CN115927351A - 褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9在诱导植物产生抗性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9在诱导植物产生抗性中的应用，所述褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明从褐飞虱中鉴定到唾液蛋白基因NlDNAJB9，首次提出唾液蛋白基因NlDNAJB9在诱导植物产生抗虫性和抗病性中的应用，将其插入植物表达载体PBINGFP2。将所述载体导入植物中，能够产生显著的HR反应、ROS积累和胼胝质沉积，激发植物免疫。本发明中的NlDNAJB9蛋白基因可以作为开发植物免疫诱抗剂的潜在候选者，为防控植物病虫害提供理论支撑。同时也可以直接导入作物中制备转基因植株，提供新型转基因抗病策略。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及诱导植物产生抗性的褐飞虱唾液蛋白NlG14基因、蛋白及其应用。
背景技术
褐飞虱(Nilaparvata lugens)，是一种以韧皮部汁液为食的刺吸式昆虫，几十年来已成为水稻的主要害虫。褐飞虱的防治方法主要以化学防治为主，但使用化学农药带来的害虫抗药性问题以及环境食品安全问题已引起人们的普遍关注。
唾液蛋白是由昆虫唾液腺分泌的一类外泌型蛋白分子，通过分泌到植物体内，操控寄主植物防御反应。有些唾液蛋白会被植物调控抗病相关基因识别，触发局部抗性反应，其特征在于感染部位会快速死亡。活性氧积累和胼胝质沉积也是触发防御反应的关键标识。活性氧的积累通常造成氧化胁迫以及调控植物体内各种防卫相关基因的表达。植物胼胝质沉积可以加强植物细胞壁来阻止病原微生物侵入，也可阻塞筛管，阻止刺吸式昆虫取食韧皮部汁液，从而达到抗病或抗虫目的。植物免疫诱抗剂可以分为生物来源及非生物来源，生物来源的免疫诱抗剂主要从细菌、真菌和病毒中鉴定纯化出。目前，昆虫源的免疫诱抗蛋白仍然较少。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的农作物抗虫基因资源不足，本发明提供褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9在诱导植物产生抗性中的应用，本发明从褐飞虱(Nilaparvatalugens)中鉴定到唾液蛋白基因NlDNAJB9，该基因编码的蛋白或者其突变体编码的突变体蛋白通过触发植物过敏性反应(HR)、胼胝质沉积和活性氧(ROS)积累，提升对害虫和病原物的抗性，保护农作物生产，首次提出了可以诱导植物产生抗性的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9。
本发明还提供所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9在制备植物免疫诱抗剂、在培育抗病虫作物品种的应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9在诱导植物产生抗性中的应用，所述NlDNAJB9基因包括其本身或者其突变体基因，所述NlDNAJB9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7中任一所示。
其中，所述褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9编码的褐飞虱唾液蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8中任一所示。所述氨基酸序列SEQID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8分别对应的编码基因为上述序列SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7。
其中，所述褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9编码的蛋白、含有所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在诱导植物产生抗性中的应用。
作为优选，该重组表达载体的出发载体为表达载体PBINGFP2。
进一步地，构建所述褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9的重组表达载体pBINGFP2:NlDNAJB9，以植物表达载体PBINGFP2为出发载体，将NlDNAJB9基因插入KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点获得。
其中，所述抗性包括抗虫性和抗病性。
进一步地，通过诱导植物产生局部坏死和活性氧积累在诱导植物产生抗性中的应用。
本发明所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9、其编码的蛋白、含有所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌诱导植物产生抗性在制备植物免疫诱抗剂中的应用。
本发明所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9、其编码的蛋白、含有所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌诱导植物产生抗性在培育抗病虫作物品种的应用。
其中，将所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9、其编码的蛋白、表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌导入植株中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，获得抗病虫作物品种。
进一步地，所述基因、蛋白、表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌导入植株中，触发HR、ROS诱导植物产生抗性。
热休克蛋白(HSP)几乎存在于所有生物体中。HSP40也称为DNAJ/J蛋白，通过DNAJ结构域与HSP70结合并刺激HSP70的ATP酶活性。在人类中，DNAJ蛋白分为I型、II型和III型，分别对应为A、B和C。本发明通过筛选获得了来源于褐飞虱(Nilaparvata lugens)的唾液蛋白基因NlDNAJB9，其瞬时表达能够触发植物过敏性反应(HR)、胼胝质沉积和活性氧(ROS)积累，本发明第一次发现唾液蛋白基因NlDNAJB9具有诱导植物产生抗性包括抗虫性和抗病性的特征。此外本发明利用农杆菌介导的瞬时表达系统客观评估发现其DNAJ结构域能够显著诱导植物产生抗性。激发HR，促进ROS积累，促进胼胝质沉积，触发植物免疫，诱导植物产生抗病反应，有助于研究开发植物免疫诱抗剂。这个基因的强大功能既可以作为开发植物免疫诱抗剂的候选基因，又可以利用转基因技术直接将基因导入植物体内，开发培育抗病虫品种。
本发明以模式植物本氏烟为测试对象，通过农杆菌介导的瞬时表达系统对褐飞虱潜在唾液蛋白NlDNAJB9调控植物防御反应的机制进行了研究。图1的结果表明，NlDNAJB9的瞬时表达可以引起植物过敏性反应(HR)以及活性氧(ROS)积累。本发明还通过苯胺蓝染色法检测了NlDNAJB9的瞬时表达对植物胼胝质沉积量的影响。图2的结果表明，NlDNAJB9的瞬时表达可以显著提高植物的胼胝质沉积。本发明还通过构建缺失突变体确定了NlDNAJB9诱导植物细胞死亡的关键区域。图3的结果表明，NlDNAJB9的DNAJ结构域比其它突变体诱导了最显著的细胞死亡。本发明还通过在瞬时表达NlDNAJB9-DNAJ的本氏烟叶片上接种病原菌或昆虫评估植物对病虫害抗性。图4和表4-5的结果表明，NlDNAJB9-DNAJ的瞬时表达有效抑制了辣椒疫霉等多种病原菌的侵染和草地贪夜蛾等多种害虫的取食。
本发明首次发现褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9具有诱导植物产生抗性的功能，明确了诱导植物产生抗性的分子生物学机制，有助于该基因、蛋白在免疫有抗性的开发和转基因植物的创制。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明从褐飞虱(Nilaparvata lugens)中鉴定到唾液蛋白基因NlDNAJB9，首次提出唾液蛋白基因NlDNAJB9及其突变体基因在诱导植物产生抗虫性和抗病性中的应用。将其插入植物表达载体PBINGFP2，将所述载体导入植物中，能够产生显著的HR反应、ROS积累和胼胝质沉积，激发植物免疫。
本发明通过构建所述NlDNAJB9蛋白的突变体，发现DNAJ结构域为蛋白关键功能区域，其瞬时表达相对于NlDNAJB9蛋白本身可以进一步提高了植物对生物胁迫的抗性。本发明中的NlDNAJB9蛋白基因或者其突变体基因可以作为开发植物免疫诱抗剂的潜在候选者，为防控植物病虫害提供理论支撑。同时也可以直接导入作物中制备转基因植株，提供新型转基因抗病策略。
附图说明
图1为NlDNAJB9蛋白触发植物HR、ROS；其中，A为农杆菌瞬时表达注射本氏烟叶片会诱导HR表型；B为农杆菌瞬时表达注射本氏烟叶片会诱导活性氧积累。
图2为NlDNAJB9蛋白诱发植物叶片胼胝质积累；其中数字表示三个叶盘胼胝质斑点平均数量。
图3为NlDNAJB9突变体构建和触发植物HR；其中，A为NlDNAJB9突变体构建示意图；B为各个突变体农杆菌瞬时表达导致本氏烟叶片HR表型；C为各个突变体农杆菌瞬时表达导致本氏烟叶片活性氧积累。
图4为NlDNAJB9-DNAJ诱导植物抗性；其中，A为农杆菌瞬时表达NlDNAJB9-DNAJ基因在烟草上能够提高植物对草地贪夜蛾的抗性；B为农杆菌诱导抗虫表型的幼虫数统计；C为农杆菌瞬时表达NlDNAJB9-DNAJ基因在烟草上能够提高植物对辣椒疫霉的抗性；D为农杆菌诱导抗病表型的病斑相对面积统计。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中使用的原料和试剂等均市售可得，或者采用市售的同类型原料均可。
实施例1
1.实验昆虫
供试昆虫褐飞虱(Nilaparvata lugens)于2020年采集于南京市江浦区水稻田，在室内(温度：27±1℃，湿度70％±10％，光照：L：D＝16h：8h，)传代饲养于Xiushui11水稻上。
2.供试本氏烟幼苗的准备
本氏烟草(Nicotiana benthamiana)(华越洋生物有限公司，北京)播种于装有蛭石的一次性塑料杯(200mL)中，放到16h光照/8h黑暗的温室中生长。使其生长7天，生长出两片真叶后将其移栽至蛭石黑土体积比例为5：1的培养土里生长30天，取相同3，4，5叶位的叶片用作表达实验基因，然后持续观察7天叶片表型是否有明显HR。
3.提取褐飞虱RNA，并获得目的基因的cDNA。
收集30头五龄褐飞虱，根据Invitrogen公司的说明，使用TrizolTM reagent提取总RNA。根据TaKaRa公司的说明，使用PrimeScript RT Reagent Kit去除基因组DNA，然后反转录合成cDNA。以上述cDNA为模版，用相应上下游引物进行PCR扩增(引物序列见表1)
表1引物序列
| name | sequence |
| NlDNAJB9-F | ATGAAGTCCGAACTGCTCTC |
| NlDNAJB9-R | TTAAAAACATTCGGTGTATGTGGTAAC |
PCR反应体系为：12.5μL 2×Phanta Master Mix，2μL(10μm)引物，1μL cDNA模板，无菌水补足至25μL。
反应程序为：95℃5min预变性；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
上述PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳、回收、经测序确认无误后，获得的序列为所述NlDNAJB9基因的核苷酸序列。所述NlDNAJB9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。NlDNAJB9基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。后续研究发现其具有诱导植物产生坏死和活性氧积累的强大功能。
实施例2
构建pBINGFP2:NlDNAJB9表达质粒
利用实施例1中cDNA为模板，用添加有质粒同源臂的上下游引物进行PCR扩增不包含信号肽的全长序列(引物序列见表2)。PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳、回收(方法同实施例1的步骤(3))，得到目的基因。
表2引物序列
将pBINGFP2(南京农业大学植病系植物与疫霉互作实验室提供，Tianqiao S,Zhenchuan M，Danyu S,et al.An Oomycete CRN Effector Reprograms Expression ofPlant HSP Genes by Targeting their Promoters[J].Plos Pathogens,2015,11(12):e1005348)空载体质粒用KpnⅠ和BamHⅠ进行酶切。利用诺唯赞公司的同源重组酶ExnaseⅡ(货号：C112)将目的片段和载体连接。
反应体系如下：4μL 5×CEⅡBuffer；2μL ExnaseⅡ；1μL上述PCR回收产物；4μL上述酶切后空载体；无菌水补足至10μL。
反应程序为：37℃条件下反应30min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在Kan抗性培养基上筛选转化子，挑取阳性克隆提取质粒进行菌落PCR鉴定。将鉴定到的阳性克隆测序，正确即获得了PBINGFP2:NlDNAJB9表达质粒，其序列如SEQ ID NO.9所示。
实施例3
表达载体转化农杆菌及功能验证。
1、PBINGFP2:NlDNAJB9表达载体转化农杆菌
利用电转法将PBINGFP2:NlDNAJB9表达载体转化农杆菌细胞GV3101(购自庄盟公司)。具体过程为：将实施例2构建的表达载体加入农杆菌感受态，轻轻混匀后转移至无菌的电击杯中，进行电击转化。电击完成后将农杆菌感受态细胞按体积比10％加入到700μLLB液体培养基中，28℃200rpm振荡培养2h。吸取100μL菌液，均匀涂抹在含有50mM卡那霉素和25mM利福平的固体LB培养基平板上，28℃倒置培养48h。挑取单菌落进行菌落PCR，获取阳性克隆，即含PBINGFP2:NlDNAJB9表达载体的农杆菌。
2、在本氏烟草中瞬时表达PBINGFP2:NlDNAJB9、PBINGFP2和PBI121:INF1
将步骤(1)获得含PBINGFP2:NlDNAJB9的农杆菌、含空载PBINGFP2的农杆菌(方法同步骤(1))和含PBI121:INF1载体的农杆菌(其中PBI121载体为常规植物表达载体，PBI121表达INF1蛋白由南京农业大学植病系植物与疫霉互作实验室提供，Dong Y,Jing M,ShenD,et al.The mirid bug Apolygus lucorum deploys a glutathione peroxidase as acandidate effector to enhance plant susceptibility[J].Journal of ExperimentalBotany,2020(9):9，构建方法同步骤(1))的阳性克隆放置于含有50mM卡那霉素和25mM利福平的液体LB培养基中，28℃230rpm震荡培养20h。将菌液收集，5000rpm离心3min，利用渗透缓冲液(10mM MgCl2,500mM MES,100mM乙酰丁香酮)清洗一次。最后用渗透缓冲液稀释菌液至OD600值0.4。用1mL注射器在本氏烟草叶片分别注射基因(保证每个叶片注射浸润后面积相同，一般达到饱和状态即可)，每个最少6个重复重复，实验重复三次，结果如图1所示。
3、活性氧(ROS)积累检测
注射所有处理基因48h后，用DAB染液(1mg/mL DAB,10mM Na2HPO4)在25℃避光浸泡6h，然后用95％乙醇脱色处理，最后用相机拍照记录表型，实验结果如图1所示。图1的结果表明，基因NlDNAJB9的瞬时表达可以引起植物过敏性反应(HR)以及活性氧(ROS)积累，阳性对照INF1同样表现出HR反应和ROS积累，但阴性对照GFP没有显著变化。
4、胼胝质沉积检测
注射48后，将叶盘用95％的乙醇脱色，漂白后的样品用ddH2O清洗，用染液(70mMKH2PO4和0.05％苯胺蓝，pH 9)孵育1h，染色后的叶片贴在抗荧光淬灭封片剂中，用荧光倒置显微镜观察拍照，用ImageJ软件计算胼胝质沉淀物的数量，实验重复三次，实验结果如图2所示。图2的结果表明，基因NlDNAJB9的瞬时表达可以显著提高植物的胼胝质沉积，同时证明表达了NlDNAJB9蛋白。
实施例4
突变体构建及抗虫抗病性验证
1、突变体构建
根据信号肽和结构域构建不同突变体基因NlDNAJB9-SP、NlDNAJB9-DNAJ、NlDNAJB9-C，参考示意图(图3A)，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7所示，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8所示；利用实施例1中cDNA为模板，利用带有质粒同源臂的突变体NlDNAJB9-SP、NlDNAJB9-DNAJ和NlDNAJB9-C的特异引物(引物序列见表3)进行PCR扩增。之后按照实施例1和2中的方法，利用PBINGFP2质粒构建含突变体的质粒PBINGFP2:NlDNAJB9-SP、PBINGFP2:NlDNAJB9-DNAJ和PBINGFP2:NlDNAJB9-C，上述三个质粒的序列为将BINGFP2:NlDNAJB9表达质粒序列(SEQ ID NO.9)中的NlDNAJB9基因序列(SEQ ID NO.1)分别直接替换成基因NlDNAJB9-SP(SEQ ID NO.3)、NlDNAJB9-DNAJ(SEQ ID NO.5)、NlDNAJB9-C(SEQ ID NO.7)序列获得。测序无误的质粒按照实施例3中的方法转化至农杆菌，进行本氏烟叶片的瞬时表达以及活性氧积累的检测。由图3C可以看出，瞬时表达发现NlDNAJB9-DNAJ蛋白结构域相比于NlDNAJB9蛋白、NlDNAJB9-SP蛋白、NlDNAJB9-C蛋白可以更加显著诱导细胞死亡和活性氧积累，且NlDNAJB9-DNAJ蛋白结构更简单，所以选择DNAJ结构域截短突变体NlDNAJB9-DNAJ，并用于后续实验。
表3引物序列
2、瞬时表达PBINGFP2:NlDNAJB9-DNAJ蛋白的本氏烟抗病性检测
将确认表达蛋白的叶片剪下，放置于滤纸保湿的托盘内。用打孔器在辣椒疫霉的平板生长边缘打孔，将打下的菌碟菌面向下，左右对称放置在本氏烟叶片的左右两侧。将托盘放置于25℃培养箱，黑暗，36h。取出叶片，然后用手持紫外荧光仪照射叶片。颜色变深的区域即为辣椒疫霉的侵染区域。以表达GFP2蛋白的叶面为对照，利用Image J软件测量相对侵染区域面积，比较各个蛋白对本氏烟抗性的影响(图3B)。发现来自褐飞虱的NlDNAJB9-DNAJ蛋白显著提高了本氏烟草对辣椒疫霉等病原菌的抗性，同时采用上述相同的方法测试其他病原菌的抗性，包括寄生疫霉、核盘菌、青枯雷尔氏菌、丁香假单胞菌、互隔交链孢和胡萝卜软腐果胶杆菌等(如表4所示)，说明NlDNAJB9-DNAJ蛋白显著提高了本氏烟草对上述病原菌的抗性；而NlDNAJB9蛋白、NlDNAJB9-SP蛋白、NlDNAJB9-C蛋白也可以产生上述效果，而NlDNAJB9-DNAJ蛋白效果最优，并且结构更简单。
表4.瞬时表达PBINGFP2:NlDNAJB9-DNAJ蛋白对病原菌侵染的抑制作用
3、瞬时表达PBINGFP2:NlDNAJB9-DNAJ蛋白的本氏烟抗虫性检测
根据实施例3中步骤(2)的方法以及实施例4中步骤(1)的突变体，利用本氏烟草中瞬时表达系统，将GFP或GFP:NlDNAJB9-DNAJ在本氏烟草叶片瞬时表达24h后剪下叶片，放置于托盘内。茎部用湿润的棉花保湿，将8个2龄草地贪夜蛾幼虫放置在叶片中部，分别在12h和24h后进行观察统计两片叶片虫数，共16个重复。发现NlDNAJB9-DNAJ蛋白的表达显著抑制了草地贪夜蛾等害虫的取食(如图4所示)，同时采用上述相同的方法测试对其他害虫的抗性，包括棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、草地螟、棉蚜等(如表5所示)，说明NlDNAJB9-DNAJ蛋白的表达显著抑制了上述害虫的取食；而NlDNAJB9蛋白、NlDNAJB9-SP蛋白、NlDNAJB9-C蛋白也可以产生上述效果，而NlDNAJB9-DNAJ蛋白效果最优，并且结构更简单。
表5.瞬时表达PBINGFP2:NlDNAJB9-DNAJ蛋白对害虫危害的抑制作用
Claims (10)
1.褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9在诱导植物产生抗性中的应用，所述NlDNAJB9基因包括其本身或者其突变体基因，所述NlDNAJB9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7中任一所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9编码的褐飞虱唾液蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8中任一所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9编码的蛋白、含有所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在诱导植物产生抗性中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该重组表达载体的出发载体为表达载体PBINGFP2。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，构建所述褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9的重组表达载体pBINGFP2:N1DNAJB9，以植物表达载体PBINGFP2为出发载体，将NlDNAJB9基因插入KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点获得。
6.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述抗性优选包括抗虫性和抗病性。
7.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，通过诱导植物产生局部坏死和活性氧积累在诱导植物产生抗性中的应用。
8.一种权利要求1所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9、其编码的蛋白、含有所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌诱导植物产生抗性在制备植物免疫诱抗剂中的应用。
9.一种权利要求1所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9、其编码的蛋白、含有所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌诱导植物产生抗性在培育抗病虫作物品种的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述的褐飞虱唾液蛋白基因NlDNAJB9、其编码的蛋白、表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌导入植株中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，获得抗病虫作物品种。
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| "dnaJ homolog subfamily B member 9 isoform X2 [Nilaparvata lugens]", pages 022185661, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_022185661.1?report=genbank&log$=prottop&blast_rank=2&RID=KEKBVV21016> * |
| CHEN XUAN, ET AL.: "HSP70/DNAJ Family of Genes in the Brown Planthopper, Nilaparvata lugens: Diversity and Function", GENES, vol. 12, no. 3, pages 1 - 20 * |
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