CN102532293A

CN102532293A - 金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102532293A
Application number: CN2012100437692A
Authority: CN
Inventors: 丁雨龙; 魏强; 曹慧敏; 胡佩
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2012-02-26
Filing date: 2012-02-26
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开一种金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的叶绿素降解代谢相关蛋白，来源于金丝慈竹。蛋白名称为BeCRN1,其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。金丝慈竹叶绿素降解代谢相关蛋白BeCRN1的编码基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，或者为编码SEQIDNO：2氨基酸序列的多核苷酸序列。本发明的基因可用于金丝慈竹叶绿素降解分子机制研究，并用于观赏竹类植物色泽性状改良，包括改善观赏竹类植物绿色性状等。

Description

金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及金丝慈竹的叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

叶绿素是光合作用中捕获光的主要成分，在植物生长发育后期、叶片衰老或果实成熟时，叶绿素被大规模降解。叶绿素降解对叶片衰老过程中蛋白质氮的循环再利用具有重要意义（Hörtensteiner S,Annu Rev Plant Biol, 57: 55-77,2006）；同时叶绿素降解是衰老叶肉细胞的一种解毒方式(Matile et al. Plant Physiology and Biochemistry, 27: 595-604， 1989; Matile et al. Plant Physiology, 112: 1403-1409, 1996)。最新的叶绿素降解途径为：叶绿素首先脱去镁离子，生成脱镁叶绿素（pheophytin），然后脱镁叶绿素在PPH（Pheophytin Pheophorbide Hydrolase）[Silvia Schelbert，et al. The Plant Cell,21: 767–785,2009]，又称CRN1（Co-regulated with NYE1）[Ren G,et al.Journal of Integrative Plant Biology,52(5):496-504,2010]的作用下被脱去植醇形成脱镁叶绿酸(Phaeophorbide a,Pheide)。脱镁叶绿酸是叶绿素降解中最后的绿色色素，它的卟啉大环在脱镁叶绿酸加氧酶(Pheophorbide a oxygenase, PaO) 和红色叶绿素降解物还原酶(red chlorophyll catabolite reductase, RCCR) 的作用下经过两步反应被氧化开环。由于卟啉环裂解与叶片色素(绿色) 丧失有关，因此这一步是叶片衰老时叶色黄化的关键步骤。该氧化过程的中间产物是红色叶绿素代谢产物（RCC），最终产物是原初荧光叶绿素降解产物（primer fluorescent Chl catabolite,pFCC），它是有荧光的四吡咯线性分子。然后pFCC被运出叶绿体，其C（82）位被羟基化并运送入液泡。在液泡里因为pH值偏酸性，修饰过的FCCs的D环和次甲基桥上发生非酶催化的异构，最后生成叶绿素最终代谢产物：非荧光叶绿素代谢产物（non- fluorescent Chl catabolite,NCCs）。叶绿素降解途径中的许多酶都已经被发现。CRN1/PPH基因是最近通过突变体阻断分析的方法，在拟南芥和水稻中被鉴定出来与叶片叶绿素降解代谢途径相关的一个关键基因，该基因突变之后，突变体植株叶片叶绿素降解过程基本被阻断[Ren G,et al.Journal of Integrative Plant Biology,52(5):496-504,2010; Silvia Schelbert，et al. The Plant Cell,21: 767–785,2009; Morita R, et al. Plant Journal 59: 940-952,2009]。

竹类植物是禾本科（Ggramineae）竹亚科（Bambusoideae）植物的总称，是重要的森林资源，主要分布于热带和亚热带地区，在温带和寒温带也有少量分布。中国是亚洲竹子的分布中心，是竹子种类最丰富、分布最广的国家，不论是竹林面积、竹种数量、竹笋和竹材产量均居世界首位，被誉为“竹子王国”。竹类植物因其开花周期长，难以预测且开花后植株通常死亡，所以难以运用传统的杂交方法进行育种。转基因技术在竹类植物育种中则越来越体现出其无可比拟的优越性。但是，目前为止竹类植物可利用的基因资源还非常的少。因此，运用最新的分子生物学手段，挖掘可运用于竹类植物遗传改良的基因资源显得越来越为重要。

本发明通过RACE-PCR的方法从一种重要的观赏竹-金丝慈竹(Bambusa emeiensis ‘Viridiflavus’ )中分离到了一个可用于改良竹类植物绿色性状的基因，BeCRN1，该基因可用于竹类植物叶绿素降解的分子机制研究，并可用于观赏竹类植物色泽性状改良。

发明内容

本发明的目的是提供一种金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白，是具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸残基序列的蛋白质。

金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白的编码基因，是下列核苷酸之一

1）SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

2）编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多核苷酸。

SEQ ID NO.1由1646个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第46位至1518位碱基；SEQ ID NO.2由490个氨基酸残基组成。

本发明还包括含有本发明基因的表达载体和细胞系。

本发明还包括上述基因在金丝慈竹滞绿研究中的应用，以及在竹类植物叶绿素降解途径中的应用。

附图说明

图1BeCRN1基因保守区域1 RT-PCR产物电泳图。

图2BeCRN1基因保守区域2 RT-PCR产物电泳图。

图3BeCRN1基因保守区域3 RT-PCR产物电泳图。

图4BeCRN1基因3’RACE产物电泳图。

图5BeCRN1基因5’RACE产物电泳图。

图6BeCRN1基因全长电泳图。

图7BeCRN1与其他物种来源的CRN1的进化树分析及多重序列比较。

图8BeCRN1互补拟南芥突变体crn1表型分析图。其中，a,黑暗处理4天后的各植株离体叶片表型；b,a中叶片BeCRN1的表达量。Col-0，野生型拟南芥；OX-1，OX-3，OX-6，OX-7，OX-9和OX-16, BeCRN1转基因植株。

具体实施方式

实施例1、金丝慈竹叶绿素降解代谢调控相关蛋白编码基因BeCRN1的获得。

1.1 RNA提取。

取衰老的金丝慈竹叶片材料约0.1g。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管，加1ml TRIzol ( invitrogen公司 )，混匀后，室温放置15分钟，加0.2ml氯仿:异戊醇（24:1），剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm, 4℃离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm，4℃离心15分钟。70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经0.1% DEPC处理过的ddH₂O水中，贮存于-80℃备用。

1.2 cDNA第一链合成和反转录PCR。

采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为：2µg制备的总RNA，0.5µl Rnase inhibitor，加DEPC处理过的去离子水至8.5µl, 2µl的Oligo(dT)18 primer. 65℃,5min,室温放置10min， 13000rpm 简短离心5s。再依次加入4µl 5×First-Strand buffer，0.5µl RNase Inhibitor，2µl 100mM DTT, 2µl dNTP, 1µl MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37℃反转录1小时，90℃5分钟；冰上冷却；13000rpm 短暂离心5秒钟，存放于-20℃待用

1.3 BeCRN1基因三段保守片段的获得。

1.3.1 BeCRN1基因第一段保守片段的获得。

以金丝慈竹cDNA第一链作为RT-PCR的模板，设计了两条引物CRN1F1和CRN1R1作为RT-PCR-1反应的引物。

CRN1F1：5'- TGAACCAGTTTATATTGTGGGGAA- 3' （SEQ ID NO：3）

CRN1R1：5’-CCAAATAGGTCTAACCCAAGGATC-3’ （SEQ ID NO：4）

RT-PCR反应体系如下（50µl体系）：

10×PCR缓冲液	5µl
		dNTPs	1µl
CRN1F1	1µl
		CRN1R1	1µl
cDNA第一链	1µl
		Taq酶	0.5µl
Q H₂O	40.5µl

将上述溶液混匀，在PCR仪上95℃预变性5min后进行40个循环，每个循环为95℃变性40sec, 51.9℃,退火 40sec, 72℃延伸 30sec, 最后在72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收并经测序后获得了481bp的片段。

1.3.2 BeCRN1基因第二段保守片段的获得。

以金丝慈竹cDNA第一链作为RT-PCR的模板，设计了一条引物CRN1F2和CRN1R2（根据所得到的第一段保守序列设计）作为 RT-PCR-2反应的引物。

CRN1F2：5'- GTTCGGAGTCGGGACGTTC- 3' （SEQ ID NO：5）

CRN1R2：5’-CATTTGTTGAGTGGTCGGCATA-3’ （SEQ ID NO：6）

RT-PCR反应体系如下（50µl体系）：

10×PCR缓冲液	5µl
		dNTPs	1µl
CRN1F2	1µl
		CRN1R2	1µl
cDNA第一链	1µl
		Taq酶	0.5µl
Q H₂O	40.5µl

将上述溶液混匀，在PCR仪上95℃预变性5min后进行40个循环，每个循环为95℃变性40sec, 54℃,退火 40sec, 72℃延伸 40sec, 最后在72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收并经测序后获得了551bp的片段。

1.3.3 BeCRN1基因第三段保守片段的获得。

以金丝慈竹cDNA第一链作为RT-PCR的模板，设计了一条引物CRN1F2和CRN1R2（根据所得到的第二段保守序列设计）作为 RT-PCR-3反应的引物。

CRN1F3：5'- ATGGAAGTGGTTTCTTCCAGCCA- 3' （SEQ ID NO：7）

CRN1R3：5’-TCTAACTAACCCGAGGGGGTGAAT-3’ （SEQ ID NO：8）

RT-PCR反应体系如下（50µl体系）：

10×PCR缓冲液	5µl
		dNTPs	1µl
CRN1F3	1µl
		CRN1R3	1µl
cDNA第一链	1µl
		Taq酶	0.5µl
QH₂O	40.5µl

将上述溶液混匀，在PCR仪上95℃预变性5min后进行40个循环，每个循环为95℃变性40sec, 56℃,退火 40sec, 72℃延伸 30sec, 最后在72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收并经测序后获得了448bp的片段。

1.4 用RACE法扩增BeCRN1基因的3’末端序列。

1.4.1 3’RACE ready cDNA的合成。

3’RACE按照 clontech公司的3’RACE试剂盒SMART™ RACE说明书进行。以3’RACE CDS PrimerA为引物，加入金丝慈竹总RNA，在逆转录酶作用下合成金丝慈竹3’RACE ready cDNA。

CDS PrimerA ：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T) ₃₀ VN-3’ （SEQ ID NO：9）

RNA 1.5µl
	DEPC-H₂O 9.5µl
3’RACE CDS PrimerA 1µl
	共12µl
70℃保温5分钟；
	冰上冷却；
温和离心，5秒钟。
	上述混合液 12µl
5×Reaction buffer 4µl
	RNase Inhibitor 1µl
dNTP 2µl
	混匀，温和离心；
37℃保温5分钟；
	上述混合液19µl
MMLV Reverse Transcriptase 1µl
	共20µl

小心混匀；

42℃反转录1小时；

70℃10分钟；

冰上冷却；

存放于-20℃待用。

1.4.2 BeCRN13’端扩增的PCR体系。

以试剂盒中通用引物混合物UPM（UPML和UPMS）和3’端基因特异引物CRN1-GSP1相组合，以3’RACE ready cDNA为模板进行目的基因的3’端扩增。

UPML：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ （SEQ ID NO：10）

UPMS：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ （SEQ ID NO：11）

CRN1-GSP1：5' GGCTGGGACATTTCCTCTTCCGTCA 3' （SEQ ID NO：12）

反应体系为（50µl）：

10×PCR缓冲液	5µl
		dNTPs	1µl
UPM	5µl
		CRN1-GSP1	1µl
3’RACE cDNA	1µl
		Taq酶	0.5µl
Q H₂O	36.5µl

反应程序为：95℃预变性5min后进行40个循环，每个循环为95℃变性40sec, 58.7℃退火 40sec, 72℃延伸 1min30sec , 最后在72℃延伸 10min。将所得的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收并测序获得了818 bp的cDNA片段。

1.5 用RACE法扩增BeCRN1基因的5’末端序列。

5’RACE按照TaKaRA公司的5’RACE试剂盒说明书进行。以金丝慈竹mRNA为模板，5’端磷酸化的基因特异引物CRN1-RT5 进行反转录，经RNase H消化得到单链cDNA，经T4 RNA连接酶自环化，以基因特异引物CRN1-5S1 和CRN1-5A1 进行PCR扩增。反应结束后，以此PCR反应液为模板，再用巢式引物CRN1-5S2和CRN1-5A2扩增基因的5’末端。

CRN1-RT5：5’-(P) GCAGGGTCTTCACAT -3’ （SEQ ID NO：13）

CRN1-5S1：5'- AAGTCTGGCACTGAGAATAGCAAG -3' （SEQ ID NO：14）

CRN1-5A1：5' -GTCCCAACACAAAGAACTGCG -3' （SEQ ID NO：15）

CRN1-5S2：5’-CGCCAGCAGTGCTCTTTCTA-3’ （SEQ ID NO：16）

CRN1-5A2：5’-CAAGAACTAAGAGGCGTTTGATG-3’ （SEQ ID NO：17）

1.5.1第一链cDNA的合成

反转录体系(15µl)：

Total RNA： 2.5µl

10×RT buffer ：1.5µl

RNase Inhibitor ： 0.5µl

AMV Reverse Transcriptase XL：1 µl

5’末端P标记反转录引物NaRT ： 1µl

RNase Free dH₂O ： 8.5µl

按以下条件进行反转录反应：30℃ 10 分钟；50℃ 60分钟；80℃ 2分钟；

冰上冷却。

1.5.2 Hybrid RNA的分解。

第一链cDNA 反应液：15µl

5×Hybrid RNA Degeneration buffer ：15µl

QH₂O ： 45µl

(1)在上述反应液中加入1µl 的 RNase H,30℃反应1小时；

(2)加入100µl dH₂O，500µl的100%乙醇均匀混合后在-20℃放置30分钟，进行乙醇沉淀；

(3)13000rpm以上离心10min，除掉上清液；

(4)加入500µl的70%乙醇，12000rpm以上离心5min，除去上清液后将沉淀干燥处理。

1.5.3 连接反应。

单链cDNA环化或形成首尾连接物：

5×RNA(ssDNA) Ligation buffer ： 8µl

QH₂O ： 11µl

(1)在第二步操作后的乙醇沉淀物（单链cDNA）中加入上述反应液，溶解DNA；

(2)加入20µl的40%PEG#6000，均匀混合；

(3)加入1µl的 T4 RNA Ligase ,16℃过夜反应；

(4)反应结束后，进行PCR反应。

1.5.4 两轮PCR扩增

1^stPCR反应体系为（50µl）：

10×PCR缓冲液5µl

dNTPs	1µl
		CRN1-5S1	1µl
CRN1-5A1	1µl
		过夜连接液	1µl
Taq酶	0.5µl
		Q H₂O	40.5µl

PCR反应条件为：94℃预变性5min后进行35个循环，每个循环为94℃变性40sec, 50℃退火 40sec, 72℃延伸1min30秒,最后再72℃继续延伸 10min.。

2^nd PCR反应体系为（50µl）：

10×PCR缓冲液	5µl
		dNTPs	1µl
CRN1-5S1	1µl
		CRN1-5A1	1µl
1^stPCR反应液	1µl
		Taq酶	0.5µl
Q H₂O	40.5µl

PCR反应程序为：94℃预变性5min后进行35个循环，每个循环为94℃变性40sec, 51℃退火 40sec, 72℃延伸1min30秒, 最后再72℃继续延伸 10min。

PCR产物回收纯化后克隆至TaKaRa 公司的pMD19-T vector, 转化大肠杆菌Top10菌株，经PCR鉴定后送上海华大生物公司测序，获得了长为249bp的cDNA片段。

1.6 BeCRN1cDNA全长克隆。

将RT- PCR获得的三段保守序列，3’ RACE和5’ RACE进行比对拼接得到BeCRN1 cDNA全长序列。然后设计了两条引物CRN1-S 和CRN1-A,以金丝慈竹 cDNA为模板，通过PCR方法克隆其全长序列。

CRN1-S：5’-ATGGAAGTGGTTTCTTCCAGCCA-3’ （SEQ ID NO：18）

CRN1-A：5’-TCTAACTAACCCGAGGGGGTGAAT-3’ （SEQ ID NO：19）

反应体系为（50µl）：

10×Plus buffer	5µl
		2 mM dNTPs	5µl
25 mM MgSO4	2µl
		CRN1- S	1µl
CRN1-A	1µl
		cDNA	1µl
Taq KOD plus	1µl
		Q H₂O	34µl

PCR条件为: 94℃预变性5min后进行40个循环，每个循环为94℃变性40sec, 57.5℃退火 40sec, 72℃延伸 2min, 最后再72℃延伸 10min。将所得的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收。PCR产物回收纯化后克隆至TaKaRa 公司的pMD19-T vector, 转化大肠杆菌Top10菌株，经PCR鉴定后送上海华大生物公司测序，获得了1646bp的cDNA全长序列。

实施例2：BeCRN1的功能分析。

2.1序列比较分析。

为了分析BeCRN1同其他物种CRN1蛋白的亲缘关系，使用MEGA软件建立了BeCRN1同其他物种NYE蛋白的系统进化树。结果表明BeCRN1同大麦的CRN1亲缘关系最近（图1-a）。用Genedoc软件分析了BeCRN1与其他物种的同源性。分析结果表明BeCRN1与其他物种的CRN1蛋白具有很大的同源性(图1-b)。OsCRN1 (水稻CRN1), SbCRN1 (高粱CRN1),VvCRN1 (葡萄CRN1), AtCRN1 (拟南芥CRN1)。

2.2BeCRN1基因功能分析。

2.2.1互补拟南芥crn1-1载体构建。

利用引物CRN1-S 和CRN1-A为引物扩增出拟南芥BeCRN1的编码框，并克隆至pMD19-T vector(Takara)，测序无误之后。使用KpnI（GGTACC）和PstI（CTGCAG）（两个酶切位点来自T载体）双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的pCHF3载体上,命名为PBeCRN1-pCHF3。

2.2.2农杆菌转化。

2.2.2.1 LBA4404农杆菌感受态细胞制备。

1) 在含利福霉素40µg/ml, 链霉素100µg/ml 的YEB固体培养基上划线， 28℃培养48h-72h。

2) 挑单菌落到含利福霉素40µg/ml, 链霉素100µg/ml 的YEB液体培养基中28℃培养至OD₆₀₀0.5。

3) 冰上冷却菌液，5000rpm, 4℃ 10分钟收集菌体。

4) 1mM Hepes pH 7.0洗涤3次，再用10％甘油洗涤一次。

5) 悬浮菌体于3ml 10％甘油中，分装到1.5ml离心管中，每管40µl。

2.2.2农杆菌转化

1）200ng质粒DNA，加40µl农杆菌感受态细胞混匀后按以下条件进行电转化

U 1.8 KV

R 200 Ω

C 25 uF

2）电击后添加800µl SOC液体培养基，28℃ 培养1h；

3) 4000rpm， 10分钟收集菌体，悬浮于200µl SOC中，涂在含100 µg/ml壮观霉素，利福平40µg/ml, 链霉素100µg/ml LB固体培养基上，28℃倒置培养48h-72h。

2.2.3农杆菌介导的拟南芥转化。

2.2.3.1 拟南芥基质培养:

基质组分：蛭石：黑土：珍珠岩 9 : 3 : 0.5

营养液组分：

。

基质浸透营养液后，将种子播于钵子中，用保鲜膜覆盖，置于4℃黑暗条件下，2天后转入（16h L/8h D）光照, 23℃条件下进行培养。拟南芥生长到抽苔开花即可供转化。

2.2.3.2农杆菌准备。

1) 接种携带目的表达载体的农杆菌到含适量抗生素的YEB培养基中，28℃，220rpm摇菌培养至OD₆₀₀1.2。

2) 5000rpm, 4℃ 10分钟离心收集菌体。

3) 菌体重新悬浮于5％的蔗糖溶液中，并调至OD₆₀₀0.8。

4）加入Silwet L-77至终浓度为0.03%。

2.2.3.3拟南芥转化。

取拟南芥材料，倒置浸泡地上部分于预备好的农杆菌溶液中，晃动约3秒，取出，放置到荫蔽条件下，保湿24h，转入正常条件培养。

2.2.3.4拟南芥转化子筛选。

收集转化后拟南芥的种子。种子用0.01% HgCl₂ 表面灭菌8分钟，无菌水冲洗4次，悬浮在0.1 %的琼脂糖中，然后按每平板（直径15cm）2000粒种子（约40mg），铺在卡那霉素50mg/L, 1/2MS培养基上。将平板置于4℃黑暗冰箱中2天，转移到（16h L/8h D）光照, 23℃条件下进行培养。约10天左右可筛选出具卡那霉素抗性的转基因植株。将具抗性的植株转移到基质培养，并收获T₂代种子。

2.2.4 BeCRN1互补拟南芥crn1-1转基因植株表型鉴定。

收获的T₃代纯合转基因植株种子经表面灭菌后铺在含50mg/L卡那霉素的MS培养基上，4℃黑暗冰箱中2天，转移到（16h L/8h D）光照, 23℃条件下培养。25天后取第5和第6片真叶，放在铺有湿润滤纸的培养皿上，并用保鲜膜覆盖培养皿，在黑暗中培养4天。野生型及突变体（crn1-1）的第5和第6片真叶作为对照。结果表明，BeCRN1能够互补crn1-1突变体叶片滞绿的表型，黑暗处理4天后，具不同BeCRN1表达水平的转基因植株离体叶片均有不同程度的黄化，大部分株系叶片黄化程度接近野生型拟南芥（图8），表明BeCRN1是拟南芥CRN1的功能性同源基因。

<110> 南京林业大学

<120> 金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用

<130> 001

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1646

<212> DNA

<213> 金丝慈竹（Bambusa emeiensis 'Viridiflavus'）

<400> 1

ggatcggcac tctgcagaat cggtgcgcta gctaccggag aggtcatgga agtggtttct 60

tccagccact cctgcttggc atttcatcaa acgcctctta gttcttggag gtttcggggc 120

aatggtctcg gtgcggggca taccaaatcc actcggccaa gaaaaagcgc agttctttgt 180

gttgggacag ggagaacttc aaatccaggt gattccggga aggttcatgg gagccatggg 240

ttctatgtaa gtgatgtgga tgcggccctc caaggcattc ccaagaaggc cggcgagatc 300

gagaaggtga tgattccggg cctgccggaa gggcctgata gctctcaaat cagtactggg 360

ttctgggagt ggaagccgaa gttgacggta tattacgaaa agtctggcac tgagaatagc 420

aaggcgccag cagtgctctt tctaccgggt tttggagtgg ggacgttcca ttttgagaag 480

caattgaggg atcttggccg tgattacaag gtgtggacaa tggattttct tgggctggga 540

atgtcattgc catgtgaaga ccctgctcct aagaacatag taggggagca ggatgaggaa 600

gcattttggg gttttggaca agatttgcaa ccatgggcag aggagttggt gtattctgta 660

gatttgtggc gtaaccaagt tcagtatttc attgaagagg ttatccatga accagtttat 720

attgtgggga actctcttgg aggttttgtt gccctatatt ttgctgcatc caatccacac 780

cttgtaaagg gtgtcacatt gcttaatgcg gcaccatttt ggggattcct tcctaaccct 840

gctagatctc ctcggttgtc aaagattttt ccatgggctg ggacatttcc tcttccgtca 900

tttgtgagga aacttactga aacagtgtgg cagaagataa gtgatccaag aagtatacgg 960

gacatactca agcaagtata tgccgaccac tcaacaaatg tggacaaggt gttctctcgt 1020

attatagaga caacacaaca cccagcagct gctgcatcat ttgcctccat tatgtttgct 1080

ccaatgggtc agatatcctt cgaagaggca ctttctaggt gccaaaggca aggtattccc 1140

atatctctta tgtatgggag agaagatcct tgggttaaac ctgtttgggg tattaaagtc 1200

aaacagcagg tgccagaagc accctattat gaaattagcc ctgctggtca ctgtcctcat 1260

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<210> 2

<211> 490

<212> PRT

<213> 金丝慈竹（Bambusa emeiensis 'Viridiflavus'）

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Met Glu Val Val Ser Ser Ser His Ser Cys Leu Ala Phe His Gln Thr

1 5 10 15

Pro Leu Ser Ser Trp Arg Phe Arg Gly Asn Gly Leu Gly Ala Gly His

20 25 30

Thr Lys Ser Thr Arg Pro Arg Lys Ser Ala Val Leu Cys Val Gly Thr

35 40 45

Gly Arg Thr Ser Asn Pro Gly Asp Ser Gly Lys Val His Gly Ser His

50 55 60

Gly Phe Tyr Val Ser Asp Val Asp Ala Ala Leu Gln Gly Ile Pro Lys

65 70 75 80

Lys Ala Gly Glu Ile Glu Lys Val Met Ile Pro Gly Leu Pro Glu Gly

85 90 95

Pro Asp Ser Ser Gln Ile Ser Thr Gly Phe Trp Glu Trp Lys Pro Lys

100 105 110

Leu Thr Val Tyr Tyr Glu Lys Ser Gly Thr Glu Asn Ser Lys Ala Pro

115 120 125

Ala Val Leu Phe Leu Pro Gly Phe Gly Val Gly Thr Phe His Phe Glu

130 135 140

Lys Gln Leu Arg Asp Leu Gly Arg Asp Tyr Lys Val Trp Thr Met Asp

145 150 155 160

Phe Leu Gly Leu Gly Met Ser Leu Pro Cys Glu Asp Pro Ala Pro Lys

165 170 175

Asn Ile Val Gly Glu Gln Asp Glu Glu Ala Phe Trp Gly Phe Gly Gln

180 185 190

Asp Leu Gln Pro Trp Ala Glu Glu Leu Val Tyr Ser Val Asp Leu Trp

195 200 205

Arg Asn Gln Val Gln Tyr Phe Ile Glu Glu Val Ile His Glu Pro Val

210 215 220

Tyr Ile Val Gly Asn Ser Leu Gly Gly Phe Val Ala Leu Tyr Phe Ala

225 230 235 240

Ala Ser Asn Pro His Leu Val Lys Gly Val Thr Leu Leu Asn Ala Ala

245 250 255

Pro Phe Trp Gly Phe Leu Pro Asn Pro Ala Arg Ser Pro Arg Leu Ser

260 265 270

Lys Ile Phe Pro Trp Ala Gly Thr Phe Pro Leu Pro Ser Phe Val Arg

275 280 285

Lys Leu Thr Glu Thr Val Trp Gln Lys Ile Ser Asp Pro Arg Ser Ile

290 295 300

Arg Asp Ile Leu Lys Gln Val Tyr Ala Asp His Ser Thr Asn Val Asp

305 310 315 320

Lys Val Phe Ser Arg Ile Ile Glu Thr Thr Gln His Pro Ala Ala Ala

325 330 335

Ala Ser Phe Ala Ser Ile Met Phe Ala Pro Met Gly Gln Ile Ser Phe

340 345 350

Glu Glu Ala Leu Ser Arg Cys Gln Arg Gln Gly Ile Pro Ile Ser Leu

355 360 365

Met Tyr Gly Arg Glu Asp Pro Trp Val Lys Pro Val Trp Gly Ile Lys

370 375 380

Val Lys Gln Gln Val Pro Glu Ala Pro Tyr Tyr Glu Ile Ser Pro Ala

385 390 395 400

Gly His Cys Pro His Asp Glu Val Pro Glu Val Ile Asn Tyr Leu Leu

405 410 415

Arg Gly Trp Leu Arg Asn Val Glu Ser Glu Gly Ser Ile Asp Ile Pro

420 425 430

Phe Leu Glu Glu Asp Pro Ser Tyr Asp Glu Gln Gly Val Ser Arg Glu

435 440 445

Leu Glu Phe Val Arg Glu Gly Ser Arg Lys Ser Val Arg Val Arg Leu

450 455 460

Ser Gly Ser Lys Ile Ser Leu Trp Gly Gln Leu Ser Ser Ile Leu Lys

465 470 475 480

Ser His Val Ser Gln Leu Thr Asn Asn Ile

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<211> 24

<212> DNA

<213> 金丝慈竹（Bambusa emeiensis 'Viridiflavus'）

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<213> 金丝慈竹（Bambusa emeiensis 'Viridiflavus'）

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<213> 金丝慈竹（Bambusa emeiensis 'Viridiflavus'）

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<212> DNA

<213> 金丝慈竹（Bambusa emeiensis 'Viridiflavus'）

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<213> 金丝慈竹（Bambusa emeiensis 'Viridiflavus'）

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Claims

1.一种金丝慈竹叶绿素降解代谢调控相关蛋白，其特征在于为SEQ ID NO. 2所示氨基酸残基序列的蛋白质，记为BeCRN1。

2.金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白BeCRN1编码基因，其特征在于其DNA序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者为编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：该基因的编码框为自5’端第46位到第1518位碱基的DNA序列。

4.含有如权利要求2或3所述金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白BeCRN1的编码基因的表达载体。

5.含有如权利要求2或3所述金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白BeCRN1的编码基因的细胞系。

6.如权利要求2或3所述金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白的编码基因在竹类植物绿色性状改良中的应用。