CN114736922A - 一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备与检测方法及其应用 - Google Patents

一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备与检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备与检测方法及其应用。该耐草铵膦转基因玉米BrmB01已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22650。本发明还建立了用于检测待测植物样品是否来源于所述转基因玉米BrmB01的PCR检测方法，该检测方法可以鉴定插入的外源DNA分子和植物基因组DNA的接合区域，进一步可用于准确快速的鉴定植物样品中是否包含特定转基因玉米事件BrmB01的DNA分子，为培育具有优良性状的耐草铵膦玉米品种研究奠定基础。

Description

一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备与检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备与检测方法及其应用，特别涉及一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备方法、用于检测耐草铵膦转基因玉米BrmB01的核苷酸序列及其检测方法。
背景技术
杂草不但通过与玉米争光、争水、争肥造成直接减产，还通过为许多病虫提供寄生和越冬场所而引发病虫害导致减产。因此，玉米杂草防治是保障高产稳产的重要举措。
草铵膦是铵盐草胺磷的简称。它是一种广谱触杀型除草剂，用来控制作物生长后的大范围杂草生长。草铵膦的活性成分是L-草丁膦，是谷氨酰胺合酶的抑制剂。谷氨酰胺合酶能催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，它的活性被抑制后将导致氨的积累和谷氨酸水平降低，从而抑制光合作用，使植物在几天内死亡。草铵磷乙酰转移酶能通过乙酰化使草铵膦脱毒成一种无活性的化合物，从而避免了对植物造成伤害。bar基因编码的草丁膦乙酰CoA转移酶(PAT)来源于吸水链霉菌，将bar基因导入作物中能赋予作物对草铵膦的耐受性。
通过草铵膦抗性筛选和表达量分析，可以获得具有商业化应用前景的转化体事件，采用回交转育等常规育种方法，将获得的转化体事件转育到不同遗传背景的玉米中，可以培育出具有原始转化体事件的转基因表达特征的耐草铵膦玉米品种。
每个转化体事件都具有特异的外源插入序列与植物基因组的连接区序列，以外源插入序列与植物基因组连接区序列为检测目标能特异和准确的对转化体事件进行鉴定。通过转化体特异PCR检测或Southern杂交能检测目标转化体的存在。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐草铵膦的转基因玉米BrmB01的制备与检测方法。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种耐草铵膦转基因玉米的培育方法。
本发明提供的耐草铵膦转基因玉米的培育方法包括如下步骤：将外源DNA分子插入目的玉米基因组中，得到耐草铵膦转基因玉米；
所述外源DNA分子为含有草丁膦乙酰CoA转移酶编码基因(SEQ ID No.1第1835-2386位)的DNA分子；
所述外源DNA分子在所述耐草铵膦转基因玉米中的上游侧翼序列为上游插入位点起向其上游方向延伸得到的任意一个DNA片段；
所述外源DNA分子在所述耐草铵膦转基因玉米中的下游侧翼序列为下游插入位点起向其下游方向延伸得到的任意一个DNA片段；
所述上游插入位点为玉米基因组中含有的SEQ ID No.1第1-516位所示的DNA分子中的最后一个核苷酸对应的位点；
所述下游插入位点为玉米基因组中含有的SEQ ID No.1第2664-3034位所示的DNA分子中的第一个核苷酸对应的位点。
上述方法中，所述插入为插入所述上游插入位点和所述下游插入位点之间，即替换玉米基因组中所述上游插入位点和所述下游插入位点之间的核苷酸。
进一步的，所述耐草铵膦转基因玉米含有特异DNA片段；所述特异DNA片段含有SEQID No.2所示的DNA分子和/或SEQ ID No.3所示的DNA分子。
再进一步的，所述特异DNA片段含有SEQ ID No.4所示的DNA分子和/或SEQ IDNo.5所示的DNA分子。
更进一步的，所述特异DNA片段依次由所述上游侧翼序列、所述外源DNA分子和所述下游侧翼序列组成。
所述外源DNA分子具体如SEQ ID No.1第517-2663位所示；依次包括CaMV35S核苷酸序列、草丁膦乙酰CoA转移酶基因(Bar基因)和polyA核苷酸序列。
所述上游侧翼序列具体如SEQ ID No.1第1-516位所示。
所述下游侧翼序列具体如SEQ ID No.1第2664-3034位所示。
所述特异DNA片段具体如SEQ ID No.1所示。
在本发明的一个具体实施例中，所述目的玉米为玉米品种综31。
所述上游插入位点为玉米基因组第78858568位所示的核苷酸位点；
所述下游插入位点为玉米基因组第78858626位所示的核苷酸位点；
所述玉米基因组序列的版本号为Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0。
所述耐草铵膦转基因玉米为耐草铵膦转基因玉米的T1代阳性株系BrmB01(转基因玉米事件BrmB01)，转基因玉米事件BrmB01已于2021年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为玉米(Zea Mays)，保藏编号为CGMCC No.22650。
所述转基因玉米事件BrmB01 CGMCC No.22650具体为将SEQ ID No.1第517-2663位所示的外源DNA分子插入玉米品种综31基因组第6号染色体的第78858568-78858626位间，替换掉第6号染色体的第78858568-78858626位间57bp的碱基序列后得到转基因玉米。
为了实现上述目的，本发明又提供了一种耐草铵膦转基因玉米的培育方法。
本发明提供的耐草铵膦转基因玉米的培育方法包括如下步骤：以按照上述方法制备得到的耐草铵膦转基因玉米或其后代为亲本材料与其它不具有草铵膦耐受性的玉米品种进行杂交，得到耐草铵膦转基因玉米；所述耐草铵膦转基因玉米含有上述特异DNA片段。
为了实现上述目的，本发明还提供了如下1)-4)任一所述的生物材料：
1)上述上游侧翼序列；
2)上述下游侧翼序列；
3)上述外源DNA分子；
4)上述特异DNA片段。
上述生物材料在如下a1)或a2)任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
a1)培育上述耐草铵膦转基因玉米；
a2)检测或辅助检测植物样品是否来源于上述耐草铵膦转基因玉米或其后代。
为了实现上述目的，本发明还提供了用于检测或辅助检测植物样品是否来源于上述耐草铵膦转基因玉米或其后代的方法。
本发明提供的用于检测或辅助检测植物样品是否来源于上述耐草铵膦转基因玉米或其后代的方法包括如下步骤：检测所述植物样品的基因组DNA中是否含有上述特异DNA片段，若含有所述特异DNA片段，则所述植物样品来源于所述耐草铵膦转基因玉米或其后代。
进一步的，检测所述植物样品的基因组DNA中是否含有特异DNA片段的方法为如下b1)或b2)或b3)：
b1)直接测序所述植物样品的基因组DNA，根据测序结果判断所述植物样品中是否含有所述特异DNA片段；
b2)采用引物对1和/或引物对2对所述植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，若有目的扩增产物，则所述植物样品含有所述特异DNA片段；
所述引物对1为扩增产物含有DNA片段甲的引物对；所述DNA片段甲如SEQ IDNo.2；所述SEQ ID No.2或其互补序列为转基因玉米事件BrmB01中在外源插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为26个核苷酸的序列，所述SEQ ID No.2或其互补序列跨越了玉米上游插入位点的侧翼基因组DNA序列和外源插入序列的5’末端的DNA序列，包含所述SEQ ID No.2或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件BrmB01的存在。
所述引物对2为扩增产物含有DNA片段乙的引物对；所述DNA片段乙如SEQ IDNo.3；所述SEQ ID No.3或其互补序列为转基因玉米事件BrmB01中在外源插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为26个核苷酸的序列，所述SEQ ID No.3或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的DNA序列和玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID No.3或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件BrmB01的存在。
b3)用能特异结合所述特异DNA片段的探针对所述植物样品的基因组DNA进行Southern杂交，若能杂交得到杂交片段，则所述植物样品含有所述特异DNA片段。
所述探针可为能特异结合所述特异DNA片段中的上游侧翼序列、外源DNA分子、下游侧翼序列或其接合部位(连接区序列)的一种或两种或多种核酸分子，如可以为特异性结合SEQ ID No.2或其互补序列的核酸分子和/或可以特异性结合SEQ ID No.3或其互补序列的核酸分子，也可以为特异性结合SEQ ID No.10或其互补序列的核酸分子和/或可以特异性结合SEQ ID No.11或其互补序列的核酸分子。
更进一步的，b2)中，所述引物对1由SEQ ID No.6所示的单链DNA分子和SEQ IDNo.7所示的单链DNA分子组成，其对应的目的扩增产物如SEQ ID No.10所示；所述引物对2由SEQ ID No.8所示的单链DNA分子和SEQ ID No.9所示的单链DNA分子组成，其对应的目的扩增产物如SEQ ID No.11所示。
b3)中，所述探针的核苷酸序列为序列12。
为了实现上述目的，本发明还提供了用于检测或辅助检测植物样品是否来源于上述耐草铵膦转基因玉米或其后代的试剂盒。
本发明提供的用于检测或辅助检测植物样品是否来源于上述耐草铵膦转基因玉米或其后代的试剂盒包括上述引物对1和/或上述引物对2和/或上述探针。
上述任一所述方法或按照上述任一所述方法制备的耐草铵膦转基因玉米或其后代或上述生物材料或上述试剂盒在玉米育种或加工品生产中的应用也属于本发明的保护范围。
所述玉米育种的目的为培育耐受草铵膦除草剂的玉米品种。具体可体现为：以转基因玉米事件BrmB01或其后代作为父本与母本玉米植物进行有性杂交，可以产生多样的第一代子代植株；对第一代子代植株进行草铵膦耐受性分析，筛选出具有草铵膦耐受性的子代植株，从而可以培育出耐受草铵膦除草剂的玉米品种。进一步可包括用具有草铵膦耐受性的子代植株与母本玉米植物或其它亲本玉米植物进行回交，然后通过草铵膦耐受性或鉴定与性状相关的分子标记物(如包含转基因玉米事件Brm01中的特异DNA片段)来筛选子代，从而获得耐受草铵膦除草剂的玉米植物。
上述任一所述耐草铵膦转基因玉米包括转基因玉米事件Brm01(保藏编号为CGMCCNo.22650的转基因玉米)的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因玉米事件Brm01的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自转基因玉米事件Brm01的产物，例如玉米粉、玉米面、玉米油、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。
上述任一所述耐草铵膦转基因玉米的后代可为以所述耐草铵膦转基因玉米为亲本衍生的转基因材料，包括用所述耐草铵膦转基因玉米诱变或与其他玉米杂交得到的衍生后代或所述诱变或杂交后代再进行衍生得到的后代。
上述任一所述植物样品不仅包括野生型玉米或其变体等一切可以与玉米交配的所有植物品种，以及来源于所述植物的细胞、组织和器官(如种子、叶子、果实、花、茎和根)和来源于所述植物的繁殖材料(如花粉、子房、胚珠、胚芽、胚乳、卵细胞、根、根尖、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生细胞、原生质体和细胞组织培养组成的群体，还包括以玉米为主要原料的加工品(农产品或商品)，如玉米粉、玉米面、玉米油、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、化妆品或填充剂。
本发明提供了一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01，该耐草铵膦转基因玉米BrmB01为将外源DNA分子插入玉米品种综31基因组第6号染色体的第78858568-78858626位间，替换掉第6号染色体的第78858568-78858626位间57bp的碱基序列后得到转基因玉米，该转基因玉米事件BrmB01已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22650。通过实验证明：转基因玉米事件BrmB01对草铵膦的抗性高于野生型玉米，该转基因玉米事件BrmB01对草铵膦除草剂具有很好的耐受性。本发明还建立了用于检测待测植物样品是否来源于所述转基因玉米BrmB01的PCR检测方法，该检测方法可以鉴定插入的外源DNA分子和植物基因组DNA的接合区域，进一步可用于准确快速的鉴定植物样品中是否包含特定转基因玉米事件BrmB01的DNA分子，为培育具有优良性状的耐草铵膦玉米品种研究奠定基础。
保藏说明
分类命名：玉米
拉丁名：Zea Mays
参据的生物材料：BrmB01
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2021年11月24日
保藏中心等级入册编号：CGMCC No.22650
附图说明
图1为植物表达载体pCambia2300-bar的结构示意图。
图2为转基因玉米BrmB01 CGMCC No.22650的草铵膦抗性鉴定。
图3为用于检测转基因玉米BrmB01中转基因插入序列与玉米基因组整合位点的结构示意图。
图4为转基因玉米BrmB01 CGMCC No.22650的插入位点5’端特异性检测。
图5为转基因玉米BrmB01 CGMCC No.22650的插入位点5’端特异PCR灵敏度检测。
图6为转基因玉米BrmB01 CGMCC No.22650的插入位点3’端特异性检测。
图7为转基因玉米BrmB01 CGMCC No.22650的插入位点3’端特异PCR灵敏度检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中未详细说明的操作步骤参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。
下述实施例中所涉及的试剂材料及来源如下：
pMD-18T克隆载体是六合通经贸有限公司的产品，产品目录号为D102A。
DNA提取试剂盒是北京博迈德科技发展有限公司的产品，产品目录号为DN1501。
2×EasyTaq PCR SuperMix是北京全式金生物技术有限公司的产品，产品目录号为AS111-01。
琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒是北京博迈德科技发展有限公司的产品，产品目录号为DR0101。
大肠杆菌感受态细胞是北京全式金生物技术有限公司的产品，产品目录号为CD201-01。
核酸外切酶ExoI是NEB公司的产品，产品目录号为M0293V。
NB培养基是北京西美杰科技有限公司的产品，货号为N492。
MS培养基是北京索莱宝科技有限公司的产品，货号为M8520-250g。
pCamBIA3300载体是北京科瑞思搏生物科技有限公司的产品，产品目录号为VT11938。
pCamBIA2300载体是北京科瑞思搏生物科技有限公司的产品，产品目录号为VT11898。
下述实施例中所涉及的YEB培养基及其配方如下：在800mL去离子水中依次加入1g酵母提取物，5g蛋白胨，5g蔗糖和0.98g的MgSO4。用磁力搅拌器充分混匀，调节pH到7.0，定容至1L，121℃，1.034×105Pa高温高压灭菌15min。灭菌后，4℃保存。固体YEB培养基在高压灭菌前加入1.25％的琼脂粉。
下述实施例中所涉及的玉米品种综31记载于文献“杨会，王国英，戴景瑞.玉米优良自交系综3、综31的转化研究.农业生物技术学报,2001,4:334-337,410”中。
实施例1、转基因玉米事件BrmB01的获得及性状鉴定
一、农杆菌介导法获得转基因玉米植株
1、植物表达载体pCambia2300-bar的构建
1)根据bar基因序列设计引物，为便于构建载体，在引物两端添加了xhoI酶切位点。引物序列如下：
Bar-F：5’-CACTCGAGATGAGCCCAGAACGACGCCCGGCCGA-3’；
Bar-R：5’-ACCTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGGCAGGA-3’。
2)以pCamBIA3300载体为模板采用步骤1)中的引物进行PCR扩增，获得PCR产物(bar基因)。
3)用xhoI酶切步骤2)中的PCR产物和pCamBIA2300载体，回收相应的目标片段后连接形成植物表达载体pCambia2300-bar。
植物表达载体pCambia2300-bar的结构示意图如图1所示。在此表达载体中，目标基因bar由35S启动子驱动表达，35SPloyA终止表达。
2、农杆菌菌液的制备
将步骤1中的植物表达载体pCambia2300-bar通过冻融法转化到农杆菌EHA105中。挑取含有植物表达载体pCambia2300-bar的农杆菌EHA105单菌落，在YEB培养基中28℃过夜培养。吸取1mL菌液接种到100mL YEB培养基中继续28℃培养4-6个小时至OD值为0.6-0.8备用。
3、转基因玉米的制备
取授粉后9-12天的玉米穗，去掉外苞叶，在70％的乙醇中灭菌1分钟，用手术刀剥取幼胚。以幼胚为外植体，通过农杆菌介导法将植物表达载体pCambia2300-bar中的T-DNA转入受体材料玉米品种综31基因组中，得到T0代转基因玉米植株(编号分别为BrmB01-BrmB23)。农杆菌介导法进行玉米遗传转化的具体操作步骤参照文献“贾艾敏,张玲,蒋琴,胡冲,刘坚.农杆菌介导的2mG2-epsps基因转化玉米自交系18-599R幼胚的研究,2015,33(3):245-250”中的方法。
二、转基因玉米阳性植株的PCR检测
利用北京康为试剂生物科技有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒提取步骤一获得的T0代转基因玉米植株(编号分别为BrmB01-BrmB23)的基因组DNA。根据bar基因序列设计引物bar-F-1和bar-R-2。引物序列如下：
bar-F-1：5’-CGAGACAAGCACGGTCAACTTCCGTA-3’；
bar-R-2：5’-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACG-3’。
以bar-F-1/bar-R-2为引物，以各T0代转基因玉米植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃扩增30sec，30次循环；72℃延伸10min。
同时以未转基因玉米受体材料综31和植物表达载体pCambia2300-bar作为对照。
结果表明，只有以T0代转基因玉米阳性植株的基因组DNA和植物表达载体pCambia2300-bar为模板时可扩增得到大小约为419bp的目的条带，而非转基因对照综31中没有目的条带的扩增。
三、T1转基因玉米的草甘膦抗性分析
将PCR鉴定为阳性的T0代转基因玉米植株自交后获得T1代转基因玉米。在玉米生长的5叶期，对T1代转基因玉米喷施2000ppmol的草铵膦溶液(将10mL有效成分为200g/L的草铵膦加入到1L水中即得到2000ppmol的草铵膦溶液)，以非转基因受体材料综31为对照。2周后进行调查，结果如图2所示。结果发现喷施2000ppmol的除草剂草铵膦的非转基因受体材料综31全部死亡，而不同的转基因株系中都有植株存活，其中BrmB01株系中存活植株的生长没有受到抑制，而其他几个株系中的存活植株生长缓慢，最终影响了正常结实。因此，选择T1转基因玉米株系BrmB01(转基因玉米事件BrmB01)进行后续的研究工作，并将该T1转基因玉米株系BrmB01于2021年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为玉米Zea Mays，保藏编号为CGMCC No.22650。
实施例2、转基因玉米事件BrmB01分子特征解析
一、外源基因在受体基因组中整合位点3’端侧翼序列的克隆
1、利用北京康为试剂生物科技有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒提取转基因玉米BrmB01叶片基因组DNA，提取的DNA用水稀释至终浓度为100ng/μL。
2、根据玉米转化时所用植物表达载体中靠近T-DNA左边界的已知序列设计如下引物：F1、F2、F3、R2、R3、AD1、AD2、AD3和AD4。所有引物由上海生物工程有限责任公司合成。引物用水溶解至终浓度为100μM。引物序列具体如下：
F1：5’-gaggcacagggcttcaagagcgtg-3’；
F2：5’-gtccggtcctgcccgtcaccga-3’；
F3：5’-ggtttcgctcatgtgttgagc-3’；
R2：5’-tcaagagcgtggtcgctgtcatcg-3’；
R3：5’-ggcatgacgtgggtttctggcagc-3’；
AD1：5’-ggtttctggcagctggacBDDNNNTGGT-3’；
AD2：5’-ggtttctggcagctggacDVBNNNCTAG-3’；
AD3：5’-ggtttctggcagctggacBHHNNNACCT-3’；
AD4：5’-ggtttctggcagctggacHBHNNNCCTC-3’。
其中，D表示a或g或t；B表示g或c或t；H表示a或c或t；N表示a或g或c或t；V表示a或g或c。
3、在PCR反应管中依次加入植物基因组DNA 2.5μL，上游引物F1(100pM)1μL，随机引物AD1或AD2或AD3或AD4(100pM)2μL，2×Mix PCR反应液10μL，最后加水至终体积为20μL。反应液混合均匀后置于PCR仪进行PCR反应，反应条件为：95℃6min；94℃30sec，58℃40sec，72℃3min，5个循环；94℃30sec，25℃3min，72℃3min，1个循环；94℃30s，58℃40sec，72℃3min，94℃30sec，58℃40sec72℃3min，94℃30s，45℃40sec，72℃3min 8个循环；72℃6min，12℃∞。
4、在PCR反应管中依次加入步骤3的扩增产物6μL，核酸外切酶ExoI 0.2μL、反应缓冲液1μL和2.8μL ddH2O。反应液混合均匀后置于PCR仪进行PCR反应，反应条件为：37℃反应1.5小时，80℃反应20-30min。
5、在PCR反应管中依次加入步骤4的扩增产物2μL，上游引物F2(100pM)1μL，下游引物R2(100pM)1μL，2×Buffer反应液10μL，dNTP 0.8μL，酶0.8μL，最后加水至终体积为20μL。反应液混合均匀后置于PCR仪进行PCR反应，反应条件为：95℃6min；94℃30sec，60℃40s，72℃3min，5个循环；94℃30sec，60℃40sec，72℃3min，30个循环；72℃6min，12℃∞。
6、在PCR反应管中依次加入步骤5的扩增产物2μL，上游引物F3(100pM)1.5μL，下游引物R3(100pM)1.5μL，2×Buffer反应液20μL，dNTP 1.6μL，酶1.6μL，最后加水至终体积为40μL。反应液混合均匀后置于PCR仪进行PCR反应，反应条件为：95℃6min；94℃30sec，54℃40sec，72℃3min，30个循环；72℃6min，12℃∞。
7、对第四轮PCR反应产物进行电泳检测，回收大于已知片段的DNA条带。回收的DNA条带连接PJET1.2载体，挑选阳性克隆进行测序。
8、通过DNAman软件比对分析，发现获得的DNA片段自5’末端起第1-180位为载体上的已知序列。将第181-552位所示的DNA序列在maizegdb(www.maizegdb.org)网站上进行BLAST，发现此序列可以比对到玉米基因组第6号染色体上。比对结果证明获得了转基因玉米BrmB01中外源基因在玉米基因组插入位点的3’端侧翼序列。3’端侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1第2664-3034位所示。
二、外源基因在受体基因组中整合位点5’端侧翼序列的克隆
根据网上公布的插入序列3’侧翼序列的上游序列设计引物left-F(5'-CTCTAGCTGATACTCCTCCTTCTCGT-3')，根据插入序列右边界载体序列设计引物left-R(5'-GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCA-3)。以转基因玉米BrmB01叶片的基因组DNA为模板，采用引物left-F和left-R进行PCR扩增，获得了插入序列5’端的516bp的侧翼序列。5’端侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1第1-516位所示。
三、耐草铵膦转基因玉米事件BrmB01 CGMCC No.22650分子特征解析
将步骤一和步骤二获得的插入位点上下游侧翼序列与公布的B73玉米基因组序列(Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0，MaizeGDB:http://www.maizegdb.org)进行比对，发现转基因玉米事件BrmB01 CGMCC No.22650为将SEQ ID No.1第517-2663位所示的外源DNA分子(SEQ ID No.1第1368-1822位为CaMV35S启动子核苷酸序列，第1835-2386位为Bar基因序列，第2387-2577位为polyA核苷酸序列)插入玉米品种综31基因组第6号染色体的第78858568-78858626位间，替换掉第6号染色体的第78858568-78858626位间57bp的碱基序列(被替换序列为TGTCAATGGAGTTTCAGGTTCACCGCGGATCCGCCCAAAGCGTGGCAGGAGGACATC)后得到转基因玉米。
耐草铵膦转基因玉米事件BrmB01 CGMCC No.22650含有SEQ ID No.1所示的DNA分子，SEQ ID No.1所示的DNA分子依次由5’端玉米侧翼基因组DNA序列(上游侧翼序列，SEQID No.1第1-516位)、转化载体pCambia2300-bar上的DNA序列(SEQ ID No.1第517-2663位)和3’端玉米侧翼基因组DNA序列(下游侧翼序列，SEQ ID No.1第2664-3034位)。
具体地，转基因玉米事件BrmB01中在外源DNA分子的5’末端插入位点附近的核酸序列如SEQ ID No.2所示或SEQ ID No.4，3’末端插入位点附近的核酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。可以看出，外源DNA分子的插入位置及两侧的侧翼序列可以用来鉴定待测玉米是否来源于转基因玉米事件BrmB01 CGMCC No.22650或其后代。
转基因玉米BrmB01中插入序列与玉米基因组整合位点的结构示意图如图3所示。
实施例3、外源基因在受体基因组中的拷贝数分析
选用的杂交试剂盒是罗氏生产的Southern杂交试剂盒DIG High Primer DNALabeled and Detection Starter KitⅡ，探针标记用的是PCR法标记地高辛探针的PCRDIG Probe Synthesis Kit试剂盒。
提取转基因玉米BrmB01叶片基因组DNA，利用EcoR I和HindIII分别进行过夜单酶切，每组酶切反应中基因组总量在100μg以上。电泳后进行转膜、洗膜和预杂交。以植物表达载体pCambia2300-bar质粒为模板，采用S-TZbarR(5’-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’)和S-TZbarF(5’-AAGGAAGTTCATTTCATTTG-3’)为引物进行PCR扩增，扩增出的大小为583bp的DNA片段(SEQ ID No.12，也即SEQ ID No.1第1756-2338位)，回收测序后作为标记探针。按照试剂盒说明对探针进行标记。为了计算标记探针的产量，使用Thermo Scientific NanoDrop2000C测量该探针溶液的OD260、OD280的吸光值，获得质量浓度。预杂交结束后加入标记好的探针进行杂交，杂交条件为55℃过夜。过夜结束后用低严谨洗膜液(2×SSC+0.1％SDS)200μL/cm2加入到杂交瓶中，42℃洗膜单次5min，共计2次。低严谨洗膜结束后，用30-50mL的高严谨洗膜液(0.1×SSC+0.1％SDS)在65℃洗膜15min，并重复一次。将尼龙膜转移到平皿中，倒入30mL洗膜液，室温下漂洗2min。倒掉洗膜液，加入30mL封闭液，室温下封闭至少30min。倒掉封闭液，加入20mL按照1:10 000稀释好的抗体，室温下孵育约30min。倒掉抗体稀释液，用约100mL洗膜液洗膜15min，并重复一次。倒掉洗膜液，加入30mL检测液，室温下轻摇3min。将尼龙膜取出，平放在保鲜膜上，使载有DNA的一面朝上。每100cm2尼龙膜使用1mL的CSPD，小心且均匀地滴加到尼龙膜上，使膜表面完全湿润。盖上保鲜膜，轻轻撵走气泡和多余的CSPD溶液，小心包好保鲜膜并转移到光片夹中，放在37℃下孵育10min。在暗室中将X光胶片放到光片夹中，与膜接触，曝光X光胶片1-10min(视曝光强度而定)。取出X胶片，浸没在显影液中约1min，直到出现清晰的条带，迅速转移到定影液中定影约5-10min，随后用清水冲洗胶片，晾干保存。
Southern检测结果显示，转基因玉米BrmB01基因组DNA经EcoR I和HindIII单酶切后，都只能杂交得到1条DNA条带，证明转基因玉米BrmB01中外源基因为单拷贝插入。
实施例4、耐草铵膦转基因玉米BrmB01转化体特异PCR检测体系建立
一、5’端转化体特异PCR检测体系建立
1、根据耐草铵膦转基因BrmB01 CGMCC No.22650外源基因插入位点5’端的侧翼序列，设计外源基因位点特异性PCR检测的引物5’-QF1和5’-QR1。
5’-QF1:5’-AGTCAAAGGCGCCACCATAGGTC-3’(SEQ ID No.6)；
5’-QR1:5’-CTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCT-3’(SEQ ID No.7)。
2、利用植物基因组DNA提取试剂盒提取耐草铵膦转基因玉米BrmB01 CGMCCNo.22650、非转基因受体玉米综31、水稻日本晴、陆地棉K312、海岛棉7124、拟南芥、胡麻陇亚10号、玉米B73、玉米C01、玉米Z58的叶片DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。提取的DNA用水稀释至终浓度为100ng/μL。
3、以上述步骤2提取的DNA为模板，以步骤1中的5’-QF1和5’-QR1为引物进行5’端侧翼序列特异性PCR检测。反应体系为：0.5μL Taq Polymerase(5U/μL)、5.0μL 10×PCRBuffer(Mg2+Plus)、5.0μL dNTP(2.5mM)、5’-QF1和5’-QR1各1μL(10.0μM)、模板DNA 1μL，用灭菌ddH2O补足体积至50μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃扩增30sec，30次循环；72℃延伸10min。
4、PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
结果表明：只有以耐草铵膦转基因玉米BrmB01 CGMCC No.22650的基因组DNA为模板时能扩增到大小为218bp的目标DNA条带，而其它样品中均未能扩增到相应的目标条带(图4)。将218bp的目标DNA条带回收测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
二、5’端转化体的灵敏度检测
将玉米综31的基因组DNA和转基因玉米BrmB01基因组DNA按质量百分比进行混合，配置成转基因玉米BrmB01 DNA含量依次为10％、8％、4％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.03％、0.05％和0％的DNA溶液。以不同浓度的DNA溶液为模板，利用特异性检测引物5’-QF1/5’-QR1进行PCR扩增，1.0％的琼脂糖凝胶电泳分析灵敏度。
结果表明：引物5’-QF1/5’-QR1在转基因玉米BrmB01的DNA的浓度稀释到0.1％时，仍能扩增到218bp的特异性片段(图5)。由此说明，5’端转化体的检测灵敏度可以达到0.1％。
三、3’端转化体特异PCR检测体系建立
1、根据耐草铵膦转基因BrmB01 CGMCC No.22650外源基因插入位点3’端的侧翼序列，设计外源基因位点特异性PCR检测的引物3’-TYF1和3’-TYR1。
3’-TYF1：5’-CAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGA-3’(SEQ ID No.8)；
3’TYR1：5’-TAGTGGCCAGTGTGATGGCACAT-3’(SEQ ID No.9)。
2、利用植物基因组DNA提取试剂盒提取耐草铵膦转基因玉米BrmB01 CGMCCNo.22650、非转基因受体玉米综31、水稻日本晴、陆地棉K312、海岛棉7124、拟南芥、胡麻陇亚10号、玉米B73、玉米C01、玉米Z58的叶片DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。提取的DNA用水稀释至终浓度为100ng/μL。
3、以上述步骤2提取的DNA为模板，以步骤1中的3’-TYF1和3’-TYR1为引物进行5’端侧翼序列特异性PCR检测。反应体系为：0.5μL Taq Polymerase(5U/μL)、5.0μL 10×PCRBuffer(Mg2+Plus)、5.0μL dNTP(2.5mM)、3’-TYF1和3’-TYR1各1μL(10.0μM)、模板DNA 1μL，用灭菌ddH2O补足体积至50μL。反应条件为：95℃5min；95℃30sec，62℃30sec，72℃30sec，30次循环；72℃10min。
4、PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
结果表明：只有以耐草铵膦转基因玉米BrmB01 CGMCC No.22650的基因组DNA为模板时能扩增到大小为259bp的目标DNA条带，而其它样品中均未能扩增到相应的目标条带(图6)。将259bp的目标DNA条带回收测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
四、3’端转化体的灵敏度检测
将玉米综31的基因组DNA和转基因玉米BrmB01基因组DNA按质量百分比进行混合，配置成转基因玉米BrmB01 DNA含量依次为10％、8％、4％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.05％、0.03％和0％的DNA溶液。以不同浓度的DNA溶液为模板，利用特异性检测引物3’-TYF1/3’-TYR1进行PCR扩增，1.0％的琼脂糖凝胶电泳分析灵敏度。
结果表明：引物3’-TYF1/3’-TYR1在转基因BrmB01的DNA的浓度稀释到0.1％时，仍能扩增到259bp的特异性片段(图7)。由此说明，3’端转化体的检测灵敏度可以达到0.1％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备与检测方法及其应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3034
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctctagctga ttctcctcct tctcgtcctt tcgacgtgag tatcggcctg acatagccaa 60
actggccacc actcagccgc aactcgttcc cctccgcgac cgcgtgagta atgcacgtcg 120
acaggcgggc ccccgatcca ttctcaccac cgtgcaggcg cgttgggtca gtccctagca 180
ggtggacccc actgtcgggc acatctccaa gcttcggatt tctttgcgtg gagcgcgctg 240
cgcataacaa aattcagtta cgaagatttg ctcgggcttg tttgctcttg ccataaaacc 300
ggaacccccg tgctctcctc gagttaccgc agaaactaac gccgagacat agcaaagaga 360
gaatttgggg ccgccatgcg agtcaaaggc gccaccatag gtcttcatct ttggcgtcgt 420
ccagagttcg ggattgggcc aggagggtgc gcactacctt gagggacatg ctctggtggg 480
ttatcgtgcg cgggaagcca tgggtcacag acaatttgtc aaacactgat agtttaaact 540
gaaggcggga aacgacaatc tgatccaagc tcaagctgct ctagcattcg ccattcaggc 600
tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 660
aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 720
gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg catgcctgca ggtcgactct agaggatccc 780
cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 840
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 900
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 960
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 1020
ttggctagag cagcttgcca acatggtgga gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat 1080
caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc 1140
gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcaaaa ggacagtaga 1200
aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga 1260
tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa 1320
agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgaacatg gtggagcacg 1380
acactctcgt ctactccaag aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg 1440
agacttttca acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 1500
gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg 1560
ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 1620
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 1680
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 1740
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt 1800
ctctctctac aaatctatct ctctcgagtc taccatgagc ccagaacgac gcccggccga 1860
catccgccgt gccaccgagg cggacatgcc ggcggtctgc accatcgtca accactacat 1920
cgagacaagc acggtcaact tccgtaccga gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga 1980
cctcgtccgt ctgcgggagc gctatccctg gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc 2040
cggcatcgcc tacgcgggcc cctggaaggc acgcaacgcc tacgactgga cggccgagtc 2100
gaccgtgtac gtctcccccc gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc tctacaccca 2160
cctgctgaag tccctggagg cacagggctt caagagcgtg gtcgctgtca tcgggctgcc 2220
caacgacccg agcgtgcgca tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg 2280
ggcggccggc ttcaagcacg ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc tggacttcag 2340
cctgccggta ccgccccgtc cggtcctgcc cgtcaccgag atttgactcg agtttctcca 2400
taataatgtg tgagtagttc ccagataagg gaattagggt tcctataggg tttcgctcat 2460
gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat 2520
aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca gtactaaaat ccagatcccc cgaattaatt 2580
cggcgttaat tcagtacatt aaaaacgtcc gcaatgtgtt attaagttgt ctaagcgtca 2640
atttgtttac accacaatac atcactaact acatcaccgg taataactcc tccttgttgt 2700
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tacgaatcga tctccgtcat ttagaatcca gaccgtagat cactgatccg aggtccagga 3000
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<211> 26
<212> DNA
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<400> 2
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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<210> 4
<211> 1417
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ctctagctga ttctcctcct tctcgtcctt tcgacgtgag tatcggcctg acatagccaa 60
actggccacc actcagccgc aactcgttcc cctccgcgac cgcgtgagta atgcacgtcg 120
acaggcgggc ccccgatcca ttctcaccac cgtgcaggcg cgttgggtca gtccctagca 180
ggtggacccc actgtcgggc acatctccaa gcttcggatt tctttgcgtg gagcgcgctg 240
cgcataacaa aattcagtta cgaagatttg ctcgggcttg tttgctcttg ccataaaacc 300
ggaacccccg tgctctcctc gagttaccgc agaaactaac gccgagacat agcaaagaga 360
gaatttgggg ccgccatgcg agtcaaaggc gccaccatag gtcttcatct ttggcgtcgt 420
ccagagttcg ggattgggcc aggagggtgc gcactacctt gagggacatg ctctggtggg 480
ttatcgtgcg cgggaagcca tgggtcacag acaatttgtc aaacactgat agtttaaact 540
gaaggcggga aacgacaatc tgatccaagc tcaagctgct ctagcattcg ccattcaggc 600
tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 660
aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 720
gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg catgcctgca ggtcgactct agaggatccc 780
cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 840
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 900
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 960
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 1020
ttggctagag cagcttgcca acatggtgga gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat 1080
caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc 1140
gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcaaaa ggacagtaga 1200
aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga 1260
tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa 1320
agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgaacatg gtggagcacg 1380
acactctcgt ctactccaag aatatcaaag atacagt 1417
<210> 5
<211> 854
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cacagggctt caagagcgtg gtcgctgtca tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca 60
tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg 120
ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc tggacttcag cctgccggta ccgccccgtc 180
cggtcctgcc cgtcaccgag atttgactcg agtttctcca taataatgtg tgagtagttc 240
ccagataagg gaattagggt tcctataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac 300
ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa 360
ccaaaatcca gtactaaaat ccagatcccc cgaattaatt cggcgttaat tcagtacatt 420
aaaaacgtcc gcaatgtgtt attaagttgt ctaagcgtca atttgtttac accacaatac 480
atcactaact acatcaccgg taataactcc tccttgttgt tcgccttgtc atacgcttca 540
tttatgaagc accgatcggg agatgtctag cgcaccggaa caaccagaga gctctgctcc 600
ggcgatgtgc catcacactg gccactaacg ctgtcatgtg ccgtcggcgg aggtgagtga 660
caagtcattg gccgttgatt agccaatcga cggtcttgat taaatctagt gtaccgtttc 720
gattggatgt gcctcggccg tcgatcttgg atcggctgga tacgaatcga tctccgtcat 780
ttagaatcca gaccgtagat cactgatccg aggtccagga atcattaatt cgagaagtcc 840
taatctgggt tgtt 854
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agtcaaaggc gccaccatag gtc 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ctgaatggcg aatgctagag cagct 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cagtactaaa atccagatcc cccga 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tagtggccag tgtgatggca cat 23
<210> 10
<211> 218
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
agtcaaaggc gccaccatag gtcttcatct ttggcgtcgt ccagagttcg ggattgggcc 60
aggagggtgc gcactacctt gagggacatg ctctggtggg ttatcgtgcg cgggaagcca 120
tgggtcacag acaatttgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc 180
tgatccaagc tcaagctgct ctagcattcg ccattcag 218
<210> 11
<211> 259
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cagtactaaa atccagatcc cccgaattaa ttcggcgtta attcagtaca ttaaaaacgt 60
ccgcaatgtg ttattaagtt gtctaagcgt caatttgttt acaccacaat acatcactaa 120
ctacatcacc ggtaataact cctccttgtt gttcgccttg tcatacgctt catttatgaa 180
gcaccgatcg ggagatgtct agcgcaccgg aacaaccaga gagctctgct ccggcgatgt 240
gccatcacac tggccacta 259
<210> 12
<211> 583
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gaagtccagc tgccagaaac ccacgtcatg ccagttcccg tgcttgaagc cggccgcccg 60
cagcatgccg cggggggcat atccgagcgc ctcgtgcatg cgcacgctcg ggtcgttggg 120
cagcccgatg acagcgacca cgctcttgaa gccctgtgcc tccagggact tcagcaggtg 180
ggtgtagagc gtggagccca gtcccgtccg ctggtggcgg ggggagacgt acacggtcga 240
ctcggccgtc cagtcgtagg cgttgcgtgc cttccagggg cccgcgtagg cgatgccggc 300
gacctcgccg tccacctcgg cgacgagcca gggatagcgc tcccgcagac ggacgaggtc 360
gtccgtccac tcctgcggtt cctgcggctc ggtacggaag ttgaccgtgc ttgtctcgat 420
gtagtggttg acgatggtgc agaccgccgg catgtccgcc tcggtggcac ggcggatgtc 480
ggccgggcgt cgttctgggc tcatggtaga ctcgagagag atagatttgt agagagagac 540
tggtgatttc agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc ctt 583

Claims (10)

1.一种耐草铵膦转基因玉米的培育方法，包括如下步骤：将外源DNA分子插入目的玉米基因组中，得到耐草铵膦转基因玉米；
所述外源DNA分子为含有草丁膦乙酰CoA转移酶编码基因的DNA分子；
所述外源DNA分子在所述耐草铵膦转基因玉米中的上游侧翼序列为上游插入位点起向其上游方向延伸得到的任意一个DNA片段；
所述外源DNA分子在所述耐草铵膦转基因玉米中的下游侧翼序列为下游插入位点起向其下游方向延伸得到的任意一个DNA片段；
所述上游插入位点为玉米基因组中含有的SEQ ID No.1第1-516位所示的DNA分子中的最后一个核苷酸对应的位点；
所述下游插入位点为玉米基因组中含有的SEQ ID No.1第2664-3034位所示的DNA分子中的第一个核苷酸对应的位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述耐草铵膦转基因玉米含有特异DNA片段；
或，所述特异DNA片段含有SEQ ID No.2所示的DNA分子和/或SEQ ID No.3所示的DNA分子；
或，所述特异DNA片段含有SEQ ID No.4所示的DNA分子和/或SEQ ID No.5所示的DNA分子；
或，所述特异DNA片段依次由所述上游侧翼序列、所述外源DNA分子和所述下游侧翼序列组成；
或，所述外源DNA分子如SEQ ID No.1第517-2663位所示；
或，所述上游侧翼序列如SEQ ID No.1第1-516位所示；
或，所述下游侧翼序列如SEQ ID No.1第2664-3034位所示；
或，所述特异DNA片段如SEQ ID No.1所示；
或，所述耐草铵膦转基因玉米为转基因玉米事件BrmB01 CGMCC No.22650。
3.一种耐草铵膦转基因玉米的培育方法，包括如下步骤：以按照权利要求1或2所述方法培育的耐草铵膦转基因玉米或其后代为亲本材料与其它不具有草铵膦耐受性的玉米品种进行杂交，得到耐草铵膦转基因玉米；所述耐草铵膦转基因玉米含有权利要求2中所述的特异DNA片段。
4.如下1)-4)任一所述的生物材料：
1)权利要求1或2中所述的上游侧翼序列；
2)权利要求1或2中所述的下游侧翼序列；
3)权利要求1或2中所述的外源DNA分子；
4)权利要求1或2中所述的特异DNA片段。
5.权利要求4所述的生物材料在如下a1)或a2)任一种中的应用：
a1)培育权利要求1-3中任一所述的耐草铵膦转基因玉米；
a2)检测或辅助检测植物样品是否来源于权利要求1-3中任一所述的耐草铵膦转基因玉米或其后代。
6.用于检测或辅助检测植物样品是否来源于权利要求1-3中任一所述的耐草铵膦转基因玉米或其后代的方法，包括如下步骤：检测所述植物样品的基因组DNA中是否含有权利要求2中所述的特异DNA片段，若含有所述特异DNA片段，则所述植物样品来源于所述耐草铵膦转基因玉米或其后代。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：检测所述植物样品的基因组DNA中是否含有权利要求2中所述的特异DNA片段的方法为如下b1)或b2)或b3)：
b1)直接测序所述植物样品的基因组DNA，根据测序结果判断所述植物样品中是否含有所述特异DNA片段；
b2)采用引物对1和/或引物对2对所述植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，若有目的扩增产物，则所述植物样品含有所述特异DNA片段；
所述引物对1为扩增产物含有DNA片段甲的引物对；所述DNA片段甲如SEQ ID No.2；
所述引物对2为扩增产物含有DNA片段乙的引物对；所述DNA片段乙如SEQ ID No.3；
b3)用能特异结合所述特异DNA片段的探针对所述植物样品的基因组DNA进行Southern杂交，若能杂交得到杂交片段，则所述植物样品含有所述特异DNA片段。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
b2)中，所述引物对1由SEQ ID No.6所示的单链DNA分子和SEQ ID No.7所示的单链DNA分子组成；所述引物对2由SEQ ID No.8所示的单链DNA分子和SEQ ID No.9所示的单链DNA分子组成；
b3)中，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.12。
9.用于检测或辅助检测植物样品是否来源于权利要求1-3任一所述方法制备的耐草铵膦转基因玉米或其后代的试剂盒，其包括权利要求7或8中所述的引物对1和/或权利要求7或8中所述的引物对2和/或权利要求7或8中所述的探针。
10.权利要求1-3任一所述的方法或按照权利要求1-3任一所述方法制备的耐草铵膦转基因玉米或其后代或权利要求4所述的生物材料或权利要求6-8任一所述的方法或权利要求9所述的试剂盒在玉米育种或加工品生产中的应用。
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