CN103275973A - 用于辅助鉴定具有滞绿表型的大豆的特异引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于辅助鉴定具有滞绿表型的大豆的特异引物对及其应用。本发明提供的特异引物对，由序列表的序列5所示单链DNA分子和序列表的序列6所示单链DNA分子组成。本发明还所述特异引物对在辅助鉴定具有滞绿表型的大豆中的应用。本发明还保护特异引物对在辅助筛选具有滞绿表型的大豆中的应用。本发明还保护特异引物对在鉴定携带cytG基因的大豆或携带cytG-m基因的大豆中到的应用；所述cytG基因如序列表的序列2所示，所述cytG-m基因如序列表的序列4所示。本发明可用于筛选具有滞绿表型或不具有滞绿表型大豆的筛选和育种，相同传统筛选育种方法，具有时间短、成本低、可以高通量进行的优点，对于大豆育种具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于辅助鉴定具有滞绿表型的大豆的特异引物对及其应用。
背景技术
正常绿色植物在衰老时细胞结构、代谢、基因表达等会发生一系列的变化，导致叶绿素降解，叶片逐渐变黄，进而光合作用能力下降，光合产物的形成量也随之降低，生物量增加变得缓慢直至完全停止。
滞绿(stay green)是指植物在衰老过程中叶绿素不降解或降解不明显的现象，其最明显的特征是植株生长末期叶片保持绿色的时间较长，甚至完全不黄化。由于滞绿突变体在衰老期叶片仍保持着一定量的光合作用，其生物产量有明显提高。研究表明，玉米滞绿型品种在子粒灌浆期比早衰品种多生产24％的干物质，同时多吸收30％的氮素。利用转基因技术诱发的烟草滞绿突变体的生物量和种子产量分别增加了40％和52％。另外，功能型滞绿减缓或阻止了茎、叶中叶绿素的降解，致使滞绿型品种在成熟后茎、叶中的叶绿素含量始终保持原水平而不减少，同时也保持了光合作用，从而使其茎秆的抗逆能力（如抗干旱、抗病性、抗倒伏等方面）具有很强的优势，如澳大利亚昆士兰利用滞绿特性提高高梁对水的利用效率，培育出很多抗干旱的改良品种供干旱地区种植。因此，滞绿调控基因的研究对于作物高产育种研究具有重要意义，是加速高产新品种培育的重要研究内容。
大豆原产我国，已经有5000年的栽培历史，是重要的经济粮食作物。但我国大豆生产远远不能满足我国大豆消费需求。大豆滞绿调控基因的研究可在一定程度上为大豆高产育种奠定理论基础，促进形成具有国际竞争能力的转基因高产大豆产业，确保国家粮食安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于辅助鉴定具有滞绿表型的大豆的特异引物对及其应用。
本发明提供的特异引物对，由序列表的序列5所示单链DNA分子和序列表的序列6所示单链DNA分子组成。
本发明还保护所述特异引物对在辅助鉴定具有滞绿表型的大豆中的应用。所述应用的具体步骤为：以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物为110bp、待测大豆材料为候选的具有滞绿表型的大豆材料，如果PCR扩增产物为105bp、待测大豆材料为候选的不具有滞绿表型的大豆材料。所述待测大豆可为大豆材料L74-826、大豆材料L74-824、大豆材料L62-1027、大豆材料L73-54、大豆材料L74-854、大豆材料L72-2824和大豆材料Willams82。
本发明还保护所述特异引物对在辅助筛选具有滞绿表型的大豆中的应用。所述应用的具体步骤为：以待测大豆的基因组DNA为模板，用本发明提供的特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物为110bp、待测大豆材料为候选的具有滞绿表型的大豆材料，如果PCR扩增产物为105bp、待测大豆材料为候选的不具有滞绿表型的大豆材料。所述待测大豆可为大豆材料L74-826、大豆材料L74-824、大豆材料L62-1027、大豆材料L73-54、大豆材料L74-854、大豆材料L72-2824和大豆材料Willams82。
本发明还保护所述特异引物对在鉴定携带cytG基因的大豆或携带cytG-m基因的大豆中到的应用；所述cytG基因如序列表的序列2所示，所述cytG-m基因如序列表的序列4所示。所述应用的具体方法如下：以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，如果所述PCR扩增得到了105bp的扩增产物待测大豆为携带cytG基因的大豆，如果所述PCR扩增得到了110bp的扩增产物待测大豆为携带cytG-m基因的大豆。所述待测大豆可为大豆材料L74-826、大豆材料L74-824、大豆材料L62-1027、大豆材料L73-54、大豆材料L74-854、大豆材料L72-2824和大豆材料Willams82。
本发明还保护所述特异引物对在大豆育种中的应用。
本发明还保护cytG蛋白（大豆细胞质滞绿调控蛋白），如序列表的序列1所示。
本发明还保护cytG基因，如序列表的序列2所示。
本发明还保护cytG-m蛋白，如序列表的序列3所示。
本发明还保护cytG-m基因，如序列表的序列4所示。
本发明还保护所述cytG蛋白、所述cytG基因、所述cytG-m蛋白或所述cytG-m基因在大豆育种中的应用。
本发明可用于筛选具有滞绿表型或不具有滞绿表型大豆的筛选和育种，相同传统筛选育种方法，具有时间短、成本低、可以高通量进行的优点，对于大豆育种具有重大价值。
附图说明
图1为cytG蛋白和cytG-m蛋白的二级结构比较结果。
图2为大豆材料L62-1027和大豆材料Willams82的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为待测大豆种植于北京市昌平区中科院遗传所北七家农场，正常管理，持续观察表型的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、cytG蛋白、cytG-m蛋白以及它们的编码序列的发现
cytG突变体大豆是在大豆中发现了一个受细胞质基因控制的滞绿突变体。cytG突变体大豆衰老起始期和野生型没有明显差异，大部分的类囊体蛋白被降解，但是光系统II捕光色素蛋白复合体(light harvesting complex II,LHCII)的降解受到抑制，Chl b的降解被延缓，然而Chl a的含量较少，因此Chl a/b比值较小，植株仍然保持绿色。
分别提取大豆品种Williams82和cytG突变体大豆的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用特异引物对（见表1）进行PCR扩增，并进行序列分析和比较。
表1PCR扩增采用的特异引物
从大豆品种Williams82中发现的cytG蛋白如序列表的序列1所示（由35个氨基酸残基组成），其编码基因如序列表的序列2所示（由105个核苷酸组成）。
从cytG突变体大豆中发现的cytG-m基因如序列表的序列4所示（由110个核苷酸组成），与序列2相比有5个核苷酸的插入。cytG-m基因编码序列表的序列3所示的cytG-m蛋白（由24个氨基酸残基组成）。
cytG蛋白和cytG-m蛋白的二级结构比较结果见图1。cytG蛋白的二级结构由Helix、Extended-Beta和C端的coil组成。cytG-m蛋白相比cytG蛋白缺失了Extended-Beta和C端的coil等结构。结构上的差别可能是导致cytG突变体大豆产生滞绿表型的原因。
实施例2、特异引物对的设计和应用
一、特异引物对的设计
基于cytG蛋白的编码基因和cytG-m蛋白的编码基因的差异性，设计并合成一对引物如下：
F1(序列表的序列5)：5’-atggaagtaaatattcttgc-3’；
R1(序列表的序列6)：5’-ttagtcactttgacttaccgt-3’。
二、特异引物对的应用
用于本步骤的各个大豆材料见表2（来源于美国农业部的种资资源库，该资源库的种资资源面向公众开放，可用于科研相关，可以在http://www.ars-grin.gov/npgs/acc/acc_queries.html中输入PI编号查到）。
将各个待测大豆材料分别进行如下鉴定：
1、提取待测大豆的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR扩增体积：基因组DNA100ng/μl1μl，10×PCR Buffer2.0μl，25mM MgCl22.0μl，2mM dNTP2.0μl，10μM F11.0μl，10μM R11μl，15U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O10.8μl，总体系20μl。
PCR扩增程序：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，40个循环；72℃补齐10分钟。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行5.0％琼脂糖凝胶电泳。
大豆材料L62-1027和大豆材料Willams82的琼脂糖凝胶电泳图见图2。大豆材料L74-826、大豆材料L74-824的条带位置均与大豆材料L62-1027的条带位置一致。大豆材料L73-54、大豆材料L74-854和大豆材料L72-2824的条带位置均与大豆材料Willams82的条带位置一致。
4、分别收集各个大豆材料的相应条带并进行测序，结果表明，大豆材料L74-826、大豆材料L74-824和大豆材料L62-1027的PCR扩增产物均为110bp（如序列表的序列4所示）。大豆材料Willams82、大豆材料L73-54、大豆材料L74-854和大豆材料L72-2824扩增产物为105bp（如序列表的序列2所示）。
结果见表2。
表2琼脂糖凝胶电泳和测序的结果
5、2012年5月上旬，将待测大豆种植于北京市昌平区中科院遗传所北七家农场，正常管理，持续观察表型，分别于2012年6月中旬、2012年8月中旬和2012年10月中旬拍照，照片见图3。图3中，A为6月中旬的照片，B为8月中旬的照片,C为10月中旬的照片；A中用于比较的叶片为不同待测样本相同部位的叶片；B中用于比较的叶片为不同待测样本相同部位的叶片；C中用于比较的叶片为不同待测样本相同部位的叶片。6月中旬，各个大豆材料的叶片均为绿色。8月中旬，大豆材料Willams82、大豆材料L73-54、大豆材料L74-854和大豆材料L72-2824开始变黄，即叶绿素开始降解，大豆材料L74-826、大豆材料L74-824和大豆材料L62-1027的叶片仍然保持绿色。10月中旬，大豆材料Willams82、大豆材料L74-854和大豆材料L72-2824叶片中的叶绿素已完全降解，但大豆材料L74-826、大豆材料L74-824和大豆材料L62-1027的叶片中还有未降解的叶绿素。
以上结果表明，本发明提供的特异引物对可以用于辅助鉴定待测大豆材料是否为具有滞绿表型的大豆材料。以待测大豆的基因组DNA为模板，用本发明提供的特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物为110bp、待测大豆材料为候选的具有滞绿表型的大豆材料，如果PCR扩增产物为105bp、待测大豆材料为候选的不具有滞绿表型的大豆材料。
以上结果表明，本发明提供的特异引物对可以用于辅助筛选具有滞绿表型的大豆材料，以待测大豆的基因组DNA为模板，用本发明提供的特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物为110bp、待测大豆材料为候选的具有滞绿表型的大豆材料，如果PCR扩增产物为105bp、待测大豆材料为候选的不具有滞绿表型的大豆材料。
Claims (10)
1.特异引物对，由序列表的序列5所示单链DNA分子和序列表的序列6所示单链DNA分子组成。
2.权利要求1所述特异引物对在辅助鉴定具有滞绿表型的大豆中的应用。
3.权利要求1所述特异引物对在辅助筛选具有滞绿表型的大豆中的应用。
4.权利要求1所述特异引物对在鉴定携带cytG基因的大豆或携带cytG-m基因的大豆中到的应用；所述cytG基因如序列表的序列2所示，所述cytG-m基因如序列表的序列4所示。
5.权利要求1所述特异引物对在大豆育种中的应用。
6.cytG蛋白，如序列表的序列1所示。
7.cytG基因，如序列表的序列2所示。
8.cytG-m蛋白，如序列表的序列3所示。
9.cytG-m基因，如序列表的序列4所示。
10.权利要求6所述蛋白、权利要求7所述基因、权利要求8所述蛋白或权利要求9所述基因在大豆育种中的应用。
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| SASKI C.等: "DQ317523.1", 《GENBANK》 * |
| 严波 等: "滞绿突变体的研究现状及应用前景", 《重庆大学学报(自然科学版)》 * |
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