CN107488643B - 一种兰花叶绿素降解代谢调控蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兰花叶绿素降解代谢调控蛋白及其编码基因和应用。本发明兰花叶绿素降解代谢调控蛋白的氨基酸序列由307个氨基酸残基组成，如SEQ ID NO:2所示；编码兰花叶绿素降解代谢调控蛋白的兰花叶绿素降解代谢调控基因的核苷酸序列由924个碱基组成，如SEQ ID NO:1所示。本发明兰花叶绿素降解代谢调控蛋白具有叶绿素降解酶活性，提高其表达量后可降低拟南芥叶片中的叶绿素含量；在墨兰中高表达兰花叶绿素降解代谢调控蛋白后，墨兰叶片和花枝的叶绿素也显著降低。本发明兰花叶绿素降解代谢调控基因及其编码的兰花叶绿素降解代谢调控蛋白可用于叶绿素降解分子机制的研究，以及植物叶色或花色的性状改良。

Description

一种兰花叶绿素降解代谢调控蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种兰花叶绿素降解代谢调控蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

植物叶片颜色取决于其内叶绿素的含量，因此叶绿素合成代谢调控不仅影响植物吸收光能进行光合作用的效率，更直接决定叶色变异的性状，是观赏植物的一个重要价值体现。叶片失绿造成色彩斑斓的彩叶植物长期以来深受育种学家关注。

研究发现，叶片失绿过程中，叶绿素被降解成无色代谢产物需要4种关键酶。首先，叶绿素被叶绿素酶(Chlorophyllase,CLH)催化脱去植醇基形成植基叶绿素(Chlide)，然后，由一个金属螯合物(Metal chelating substance,MCS)通过非酶学过程去除镁离子形成脱镁叶绿酸a(pheophorbide a,Pheide a)。随后Pheide a经过由脱镁叶绿酸a加氧酶(Pheide a oxygenase,PAO)和红色叶绿素代谢产物还原酶(Redchlorophyllcatabolitereductase,RCCR)催化的两步反应转化成初级荧光叶绿素代谢产物(pFCC),中间过程形成一种不稳定的中间产物红色叶绿素代谢产物(Red Chlorophyll catabolite,RCC)。最后，pFCC经过几次修饰之后运输至液泡中，并在液泡中发生非酶学异构，形成最终的非荧光叶绿素代谢产物(Nonfluorescent Chlorophyll catabolites,NCCs)。

兰花是我国的传统名贵花卉，其婀娜多姿的叶片有很高的观赏价值。特别是在叶尖、叶缘和叶中部等处出现白色或黄色斑块的彩斑，在兰界称其为叶艺兰，其商品价值根据叶艺类型不同成倍甚至十倍、百倍地增加。因此，对于叶艺性状的定向改良显得尤为重要，而传统杂交育种普遍具有周期长，且性状难以预期。

发明内容

本发明的目的在于：克服传统杂交育种存在的周期长、性状难以预期等问题，本发明通过运用最新的分子生物学手段，挖掘可运用于植物叶色改良的基因资源，实现植物叶色或花色的性状改良。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种兰花叶绿素降解代谢调控蛋白，其氨基酸序列由307个氨基酸残基组成，如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二个目的是提供编码上述兰花叶绿素降解代谢调控蛋白的兰花叶绿素降解代谢调控基因，它是从中国兰花的墨兰品种“达摩”(Cymbidium sinense‘Dharma’)的叶片cDNA中分离得到，其核苷酸序列由924个碱基组成，如SEQ ID NO:1所示。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了包含所述兰花叶绿素降解代谢调控基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌和转基因材料。

本发明通过基因工程技术发现，所述兰花叶绿素降解代谢调控基因在拟南芥和兰花中过量表达，能降低植物叶绿素含量，出现黄化叶片和白色花枝表型，因此，可将该基因及其编码的蛋白用于叶绿素降解途径的研究，以及植物叶色或花色的改良。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明从中国兰花的墨兰品种“达摩”(Cymbidium sinense‘Dharma’)的叶片cDNA中分离得到兰花叶绿素降解代谢调控基因，其编码的兰花叶绿素降解代谢调控蛋白具有叶绿素降解酶活性，提高其表达量后可降低拟南芥叶片中的叶绿素含量；在墨兰中高表达兰花叶绿素降解代谢调控蛋白后，墨兰叶片和花枝的叶绿素也显著降低。本发明兰花叶绿素降解代谢调控基因及其编码的兰花叶绿素降解代谢调控蛋白可用于叶绿素降解分子机制的研究，以及植物叶色或花色的性状改良。

附图说明

图1为本发明实施例1中，CsCLH2与其他物种来源的CLH2进化树分析及多重序列比较。

图2为本发明实施例2中，CsCLH2蛋白原核表达电泳图，其中，1为Marker，2为pGEX6p-1-CsCLH2-1沉淀，3为pGEX6p-1-CsCLH2-1上清，4为marker，5为pGEX6p-1-CsCLH2-2沉淀，6为pGEX6p-1-CsCLH2-2上清。

图3为本发明实施例3中，CsCLH2在墨兰中的表达模式分析图。

图4为本发明实施例4中，转基因拟南芥植株CsCLH2表达量分析，其中line1-16分别表示转基因拟南芥植株。

图5为本发明实施例4中，转基因拟南芥表型分析；经过4天黑暗处理后，高表达株系叶片中叶绿素含显著降解，其中WT表示野生型，Line2、Line5表示转基因拟南芥植株。

图6为本发明实施例5中，墨兰体内CsCLH2基因瞬时高表达及表型分析，CK1表示野生型，CK2表示含有空载体的农杆菌液注射植株，CsCLH2-OE1、CsCLH2-OE2表示含有pCAM1301-CsCLH2质粒的农杆菌液注射植株。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1 CsCLH2基因的克隆以及序列分析

1.RNA的提取

取墨兰栽培品种达摩幼嫩叶片组织2g，利用植物Trizol(Invitrogen)试剂抽提其总RNA，并反转录成cDNA(Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesisKit)。

2.目的基因CsCLH2的获得

以CsCLH2-F1(SEQ ID NO:3)和CsCLH2-R1(SEQ ID NO:4)为引物，以上步所得cDNA为模板，利用Ex-Taq酶(TaKaRa Biotechnology Co.)进行PCR，按照下列条件：94℃4min，然后34cycles(94℃40s,59.5℃40s,72℃1.5min，72℃10min)。从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，然后连接pMD19-T载体(TaKaRa Biotechnology Co.)并送华大基因研究院进行测序。测序结果分析发现扩增片段含有目的基因CsCLH2的完整CDs序列，由924个碱基组成，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，命名为兰花叶绿素降解代谢调控基因(CsCLH2基因)，其编码的蛋白的氨基酸序列由307个氨基酸残基组成，如SEQ ID NO:2所示，命名为兰花叶绿素降解代谢调控蛋白(CsCLH2蛋白)。获得的含有CsCLH2-pMD19-T的大肠杆菌目前保存于广东省农业科学院环境园艺研究所。

3.CsCLH2基因序列分析

CsCLH2的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)与其他物种包括单子叶植物：Dendrobiumcatenatum XP_020704137、Phalaenopsis equestris XP_020591734、Ananas comosus XP_020103801、Phoenix dactylifera XP_008775648、Elaeis guineensis XP_010932817、Asparagus officinalis XP_020258948和双子叶植物Jatropha curcas XP_012069695、Gossypium raimondii XP_012457535、Cajanus cajan XP_020210370、Arabidopsisthaliana NP_199199、Brassica napus CDX96924中的CLH2进行比对。分析结果表明CsCLH2蛋白与其他物种CLH2氨基酸序列有较高相似性，且与铁皮石斛中亲缘关系最近，有89％相似性(图1)。

实施例2 CsCLH2蛋白原核表达

1.蛋白原核表达载体构建

以CsCLH2-F2(SEQ ID NO:5)和CsCLH2-R2(SEQ ID NO:6)为引物，以墨兰叶片cDNA为模板，利用Ex-Taq酶(TaKaRa Biotechnology Co.)进行PCR，按照以下条件：94℃4min，然后34cycles(94℃40s,59.5℃40s,72℃1.5min，72℃10min)。从琼脂糖凝胶中回收PCR产物(CsCLH2基因),然后连接pGEX6P-1载体(TaKaRa Biotechnology Co.)并进行测序验证其准确性，确认CsCLH2基因插入了pGEX6P-1载体中，由此得到pGEX6P-1-CsCLH2表达载体。含有pGEX6P-1-CsCLH2的大肠杆菌目前保存于广东省农业科学院环境园艺研究所。

2.蛋白诱导表达及酶活分析

1)分别接种含pGEX6P-1-CsCLH2和pGEX6P-1空载体的单菌落到20ml左右含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，于37℃，225rpm，培养过夜。

2)取500μl过夜培养物按1：100比例接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，分别于18℃，28℃和37℃，225rpm，震荡培养至OD₆₀₀ 0.3～0.5。

3)加入IPTG，分别至终浓度0.1、0.5mmol/L，于2、4、6、8h离心收集2ml菌体，5000rpm离心，弃上清。

4)10％SDS–PAGE检测其诱导表达见图2。

5)收集步骤3所得诱导表达菌液20ml，加入4ml 0.01M PBS磷酸盐缓冲液(NaCl8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g加蒸馏水至1000ml，调节pH到7.4)充分混匀，超声波破碎细菌，4℃3000g离心30min，去除不溶性细胞碎片，上清(细胞裂解物)转入到一个新管中待用。

6)采用双抗体夹心法测定样品中叶绿素酶水平。原理是采用纯化的植物叶绿素酶抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入叶绿素酶，再与HRP标记的叶绿素酶抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物叶绿素酶呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品中叶绿素酶活性浓度。结果发现，随着表达蛋白样品(上清)稀释倍数增加，酶活浓度降低，证实上步中CsCLH2蛋白被正确表达且具有酶活力。

实施例3 CsCLH2在兰花中的表达模式

1.RNA的提取

取墨兰栽培品种达摩幼嫩叶片、老叶、根、假鳞茎、花不同组织各2g，利用植物Trizol(Invitrogen)试剂抽提其总RNA，取其中2μl采用反转录试剂盒Thermo ScientificRevertAid First Strand cDNASynthesis Kit反转录成cDNA。

2.定量PCR

利用引物CsCLH2QRT-F(SEQ ID NO:7)和CsCLH2QRT-R(SEQ ID NO:8)，对兰花不同组织中CsCLH2基因表达量进行实时定量PCR检测。采用Actin QRT-F(SEQ ID NO:9)和ActinQRT-R(SEQ ID NO:10)作为引物，扩增Actin作为内参。按照下列程序：95℃预变性30S，然后经40个循环(95℃10s、59.5℃10s、72℃30s)，72℃延伸10min。采用iCycler IQ Real-timePCR Detection System(Bio-Rad,USA)进行扩增，操作按照HiscriptⅡQRT SuperMix forqPCR(+gDNA wiper)(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒说明书进行。

3.表达分析

用icycler realtime detection system software(version 5.0)对PCR结果进行分析。发现CsCLH2基因在根中表达量最低，在嫩叶和假鳞茎中的表达量相对较高，而在成熟叶中的表达量最高，与植物体内叶绿素代谢和分布模式一致(图3)。

实施例4 拟南芥中CsCLH2基因的功能分析

1.转化拟南芥高表达载体构建

利用引物CsCLH2-F3(SEQ ID NO:11)和CsCLH2-R3(SEQ ID NO:12)扩增出墨兰CsCLH2基因的CDs序列(即CsCLH2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，并克隆至pMD19-Tvector(Takara)，送华大基因测序。测序无误之后，使用EcoRI和SacI双酶切(ThermoFisher Scientific)，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的pBI121载体上命名为pBI-CLH2。

2.转化拟南芥植物

2.1农杆菌GV3101的转化

1)将-80℃保存的感受态细胞于冰上化冻，待细胞完全溶解后，加入约1μg质粒(pBI-CLH2)，轻柔混匀，冰上放置30min。

2)液氮速冻1min后37℃，5min化冻，重复一次。加入1ml LB于28℃恒温振荡培养4～6hr，200rpm。

3)菌液摇浓后，4000rpm室温下离心5min。弃上清，用100μl的LB培养液重悬农杆菌沉淀。

4)把所有混合物涂板到含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素的LB板上，置于28℃恒温培养箱中培养48～72hr，待长出群落后再挑菌重新划线以确保是单克隆，由此得到转化有pBI-CLH2的农杆菌。

2.2花序侵染法转化拟南芥

用OD＝0.3～0.5的转化有pBI-CLH2的农杆菌液侵泡拟南芥花序2～3sec后取出，避光密封16小时后，移至生长室中继续生长。大约3～4周后，收集种子贮藏于4℃(黑暗条件)。

2.3拟南芥转化子筛选

1)配制0.1％的氯化汞溶液。

2)将收集的种子放到1.5mL的Eppendorf管中，加1mL的75％的酒精摇匀，在BloodTube Rotator上旋转5min。0.1％的氯化汞消毒5分钟。

3)离心，6000rpm，2min。弃上清液，加入1mL的灭菌水，混匀，在Blood TubeRotator上旋转2min。重复3次。

4)去上清液，用1mL的无菌水悬浮种子，平铺于含50μg/ml卡那霉素的1/2MS培养基表面。封板，于4℃黑暗春化3天后移入组织培养室(16h L/8h D)光照，23℃条件。

5)待苗长出绿色子叶后观察统计绿色子叶幼苗数目。并去除粘附在根上的培养基，移至基质中培养。

6)经60天左右的生活周期，得到转基因拟南芥第一代种子。收获T二代纯合种子(转基因植株)用于后续试验。

3.转基因拟南芥CsCLH2表达量分析

为了确定CsCLH2基因在拟南芥中的生物学功能，以拟南芥野生型和上步所得转化子(T二代纯合种子生长后的转基因植株)cDNA为模板，采用引物CsCLH2QRT-F/R检测转基因拟南芥中CsCHL2基因的表达量。按照下列程序：95℃预变性30S，然后经40个循环(95℃10s、59.5℃10s、72℃30s)，72℃延伸10min。采用iCycler IQ Real-time PCR DetectionSystem(Bio-Rad,USA)进行扩增，操作按照HiscriptⅡQRT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒说明书进行。结果发现在获得的转基因植株中CsCLH2的表达量均提高，选取其中三个株系用于后续表型分析(图4)。

4.转基因拟南芥表型分析

收获的T3代纯合转基因植株种子经表面灭菌后铺在含50μg/ml卡那霉素的MS培养基上，4℃黑暗培养2天，转移到(16h L/8h D)光照，23℃条件下培养。25天后将生长状态一致地野生型和高表达植株(转基因植株)在黑暗条件下培养4天。结果表明，各转基因植株离体叶片均有不同程度的黄化，叶绿素加速降解(图5)，而作为对照的野生型则没有转基因植株严重。

实施例5 兰花中CsCLH2基因的功能分析

1.高表达载体构建

利用引物CsCLH2-F3(SEQ ID NO:11)和CsCLH2-R3(SEQ ID NO:12)扩增出墨兰CsCLH2的CDs序列，并克隆至pMD19-Tvector(Takara)，测序无误之后。使用EcoRI和SacI双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的pCAM1301载体上，得到pCAM1301-CsCLH2。

2.转化兰花叶片

2.1农杆菌GV3101的转化

1)将-80℃保存的感受态细胞于冰上化冻，待细胞完全溶解后，加入约1μg质粒(pCAM1301-CsCLH2)，轻柔混匀，冰上放置30min。

2)液氮速冻1min后37℃，5min化冻，重复一次。加入1ml LB于28℃恒温振荡培养4～6hr，200rpm。

3)菌液摇浓后，4000rpm室温下离心5min。弃上清，用100μl的LB培养液重悬农杆菌沉淀。

4)把所有混合物涂板到含50μg/mL卡那霉素和32μg/mL庆大霉素的LB板上，置于28℃恒温培养箱中培养48～72hr，待长出群落后再挑菌重新划线以确保是单克隆，得到含有pCAM1301-CsCLH2质粒的农杆菌。

2.2农杆菌直接注射法转化兰花叶芽

用OD＝0.3～0.5，含有pCAM1301-CsCLH2质粒的农杆菌液直接注射兰花品种‘银针’幼嫩叶芽和花芽，以pCAM1301空载体作为对照。每周注射一次，连续三周，置于培养室中继续生长。大约8～12周后，收集接种后叶片进行基因表达量检测。

2.3.接种农杆菌后兰花CsCLH2基因表达量分析

为了确定CsCHL2基因在兰花中的生物学功能，以兰花品种‘银针’未接种的野生型、空载体和接种后叶片的cDNA为模板，采用引物CsCLH2QRT-F(SEQ ID NO:7)和CsCLH2QRT-R(SEQ ID NO:8)，检测注射农杆菌后兰花中CsCHL2基因的表达量。按照下列程序：95℃预变性30S，然后经40个循环(95℃10s、57℃10s、72℃26s)。同样的cDNA也作为模板，使用墨兰Actin QRT-F(SEQ ID NO:9)和Actin QRT-R(SEQ ID NO:10)，扩增Actin作为内参。按照下列程序：95℃预变性30S，然后经40个循环(95℃10s、59.5℃10s、72℃30s)，72℃延伸10min。采用iCycler IQ Real-time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)进行扩增，操作按照HiscriptⅡQRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒说明书进行。结果表明在含有pCAM1301-CsCLH2质粒的农杆菌液注射植株中CsCLH2基因的表达量均提高，选取其中三个株系用于后续表型分析(图6)。

2.4高表达CsCLH2兰花表型分析

接种含有pCAM1301-CsCLH2质粒的农杆菌液注射植株的叶芽生长16周后，跟未接种的野生型或空载体相比，含有pCAM1301-CsCLH2质粒的农杆菌液注射植株新生叶边有明显白色条纹，叶绿素含量降低。生长20周后，处理组(含有pCAM1301-CsCLH2质粒的农杆菌液注射植株)和对照组(未接种的野生型或空载体)均开始出现新生花芽，处理组中20％新生花芽颜色变浅，花枝呈白色，叶绿素含量降低(图6)。

根据上述说明书的揭示，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

序列表

<110> 广东省农业科学院环境园艺研究所

<120> 一种兰花叶绿素降解代谢调控蛋白及其编码基因和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 924

<212> DNA

<213> 墨兰达摩(Cymbidium sinense ‘Dharma’)

<400> 1

atgtcttctc cttgtcatgt cttcaagact ggcaggcacg cagtgaagct ccttaatgtt 60

caccaggaag acagccagag ctccgccgct ccacctccac cgaagccctt gcttgtctca 120

actccttgcg aggaagggga atttcctgtt ttgatctttg tccatggata ccttctctat 180

aattccttct attctcagct ccttcagcac atctcctctc atggctttat agtggtcgct 240

cctcagctct acaccattgc aggacctgat tcttttgaag agatttctgt tgtagcaaaa 300

ataacagatt ggctaactaa tggtttggtt cacatccttc ccaatcaagt tcaaccaaat 360

ctctacaagc tagccattgc tggtcacagc cgcggaggca aagttgcatt tgctctaggc 420

ctaggctatg ctaagacctc actcaccttc tcagctctaa tggtggttga tccggtcgat 480

gggatggaca aaggaaagca gaccaatcca cccatcctca cttatattcc tcactctttt 540

gagctaaaaa tggcagcttt ggtgatcggt tcgggcctcg gagggttgaa gaagaatctc 600

ttctttcctc cttgtgctcc caagggagtg agccaccatg atttcttcga agaatgcaaa 660

tctcctgcct gccatcttgt ggccaaggat tatggccact tggacatatt ggatgatgag 720

acgaagggga ttagaggaaa agctacttat tgcttgtgtg tgaatggaag ggctagggag 780

cctatgagga cttttgctgg tggagccatg gtggcattta tgagagccta tttggatggt 840

gatatggagg atttgtggac tctaagggac aatccagagc tcgcaatacc tattatgtta 900

tcaatagctt gttttcagga atga 924

<210> 2

<211> 307

<212> PRT

<213> 墨兰达摩(Cymbidium sinense ‘Dharma’)

<400> 2

Met Ser Ser Pro Cys His Val Phe Lys Thr Gly Arg His Ala Val Lys

1 5 10 15

Leu Leu Asn Val His Gln Glu Asp Ser Gln Ser Ser Ala Ala Pro Pro

20 25 30

Pro Pro Lys Pro Leu Leu Val Ser Thr Pro Cys Glu Glu Gly Glu Phe

35 40 45

Pro Val Leu Ile Phe Val His Gly Tyr Leu Leu Tyr Asn Ser Phe Tyr

50 55 60

Ser Gln Leu Leu Gln His Ile Ser Ser His Gly Phe Ile Val Val Ala

65 70 75 80

Pro Gln Leu Tyr Thr Ile Ala Gly Pro Asp Ser Phe Glu Glu Ile Ser

85 90 95

Val Val Ala Lys Ile Thr Asp Trp Leu Thr Asn Gly Leu Val His Ile

100 105 110

Leu Pro Asn Gln Val Gln Pro Asn Leu Tyr Lys Leu Ala Ile Ala Gly

115 120 125

His Ser Arg Gly Gly Lys Val Ala Phe Ala Leu Gly Leu Gly Tyr Ala

130 135 140

Lys Thr Ser Leu Thr Phe Ser Ala Leu Met Val Val Asp Pro Val Asp

145 150 155 160

Gly Met Asp Lys Gly Lys Gln Thr Asn Pro Pro Ile Leu Thr Tyr Ile

165 170 175

Pro His Ser Phe Glu Leu Lys Met Ala Ala Leu Val Ile Gly Ser Gly

180 185 190

Leu Gly Gly Leu Lys Lys Asn Leu Phe Phe Pro Pro Cys Ala Pro Lys

195 200 205

Gly Val Ser His His Asp Phe Phe Glu Glu Cys Lys Ser Pro Ala Cys

210 215 220

His Leu Val Ala Lys Asp Tyr Gly His Leu Asp Ile Leu Asp Asp Glu

225 230 235 240

Thr Lys Gly Ile Arg Gly Lys Ala Thr Tyr Cys Leu Cys Val Asn Gly

245 250 255

Arg Ala Arg Glu Pro Met Arg Thr Phe Ala Gly Gly Ala Met Val Ala

260 265 270

Phe Met Arg Ala Tyr Leu Asp Gly Asp Met Glu Asp Leu Trp Thr Leu

275 280 285

Arg Asp Asn Pro Glu Leu Ala Ile Pro Ile Met Leu Ser Ile Ala Cys

290 295 300

Phe Gln Glu

305

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列CsCLH2-F1(Artificial Sequence)

<400> 3

agaaagggtt ttgaagttaa catg 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列CsCLH2-R1(Artificial Sequence)

<400> 4

gcacctctca caagtcttca ttc 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列CsCLH2-F2(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtcttctc cttgtcatgt cttc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列CsCLH2-R2(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcctgaaaa caagctattg ataa 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列CsCLH2QRT-F(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcgctcctc agctctacac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列CsCLH2QRT-R(Artificial Sequence)

<400> 8

aaatgcaact ttgcctccgc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列Actin QRT-F(Artificial Sequence)

<400> 9

caatgagctt cgtgttgccc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列Actin QRT-R(Artificial Sequence)

<400> 10

gatacgaacc agttgtgcgg 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列CsCLH2-F3(Artificial Sequence)

<400> 11

atgtcttctc cttgtcatgt ct 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列CsCLH2-R3(Artificial Sequence)

<400> 12

tcattcctga aaacaagcta t 21

Claims (7)

1.一种兰花叶绿素降解代谢调控蛋白，其特征在于，所述兰花叶绿素降解代谢调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种编码权利要求1所述的兰花叶绿素降解代谢调控蛋白的兰花叶绿素降解代谢调控基因。

3. 根据权利要求2所述的兰花叶绿素降解代谢调控基因，其特征在于，所述兰花叶绿素降解代谢调控基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2～3中任意一项权利要求所述的兰花叶绿素降解代谢调控基因。

5.一种宿主菌，其特征在于，包含权利要求2～3中任意一项权利要求所述的兰花叶绿素降解代谢调控基因。

6.权利要求2～3中任意一项权利要求所述兰花叶绿素降解代谢调控基因在兰花或拟南芥叶色或花色的性状改良中的应用。

7.权利要求1所述兰花叶绿素降解代谢调控蛋白在兰花或拟南芥叶色或花色的性状改良中的应用。

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