CN117106046A

CN117106046A - 棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1和转录因子GhTCP14a及其表达基因和应用

Info

Publication number: CN117106046A
Application number: CN202310853579.5A
Authority: CN
Inventors: 王坤; 胡晓; 周宇; 王得和
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2022-07-25
Filing date: 2023-07-12
Publication date: 2023-11-24

Abstract

本发明涉及一种棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，或具有0，或1，或多个氨基酸突变，但生物活性不变的序列。本发明涉及所述分泌肽GhRALF1的表达基因，以及其相关应用。本发明还涉及转录因子GhTCP14a及其表达基因应用。发明人通过酶解获得胚珠外珠被细胞的方法，并进行单细胞测序分离出纤维细胞类群。随后发现纤维的生长是一个节律的过程，除了核心节律基因对该过程的调控，还被小分子肽GhRALF1和转录因子GhTCP14a调控，改变其节律性，可以加快纤维生长，通过对节律基因，分泌肽及转录因子的表达进行调节可改变棉纤维长度，可推广至棉花育种技术领域，有效改善纤维的品质。

Description

棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1和转录因子GhTCP14a及其表达基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1和转录因子GhTCP14a及其表达基因和应用。

背景技术

棉花(Gossypium spp.)是世界上主要的经济作物，不仅是世界上主要的天然纤维来源，也是仅次于大豆的重要油料和蛋白作物。棉纤维的发育受到世界各地棉花研究者的广泛关注。至今已有多个与棉纤维发育相关的基因被报道，但是棉纤维发育复杂的分子调控网络仍然有待探究。

昼夜节律钟作为节拍器控制植物气孔开合，下胚轴伸长，开花时间等生理过程。在番茄和大豆中，生物钟发生改变可以促进其生长，与调节植物的昼夜节律钟可以提高产量及其他农艺性状的观点一致。在棉花中，与纤维发育相关的脂肪酸代谢和乙烯合成通路都存在节律性，然而昼夜节律与纤维发育有无直接的联系仍然是未知的。

发明内容

本发明的目的之一在于提供棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1及其表达基因和应用。

本发明证实棉纤维细胞的伸长是一个节律性的过程，其受到节律基因及多种因子的调控，主要包括分泌肽GhRALF1及转录因子GhTCP14a，这两种因子同样受到节律基因的调控，改变其节律性可提高纤维的品质。

实现上述目的的技术方案包括如下。

本发明的第一方面，是提供一种棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，或具有0，或1，或多个氨基酸突变，但棉花节律调控的生物活性不变的序列。

在其中一些实施例中，所述的棉花是指陆地棉(Gossypiumhirsutum)或海岛棉(Gossypium barbadense)。

本发明的第二方面，是提供表达如上述的分泌肽GhRALF1的棉花节律调控相关基因GhRALF1。

本发明的第三方面，是提供上述的棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1和/或上述的基因GhRALF1的应用。

上述的棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1和/或上述的基因GhRALF1在调控棉花节律生长中的应用。

上述的棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1和/或上述的基因GhRALF1在调控棉纤维生长中的应用。

在其中一些实施例中，所述应用包括抑制棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1的表达，用于促进棉纤维伸长。

上述的棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1和/或上述的基因GhRALF1在棉花育种中调控棉纤维长度的应用。

本发明的第四方面，是提供一种调控棉纤维生长的方法，包括抑制或者促进棉花植株或棉花细胞中的如上述的基因GhRALF1的表达；或

降低或提高上述分泌肽GhRALF1的表达量。

在其中一些实施例中，抑制棉花植株或棉花细胞中的上述的基因GhRALF1的表达，用于促进棉纤维伸长；

或降低上述分泌肽GhRALF1的表达量，用于促进棉纤维伸长。

在其中一些实施例中，包括抑制棉花GhRALF1基因的表达；所述的抑制GhRALF1基因的表达是通过对棉花GhRALF1基因进行基因编辑实现。

本发明的第五方面，是提供一种调控棉纤维生长的生物制剂，包括有抑制或者促进棉花植株或棉花细胞中的如上述的基因GhRALF1的表达，或降低或提高上述分泌肽GhRALF1的表达量的物质。

在其中一些实施例中，所述物质为促进剂或抑制剂。

在其中一些实施例中，所述的调控剂为抑制剂，并且所述的调控是指促进植物细胞和/或棉纤维伸长。

在其中一些实施例中，所述的调控剂为促进剂，并且所述的调控是指抑制植物细胞和/或棉纤维伸长。

在其中一些实施例中，所述物质为抑制上述的基因GhRALF1的表达RNAi干扰序列。

本发明的目的之二在于提供棉花节律调控相关转录因子GhTCP14a及其表达基因和应用。

本发明的第五方面，是提供一种棉花节律调控相关转录因子GhTCP14a，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，或具有0，或1，或多个氨基酸突变，但生物活性不变的序列。

本发明的第六方面，是提供表达上的转录因子GhTCP14a的棉花节律调控相关基因GhTCP14a，其序列如SEQ ID NO.9所示，或具有0，或1，或多个核苷酸突变，但生物活性不变的序列。

本发明的第七方面，是提供上述的棉花节律调控相关转录因子GhTCP14a和/或上述的基因GhTCP14a在调控棉花节律生长中的应用。

本发明的第七方面，是提供上述的棉花节律调控相关转录因子GhTCP14a和/或上述的基因GhTCP14a在调控棉纤维生长中的应用。

在其中一些实施例中，促进棉花节律调控相关基因GhTCP14a的表达，用于促进棉纤维伸长。

本发明的第八方面，是提供上述的棉花节律调控相关转录因子GhTCP14和/或上述的基因GhTCP14a在棉花育种中调控棉纤维长度的应用。

本发明的第九方面，是提供一种调控棉纤维生长的方法，包括抑制或者促进棉花植株或棉花细胞中的如上述的基因GhTCP14a的表达；或

降低或提高上述转录因子GhTCP14a的表达量。

在其中一些实施例中，促进棉花植株或棉花细胞中的如上述的基因GhTCP14的表达，用于促进棉纤维伸长；

或促进上述转录因子GhTCP14a的表达量，用于促进棉纤维伸长。

本发明的第十方面，是提供一种提高纤维长度的方法，包括延长对棉花植株的光照时长。

在本发明中，发明人通过酶解获得胚珠外珠被细胞的方法，并进行单细胞测序分离出纤维细胞类群，随后发现纤维的生长是一个节律的过程，除了核心节律基因对该过程的调控，还被小分子肽GhRALF1和转录因子GhTCP14a调控，改变其节律性，可以加快纤维生长，通过对节律基因，分泌肽及转录因子的表达进行调节可改变棉纤维长度，可推广至棉花育种技术领域，有效改善纤维的品质。

附图说明

图1为单细胞测序方案。

图2为酶解产生大量来自胚珠外珠被的原生质体。

图3为酶解前后胚珠切片。

图4为模块富集基因鉴定。

图5为251个模块富集基因的聚类。

图6为单细胞分群。

图7为WT和FL单细胞分群。

图8为单细胞测序的重复性。

图9为WT和FL单细胞测序的批次效应。

图10为标记基因数目。

图11为C3标记基因GO注释。

图12为XTH基因原位杂交。

图13为无根发育轨迹图。

图14为相对表达时间。

图15为纤维细胞发育轨迹。

图16为荧光定量验证发育轨迹。

图17为RALF的单细胞表达。

图18为RALF小肽序列比对。

图19为RALF小肽处理体外培养的胚珠。

图20为RALF对胚珠质子泵活性的影响。

图21为GhRALF1处理前后的转录组测序。

图22为GhRALF1的表达及pH，纤维长度变化。

图23为节律基因表达。

图24为节律表达基因qRT-PCR验证。

图25为基于单细胞染色质可及性测序进行单细胞分群。

图26为WT和FL在染色质可及性上的差异。

图27为预测纤维细胞特异K-mer基序的方法。

图28为具有调控特异性基因潜力的k-mers。

图29为M1中包含的G-box基序。

图30为TCP/TCP-like基序。

图31为C3高表达基因中被TCP/TCP-like基序靶向的比例。

图32为TCP/TCP-like靶标基因的GO注释。

图33为凝胶阻滞实验证实TCP蛋白与TCP/TCP-like基序结合。

图34为GhTCP14a在16小时和24小时日照下表达变化。

图35为WT和FL有关多聚核糖体和能量产生的比较。

图36为WT昼夜有关多聚核糖体和能量产生的比较。

图37为24小时连续光照对纤维长度的影响。

图38为实施例四中GhRALF1的表达规律响。

图39为实施例四中GhRALF1的完整蛋白序列的大小检测结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

单细胞测序技术的发展使得在单个细胞精度下检测基因的表达成为可能。但是由于植物存在细胞壁，将植物组织酶解获得原生质体这一难题大大限制了单细胞测序在植物中的应用。目前仅在拟南芥的根和叶片，水稻，玉米，杨树茎和小立碗藓中成功运用，在棉花中还未见报道。

>GhTCP14a(CDS序列)

ATGGAAGGAGGAGGAAGTGATGATCATCACCACCACCACCACAGCCACCACCATCACCACCAACAACCGCTCCATCATCA

TCATCGTCACCACCACCGCCCTACTTTCCCATTCCAATTACTAGAGAAGAAAGAAGAAGATAACCAACCTTGTTCCTCCT

CTTCTTCCCTTCCTTTCCCTTCCCTACCGGTTTCATCTTCCTCGGCCGATCAACACACCTCGACTCGTTCCATTTCAACC

CACCAGATCTCGCCGGAAACTTCCAAGACTCCACCGCCTAAACGTACTTCGACTAAAGACCGACACACCAAGGTAGATGG

GCGTGGTCGTAGGATCCGCATGCCGGCTCTTTGTGCAGCTAGGGTTTTTCAGCTTACTCGCGAGTTGGGTCATAAATACG

ATGGTGAAACGATCGAGTGGTTGCTACAACAAGCTGAGCCGGCGGTGATCGCCGCTACGGGGACTGGTACCATCCCTGCA

AACTTCACTTCCCTCAATATCTCACTCCGTAGCTCCGGCTCAAGCATGTCGGTTCCTTCTCAGCTTCGGTCCTCGGGTTT

TAGCTCCAACTTTTCTATGCAACAACGTAGAAGCTTGTTCCCCGGAATCGGACTCGAAACGACGCCGACGCCGACGACGT

TCCTTAACTTCCAATCTAGTAGTACTTCGTTGGGAATATCGGAAGAAGCCGAAGAAAGTAGTTTAGGAAGGAAACGAAGA

CCCGAACAAGATTTATCTTCACAACATCATCAAATGGGGAGTTACTTGTTGCAATCAAGCACCGGTACAATTCCGGCGAG

TCACCACGGTCAAGTTCCGGCTAACTTTTGGATGGTAACTAATTCTAATAATCAAGTTATGAGTGGTGGTGACCCTATAT

GGACATTTCCTTCAGTTAATAACAGTGGTTTGTATAGGGGAACTATGTCTAGTGGGTTGCATTTCATGAACTTTCCAACA

CCAATGGCCTTGTTACCAGGCCAACAATTGGGTTCAAGCAGTAGCGGTGCCGATGGAGGCGGCGGCGGAGGTGGCAGTGG

TGGAAGTAGTGGCATAAGTGAAGGACATTTAAATATGTTAGCTGGATTGAATCCTTATAGACAAGACTCCGGTGGCACCGGCGTTTCGGAATCTCAAGTGAGTGGCTCACATTCACACCACGGTGGTGGAGGTGGCAGCGATGAATGA(SEQ ID NO.9)>GhTCP14 a(氨基酸序列)

MEGGGSDDHHHHHHSHHHHHQQPLHHHHRHHHRPTFPFQLLEKKEEDNQPCSSSSSLPFPSLPVSSSSADQHTSTRSIST

HQISPETSKTPPPKRTSTKDRHTKVDGRGRRIRMPALCAARVFQLTRELGHKYDGETIEWLLQQAEPAVIAATGTGTIPA

NFTSLNISLRSSGSSMSVPSQLRSSGFSSNFSMQQRRSLFPGIGLETTPTPTTFLNFQSSSTSLGISEEAEESSLGRKRR

PEQDLSSQHHQMGSYLLQSSTGTIPASHHGQVPANFWMVTNSNNQVMSGGDPIWTFPSVNNSGLYRGTMSSGLHFMNFPTPMALLPGQQLGSSSSGADGGGGGGGSGGSSGISEGHLNMLAGLNPYRQDSGGTGVSESQVSGSHSHHGGGGGSDE*(SEQ ID NO.8)

>GhRALF1(CDS序列)

ATGGCGGTACTCAACTATAAGCTCGTTGTGATCTGCGCGACGCTCATGGCAGCAGCTGCGGCGGCGGTAATGACTGTTGATGCGAGTGGGGACCACCACCTGCAACACCCGATCCTGGGGAGGATACCGACCAGATCGCCATGCAAGGGCTCCATAGCCGAATGCTTAGCCGGGGAAGAGTTCGAGCTGGATTCGGAGAGCAGCCGGCGCATTTTAGCCACCACCAGGTACATCAGCTACGGCGCGCTTCAGAGGAACACCGTTCCTTGTTCCCGGCGTGGCGCTTCCTATTATAATTGCAAGCCTGGTGCTCAGGCTAACCCTTACAACCGTGGGTGCAGCCGTATTACCAGGTGCAGGGGCTGA(SEQ IDNO.7)

>GhRALF1(氨基酸序列)

MAVLNYKLVVICATLMAAAAAAVMTVDASGDHHLQHPILGRIPTRSPCKGSIAECLAGEEFELDSESSRRILATTRYISYGALQRNTVPCSRRGASYYNCKPGAQANPYNRGCSRITRCRG*((SEQ ID NO.6)

上述为该小肽的完整序列，该小肽会被切割，成熟肽才发挥作用,下划线部分为切割位点。ATTRYISYGALQRNTVPCSRRGASYYNCKPGAQANPYNRGCSRITRCRG(SEQ ID NO.5)为其成熟肽的氨基酸序列。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例Ⅰ棉花胚珠外珠被细胞单细胞测序及纤维细胞类群的鉴定

(一)酶解获得胚珠外珠被细胞

酶解使用的缓冲液包含10mM KCl,2mM MgCl₂,2mM CaCl₂,0.1％BSA,2mM MES pH5.7和600mM甘露醇。所用酶的组合为：1.5％cellulase R-10，1.0％hemicellulose，0.3％Macerozyme R-10。来自-2,-1,0,1,2DPA(0DPA为开花当天，-2DPA为开花前2天。2DPA为开花后2天)的胚珠在28℃摇床中以50rpm酶解1.5h后，用40μm的筛网过滤去除未被酶解的组织以及较大的碎片，滤液使用水平转子100g离心10min，弃掉上清，获得的原生质体沉淀用8％的甘露醇清洗三次，最终用500μL重悬。使用台盼蓝染色确定细胞活率后，血球计数板计数。

(二)裂解胚珠外珠被细胞获得细胞核

裂解所用的裂解液包含10mM Tris-HCL,pH 7.4,10mM NaCl,3mM MgCl2,0.1％Tween20,1％BSA,0.1％NP-40,0.5％Dodecyl Maltoside(DDM)，裂解后使用40μm筛网过滤，滤液经过500g离心3min后，弃上清重悬，使用流式细胞仪对细胞核悬液进行纯化，收集的细胞核用血球计数板计数。

(三)单细胞测序及数据分析

单细胞转录组测序：单细胞液滴的形成使用10×Genomics公司的单细胞微流控芯片，构建好的文库使用BGISEQ-500平台进行PE100测序。

单细胞ATAC测序：纯化的细胞核使用Tn5转座酶切割。构建好的文库使用MGISEQ-2000进行PE50测序。

使用Cellranger(v3.1.0)分离出单个细胞的表达谱后，利用Batchelor package(v1.2.4)中的correctExperiments功能去除批次效应。校正后的数据使用UMAP algorithm降维，然后使用monocle3(v0.2.1)对细胞进行分群。

标记基因使用scran package中的findMarkers功能来预测，差异表达基因使用edgeR package(v3.28)来获得。

(四)RNA原位杂交

为了证明cluster3(细胞类群3即C3)为纤维细胞，使用引物对上游引物(ForwardPrimer):5‘-CTGGGACTGTCACTGCCTTT-3’(SEQ ID NO.1)及下游引物(Reverse Primer):5’-AATTAATACGACTCACTATAGGGTGGACCAGTCGGTCTTTTCG-3’(SEQ ID NO.2)进行体外扩增及转录作为反义探针进行RNA原位杂交。使用引物对Forward Primer:5’-ATTTAGGTGACACTATAGCTGGGACTGTCACTGCCTTT-3’(SEQ ID NO.3)及Reverse Primer:5’-TGGACCAGTCGGTCTTTTCG-3’(SEQ ID NO.4)进行体外扩增及转录作为正义探针进行RNA原位杂交作为对照。组织切片为14μm，探针的杂交在杂交炉中进行，杂交炉中45℃过夜孵育。杂交信号使用anti-digoxigenin-AP抗体和NBT/BCIP检测。

实例二GhRALF1小肽对纤维伸长的抑制作用(一)棉花胚珠体外培养及小肽处理1DPA的棉桃使用10％的次氯酸钠消毒后，小心地将棉桃中的胚珠剥离到体外培养液体培养基上，在28℃培养箱中暗培养，体外合成的GhRALF1小肽序列为ATTRYISYGALQRNTVPCSRRGASYYNCKPGAQANPYNRGCSRITRCRG(SEQ ID NO.5)和GhRALF2小肽序列为FWKRMRYYISYGALWANRIPCPPRAGRSYYTHNCFKVHGPVHPYTRGCSRITRCRR(SEQ ID NO.10)即RRXL切割位点后面的成熟肽部分，在体外培养的过程中使用终浓度1μM处理。

(二)棉花胚珠转录组测序

按照上述体外培养及小肽处理的方法，30min后，分别取小肽处理和未处理的体外培养的胚珠，提取总RNA,构建的文库使用DNBSEQ进行PE150测序。

(三)细胞质膜H⁺-ATPase活性检测

使用Seahorse XF24生物能量测定仪测量胚珠质膜的H+-ATPase活性,在实验前一天将校准液加入到探针板中，在28℃过夜水化探针板，检测板每个孔放三颗胚珠，加入等量的检测液后，放入28℃无二氧化碳培养箱45min后，上机检测，共检测23个循环，每个循环包括混匀3min,静置2min,再检测3min。GhRALF1和GhRALF2小肽分别在检测大概20分钟被注射进检测孔。

(四)棉花胚珠质外体pH检测及纤维细胞长度测量

使用pH＝7.0的ddH₂O作为检测液，将0-2DPA棉桃的胚珠剥离到1ml检测液中，微电极pH计对棉花胚珠的pH进行检测。纤维细胞长度的测量使用石蜡包埋技术，切片后番红固绿染色，扫描的图像使用Caseviewer(V2.4)测量纤维细胞的长度。为了尽量减小差异，我们摘取的棉桃都是来自相同生长状况的棉花植株，并且在相同位置的树枝上，另外对于胚珠切片，我们选用的胚珠都是来自棉桃中相同位置的。

(五)胚珠外珠被qRT-PCR(荧光定量PCR)及RNA-seq

胚珠外珠被细胞的获得使用上述酶解的方法，使用天根多糖多酚RNA提取试剂盒提取，向收集的原生质体中直接加入RNA提取裂解液进行裂解。反转录使用OligodT引物，一步法反转录试剂盒。同时构建的文库使用DNBSEQ进行PE150测序。

实施例三GhTCP14a节律性地控制纤维伸长过程中的翻译和线粒体能量产生

(一)凝胶阻滞实验

使用引物对5’FAM-GCAGAATTCACTTGtgggctaaACCAGTCTAGACGT-3’

(SEQ ID NO.11),5’-ACGTCTAGACTGGTttagcccaCAAGTGAATTCTGC-3’(SEQ IDNO.12)退火形成5`端带FAM标签的探针，冷探针使用相同的探针序列但是不带FAM荧光标签，突变探针使用引物对5’-GCAGAATTCACTTGaaaaaaaaACCAGTCTAGACGT-3’(SEQ IDNO.13)，5’-ACGTCTAGACTGGTttttttttCAAGTGAATTCTGC-3’(SEQ ID NO.14)退火形成，蛋白与探针在25℃孵育60min后，在6％非变性PAGE胶中电泳1小时。

(二)ATP含量测定

ATP的浓度使用ATP检测试剂盒检测。使用200微升裂解液裂解样品，在4℃下12000g离心5min，取上清测定蛋白浓度后检测ATP的浓度，荧光信号使用酶标仪FlexStation 3检测，ATP的浓度使用蛋白的含量进行计算。

(三)多聚核糖体分析

多聚核糖体提取后重悬在提取缓冲液中，然后上样到10％-50％的蔗糖梯度介质上，使用超速离心机35000rpm在4℃离心4小时，每一层核糖体组分由UV260吸收光谱检测。

实验结果：

棉花胚珠的结构有中心的胚囊及胚囊外的两层包被，即内珠被和外珠被，纤维细胞是由外珠被最外层细胞发育而来，为了确定外珠被的细胞类型，我们对陆地棉野生型及其无毛突变体的外珠被进行了单细胞转录组测序和单细胞染色质可及性测序(图1)。该无毛突变体不发育形成纤维细胞，对于研究纤维细胞的起始和伸长是很有价值的材料。

发明人发明了一种新的制备原生质体的方法，即部分组织酶解消化法(PTED)。通过使用纤维素酶，半纤维素酶及果胶酶对陆地棉野生型和无毛突变体-2，-1，0，1，2DPA的胚珠进行酶解，通过控制酶解的时间为1.5小时获得只来自外珠被的原生质体，原生质体的活率可达到85％以上(图2)。通过石蜡包埋切片，番红固绿染色的方法，我们对酶解前后的胚珠进行比较，发现该酶解方法只酶解了来自胚珠外珠被的细胞(图3)。

来自WT(棉花陆地棉野生型)和FL(陆地棉天然的无毛突变体)外珠被(outerintegument)的原生质体分别进行了单细胞转录组测序和单细胞染色质可及性测序。最终在单细胞转录组测序的两个重复中，我们成功地在WT和FL中分别捕获了18064和21389个细胞，分别检测到98263514和109914075条序列，分别检测到58081和59869个基因。

我们使用UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection forDimension Reduction)对单细胞测序数据进行了降维处理。为了知道所有检测到的细胞的分布情况，我们鉴定到251个在UMAP特异位置表达的模块富集基因(图4)，并且这些细胞可以分为5个类群，其中表达模块富集基因的细胞分为4个类群，不表达模块富集基因的细胞分为一个类群(图5)。根据模块富集基因在UMAP上的特异分布，非监督聚类得到的这12个细胞类群能合并成5个类群C1-C5(图6)。野生型中捕获到的细胞分为5个类群C1,C2,C3,C4,C5，无毛突变体分为四个类群C1,C2,C4,C5(图7)。单细胞转录组测序两个重复之间的强相关性说明我们实验的可重复性(图8)。同时我们评估了单细胞转录组测序中WT和FL之间的批次效应(图9)。

为了对这5个细胞类群进行定义，我们从这5个类群中鉴定到了668个标记基因，包括89个转录因子和579个非转录因子(图10)，其中C3的标记基因数目最多，转录因子有49个，非转录因子有290个。在比较了WT和FL的细胞类群之后，我们发现WT有一个特异的细胞类群C3，在考虑到WT和FL样本的表型差异，即WT外珠被最外层细胞可发育成纤维细胞，而FL最外层细胞不能发育成纤维，我们推测C3为纤维细胞，该推测还可以由以下原因来支持：首先对C3标记基因中的转录因子进行注释发现在C3特异表达的转录因子与种皮毛分化和起始相关(图11)。第二，C3表达的基因包含多个已经报道过的棉花纤维相关的转录因子，如MYB25,GhHOX3等，以及GWAS分析出的跟棉花纤维性状相关的基因：GhTUA9和qFWPB_D02。第三，GhTCP14a，GhFLA1，GbPDF1，GhMYB109等都已经被证明在纤维细胞中特异表达。且我们自己通过原位杂交证明C3的标记基因XTH在纤维细胞中特异表达(图12)。

为了探究这5个细胞类群之间的联系，我们使用了monocle3建立了单细胞发育轨迹。我们首先获得了一个无根的轨迹图谱(图13)。为了定义发育轨迹的源头，我们使用已经发布的不同发育时期的转录组数据来分析，由此定义了所有单细胞的相对表达时间(图14)，我们最终确定了C1-C3为纤维细胞发育的轨迹(图15)。我们用荧光定量PCR证明了不同的发育时间高表达的基因与预测结果相符(图16)。

小分泌肽在植物细胞通讯中起到重要作用，我们对于C3细胞类群的高表达基因进行分析，发现7个编码RALF小肽的基因在纤维细胞中表达较高(图17)，将这七个RALF基因的成熟肽氨基酸序列进行比对，发现根据相似性这7个小肽编码基因可分为两组GhRALF1和GhRALF2(图18)，当分别使用体外合成的小肽去处理体外培养的棉花胚珠时，小肽GhRALF1会对棉花胚珠的生长产生抑制，GhRALF2对胚珠的生长没有显著的影响(图19)。为了探索GhRALF1抑制作用的分子机制，我们检测了GhRALF1小肽处理后胚珠的质子泵活性，发现GhRALF1会导致质子泵活性降低(图20)，并且对处理前后的胚珠进行转录组测序，发现GhRALF1的处理使得起抑制作用的生长素基因响应(图21)。为了解释该小肽在纤维细胞中高表达却又抑制纤维伸长这一看似相互矛盾的现象，我们选取了连续三天四小时间隔的胚珠外珠被进行了荧光定量PCR，发现GhRALF1的表达是一个节律性的过程，并且对胚珠进行切片统计纤维细胞长度和测量胚珠的pH，发现在GhRALF1表达升高时，胚珠的pH会随之升高，在GhRALF1表达较低时，胚珠的pH也较低，纤维伸长速度较快(图22)，表明GhRALF1小肽在纤维的伸长过程中起到控制其节律性生长的作用。

为了系统地研究上述纤维节律性生长的情况，我们对-2DPA,-1DPA,0DPA,1DPA,2DPA早上10点和晚上10点的胚珠外珠被进行了转录组测序，发现共29282个基因具有昼夜节律性表达，并且这些基因可以分为4种表达形式L1,L2,L3,N1,其中L1,L2,L3为在白天高表达的基因，N4为在晚上高表达的基因(图23)，类群L3包含植物节律基因PRR5,PRR7,PRR9,CCA1,LNK1,LNK2等，多数节律基因WT和fl的表达并无差异，但当我们提取更高密度即4小时间隔的胚珠外珠被RNA进行荧光定量PCR验证发现，在WT和FL中PRR5和CCA1的表达存在差异，在WT中PRR5的表达高于FL,而FL中CCA1的表达高于WT，并且均呈现节律性，在连续光照下，其节律性仍然存在。在N1中显著富集与纤维发育相关的基因，如GhHD1,GhHOX3,GhPDF1,GhMYB25等，随后我们用qRT-PCR验证了GhHOX3，GhMYB25的表达，发现在WT中均呈现节律性表达，而在FL中几乎不表达，连续光照下在WT中的节律性消失。证明这些与纤维发育相关的基因的表达受到光的调控(图24)。

综上，我们认为纤维的伸长是节律性的，其受到节律基因以及光响应基因的调控，而由节律基因所控制的GhRALF1小肽在这个复杂的过程中作为一个抑制因子调控纤维的伸长。

另外，我们想在染色质水平探究调控纤维细胞节律性伸长的重要因子，我们从WT和FL单细胞染色质可及性测序分别捕获到8992和13615个细胞核，共发现216160个高度可信的染色质开放区域，并且在基因组上广泛分布。然而我们使用了各种方法都无法对这些细胞进行分群,这说明来自胚珠外珠被的细胞在染色质开放性上非常相似，其差异不足以进行细胞分群(图25)。

因此，我们将单细胞ATAC-seq所测得的数据作为一个批量的数据去分析WT和fl的差异，共发现11538个差异染色质可及区域，在基因水平WT和fl分别有117和95个基因的染色质可及性高度富集(图26)，对于多数基因而言，染色质的开放性与其基因的表达高度相关。我们进一步研究了ATAC-seq中与染色质可及区域结合的转录因子。我们整合了染色质可及性和scRNA-seq数据，开发了一种方法来识别TSS上游1kb基因区或启动子区域ACRs中的纤维细胞特异性K-mer基序(图27)。我们鉴定了590个具有很强调控特异性基因潜力的k-mers(图28)，并评估了它们在转录起始位点(TSS)的相对分布情况。基于此，我们发现了317个K-mers在TSS附近富集，其中247个显示方向特异性。这590个K-mers可以被分为两类：M1和M2，分别对Cluster3高表达基因起到抑制和激活作用。具有抑制作用的M1包含多个G-box基序(图29)，这个基序已经被报道过会被节律基因PRR结合去抑制节律调控中基因的转录,这些结果又一次证明我们上面有关关键节律基因参与纤维伸长的调控的结论。

另外，我们发现两组具有激活作用的顺势调控元件：TCP基序(TGGGCC/T)及TCP-like基序(TAGGGC/T)(图30),大约有1/3的cluster3高表达的基因有一个或多个的TCP/TCP-like基序(图31),并且这两类基序的激活作用仅在cluster3中发现，通过GO注释发现被TCP/TCP-like基序调控的基因主要与蛋白翻译和线粒体能量相关(图32)。

接下来我们分析了TCP蛋白家族，发现GhTCP7,GhTCP14a，GhTCP21在cluster3中特异表达，我们用凝胶阻滞实验证明了GhTCP14a不仅能结合TCP基序也能结合TCP-like基序(图33)，荧光定量PCR证明GhTCP14a在WT中存在昼夜节律表达，而FL中表达较低，且在连续光照下仍然保持节律，说明它也是由节律基因所控制的(图34)。并且被TCP靶向的蛋白翻译和线粒体能量也表现出相似的特性，即WT中蛋白翻译和线粒体能量都强于FL(图35)，且在WT中夜晚高于白天(图36)。

另外我们通过在棉花植株营养生长结束之后，将每日的光照时长从16小时提高到20小时，对获得的棉纤维长度进行比较发现(实验方法为，将温室的光照时间调为20小时，收取棉铃吐絮后的棉纤维，沿棉籽中缝梳开，用钢尺测量长度，并与光照时间为16小时的棉纤维进行对比)，光照时长增加能显著提高纤维长度(图37)。

实施例四GhRALF1小肽对纤维伸长的抑制作用

(一)完整胚珠RNA-seq

我们将一天24小时划分为6个时间段，在时间点为10am、2pm、6pm、10pm、2am、6am取完整的胚珠冻存，使用天根多糖多酚RNA提取试剂盒提取RNA。取100mg新鲜样品或在-80℃保存的样品，将其在液氮中迅速充分研磨成粉末，将粉末加入到600μL裂解液(提前加入30μLβ-巯基乙醇)中进行裂解。反转录使用Oligo dT引物，一步法反转录试剂盒。同时构建的文库使用DNBSEQ进行PE150测序。

获得测序数据的原始文件后上传至服务器。对Clean Data采用fastp(v0.20.1)软件进行双端测序数据接头序列的检测以及去除,去除接头序列后的数据采用STAR(v2.7.6a)软件与陆地棉HAU_v1基因组比对,通过featureCounts对结果进行基因水平定量，得到每个基因在对应样本中的原始表达量count数据。

(二)GhRALF1抗体制备

根据GhRALF1小肽的序列设计了特异性多肽，体外合成该特异性多肽CKPGAQANPYNRG(SEQ ID NO.15)，对新西兰大白兔进行免疫，经过多次效价检测后进行终放血，后纯化抗体。

(七)WB检测GhRALF1小肽

将要上样的蛋白或合成的特异性多肽进行变性处理，调整上样的量一致，在蛋白胶中电泳至marker到达胶底端后，停止电泳，转膜，封闭，使用上述制备的抗体进行孵育，用相应的二抗进行孵育，显影观察条带。

我们对0DPA,1DPA,2DPA的不同时间点(间隔4小时)的完整胚珠进行了转录组测序，通过对数据进行均一化后，提取GhRALF1的表达，发现GhRALF1在完整胚珠中依然保持白天表达低，夜间表达高的规律(图38)。

为了进一步探究GhRALF1的作用机制，我们设计了针对GhRALF1的特异性多肽序列，对兔子进行免疫反应，最终获得特异性抗体。我们用获得的抗体对合成的GhRALF1成熟肽(ATTRYISYGALQRNTVPCSRRGASYYNCKPGAQANPYNRGCSRITRCRG SEQ ID NO.5)进行蛋白免疫印迹实验，发现根据GhRALF1的成熟肽序列计算其大小约为5.7KD，而检测到的大小约为11KD，约为两倍的关系，推测GhRALF1成熟肽组装成了二聚体发挥作用。对提取的胚珠膜蛋白和全蛋白分别进行蛋白免疫印迹实验，检测到的大小约为26KD，而GhRALF1的完整蛋白序列(MAVLNYKLVVICATLMAAAAAAVMTVDASGDHHLQHPILGRIPTRSPCKGSIAECLAGEEFELDSESSRRILATTRYI SYGALQRNTVPCSRRGASYYNCKPGAQANPYNRGCSRITRCRG SEQ ID NO.6)计算得到大小为13KD(图39)，同样为两倍的关系，根据这个结果，我们推测GhRALF1在行使功能时聚合成二聚体发挥作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，或具有0，或1，或多个氨基酸突变，但棉花节律调控的生物活性不变的序列。

2.表达如权利要求1所述的分泌肽GhRALF1的棉花节律调控相关基因GhRALF1。

3.权利要求1所述的棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1和/或权利要求2所述的基因GhRALF1在调控棉花节律生长中的应用；或

权利要求1所述的棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1和/或权利要求2所述的基因GhRALF1在调控棉纤维生长中的应用；或

权利要求1所述的棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1和/或权利要求2所述的基因GhRALF1在棉花育种中调控棉纤维长度的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，抑制棉花节律调控相关分泌肽GhRALF1的表达，用于促进棉纤维伸长。

5.一种调控棉纤维生长的方法，其特征在于，包括抑制或者促进棉花植株或棉花细胞中的如权利要求2所述的基因GhRALF1的表达；或

降低或提高权利要求1所述分泌肽GhRALF1的表达量。

6.一种调控棉纤维生长的生物制剂，其特征在于，包括有抑制或者促进棉花植株或棉花细胞中的如权利要求2所述的基因GhRALF1的表达，或降低或提高权利要求1所述分泌肽GhRALF1的表达量的物质；优选地，所述物质为促进剂或抑制剂；或优选地，所述物质为抑制权利要求2所述的基因GhRALF1的表达RNAi干扰序列。

7.一种棉花节律调控相关转录因子GhTCP14a，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，或具有0，或1，或多个氨基酸突变，但生物活性不变的序列。

8.表达如权利要求7所述的转录因子GhTCP14 a的棉花节律调控相关基因GhTCP14a，其序列如SEQ ID NO.9所示，或具有0，或1，或多个核苷酸突变，但生物活性不变的序列。

9.权利要求7所述的棉花节律调控相关转录因子GhTCP14a和/或权利要求8所述的基因GhTCP14a在调控棉花节律生长中的应用；或

权利要求7所述的棉花节律调控相关转录因子GhTCP14a和/或权利要求8所述的基因GhTCP14a在调控棉纤维生长中的应用；或

权利要求7所述的棉花节律调控相关转录因子GhTCP14a和/或权利要求8所述的基因GhTCP14a在棉花育种中调控棉纤维长度的应用。

10.一种调控棉纤维生长的方法，其特征在于，包括抑制或者促进棉花植株或棉花细胞中的如权利要求8所述的基因GhTCP14a的表达；或

降低或提高权利要求7所述转录因子GhTCP14a的表达量；

优选地，促进棉花植株或棉花细胞中的如权利要求8所述的基因GhTCP14a的表达，用于促进棉纤维伸长；

或优选地，促进权利要求7所述转录因子GhTCP14a的表达量，用于促进棉纤维伸长。