CN111269920A

CN111269920A - 一种小麦抗赤霉病基因TaXAX1及其应用

Info

Publication number: CN111269920A
Application number: CN202010260986.1A
Authority: CN
Inventors: 胥倩; 王群青; 牛新慧; 毕建杰
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111269920B

Abstract

本发明属于公开了一种小麦抗赤霉病基因TaXAX1及其应用，cDNA如SEQ ID NO：1所示。本发明在小麦中过量表达了TaXAX1基因，可显著提高小麦赤霉病的抗性。

Description

一种小麦抗赤霉病基因TaXAX1及其应用

技术领域

本发明涉及分子育种技术领域，具体为一种小麦抗赤霉病基因TaXAX1及其应用。

背景技术

赤霉病（Fusarium Head Blight, FHB）是由禾谷镰刀菌复合种Fusarium graminearumspacies complex（FGSC）引发的世界范围的流行性病害(Bai & Shaner,2004)，可侵染小麦和多种禾谷类作物。其中禾谷镰刀菌（F.graminearum，F.g）是我国麦类赤霉病的主要致病种。赤霉病不仅引起产量的严重降低，而且分泌多种对人畜有害的毒素和次生代谢物质(康振生, 2004)，降低小麦品质，对人畜健康产生严重威胁(J. DavidMiller, Greenhalgh, Wang, & Lu, 1991)。而在当前小麦育种过程中，亲本选择具有单一性，使得育成小麦品种的遗传组成单一化，农艺性状和对各种病害的抵御能力下降，所以小麦抗病基因的挖掘和功能研究对小麦病害问题具有重要意义。

发明内容

本发明针对以上不足之处，提供了一种小麦抗赤霉病基因TaXAX1。在小麦中过量表达了TaXAX1基因，可显著提高小麦赤霉病的抗性。

本发明解决以上问题，采用的技术手段为：一种小麦抗赤霉病基因TaXAX1， cDNA如SEQ ID NO .1所示。

小麦抗赤霉病基因TaXAX1编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO ：2。

所述的小麦抗赤霉病基因TaXAX1在小麦品种改良中的应用。

所述的小麦抗赤霉病基因TaXAX1在提高小麦抗赤霉病中的应用。

本发明提供了一种提高小麦抗赤霉病的基因TaXAX1及其编码的蛋白TaXAX1。通过构建过表达载体，转化感病小麦，经过除草剂及PCR筛选阳性植株，最终发现在小麦中过量表达TaXAX1基因后，转基因阳性植株赤霉菌的发病现象产生了明显的延缓，赤霉病抗性得到显著提高。

本发明首次分离克隆了小麦TaXAX1基因，并首次在小麦中过量表达了TaXAX1基因，为培育抗赤霉病的小麦品种提供了新的思路。也为其他单子叶植物的抗赤霉病育种提供了参考。

附图说明

图1所示是本发明TaXAX1 cDNA 扩增结果，其中M: marker; C1、C2：TaXAX1 cDNA扩增带。

图2所示是TaXAX1基因在应激条件下的RNA-seq表达模式，其中y轴的单位是每千百万个碱基（TPM）的转录本，TaXAX1基因的每个TPM值是三个生物学重复的平均值。误差棒代表SD。t 检验进行差异显著分析，* P value t test<0.05； ** P value t test<0.01；*** P value t test<0.001；

图3所示是转基因植株的PCR验证结果，其中M:Marker; CK:Fielder;1-12:不同的转基因小麦植株；V：PC611-TaXAX1表达载体；

图4所示是T2代阳性转基因植株不同时间点发病表型，其中A.病穗率；** P value ttest<0.01；B.4天穗部发病表型；C.14天穗部发病表型；D.21天穗部发病表型；WT：野生型Fielder；Line1、Line3：转基因阳性纯系，阴：转基因阴性植株；箭头表示初步侵染部位。

图5中，A所示为总RNA电泳图，B所示为cDNA电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述：

实施例1、基因TaXAX1的筛选

以小麦品种“望水白”叶片为材料，将DON(Deoxynivalenol, 脱氧雪腐镰刀菌烯醇，sigma公司)毒素标准液稀释至100PPM，然后用一次性注射器注射进小麦幼苗叶片表皮，同时以无菌水相同操作注射为对照。分别培养12、24小时后取样备用。

把DON诱导处理的2份望水白叶片组织样品等量混合作为实验样品，把无菌水处理的2份望水白叶片组织样品等量混合作为对照样品。依照TRIzol Reagent kit（Invitrogen公司）提取2份混合样品的总RNA（图5A）。分离mRNA后,按照BD sMART PCR cDNA synthesis试剂盒(Clontech公司)的说明合成双链cDNA。经1.4%的琼脂糖凝胶电泳后, cDNA呈现为一条0.3～2 kb的smear状（图5B)，从大小上来看与真核植物的基因转录本大小相吻合。

正向差减杂交cDNA(以DON处理过的cDNA作为tester) 和反向差减杂交cDNA(以水处理过的cDNA作为tester) ，构建DON毒素处理的小麦cDNA抑制差减杂交文库（suppression subtractive hybridization,SSH），从中筛选获得一个DON诱导的262bpEST片段。

利用EnsemblPlants小麦物种数据库（http://plants.ensembl.org/Triticumaestivum）中blast得到一个全长为2210bp的全长cDNA克隆，位于7D染色体上。同时发现另外A、B基因组中的同源基因。并且在登录号ERP003465的转录组数据库中，在抗FHB(Fusarium head blight)小麦品种CM-820365的穗中分别接菌F.g和水mock 50h后，3条同源基因都发现明显上调（图2）。

实施例2、基因TaXAX1CDNA序列获得

以望水白叶片cDNA为模板，用引物TaXAX1F（5’— TATATGCGGCCGCATGGCGTCCACGGCGTACG—3’，SEQ ID NO：3），TaXAX1R（5’—TATATGGCGCGCCCATCCTGCAGCTGGTCGAG— 3’， SEQ IDNO：4） PCR 扩增基因TaXAX1。使用超保真DNA 聚合酶（Phanta Max Super-Fidelity DNApolymerase 南京诺唯赞公司）：

PCR 反应（50 μL）：

2 × Phanta Max Buffer 25 μL

dNTP Mix（2.5 mM） 4 μL

引物 1(10 μM) 2 μL

引物 2(10 μM) 2 μL

模板 x μL（约 100 ng）

Phanta Max Super-Fidelity

DNA polymerase（1U/μL） 1 μL

ddH2O to 50 μL

PCR 反应程序：95℃与变性3min,94℃变30s,68℃退火30s，72℃延伸(1min/1Kb),共30~40个循环，之后72℃终延伸5min，16℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。切胶回收目的片段。将该核苷酸与T-载体（全式金）在25℃连接15min,连接体系为5μL，包括T-载体0.5μL，PCR产物4.5μL，连接产物通过42℃热击90秒，冰浴2min,转化到大肠杆菌细胞中，送至博日公司测序。扩增结果见图1，所得基因TaXAX1的序列如SEQ ID NO .1所示，该蛋白包含546个氨基酸,等电点为5.98，如SEQ ID NO .2所示。

实施例3、

将TaXAX1基因连接到表达载体PC611强启动子Ubi下游，获得过表达载体PC611-TaXAX1。验证后，构建好的PC611-TaXAX1载体由中国农业科学院小麦遗传转化平台转化感病材料Fielder。

转化完成后，将分化苗转移至生根壮苗培养基后，待苗长至10cm左右时炼苗移栽，缓苗后先用除草剂涂饰叶片，初步筛选阳性植株,对有除草剂抗性的植株提取叶片DNA进行PCR验证，验证引物为TaXAX1F/R。验证结果如图3所示。

将阳性株系种植于山东农业大学温室中，种植阴性转基因株系和野生型Fielder为对照。扬花期，利用禾谷镰刀菌（F. graminearum）野生型菌株 PH-1，单花滴定接种赤霉菌(Kong, Anderson, & Ohm, 2005; Li et al., 2016)。将孢子液浓度调整为4×10⁵个/mL，吸取10 μL 孢子悬浮液滴入麦穗中部小穗外稃和内稃中间的小花处。套袋保湿72 h。每天按时观察统计。统计过程中一般将小穗发生明显枯黄作为发病表型，只有菌丝一般不认为小穗开始发病。计算病穗率以判断赤霉病的严重程度。病穗率(percentage of scabbedspiklet, PSS)=（发病小穗数/总小穗数）×100%。

如图4所示，初始统计时发现株系Line1、Line3发病表型出现较晚，野生型与阴性植株注菌第4天出现明显枯黄表型，Line1、Line3第5天才可以观察到明显发病表型。后期发病中，Line1、Line3的病穗率一直明显低于野生型与阴性植株，这说明过表达TaXAX1基因的植株对赤霉病的抗性能力得到提高。推测TaXAX1基因与赤霉病抗性相关，可能与该基因参与细胞壁木聚糖的生物合成有关，增强细胞壁抗降解酶的能力，使小麦抗赤霉病的能力增强。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种小麦抗赤霉病基因TaXAX1及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1641

<212> DNA

<213> 小麦品种望水白(Triticum aestivum L.)

<400> 1

atggcgtcca cggcgtacgc gcgggggtcc aagccgccgg tcggtcccgg cgagcggagg 60

cagccgcggc tggccaagga gctgagcagg atcgagccca agaagctcgg gattgggctc 120

gtcgccggct gctgcctcgc cctcctcacc tacatctcct tcgcccgcct cttcgccatc 180

tactcgccgg tcttcgagag cacgtccatg gtgatgaaga acgccccgcc cgcctccacg 240

gcggtgccca gcacggagga ggccgtgccg gtccagaaga agatcgaagt cgagggcggg 300

gaagatctcg ctggaggcgg cacggagccg aaagagcccg gctttccaca agaaacaaag 360

atcgaagaaa aggaggagga gaccccagcg gagacaaaaa gcacccaaaa agaggagacc 420

gcggtaacca agccagatgg tgccgataaa acagaagagg ccaaggccaa gatgacctgc 480

gacgagaacg ccgtggacga gggcttcccc tacgcgcgcc cgtccgtgtg cgagctcacc 540

ggcgacgtcc gtgtcagccc caaggagaag accatgttct tcgtaaaccc gtccggcgcc 600

ggcccgttcg acgacaacgg ggagaagaag atccggccgt acgcccgaaa ggacaccttc 660

cttctcccgg gcgtcgtgga ggtcaccatc aagtccgtgg cgtcgcccgt gtccgcgccg 720

gcgtgcgccc ggcggcacga cgtccccgcg gtggtcttct ccacggccgg ctacacggac 780

aacttcttcc acgacaacac ggacgtgatg atcccgctct tcctctccac ggcgcacttc 840

gccggcgagg tgcagttcct catcaccaac tacaagccgt ggtgggtgac caagttcgcg 900

ccgctgctca agaagctgtc caactacgag gtgatcaact tcgacaagga ggaggaggtg 960

cactgcttcc ccggaggcca gctcgggctg taccgcgacc gcgacctcat catcggcccg 1020

cacccgaccc gcaacccgca caactacacc atggtggact acaaccggtt cctccgccgc 1080

gcgttcggcc tgccgcggga cgccccggcg gtgctcggcg agaagatggc cgtcaggccc 1140

aagatgctca tgatcgagcg caagggcacg cgcaagctgc tcaacctgcg cgccgtgcag 1200

gccctctgcg aggagctcgg cttcgaggtg accgtggcgg aggccggcgc cgacgtgcgc 1260

gccttcgccg agacggtcaa cgccgccgac gtgctcctgg cggtgcacgg cgccgggctg 1320

accaaccaga tcttcctgcc caccggcgcc gtgctggtgc agatcgtgcc gtggggcaag 1380

atggactgga tggccacaaa cttctacggc cagccggcgc gcgacatgca gctccggtac 1440

gtcgagtact acgtgtccga ggaggagacg acgctcaagg acaagtactc ccgcgaccac 1500

tacgtgttca agaaccccat gcagatccac gcggggggat ggccggcgct cgcggagatc 1560

gtcatgaagc aggatgtcat ggtgaatgtc accagattca agccgttcct cctcaaggcg 1620

ctcgaccagc tgcaggattg a 1641

<210> 2

<211> 546

<212> PRT

<213> 小麦品种望水白(Triticum aestivum L.)

<400> 2

Met Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Arg Gly Ser Lys Pro Pro Val Gly Pro

1 5 10 15

Gly Glu Arg Arg Gln Pro Arg Leu Ala Lys Glu Leu Ser Arg Ile Glu

20 25 30

Pro Lys Lys Leu Gly Ile Gly Leu Val Ala Gly Cys Cys Leu Ala Leu

35 40 45

Leu Thr Tyr Ile Ser Phe Ala Arg Leu Phe Ala Ile Tyr Ser Pro Val

50 55 60

Phe Glu Ser Thr Ser Met Val Met Lys Asn Ala Pro Pro Ala Ser Thr

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Thr Glu Glu Ala Val Pro Val Gln Lys Lys Ile Glu

85 90 95

Val Glu Gly Gly Glu Asp Leu Ala Gly Gly Gly Thr Glu Pro Lys Glu

100 105 110

Pro Gly Phe Pro Gln Glu Thr Lys Ile Glu Glu Lys Glu Glu Glu Thr

115 120 125

Pro Ala Glu Thr Lys Ser Thr Gln Lys Glu Glu Thr Ala Val Thr Lys

130 135 140

Pro Asp Gly Ala Asp Lys Thr Glu Glu Ala Lys Ala Lys Met Thr Cys

145 150 155 160

Asp Glu Asn Ala Val Asp Glu Gly Phe Pro Tyr Ala Arg Pro Ser Val

165 170 175

Cys Glu Leu Thr Gly Asp Val Arg Val Ser Pro Lys Glu Lys Thr Met

180 185 190

Phe Phe Val Asn Pro Ser Gly Ala Gly Pro Phe Asp Asp Asn Gly Glu

195 200 205

Lys Lys Ile Arg Pro Tyr Ala Arg Lys Asp Thr Phe Leu Leu Pro Gly

210 215 220

Val Val Glu Val Thr Ile Lys Ser Val Ala Ser Pro Val Ser Ala Pro

225 230 235 240

Ala Cys Ala Arg Arg His Asp Val Pro Ala Val Val Phe Ser Thr Ala

245 250 255

Gly Tyr Thr Asp Asn Phe Phe His Asp Asn Thr Asp Val Met Ile Pro

260 265 270

Leu Phe Leu Ser Thr Ala His Phe Ala Gly Glu Val Gln Phe Leu Ile

275 280 285

Thr Asn Tyr Lys Pro Trp Trp Val Thr Lys Phe Ala Pro Leu Leu Lys

290 295 300

Lys Leu Ser Asn Tyr Glu Val Ile Asn Phe Asp Lys Glu Glu Glu Val

305 310 315 320

His Cys Phe Pro Gly Gly Gln Leu Gly Leu Tyr Arg Asp Arg Asp Leu

325 330 335

Ile Ile Gly Pro His Pro Thr Arg Asn Pro His Asn Tyr Thr Met Val

340 345 350

Asp Tyr Asn Arg Phe Leu Arg Arg Ala Phe Gly Leu Pro Arg Asp Ala

355 360 365

Pro Ala Val Leu Gly Glu Lys Met Ala Val Arg Pro Lys Met Leu Met

370 375 380

Ile Glu Arg Lys Gly Thr Arg Lys Leu Leu Asn Leu Arg Ala Val Gln

385 390 395 400

Ala Leu Cys Glu Glu Leu Gly Phe Glu Val Thr Val Ala Glu Ala Gly

405 410 415

Ala Asp Val Arg Ala Phe Ala Glu Thr Val Asn Ala Ala Asp Val Leu

420 425 430

Leu Ala Val His Gly Ala Gly Leu Thr Asn Gln Ile Phe Leu Pro Thr

435 440 445

Gly Ala Val Leu Val Gln Ile Val Pro Trp Gly Lys Met Asp Trp Met

450 455 460

Ala Thr Asn Phe Tyr Gly Gln Pro Ala Arg Asp Met Gln Leu Arg Tyr

465 470 475 480

Val Glu Tyr Tyr Val Ser Glu Glu Glu Thr Thr Leu Lys Asp Lys Tyr

485 490 495

Ser Arg Asp His Tyr Val Phe Lys Asn Pro Met Gln Ile His Ala Gly

500 505 510

Gly Trp Pro Ala Leu Ala Glu Ile Val Met Lys Gln Asp Val Met Val

515 520 525

Asn Val Thr Arg Phe Lys Pro Phe Leu Leu Lys Ala Leu Asp Gln Leu

530 535 540

Gln Asp

545

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

tatatgcggc cgcatggcgt ccacggcgta cg 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tatatggcgc gcccatcctg cagctggtcg ag 32

Claims

1.一种小麦抗赤霉病基因TaXAX1，其特征在于，cDNA如SEQ ID NO ：1所示。

2.权利要求1所述的小麦抗赤霉病基因TaXAX1编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO ：2。

3.权利要求1所述的小麦抗赤霉病基因TaXAX1在小麦品种改良中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的小麦抗赤霉病基因TaXAX1在提高小麦抗赤霉病中的应用。