY72的表达结果;
图33为对LUC/REN相对活性的检测结果;
上述图中的“W33-OE”和“WRKY33-OE”均为GmWRKY33-OE的简写,“W33-RNAi”和“WRKY33-RNAi”均为GmWRKY33-RNAi的简写。
具体实施方式
本发明提供了大豆GmWRKY33基因在提高作物中病程相关蛋白基因PR的表达量中的应用,在作物中过表达大豆GmWRKY33基因,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
在本发明中,所述大豆GmWRKY33基因的CDS序列为:ATGGCATCTTCTTCTGGTAGTTTAGACACCTCTGCAAGTGCAAACTCCTTCACCAACTTCACCTTCTCCACACACCCTTTCATGACCACTTCTTTCTCTGACCTTCTTGCTTCTCCCACAGACAACAACAAACCACCACATGGTGGTGGTGGTGGTTTGTCTGAGAGAACTGGCTCTGGTGTCCCCAAATTCAAGTCCACACCACCACCTTCTCTGCCTCTCTCTCCCCCTCCCATTTCTCCTTCTTCCTACTTTTCTATTCCTCCTGGTTTGAGCCCTGCTGAGCTTCTTGACTCACCTGTTCTCCTTAACTCTTCCAACATTCTGCCATCTCCAACAACTGGAGCATTTGTTGCTCGGAGCTTCAATTGGAAGAGCAGTTCCGGGGGGAACCAGCGAATTGTCAAAGAAGAAGACAAAGGCTTCTCAAATTTCTCCTTTCAAACCCAACAAGGACCTCCTGCTTCATCCACAGCAACATATCAGTCTTCAAATGTCACAGTTCAAACACAACAGCCATGGAGTTATCAGGAGACCACAAAGCAGGATAATTTTTCTTCAGGAAAGAGCATGATGAAAACTGAAAAATCTTCATCCATGCAAAGTTTTTCCCCTGAGATTGCTAGTGTCCAAAATAATCATAGCAATGGGTTTCAATCGGATTATGGCAATTACCCCCCACAATCTCAGACCTTAAGCAGAAGGTCAGATGATGGGTACAATTGGAGGAAATATGGCCAAAAACAAGTGAAGGGAAGTGAAAATCCAAGAAGTTATTACAAATGCACATACCCCAACTGCCCTACAAAGAAGAAGGTTGAGAGGTCTTTAGATGGACAAATTACTGAGATCGTTTATAAGGGTACTCATAACCATCCTAAGCCTCAAAATACTAGGAGAAACTCATCAAATTCCTCTTCTCTTGCAATCCCTCATTCAAATCCCATCAGCGCTGAAATCCCAGATCAATCCTATGCCACACATGGAAGTGGACAAATGGATTCAGCTGCCACCCCAGAAAACTCATCAATATCAATTGGAGATGATGATTTTGAGCAGAGTTCTCAAAAGTGTAAATCAGGAGGGGATGAATATGATGAAGATGAACCTGATGCCAAAAGATGGAAAATTGAAGGTGAAAATGAGGGTATGTCTGCCCCTGGAAGTAGAACAGTAAGAGAACCTAGAGTTGTAGTTCAGACAACCAGTGACATTGATATCCTAGATGATGGGTATAGATGGAGAAAATACGGGCAGAAAGTAGTGAAGGGCAATCCAAATCCAAGGAGTTACTACAAGTGTACACACCCAGGATGTCCAGTGAGGAAGCATGTGGAAAGAGCTTCACATGACCTAAGGGCTGTGATCACAACCTATGAGGGGAAGCACAACCATGATGTTCCTGCAGCTCGTGGCAGTGGCAGCCATTCTGTTAACAGACCAATGCCAAACAATGCTTCAAACCCTACCAACACTGCAGCCACTGCCATAAGTCCCTTGCAAGTGATCCAACACAGTGACAATTCCCATCAGAACCAAAGATCTCAAGCACCACCAGAGGGGCAATCACCCTTCACCCTAGAGATGCTACAAAGTCCAGGAAGTTTTGGATTCTCAGGGTTTGGGAATCCAATGCAATCTTACATGAATCAGCAGCAACAACAACTATCTGACAATGTTTTCTCTTCCAGAGCCAAGGAGGAGCCTAGAGATGACATGTTCCTTGAGTCTCTACTATGCTGA(SEQ ID No.1)
所述大豆GmWRKY33基因编码的蛋白质的氨基酸序列为:MASSSGSLDTSASANSFTNFTFSTHPFMTTSFSDLLASPTDNNKPPHGGGGGLSERTGSGVPKFKSTPPPSLPLSPPPISPSSYFSIPPGLSPAELLDSPVLLNSSNILPSPTTGAFVARSFNWKSSSGGNQRIVKEEDKGFSNFSFQTQQGPPASSTATYQSSNVTVQTQQPWSYQETTKQDNFSSGKSMMKTEKSSSMQSFSPEIASVQNNHSNGFQSDYGNYPPQSQTLSRRSDDGYNWRKYGQKQVKGSENPRSYYKCTYPNCPTKKKVERSLDGQITEIVYKGTHNHPKPQNTRRNSSNSSSLAIPHSNPISAEIPDQSYATHGSGQMDSAATPENSSISIGDDDFEQSSQKCKSGGDEYDEDEPDAKRWKIEGENEGMSAPGSRTVREPRVVVQTTSDIDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTHPGCPVRKHVERASHDLRAVITTYEGKHNHDVPAARGSGSHSVNRPMPNNASNPTNTAATAISPLQVIQHSDNSHQNQRSQAPPEGQSPFTLEMLQSPGSFGFSGFGNPMQSYMNQQQQQLSDNVFSSRAKEEPRDDMFLESLLC*(SEQ ID No.2)。
本发明还提供了大豆GmWRKY33基因在提高作物抗氧化防御系统的关键酶活性中的应用,在作物中过表达大豆GmWRKY33基因,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体,包括大豆GmWRKY33基因和pCAMBIA3301过表达载体,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了所述过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体的构建方法,包括如下步骤:
(1)对pCAMBIA3301过表达载体进行线性化处理,获得线性化表达载体pCAMBIA3301;
(2)将大豆GmWRKY33基因连接至pMDTM18-T载体上,再转化至大肠杆菌感受态细胞中扩繁,获得pMDTM18-T-GmWRKY33;
(3)以获得的pMDTM18-T-GmWRKY33为模板,设计两端带有载体末端序列的特异性引物,并通过PCR扩增出GmWRKY33基因的目的片段;
(4)将目的片段插入线性化表达载体pCAMBIA3301中,获得过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体。
本发明还提供了所述的重组载体在提高作物对大豆疫霉根腐病抗性中的应用。
本发明还提供了一种过表达大豆GmWRKY33基因的转化体,将过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体导入大肠杆菌中,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
在本发明中,所述大肠杆菌优选为Trans1-T1感受态细胞。
本发明还提供了所述的转化体在提高作物对大豆疫霉根腐病抗性中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下使用的pCAMBIA1302、pCAMBIA3301、pFGC5941、pHIS2和pGreenII 0800载体菌液均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
实施例1大豆GmWRKY33基因的克隆
1.1根据GmWRKY33的编码区序列,用Primer Premier 5设计引物,扩增该基因的CDS全长序列,引物序列为:
GmWRKY33 F(5’-ATGGCATCTTCTTCTG-3’)(SEQ ID No.3);
GmWRKY33 R(5’-TCAGCATAGTAGAGACTCAA-3’)(SEQ ID No.4);
1.2RNA提取
将高抗大豆品种“绥农10”(保存于东北农业大学大豆生物学教育部重点试验室)的叶片在液氮中磨成粉末,取100mg粉末于1.5mL的离心管(EP管)中,加入1mL Trizol试剂,立即震荡20s使其充分裂解并放置于冰上5min,加入200μL氯仿,充分混匀并静置8min,将EP管加入低温冷冻离心机中,4℃,12,000×g下离心15min,离心结束后吸取500μL上清到新的AXgen无酶EP管,取500μL异丙醇到EP管中混匀,随后置于冰上静止8min,4℃,12,000×g离心10min,弃上清,使用由DEPC水配制的75%乙醇清洗沉淀,弃上清,待沉淀干燥后,加入适量DEPC水溶解RNA,获得RNA。
1.3 RNA的反转录
根据ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司,日本)的使用说明进行,具体为:设置如表1所示的反转录体系以及37℃,15min;98℃,5min的反转录程序;将上述提取的RNA在65℃条件下变性5min,变性结束后立即置于冰上冷却,反应结束后稀释并-20℃保存,获得cDNA。
表1 RNA反转录体系
1.4 PCR反应
以上述得到的cDNA为模板,使用已合成好的扩增引物序列,设定如表2所示的PCR反应体系以及98℃3min预变性;(98℃10s,60℃5s,68℃5s)×35;68℃10min延伸的反应程序,克隆GmWRKY33的CDS序列(1743bp)。将PCR扩增得到的产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收目的片段连接至pMDTM18-T载体(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)上,获得pMDTM18-T-GmWRKY33,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)后进行测序比对。电泳结果如图1所示。
表2 GmWRKY33克隆的PCR反应体系
实施例2构建重组载体
1.1载体的线性化
根据AXgen质粒提取说明书提取载体质粒,具体步骤为:取经过二次活化的pCAMBIA1302亚细胞定位载体菌液、pCAMBIA3301过表达载体菌液和pFGC5941干扰载体菌液于2mL离心管中,室温、12,000×g离心1min,倒掉EP管中的废液,加入250μL的SolutionⅠ于EP管中重悬菌体,吸取250μL的SolutionⅡ于EP管中并轻柔混匀,吸取350μL的SolutionⅢ加入到上述体系中并轻柔混匀,室温、12,000×g离心10min,用移液枪将EP管中的上清加入到试剂盒自带的制备管中,室温、12,000×g离心2min,倒掉制备管过滤后的废液,取500μL的Wash BufferⅠ于制备管中,室温、12,000×g离心2min,倒掉制备管过滤后的废液,取700μLWash BufferⅡ于制备管,室温、12,000×g离心2min,倒掉制备管过滤后的废液,重复洗涤一次,室温、12,000×g空离心制备管1min,然后将制备管转移至试剂盒自带的EP管中,用移液枪吸取40μL Elution Buffer于转移后的EP管中,室温、12,000×g离心2min,重复洗脱一次。用移液枪吸取洗脱质粒进行双酶切,获得线性化载体。所述双酶切的体系如表3所示。
表3载体双酶切体系
1.2胶回收
参照OMEGA公司的胶回收试剂盒说明书对线性化载体进行胶回收,具体步骤为:将琼脂糖凝胶放置到蓝光切胶仪上,切下分离的目的片段置于1.5mLEP管中,加入200μL的Binding Buffer,置于金属浴60℃孵育5min至凝胶完全溶化,再将溶胶转移至试剂盒自带的吸附柱中,室温、12,000×g离心30s,倒掉EP管中的过滤液;吸取300μL的Binding Buffer加入到吸附柱中,室温、12,000×g离心30s,倒掉EP管中的过滤液;吸取700μL的WashBuffer加入到吸附柱中,室温、12,000×g离心30s,倒掉EP管中的过滤液,重复洗涤一次;室温、12,000×g空离心吸附柱1min,将吸附柱转移至新的1.5mL EP管,加入20μL ElutionBuffer,室温、12,000×g离心1min,重复洗脱一次。
利用超微量核酸蛋白分析仪检测胶回收产物的浓度,将其稀释至100ng/μl~400ng/μl,确保重组反应加样符合线性化载体和插入片段的最佳使用量。
1.3 GmWRKY33目的片段的扩增
按照ClonExpress II One Step Cloning Kit(购自北京全式金生物技术股份有限公司)说明书,利用Vazyme官网引物设计软件CE Design V1.04分别设计两端带有载体末端序列的特异性引物,以pMDTM18-T-GmWRKY33为模板,PCR扩增出GmWRKY33的目的片段。所述特异性引物的序列如表4所示。
表4两端带有载体末端序列的特异性引物
注:引物名称末位的“F”代表正向引物,“R”代表反向引物。
1.4重组反应
冰上配置如表5所示的重组反应体系。将上述1.3获得的目的片段分别插入线性化表达载体pCAMBIA3301、pCAMBIA1302、pFGC5941中,分别获得重组载体pCAMBIA3301-GmWRKY33、pCAMBIA1302-GmWRKY33、pFGC5941-GmWRKY33。
表5重组载体的反应体系
实施例3大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞的转化
用移液枪将上述实施例2的1.4部分重组反应后的PCR管中的反应液转移到100μLTrans1-T1感受态细胞中,轻柔混匀,置于冰上25min,转移到42℃水浴锅热激45s,再立刻冰浴2min。在超净工作台内用移液枪取LB液体培养基500μL,恒温摇床37℃、150rpm条件下复苏1h,室温、5,000×g离心2min,在超净工作台内用移液枪取出适量上清并用剩余上清重悬菌体,获得复苏菌液;取200μL获得的复苏菌液于LB平板培养基(含50mg/mLKana),涂布均匀,37℃培养箱恒温培养过夜。
在培养平板上挑取若干单菌落于适量LB筛选培养基(含50mg/mLKana),37℃、220rpm恒温摇床培养过夜。在超净工作台内取2μL培养菌液进行PCR扩增(所述PCR扩增的引物与表4相同)。
PCR反应结束后从PCR反应管中取20μL反应液进行电泳。选择目的条带扩增成功的样品对应菌液保存为甘油菌,并提取质粒转化至农杆菌K599感受态中。
所述PCR扩增的PCR反应体系如表6所示,反应程序为:94℃3min预变性;(94℃30s,60℃30s,72℃1min)×30;72℃10min延伸。
表6重组表达载体菌液PCR鉴定体系
此外,按照实施例2中的方法,以pMDTM18-T-GmWRKY33为模板,构建如下载体:
pCAMBIA3301-GmWRKY33、pCAMBIA1302-GmWRKY33-GFP、pFGC5941-GmWRKY33、PGADT7-GmWRKY33(与GmWRKY33-AD相同)、PGmERF1B-pHIS2、PGmWRKY72-pHIS2、pGmERF1B-pGreenII 0800(与p35S:REN-pGmGmERF1B:LUC相同)和pGmWRKY72-pGreenII 0800(与p35S:REN-pGmWRKY72:LUC相同);
并按照实施例3中的方法将构建的上述载体转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中。
实施例4大豆GmWRKY33基因的生物信息学分析
根据PROSITE对大豆GmWRKY33基因进行结构域预测,用MEGA5.1对大豆GmWRKY33基因进行进化树分析,用分子模拟软件对大豆GmWRKY33基因进行二级结构分析,用Swiss-Model对大豆GmWRKY33基因进行三级结构分析,用TMHMM对大豆GmWRKY33基因进行氨基酸跨膜结构分析。结果如图3至图7所示。
利用在线软件对GmWRKY33基因进行结构域分析的结果显示,GmWRKY33氨基酸序列含有两个高度保守的WRKYGQK结构域,属于第一类WRKY家族转录因子,其功能保守结构域为从第236位氨基酸至第468位氨基酸的肽段序列。
在NCBI网站下载与GmWRKY33同源性较高的大豆和拟南芥转录因子的氨基酸序列,利用MEGA5.1软件构建系统发育树的结果显示,GmWRKY33与GmWRKY49同源性最高为94.48%,与GmWRKY20同源性最低为59.43%。
利用在线软件PredictProtein分析GmWRKY33二级结构成分的结果显示,GmWRKY33的二级结构包括α-螺旋(h),扩展长链(e),β转角(t)和无规则卷曲(c)。
利用在线软件Swiss-Model分析GmWRKY33蛋白WRKY结构域的3D结构的结果显示:GmWRKY33蛋白的WRKY结构域含有4-5个β-折叠结构,且与拟南芥AtWRKY33的结构相似。
利用TMHMM软件对GmWRKY33基因的氨基酸跨膜结构进行预测的结果显示,GmWRKY33基因的氨基酸存在跨膜区域的概率极低,在膜内的概率也很小,在膜外的概率很高,由此推测,GmWRKY33基因没有跨膜转运信号。
实施例5GmWRKY33蛋白的亚细胞定位
本实验采用原生质体提取试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行。
利用大量法提取pCAMBIA1302-GmWRKY33-GFP重组质粒,并通过PEG介导法将其转化至拟南芥原生质体细胞,在共聚焦荧光显微镜下观察GmWRKY33-GFP融合蛋白(即将pCAMBIA1302-GmWRKY33-GFP转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中后表达的蛋白)的亚细胞定位情况,并以空载体pCAMBIA1302-GFP(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)作为空白对照,以pCAMBIA1302-GmERF5-GFP(记载于《Lidong D,Yingxin C,Junjiang W,etal.Overexpression of GmERF5,a new member of the soybean EAR motif-containingERF transcription factor,enhances resistance to Phytophthora sojae insoybean.[J].Journal ofexperimental botany,2015,66(9):》中)为核定位对照。结果如图8所示。
其中,所述大量法提取pCAMBIA1302-GmWRKY33-GFP重组质粒的具体步骤为:在无菌操作台内取50μL含有pCAMBIA1302-GmWRKY33的大肠杆菌菌液扩繁至50mL,用碱性SDS溶液裂解大肠杆菌细胞,取30mL加入50mL离心管中,室温、3,500×g离心10min,将上清废液丢弃,使用干净的纸巾吸干容器壁上多余的液体,向管底的大肠杆菌沉淀中加入2.5mL含有RNaseA的溶液I,将沉淀完全吹打溶解在溶液I中,将细胞悬浮液转移到50mL离心管中,加入2.5mL溶液II,充分混匀,室温孵育2min,得到粘稠状的裂解液;加入3.2mL溶液III,盖上盖子,翻转混匀,直到形成絮状的白色沉淀,4℃、12,000×g离心10min,使细胞碎片和基因组DNA分离完全;准备HiBindMidi吸附柱,将HiBind Midi吸附柱放入提供的15mL收集管中,加入2mL缓冲液GPS,室温静置5min,摆动斗式转子中3,000×g旋转5min,弃去洗脱液,在15mL的收集管中组装柱;吸取3.7mL上清液到15mL收集管中组装的HiBind Midi柱(最大容量为4mL)中,避免吸入细胞碎片,室温、3,000×g离心3min,重复几次直至使裂解液都通过柱子一遍,富集全部的质粒;在Midi柱中加入3mL HB缓冲液,室温、3,000×g离心3min,弃滤液;向Midi柱中加入3.5mLDNA洗涤缓冲液,室温、3,000×g离心3min,丢弃过滤后的液体,重复一次,再以3000xg空离心10min;将Midi柱放入干净的1.5mL离心管中,加入0.5mL TE缓冲液,室温静置2min,8,000×g离心5min,重复一次;将获得的质粒经过超分辨分光光度计进行质粒浓度的测定,若浓度大于800ng/mL,则获得的质粒能够满足试验转化率要求,将其置于-20℃保存。
结果显示,转入pCAMBIA1302-GmWRKY33质粒的拟南芥原生质体细胞中只有细胞核呈现绿色荧光,与核定位对照表达定位情况一致,表明GmWRKY33定位于细胞核,是一个核定位蛋白。
实施例6大豆GmWRKY33基因的表达模式分析
待高抗大豆品种“绥农10”及高感大豆品种“东农50”(保存于东北农业大学大豆生物学教育部重点试验室)幼苗长至V1期,挑选长势良好的“东农50”及“绥农10”幼苗,用液氮对根、茎、叶和子叶进行速冻,提取其RNA并反转录成cDNA(根据实施例1中的1.2和1.3部分进行),以cDNA为模板利用qRT-PCR的试验方法分析GmWRKY33在不同品种的不同组织器官中的差异表达情况。结果如图9所示。
结果显示,GmWRKY33在大豆品种“绥农10”和“东农50”的相对表达量由高到低依次是子叶、叶片、根、茎,其中在大豆品种“绥农10”和“东农50”茎中的相对表达量均为最低。同时,GmWRKY33在大豆品种“绥农10”中各个部位相对表达量均显著高于大豆品种“东农50”(**P<0.01)。
同时,设定接种大豆疫霉菌的处理组和对照组以及喷施激素的处理组和对照组,分析不同处理方式对大豆GmWRKY33基因相对表达量的影响。具体操作如下:
将大豆疫霉菌生理1号小种(黑龙江省优势小种,保存于东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室)接种于“东农50”和“绥农10”的下胚轴,将处理组和对照组分别于接种的0h,1h,3h,6h,9h,12h,24h,36h,48h,72h采集大豆叶片,用液氮将取得的样品速冻,并存于-80℃备用。结果如图10至图14所示。
其中,所述处理组包括接种大豆疫霉菌的处理组和喷施激素的处理组;所述对照组包括接种大豆疫霉菌的对照组和喷施激素的对照组。接种大豆疫霉菌的处理组的处理方式为:在下胚轴部位划开伤口,接种菌块;接种大豆疫霉菌的对照组的处理方式为:在下胚轴部位划开伤口,不接种菌块;喷施激素的处理组的处理方式为:对大豆植株喷施激素的液体或气体;喷施激素的对照组的处理方式为:对大豆植株喷施蒸馏水;所述激素分别为茉莉酸(MeJA)、乙烯(ET)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)。
对GmWRKY33在高抗大豆品种“绥农10”和感病大豆品种“东农50”中的表达量进行显著性比较,发现在大豆疫霉菌的处理下,“绥农10”中GmWRKY33的表达量在1~72h均显著高于“东农50”。由此得出,GmWRKY33在抗感品种接种大豆疫霉菌后具有抗感表达差异,且在高抗大豆品种“绥农10”中的相对表达量显著高于感病大豆品种“东农50”(**P<0.01);在4个激素处理中,在高抗大豆品种“绥农10”和感病大豆品种“东农50”中,使用MeJA诱导的GmWRKY33的相对表达量最高,其次是ET、SA、ABA。
实施例7制备GmWRKY33转基因大豆阳性毛状根
配制如表7所示的萌发培养基和如表8所示的诱导培养基,并配制如表9所示的侵染液。
表7萌发培养基的配制
表8根诱导培养基的配制
表9侵染液的配制
选取生长健康、颗粒饱满、大小均匀的“东农50”大豆种子,氯气消毒过夜。在超净工作台内用高温灭菌的镊子将消毒后的大豆种子种于萌发培养基上,并置于光照培养架上室温光下培养5d。
分别吸取100μL含p35S:GmWRKY33-Myc的重组质粒的K599发根农杆菌(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)和含GmWRKY33-RNAi的重组质粒的K599发根农杆菌(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)至10mL的YEP培养基(含50mg/L卡那霉素,购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)中,28℃、220rpm恒温摇床培养过夜,在超净工作台内吸取800μL扩繁菌液,二次接种活化至OD600=0.6,将上述菌液在离心机中8,000×g离心15min,倒掉废液,用侵染液重悬活化后的含p35S:GmWRKY33-Myc重组质粒的K599发根农杆菌菌体和含GmWRKY33-RNAi的重组质粒的K599发根农杆菌菌体。
将pCAMBIA3301、pFGC5941、pCAMBIA3301-GmWRKY33和pFGC5941-GmWRKY33重组载体分别转化至对应的K599发根农杆菌菌体中,并通过农杆菌介导法转化至“东农50”中,分别获得含有pCAMBIA3301-GmWRKY33重组质粒的毛状根(命名为GmWRKY33-OE)、含有pFGC5941-GmWRKY33重组质粒的毛状根(命名为GmWRKY33-RNAi)、含有pCAMBIA3301载体的毛状根(命名为EV1)和含有pFGC5941载体的毛状根(命名为EV2),其中,含有pCAMBIA3301-GmWRKY33重组质粒的毛状根和含有pFGC5941-GmWRKY33重组质粒的毛状根分别获得了3株,分别命名为GmWRKY33-OE-1、GmWRKY33-OE-2、GmWRKY33-OE-3以及GmWRKY33-RNAi-1、GmWRKY33-RNAi-2、GmWRKY33-RNAi-3。
同时,在超净工作台内用高温灭菌后的手术刀在子叶外部打一个凹陷伤口,将子叶均匀的排布在配制的根诱导培养基上。再吸取适量重悬菌体到子叶伤口处。将根诱导培养基置于光照培养架上室温培养20d,获取大豆毛状根。
实施例8过表达GmWRKY33转基因大豆阳性毛状根的检测
参照GUS染色试剂盒(购自兰杰柯科技有限公司,Biosharp)的说明书分别对实施例7获得的毛状根进行染色鉴定。具体方法为:
用刀片分别截取2mm实施例7获得的含有pCAMBIA3301-GmWRKY33重组质粒的毛状根和含有pCAMBIA3301载体的毛状根,放置于PCR管中,将事先配制的GUS染色工作液加入到PCR管中,将试验材料充分覆盖。待加完GUS染色工作液后,将样品用锡纸避光保存,并在室温条件下过夜,第二天观察根部组织的染色情况。
同时,提取GmWRKY33-OE和EV1毛状根的蛋白,以Anti-Myc为抗体(购自哈尔滨赛信生物科技开发有限公司)进行westernblot检测;利用qRT-PCR检测GmWRKY33-OE毛状根中GmWRKY33的表达量。结果如图15至图17所示。
其中,提取GmWRKY33-OE和EV1毛状根的蛋白的具体方法为:用剪刀剪下0.4g毛状根,液氮速冻,用冷却后的研钵仔细研磨,待样品研磨程度达到白色粉末状,证明样品处理成功;将研磨过的样品收集到速冻过的1.5mL EP管中,用移液枪加入200μL蛋白裂解液(具体配方为:150μL 5MNaCl、250μL 1M Tris7.5、1ml 10%Trition-100、2ml 50%Glycerall、50μLPSMF、100μL罗氏抑制剂、1.47ml蒸馏水),用震荡机充分混合样品和裂解液,冰上静置5min,4℃,8,000×g离心10min,将上清液移至新的EP管中,加入蛋白上样buffer(V/V=5:1),沸水浴高温变性8min,冷却后置于-80℃保存备用。
GUS染色结果显示,GmWRKY33-OE和EV1转基因毛状根均呈蓝色,qPCR结果表明,GmWRKY33-OE转基因毛状根中GmWRKY33的转录水平显著高于EV1(**P<0.01);western blot检测结果显示,GmWRKY33-OE转基因毛状根可检测到符合目的蛋白大小的杂交信号。综上,本研究已成功获得GmWRKY33-OE转基因阳性毛状根。
实施例9干扰GmWRKY33转基因大豆阳性毛状根的检测
分别提取实施例7获得的含有pFGC5941-GmWRKY33重组质粒的毛状根和含有pFGC5941载体的毛状根的DNA,对其进行外源bar基因检测。利用qRT-PCR检测GmWRKY33-RNAi毛状根中GmWRKY33的表达量。结果如图18至图20所示。
结果显示,GmWRKY33-RNAi和EV2转基因毛状根试纸条均为两条带,bar基因检测出bar基因条带,qRT-PCR结果也表明GmWRKY33-RNAi转基因毛状根中GmWRKY33的表达量显著低于EV2毛状根(**P<0.01)。综上,本研究已成功获得GmWRKY33-RNAi转基因阳性毛状根。
实施例10GmWRKY33转基因大豆毛状根的抗性分析
分别选取生长状态及长度一致的单条毛状根,所述单条毛状根分别为实施例7制得的含有pCAMBIA3301-GmWRKY33重组质粒的毛状根(命名为GmWRKY33-OE)、含有pFGC5941-GmWRKY33重组质粒的毛状根(命名为GmWRKY33-RNAi)、含有pCAMBIA3301载体的毛状根(命名为EV1)和含有pFGC5941载体的毛状根(命名为EV2),分别置于湿润的白色医用纱布上,其中一端对齐垫于凹槽载玻片上,用于滴加接种大豆疫霉菌游动孢子(保存于东北农业大学大豆生物学教育部重点试验室)。接菌48h后观察并用尼康D7000照相机拍照。随后取样,液氮速冻,提取毛状根RNA,利用qRT-PCR检测疫霉菌的生物量积累。结果如图21至图23所示。
结果显示,接种疫霉菌1号生理小种的游动孢子72h后发现,与EV1相比,GmWRKY33-OE的接菌部位发病较轻,无明显发病症状,GmWRKY33-RNAi的接菌部位较EV2发病症状明显严重并变成黑褐色。对GmWRKY33-OE、EV1、EV2及GmWRKY33-RNAi转基因毛状根的病斑面积进行测量后,发现GmWRKY33-OE的病斑面积显著低于EV1(**P<0.01),GmWRKY33-RNAi显著高于EV2(**P<0.01)。同时,基于大豆疫霉菌内参基因TEF1表达量检测的疫霉菌生物量积累分析结果显示,GmWRKY33-OE中大豆疫霉菌的生物量积累显著低于EV1毛状根(**P<0.01),而GmWRKY33-RNAi转基因毛状根中大豆疫霉菌的生物量积累显著高于EV2转基因毛状根(**P<0.01)。以上结果表明,GmWRKY33是响应P.sojae侵染的正调控因子。
实施例11病程相关蛋白基因(PR)的表达量检测
利用qRT-PCR法分别检测实施例7制得的GmWRKY33-OE、GmWRKY33-RNAi、EV1和EV2中PR基因的表达量。所述qRT-PCR所用的引物序列如表10所示。结果如图24所示。
表10 PR基因的qRT-PCR引物序列
结果表明,在GmWRKY33-OE的转基因阳性毛状根中,GmPR1、GmPR2和GmPR4的表达量显著高于EV1(*P<0.05),而GmPR3的表达量和EV1相比未达到显著差异水平。在GmWRKY33-RNAi的转基因阳性毛状根中,GmPR1、GmPR2和GmPR4的表达量显著低于EV2(*P<0.05),GmPR3的表达量和EV1相比未达到显著差异水平,以上结果表明,GmWRKY33可以正调控GmPR1、GmPR2和GmPR4的表达,从而提高大豆对大豆疫霉菌的抗性。
实施例12GmWRKY33转基因大豆毛状根SOD活性的测定
参考(Ward E WB,Lazarovits G,Unwin C H,Buzzell R I.Hypocotyl reactionsand glyceollin in soybeans inoculatedwith zoospores ofPhytophthora megaspumavar.sojae[J].Phytopathology,1979(69):951-955.)中记载的方法,以高抗大豆品种“绥农10”和感病大豆品种“东农50”植株为试验材料,分别将大豆疫霉菌接种至试验材料的下胚轴,并设定不接种大豆疫霉菌的处理;分别获得含有pCAMBIA3301-GmWRKY33重组质粒的毛状根(命名为GmWRKY33-OE)、含有pFGC5941-GmWRKY33重组质粒的毛状根(命名为GmWRKY33-RNAi)、含有pCAMBIA3301载体的毛状根(命名为EV1)和含有pFGC5941载体的毛状根(命名为EV2)。
参照苏州科铭生物技术公司的SOD试剂盒说明,测定制得的GmWRKY33-OE、EV1、EV2和GmWRKY33-RNAi的SOD活性。具体为:
将新鲜的制得的GmWRKY33-OE、EV1、EV2和GmWRKY33-RNAi分别放置于1.5mL的EP管中,按照1g:10mL的比例加入试剂盒中自带的提取液,放置于冷冻研磨仪中将其充分研磨成匀浆,将EP管配平放置于低温冷冻离心机中,14,000×g离心15min,离心结束后吸取上清加入到事先准备的新的1.5mL的EP管中,并将体系放置于冰上作为待测样品。
按照试剂盒说明书将100μL试剂三与4.9mL的蒸馏水混合,记做A1液;取50mL试剂一与250μL试剂二混合,记做A2液;将100μL试剂四溶解于5mL的水中,记做A3液。
在1mL的比色皿中依次加入50μL待测样品(对照组加入50μL的蒸馏水)、50μL的A1液、800μL的A2液以及100μL的A3液,将其充分混匀后,静置30min,利用分光光度计分别测定对照管(添加A1、A2、A3液)和测定管(添加待测样品)在450nm处的吸光光度值,记为A对照和A测定。结果如图25所示。
按照公式(1)和公式(2)对样本中SOD的活性进行计算:
抑制百分率=(A对照-A测定)/A对照×100% 公式(1)
SOD活性(U/mg prot)=抑制百分率/((1-抑制百分率)×V反总)/(V×Cpr) 公式(2)
公式(1)和(2)中,
V反总:反应体系总体积,mL;
V:加入反应体系中样本体积,mL;
Cpr:待测样本蛋白浓度,mg/mL。
结果显示,含有GmWRKY33的转基因毛状根在未接菌时SOD酶的活性无显著差异,随着接菌时间的延长,GmWRKY33-OE转基因毛状根中SOD酶的活性均极显著高于EV1毛状根(**P<0.01),而GmWRKY33-RNAi转基因毛状根中SOD酶的活性均极显著低于对照EV2毛状根(**P<0.01)。
实施例13 GmWRKY33转基因大豆毛状根POD活性的测定
参照苏州科铭生物技术公司的POD试剂盒测定实施例7制得的GmWRKY33-OE、EV1、EV2和GmWRKY33-RNAi中的POD活性。具体为:
将新鲜的实施例7制得的毛状根GmWRKY33-OE、EV1、EV2和GmWRKY33-RNAi分别放置于1.5mL的EP管中,按照1g:10mL的比例加入试剂盒中自带的提取液,放置于冷冻研磨仪中将其充分研磨成匀浆,将EP管配平放置于低温冷冻离心机中并在转速14000rpm的条件下离心15min,离心结束后吸取上清加入到事先准备的新的1.5mL的EP管中,并将体系放置于冰上作为待测样品。
分别取试剂盒中的试剂一26mL、试剂二15μL和试剂三10μL于50mL离心管中,混匀后作为工作液。
按照试剂盒说明书向1mL比色皿中依次加入50μL待测样本和950μL工作液混匀,用分光光度计分别测定470nm下反应1min时的吸光值A1和反应2min时的吸光值A2。结果如图26所示。
按照公式(3)和公式(4)对样本中POD的活性进行计算:
ΔA=A2-A1 公式(3)
POD(U/mg prot)=ΔA×V反总/((V×Cpr)÷0.01)/T 公式(4)
公式(3)和公式(4)中,
V反总:反应体系的总体积,mL;
V:加入的样本的体积,mL;
T:反应的时间,1min;
Cpr:待测样本蛋白浓度,mg/mL。
结果显示,GmWRKY33的转基因毛状根在未接菌时POD酶的活性无显著差异,随着接菌时间的延长,GmWRKY33-OE转基因毛状根中POD酶的活性均极显著高于EV1毛状根(**P<0.01),而GmWRKY33-RNAi转基因毛状根中POD酶的活性均极显著低于对照EV2毛状根(**P<0.01)。
实施例14 GmWRKY33转基因大豆毛状根CAT活性的测定
参照苏州科铭生物技术公司的CAT试剂盒测定实施例7制得的GmWRKY33-OE、EV1、EV2和GmWRKY33-RNAi中的CAT活性。具体为:
将新鲜的实施例7制得的分别含有GmWRKY33-OE、EV1、EV2和GmWRKY33-RNAi重组质粒的毛状根分别放置于1.5mL的EP管中,按照1g:10mL的比例加入试剂盒中自带的提取液,放置于冷冻研磨仪中将其充分研磨成匀浆,将EP管配平放置于低温冷冻离心机中并在转速14,000×g的条件下离心15min,离心结束后吸取上清加入到事先准备的新的1.5mL的EP管中,并将体系放置于冰上作为待测样品。
向比色皿中加入适量CAT检测工作液(试剂盒自带的)后,向其中加入待测样本,待室温平衡5s后立即测定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。结果如图27所示。
按照以下公式(5)和公式(6)对样本中CAT的活性进行计算:
ΔA=A1-A2 公式(5)
CAT(nmol/min/mgprot)=[ΔA×V反总/(ε×d)×109]/(V样×Cpr)/T=678×ΔA/Cpr 公式(6)
公式(5)和公式(6)中,
V反总:反应体系的总体积,mL;
V:加入的样本的体积,mL;
T:反应的时间,1min;
Cpr:待测样本蛋白浓度,mg/mL。
结果显示,GmWRKY33的转基因毛状根在未接菌时CAT酶的活性无显著差异,随着接菌时间的延长,GmWRKY33-OE转基因毛状根中CAT酶的活性均极显著高于EV1毛状根(**P<0.01),而GmWRKY33-RNAi转基因毛状根中CAT酶的活性均极显著低于对照EV2毛状根(**P<0.01)。
实施例15GmWRKY33直接调控的下游靶基因的筛选及验证
1.1qRT-PCR验证
利用qRT-PCR技术检测实施例7制得的GmWRKY33-OE、EV1、EV2和GmWRKY33-RNAi中的与胁迫应答相关的下调差异表达基因的转录水平。所述qRT-PCR的引物如表11所示。
具体引物序列见表11:
表11 GmWRKY33转录组中胁迫相关基因的引物序列
本发明对GmWRKY33-OE过表达转基因大豆毛状根和EV1空载体转基因大豆毛状根进行了转录组测序分析。结果如图28所示。
转录组测序显示,共存在332个差异表达基因(FC>2,错误率FDR<0.01),在这332个差异表达基因中有144上调表达的差异基因和188下调表达是差异基因。
根据GmWRKY33-OE毛状根的转录组数据,挑选部分响应生物胁迫及非生物胁迫的差异表达基因,利用qRT-PCR技术检测其分别在GmWRKY33-OE、EV和GmWRKY33-RNAi中的转录水平。结果如图29和图30所示。
所述差异表达基因为下列10个基因:GmBTB/POZ-MATH(MATH domain and coiled-coil domain-containing protein At3g58370 isoform X1,Glyma.03G116300)、GmHSFA-3(heat stress transcription factorA-3,Glyma.03G191100)、GmNAC5(NACdomainproteinNAC5,Glyma.06G195500)、GmWRKY29(probable WRKYtranscriptionfactor29,Glyma.08G018300)、GmWRKY72(probable WRKY transcription factor 72,Glyma.09G240000)、GmERF1B(ethylene-responsive transcription factor 1B,Glyma.10G186800)、TMV抗病蛋白N基因(TMVresistance proteinN,Glyma.14G048600)、GmERF091(ethylene-responsive transcription factor ERF091-like,Glyma.15G079200)、TIR-NBS-LRR抗病蛋白基因(TIR-NBS-LRR type disease resistanceprotein,Glyma.18G127900)、TMV抗病蛋白N-X1基因(TMVresistance proteinN isoformX1,Glyma.06G268700)。
结果表明,在GmWRKY33-OE转基因毛状根中这10个胁迫应答相关基因的表达量均显著高于EV1转基因毛状根(**P<0.01),而在GmWRKY33-RNAi转基因毛状根中这10个胁迫应答相关基因的表达量显著低于EV2转基因毛状根(**P<0.01)。由此表明,GmWRKY33可以正调控这10个胁迫应答相关基因的表达。其中,GmWRKY72和GmERF1B在GmWRKY33-OE的转基因大豆毛状根中相对表达量与EV1相比升高倍数最高(**P<0.01),在GmWRKY33-RNAi转基因大豆毛状根中降低幅度最大(**P<0.01),由此推测GmWRKY72和GmERF1B可能在GmWRKY33的调控机制中起到重要作用,所以将GmWRKY72和GmERF1B作为GmWRKY33的下游靶基因进行进一步验证。
1.2酵母单杂交试验验证GmWRKY33结合GmERF1B和GmWRKY72启动子的能力
将GmERF1B和GmWRKY72的启动子连接至pHIS2酵母单杂交载体(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)上,根据GmERF1B和GmWRKY72的启动子序列,pHIS2的载体序列,选择EcoRI和SacI作为酶切位点。具体引物序列如表12所示。
表12 PGmERF1B和PGmWRKY72连接酵母单杂交载体的引物序列
将重组质粒组合PGmWRKY72-pHIS2+GmWRKY33-AD和pGmERF1B-pHIS2+GmWRKY33-AD作为待测组合,将pHis2+GmWRKY33-AD、pGmWRKY72-pHIS2+AD、pGmERF1B-pHIS2+AD以及pHis2+AD作为阴性对照组合分别转入酵母感受态Y187中,涂布于DDO平板生长3d挑取单斑用DDO液体扩繁。取4μL共转化后的菌株菌液接种于二缺DDO培养基及三缺TDO+70mM 3AT培养基上,置于30℃恒温培养箱中培养2-3d。
酵母菌落的生长情况如图31所示:在DDO平板培养基上各组合共转化的酵母细胞均能够生长正常;在TDO+70mM 3AT平板培养基上,只有pGmWRKY72-pHIS2+GmWRKY33-AD和pGmERF1B-pHIS2+GmWRKY33-AD共转化的酵母细胞能够正常生长,而阴性对照组合共转化的酵母细胞则不能够正常生长,因此表明GmWRKY33能与GmWRKY72和GmERF1B启动子特异性结合。
1.3双荧光素酶报告系统
为进一步揭示GmWRKY33对GmERF1B和GmWRKY72的调控机制,本发明分别构建了报告载体p35S:REN-pGmWRKY72:LUC和报告载体p35S:REN-pGmGmERF1B:LUC,将报告载体及效应载体分别转化至烟草叶片中,具体为:
在超净工作台内取菌液至适量YEP培养基(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)中,28℃、220rpm恒温摇床培养过夜,二次扩繁菌液至OD600=0.6,将菌液转移至50mL EP管中,8,000×g离心10min,倒掉废液。取10mL农杆菌侵染液(10mM MES,150mM乙酰丁香酮,10mM MgCl2)重悬菌体并调整OD600=0.8,将体系避光25℃条件下平衡4h,选择生长至6-7片叶片的烟草植株,将相应载体的农杆菌共注射至烟草叶片中。将烟草植株放在室温暗培养3d,3d后向注射转染后烟草叶片喷施适量1.5mM Luciferin,利用萤火虫荧光素酶互补系统进行成像。
所报告载体为:pGmERF1B-pGreenII 0800(p35S:REN-pGmGmERF1B:LUC)和pGmWRKY72-pGreenII 0800(p35S:REN-pGmWRKY72:LUC)载体。效应载体为:GmWRKY33-OE和EV1。
结果如图32-33所示,与报告载体p35S:REN-pGmWRKY72:LUC和空效应载体EV1共转染烟草叶片相比,报告载体p35S:REN-pGmWRKY72:LUC和效应载体p35S:GmWRKY33-MYC共转染烟草部位检测到的化学发光信号明显增强被激活;报告载体p35S:REN-pGmERF1B:LUC和效应载体p35S:GmWRKY33-MYC共转染烟草部位化学发光信号也明显增强并被激活。通过检测LUC/REN的相对活性也进一步证明,GmWRKY33能够结合GmWRKY72和GmERF1B启动子,并直接激活它们的表达,初步证实GmWRKY72和GmERF1B是GmWRKY33直接调控的下游靶基因。
综合上述试验结果可知,大豆疫霉菌正调控因子GmWRKY33的转录组测序结果筛选出其直接调控的下游靶基因GmERF1B和GmWRKY72,并发现过量表达GmWRKY33基因可以提高大豆对大豆疫霉菌的抗性,主要表现在GmWRKY33的抗病性表型鉴定、病程相关蛋白基因PR的表达量提高以及抗氧化防御系统的关键酶(SOD、POD、CAT)活性的提高等特征。此外,GmWRKY33还可受到水杨酸、茉莉酸、乙烯和脱落酸不同程度的诱导表达,表明其可能作为生物及非生物胁迫的交联因子在逆境胁迫中发挥重要作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.大豆GmWRKY33基因在提高作物中病程相关蛋白基因PR的表达量中的应用,其特征在于,在作物中过表达大豆GmWRKY33基因,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
2.大豆GmWRKY33基因在提高作物抗氧化防御系统的关键酶活性中的应用,其特征在于,在作物中过表达大豆GmWRKY33基因,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
3.一种过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体,其特征在于,包括大豆GmWRKY33基因和pCAMBIA3301过表达载体,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
4.如权利要求3所述过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)对pCAMBIA3301过表达载体进行线性化处理,获得线性化表达载体pCAMBIA3301;
(2)将大豆GmWRKY33基因连接至pMDTM18-T载体上,再转化至大肠杆菌感受态细胞中扩繁,获得pMDTM18-T-GmWRKY33;
(3)以获得的pMDTM18-T-GmWRKY33为模板,设计两端带有载体末端序列的特异性引物,并通过PCR扩增出GmWRKY33基因的目的片段;
(4)将目的片段插入线性化表达载体pCAMBIA3301中,获得过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体。
5.如权利要求3所述的重组载体在提高作物对大豆疫霉根腐病抗性中的应用。
6.一种过表达大豆GmWRKY33基因的转化体,其特征在于,将过表达大豆GmWRKY33基因的重组载体导入大肠杆菌中,所述大豆GmWRKY33基因如SEQ ID No.1所示。
7.根据权利要求6所述的转化体,其特征在于,所述大肠杆菌为Trans1-T1感受态细胞。
8.如权利要求6或7所述的转化体在提高作物对大豆疫霉根腐病抗性中的应用。
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