CN115992171A - 一种增强植物抗丁香假单胞菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强植物抗丁香假单胞菌的方法，将编码转录因子LaMYC7的基因转化到植物细胞中，再将所述植物细胞培育成植株，并在所述植株中过表达所述基因；其中，所述的转录因子LaMYC7的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。LaMYC7可以与石竹烯合酶LaCPS启动子结合。将LaMYC7转化烟草发现LaMYC7在烟草中过表达显著增加了挥发性物质含量(尤其石竹烯含量)，LaMYC7与LaCPS启动子结合，并且显著增加植株抵抗丁香假单胞菌的能力。在烟草中共表达LaMYC7与LaCPS能进一步增强植物对丁香假单胞菌的抗性。

Description

一种增强植物抗丁香假单胞菌的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及的是一种增强植物抗丁香假单胞菌的方法。

背景技术

植物在其生命周期中受到来自环境的各种压力，如非生物胁迫(盐、干旱等)，生物胁迫(病原菌和害虫等)(Suzuki et al.,2014；Chisholm et al.,2006)。植物为了下一代的生存和延续，进化出了多种防御机制(Atkinson and Urwin,2012)。而在各种生物胁迫中，病原体被认为是主要威胁植物生长、发育和产量的。其中丁香假单胞菌是一类盛行的植物病原细菌，其引发植物病害的发生率居十大细菌性植物病害之首(王丹丹和王清明，2017)。为了应对病原体的危害，植物进化出了很多复杂的免疫途径，如与病原体相关的分子模式触发免疫和效应触发免疫，其中植物合成释放的挥发性有机化合物(VolatileOrganicCompounds，VOCs)既可以起到直接杀菌的作用，又可以充当信号作用(Katagiriand Tsuda,2010；Ninkovic,et al.,2019；Sharifi&Ryu,2020)。

JA信号已经被证明可以调节防御对抗一些从活植物细胞中获取营养的生物营养型和半生物营养型病原体(Nahar et al.,2011；De Vleesschauwer et al.,2013)。除了在调节防御方面的作用外，JA也是植物生长、发育、繁殖所必需的，如不定根的形成、种子萌发、叶片衰老、腺毛和树脂导管的形成等(Wasternack and Hause,2013；Campos et al.,2014；Kazan,2015；Wasternack and Strnad,2016)。而腺毛、树脂导管等可以产生直接或间接参与植物防御的多种化合物，如挥发性萜类物质。

碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子(transcription factors，TFs)在植物生长发育、应激反应和次生代谢物的生物合成中发挥着关键作用(Mertens et al.,2016)。MYC家族成员属于bHLH TFs(Huang et al.,2015)，其中一些MYCs转录因子是JA的重要响应基因，并控制植物中的萜类生物合成，参与植物生命中的一些防御反应(Yang et al.,2012；Zhang et al.,2017；Zhang et al.,2020)。如在拟南芥中发现，当AtMYC2，AtMYC3，AtMYC4突变时，拟南芥对丁香假单胞菌不敏感(Patricia et al.,2011)。

薰衣草(Lavandula angustifolia)为唇形科(Lamiaceae)薰衣草属(Lavender)的多年亚灌木，原产于地中海沿岸阿尔卑斯山南麓，具有极高的观赏价值和经济价值。薰衣草全株含有VOCs，目前，在薰衣草中有超过75种挥发性萜类被鉴定(

et al.,2019；

et al.,2019)，被认为是研究萜类合成调控的模式植物，同时也是作为生物防治重要的储备物种之一。但在薰衣草中仅有LaMYC4(Dong et al.,2022，现被命名为LaMYC17)被报道可被丁香假单胞菌诱导。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种增强植物抗丁香假单胞菌的方法。

本发明提供一种增强植物抗丁香假单胞菌的方法，将编码转录因子LaMYC7的基因转化到植物细胞中，再将所述植物细胞培育成植株，并在所述植株中过表达所述基因；其中，所述的转录因子LaMYC7的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明一个实施方案中，所述方法还可包括将编码薰衣草石竹烯合酶LaCPS的基因转化到所述植物细胞中，并在所述植株中过表达，其中，所述的LaCPS的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

其中，所述的编码转录因子LaMYC7的基因和所述的编码LaCPS的基因可构建在同一个表达载体，也可构建在不同的表达载体中。

其中，所述的编码转录因子LaMYC7的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

其中，所述的编码LaCPS的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供转录因子LaMYC7在激活薰衣草LaCPS基因启动子中的应用，所述的转录因子LaMYC7的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供编码转录因子LaMYC7的基因在激活薰衣草LaCPS基因启动子中的应用，所述的编码转录因子LaMYC7的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

其中，所述LaCPS启动子序列如SEQ ID No.5所示。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明选取狭叶薰衣草‘京薰2’为试验材料，基于转录组数据和生物信息学分析，筛选出参与薰衣草挥发性物质合成调控的MYC转录因子LaMYC7，采用RT-PCR技术，分离了LaMYC7的cDNA全长。通过酵母单杂交技术证明了LaMYC7可以与石竹烯合酶LaCPS启动子结合。将LaMYC7转化烟草发现LaMYC7在烟草中过表达显著增加了挥发性物质含量(尤其石竹烯含量)，并且LaMYC7与LaCPS显著增加植株抵抗丁香假单胞菌的能力。在烟草中共表达LaMYC7与LaCPS能进一步增强植物对于丁香假单胞菌的抗性。

附图说明

图1所示为LaMYC7基础表征。(a)外施MeJA后LaMYC7转录水平改变；(b)在薰衣草不同组织LaMYC7表达水平；(c)LaMYC7在薰衣草开花过程中表达水平；(d)LaMYC7和拟南芥bHLH进化树分析和亚科分类；(e)LaMYC7保守结构域分析。

图2所示为LaMYC7亚细胞定位和自激活检测。(a)用对照(包含GFP)和融合质粒(LaMYC7：：GFP)GV3101注射烟草叶片；(b)阳性对照载体(上)、含有LaMYC7融合载体(中)和阴性对照载体(下)分别转化酵母细胞(AH109)。

图3所示为LaMYC7在烟草中过表达挥发物含量变化。(a)总挥发物含量；(b)石竹烯含量。

图4所示为LaMYC7与LaCPS启动子互作。

图5所示为LaMYC7与LaCPS提高烟草对DC3000的抵抗能力。(a)分别为野生型(WT)、空载(2300)、过表达LaMYC7烟草转基因株系#2、#9喷施细菌浓度OD₆₀₀＝0.5五天后表型；(b)五天后野生型(WT)、空载(2300)、过表达LaMYC7烟草转基因株系#2、#9细菌在平板上生长情况；(c)五天后野生型(WT)、空载(2300)、过表达LaMYC7烟草转基因株系#2、#9细菌个数；(d)不同细菌浓度注射烟草叶片后表型：WT:野生型；2300：空载株系；OV-LaMYC7：过表达LaMYC7株系；LaMYC7：瞬时注射含有过表达载体LaMYC7的农杆菌；LaMYC7+LaCPS同时注射含有过表达载体LaMYC7和LaCPS的农杆菌；(e)不同细菌浓度注射烟草叶片示意图；(f)WT、2300、OV-LaMYC7、瞬时注射LaMYC7和LaCPS烟草感染不同浓度细菌后疾病指数，以百分比表示(％)。

具体实施方式

为详细说明本发明技术内容，下面提供具体实施例。需要说明的是，以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，但本发明所述的方法和保护的范围并不限于此。

以下实施例所用的试剂和方法如无特别说明，均按常规方法配制和操作；所用的试剂，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.材料与方法

1.1试验材料

本研究以狭叶薰衣草‘京薰2’为试材，采自中国科学院植物研究所芳香植物种植基地。

1.2载体、试剂盒和菌株

载体：表达载体pCAMBIA2300，酵母双杂载体体pGADT-7、pGBKT-7，pGADT-T和pGBKT-53，酵母单杂载体placZi和pB42AD均来自中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室保存。

试剂盒：RNA和DNA提取试剂盒购自广州美杰；反转录试剂盒、胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自南京诺唯赞。

菌株：大肠杆菌DH5α购于南京诺唯赞，农杆菌菌株GV3101，酵母菌菌株AH109和EGY48购于昂羽生物。

1.3薰衣草MYC基因家族成员筛选和分析

1.3.1薰衣草MYC基因家族成员筛选

利用HMM建模(Pfam accessions:PF14215 and PF00010)，阈值Evalue<1.0E-05，在全基因组水平上共鉴定出26个MYCs，按照染色体位置从1-26命名。

1.3.2系统发育分析

自TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)下载拟南芥MYC基因家族序列和Ensembl Plants(https://plants.ensembl.org/index.html)获得水稻MYC基因家族序列，利用MEGA7.0构建进化树。

1.4植物总RNA提取

按照美基生物R4151-02植物RNA小提试剂盒说明书，进行RNA提取，RNA质量和浓度通过琼脂糖凝胶和超微量分光光度计检测。

1.5基因克隆及序列分析

以‘京薰2’盛花期小花提取总RNA反转录合成的cDNA为模板，根据基因组序列设计引物。按照2x Phanta Flash Master Mix说明书进行RT-PCR扩增，产物由1％琼脂糖电泳检测和胶回收，回收片段根据诺唯赞ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit说明书与表达载体pCAMBIA230链接，然后转化大肠杆菌感受态细胞，进行测序分析，序列如SEQ ID No.1所示。

利用ExPasy服务器中的Prot-Param工具在线预测目的基因编码蛋白的基本理化性质；运用MEGA7.0软件进行系统进化树的构建。

重组引物：

MYC7-2300-F：TCGATACACCAAATCGACTCTAGAAAATGACTGATCACCGGC

MYC7-2300-R：CCCCGGGCCCCTGCAGAAGCCCGAGATTCACCAACTT

1.6LaMYC7蛋白定位和自激活检测

1.6.1亚细胞定位

选取3-4周龄的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，选取菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8注射烟草叶片，转化3d后，取出叶子并在共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5)上进行分析。

1.6.2自激活检测

以序列SEQ ID No.1所示的LaMYC7基因为模板，采用引物MYC7-BK-F和MYC7-BK-R进行PCR扩增，得到PCR产物，采用同源重组的方法，将LaMYC7全长cDNA与表达载体pGBKT7连接产生融合蛋白(pGBKT7-LaMYC7)。通过热激法将空载体(pGBKT7)和重组载体(pGBKT7-LaMYC7)转化到酵母AH109中。引物序列如下：

MYC7-BK-F:

GCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGACTGATCACCGGC

MYC7-BK-R:

CGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTACCGAGATTCACCAAC

1.7转基因植物获得

1.7.1转化

将重组载体pCAMBIA2300-LaMYC7通过热激法转入GV3101，经PCR鉴定获得阳性克隆后，利用叶盘法侵染烟草(N.tabacum)，具体步骤如下：

将含有重组载体的GV3101农杆菌摇菌到OD600＝1左右，富集菌液，弃上清。

将富集的菌液用含有200mM AS的1/2MS悬浮，28℃，避光2-3h。

将无菌烟草叶片切成1x1 cm，放于侵染液中15-20min，每5min摇晃一次。

共培养：于超净台中，用无菌滤纸吸干多余菌液，放于含有1mg/L6BA、0.1mg/L NAA的MS培养基中，8℃，黑暗培养3d。

筛选培养：暗培养3d后，用无菌水冲洗2次，1％头孢冲洗3次，每次6min，然后在水洗3次，无菌滤纸吸干多余水份，放于MS(6BA，1mg/L；NAA 0.1mg/L；Tim，100mg/L；K+，100mg/L)，光照，25+1℃，2周更换一次培养基。

生根：4-5周长出芽后，切下，于1/2MS(100mg/L；K⁺，100mg/L)培养生根。

鉴定：2周后，出瓶，提取DNA鉴定阳性苗，成熟后收种子，在添加100mg/L K⁺的1/2MS培养基平板上进行阳性苗筛选，生长正常的苗种于土中，长到4-5片叶子时，提取DNA进行PCR和荧光显微镜下观察荧光来检测阳性苗，选取其中5株阳性苗，进行qPCR验证，选取其中表达量较高的两个株系作为后续检测植株。

1.8过表达LaMYC7增加烟草中挥发物含量

1.8.1挥发物检测

将2g盛开的烟草花于液氮中研磨，放于20mL顶空上样小品中，在60℃下保持40min后，DVB/CAR/PDMS取样针插入孵育20min，然后在250℃下解析3min。每个样品中加入0.25μg的3-辛醇作为内标。

1.8.2产物鉴定

根据NIST-14.0和文献数据获得的保留时间和电子电离质谱碎片以及标准品进行比对来鉴定物质。

1.8.3挥发物含量计算

将鉴定出来的物质根据峰面积和内标3-辛醇含量进行计算2g花样品中的物质含量。

1.9酵母单杂交

1.9.1载体构建

将LaMYC7与pB42AD载体连接，将石竹烯合酶LaCPS启动子序列连接到placZi载体上，将其转化大肠杆菌感受态，测序获得阳性重组质粒pB42AD-LaMYC7、placZi-LaCPS。

引物：

LaCPS-Zi-F(KpnI)：

TGGATCGGAATTCGAGCTCGGTACCGTAGCATTAACATTAAATGGGC

LaCPS-Zi-R(SalI)：

ACAGAGCACATGCCTCGAGGTCGACTGCATGAAAAAGTTGTTTAATG

LaMYC7-42AD-F(EcoRⅠ)：

GATTATGCCTCTCCCGAATTCATGACTGATCACCGGC

LaMYC7-42AD-R(XhoⅠ)：

AGAAGTCCAAAGCTTCTCGAGCCGAGATTCACCAACTT

1.9.2酵母菌株EGY48转化

将重组质粒pB42AD-LaMYC7和placZi-LaCPS，pB42AD-LaMYC7和placZi，pB42AD和placZi，pB42AD和placZi-LaCPS根据说明书分别共转于EGY48感受态细胞，经PCR检测后获得阳性克隆，于含有X-α-gal二缺(SD/-Trp-Ura)显色平板上显色。

1.10抵抗假单胞杆菌DC3000能力检测

将DC3000菌液于28℃，180rpm过夜培养，菌液OD600约为1左右，富集菌液，用含有10mM MgCl2和0.04％Silwet L-77溶液悬浮菌体，将菌液浓度调为OD600＝0.5，分别喷施野生型(WT)、空载(2300)和过表达LaMYC7植株叶片，5天后分别从植株叶片上用打孔器取下6片，用含有Rif的LB液体培养基漂洗，取500微升涂布于含有Rif的LB固体平板，于28度培养2天计数。用DC3000菌液浓度分别OD₆₀₀＝0.5、0.2、0.1、0.02注射野生型、空载和过表达LaMYC7烟草叶片，并将含有融合载体pCAMBIA2300-LaMYC7和pCAMBIA2300-LaMYC7：pCAMBIA2300-LaCPS＝1：1的GV3101菌液浓度调整为OD₆₀₀＝0.5分别注射野生型烟草叶片24h后，在用DC3000菌液浓度分别OD₆₀₀＝0.5、0.2、0.1、0.02菌液注射。

2.结果

2.1薰衣草MYC转录因子的筛选和分析

通过HMM建模，在全基因组水平上共鉴定出26个MYC基因家族成员。根据拟南芥家族bHLH家族分类，如图1所示，薰衣草中26个MYC基因家族成员分在3个亚组，其中20个被分在第二亚组，且LaMYC7和LaMYC17也被分在第二亚组，据文献报道，第二亚组的大多数蛋白能够响应不同的生物或非生物胁迫。

2.2 LaMYC7亚细胞定位和自激活检测

通过烟草亚细胞定位实验，结果如图2a显示，LaMYC7定位在细胞核中。酵母自激活结果显示(图2b)，阳性对照和实验组pGBKT7-LaMYC7在含有X-α-gal的SD/-Trp缺陷型培养基上显现出蓝色，证明LaMYC7具有自激活的能力。

2.3烟草中过表达LaMYC7增加挥发性萜类物质

在CaMV 35S启动子下，LaMYC7被在烟草中过表达，T2代花挥发性物质被用SPME-GC-MS检测，结果如图3所示，过表达LaMYC7烟草植株挥发物总含量显著增加，尤其倍半萜石竹烯。

2.4 LaMYC7与LaCPS启动子结合分析

酵母单杂交结果显示(图4)，所有组合在SD/-Trp-Ura二缺培养基上均能正常生长，而只有共转pB42AD-LaMYC7和placZi-LaCPS的酵母菌在加有X-α-Gal的SD/-Trp-Ura二缺培养基上显现出蓝色，表明LaMYC7可以与LaCPS启动子结合，从而启动石竹烯合酶LaCPS表达。

2.5 LaMYC7抵抗DC3000的能力

在烟草植株上喷施丁香假单胞菌DC3000，发现过表达LaMYC7烟草植株叶子无明显变化，野生型和转空载的植株叶片出现黄色斑点(图5a)，并且5天后转基因烟草株系叶片上的菌液数量显著小于野生型和空载(图5b，c)；以菌液OD₆₀₀＝0.5，0.2，0.1浓度注射烟草叶片，发现转基因烟草和空载及野生型均出现了坏死现象(图5d，f)，且在菌液OD₆₀₀＝0.02时，转基因烟草叶片坏死最轻；但将含有LaMYC7和LaMYC7：LaCPS＝1：1的农杆菌GV3101先注射烟草叶片，24h后，再注射OD₆₀₀＝0.5，0.2，0.1，0.02的DC3000菌液，单独注射含有LaMYC7农杆菌的叶片会在DC3000菌液OD₆₀₀＝0.5的浓度下出现较为严重的坏死现象，而注射含有LaMYC7和LaCPS的农杆菌烟草叶片只会在注射孔处出现坏死现象(图5d，f)。表明，在植物中共同表达LaMYC7和LaCPS能进一步增强植物对于丁香假单胞菌的抗性

综合以上结果证实，LaMYC7可以与LaCPS启动子结合，能够提高植株对丁香假单胞菌DC3000的抵抗作用。与LaCPS共同表达能进一步增强植物对于丁香假单胞菌的抗性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种增强植物抗丁香假单胞菌的方法，其特征在于，将编码转录因子LaMYC7的基因转化到植物细胞中，再将所述植物细胞培育成植株，并在所述植株中过表达所述基因；其中，所述的转录因子LaMYC7的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：将编码薰衣草石竹烯合酶LaCPS的基因转化到所述植物细胞中，并在所述植株中过表达，其中，所述的LaCPS的氨基酸序列如SEQID No.4所示。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的编码转录因子LaMYC7的基因和所述的编码LaCPS的基因构建在同一个表达载体或构建在不同的表达载体中。

4.如权利要求1-2所述的方法，其特征在于，所述的编码转录因子LaMYC7的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的编码LaCPS的基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

6.转录因子LaMYC7在激活薰衣草LaCPS基因启动子中的应用，所述的转录因子LaMYC7的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

7.编码转录因子LaMYC7的基因在激活薰衣草LaCPS基因启动子中的应用，所述的编码转录因子LaMYC7的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述LaCPS启动子序列如SEQ ID No.5所示。

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