CN1944677A - 一种利用scar标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，该方法以春大白菜新品种“冠春”及其亲本的基因组DNA为模板，通过RAPD分析，建立了杂交种“冠春”杂交种及其亲本的RAPD特异指纹图谱，成功地获得了一个母本特异性SCAR标记和一个杂种特异性SCAR标记，应用这2个SCAR标记，根据品种指纹图谱和特异标记可以进行“冠春”杂交种的品种鉴定和种子纯度检验。通过134个冠春随机群体的鉴定，鉴定结果与田间鉴定相一致。
Description
技术领域
本发明属于农业的蔬菜品种鉴定与良种领域，涉及白菜的品种鉴定和种子纯度检验方法，特别是一种利用SCAR标记进行“冠春”大白菜的品种鉴定和种子纯度检验方法。
背景技术
对杂种种子遗传学纯度的检验，越来越引起种子生产单位的特别重视。虽然田间形态学鉴定结果可靠，实施简单，但检测周期长，耗时费工，难以满足当年收获，当年用种的要求。同功酶和蛋白质电泳技术已经在一些十字花科蔬菜作物品种及杂种纯度检验中得到了应用，但是由于其存在组织特异性，在不同器官、不同生长时期带型差异不稳定等因素，及其多态性不丰富，谱带较少，差异有限等缺陷，难以满足越来越多的品种检测要求。
分子标记是近年来研究的热门领域，它以DNA为研究对象，具有以下优越性：(1)直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；(2)数量极多，遍及整个基因组，可检测到的基因座位几乎是无限的；(3)多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；(4)表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；(5)有许多分子标记表现为共显性(codominance)，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息，因而现已形成许多分子标记系统。
PCR技术是近年来发展起来的DNA分子标记之一，与RFLP相比，RAPD标记具有以下特点：(1)RAPD的引物具有通用性，同一套引物可适用于不同生物基因组的分析。相反RFLP标记具有种族特异性，只在一定的种属范围内可相互使用；(2)RAPD技术简单成熟，可程序化作业，特别适于大批量检测；(3)由于引物的随机性，RAPD标记几乎可覆盖整个基因组；(4)RAPD标记一般表现为显性遗传，不能区分杂合型和纯合型；(5)RAPD标记一般可以同时检测多个位点，很适于快速构建遗传图谱和不同材料多态性筛选；(6)RAPD分析不使用同位素，因而比较安全，也不受特殊地区规定限制；(7)RAPD技术DNA用量少，不受植株生长条件、时期的限制。所以，RAPD分析非常适于大规模样品的植物育种、种群遗传学和生物多样性等众多研究领域。
SCAR标记，即序列特异扩增带，是基于RAPD发展起来的一类标记，在对多态性RAPD产物测序的基础上，设计一对新的引物，特异地扩增一个在遗传上定义为一个位点的DNA区段。在对多态性RAPD产物测序的基础上，设计一对新的引物，特异地扩增一个在特定位点的DNA片段，一般在原RAPD引物的3’与5’端延长14个碱基，利用两端各24个碱基的引物进行特异扩增，因此，该方法与RAPD相比具有如下优点：由于使用较长的引物和高退火温度，因此具有重复性和稳定性好，带型简单等优点，因此，SCAR标记成为分子育种、品种鉴定和种子纯度检验的首选标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，该方法以“冠春”父母本及F1代种子为研究材料，首先进行PCR反应体系优化，筛选特异性引物，进一步对特异片段克隆测序，转化为SCAR标记，应用于“冠春”大白菜品种鉴定和种子纯度检验，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)材料的准备：
以春大白菜新品种“冠春”及其亲本种子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期单株编号，随机选取100-200株，于苗期取幼嫩叶片提取DNA备用，成株期根据品种特性鉴定生物学性状；
2)DNA提取：
采用CTAB法，其过程为，取0.2g幼嫩叶片，液氮下研磨成粉末；加入750μL CTAB提取液后转入至1.5mL离心管中；然后65℃水浴30min，其间振荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各抽提一次，于常温下在12000r/min条件下离心2次，每次10min；取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4℃条件下离心15min；离心转速为12000r/min，离心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入DNA贮存液，经DNA纯度检测证实纯化度，存于-20℃冰箱中备用；
3)SCAR引物设计：
母本特异性引物SC134-1200
fS134M：TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC
rS134M：TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG
杂种特异性引物SC266-260
fS266F：AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAG
fS266F：AGGCCCGATGATGATAAATCATTG
4)SCAR-PCR扩增：
采用25μL的PCR反应体系，其中包括1×缓冲液，2.0mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs，0.3μmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30～50ng模板DNA；反应程序：SCAR扩增程序为，94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min；
扩增产物在含5μg/mLEB的1.5％琼脂糖胶，120V下电泳1.0h，电泳后在紫外灯下观察并照相；
5)SCAR标记的特征：
A、SC134-1200标记：
用SC134-1200的SCAR引物对“冠春”群体鉴定，在母本和杂交种中可以扩增出S134-1200的特异条带，而父本及其自交苗中不能扩出S134-1200的特异条带，因此利用该比较可以正确的鉴定“冠春”反交种子；鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率；
B、SC266-260标记：
用SC266-260的SCAR引物对“冠春”群体鉴定，母本、父本均没有扩增带，只有真杂种有扩增带，没有扩增带的可能是假杂种；利用该比较可以正确的鉴定“冠春”正交、反交单收以及混收种子；鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率。
本发明的方法通过134个冠春随机群体的鉴定，鉴定结果与田间鉴定相一致。
附图说明
图1是引物S47对“冠春”及其亲本的扩增结果，其中，M.DL2000Marker；1、母本，2、父本，3～15、杂交种；
图2是引物S134对“冠春”杂交种及其亲本的扩增结果，其中，M.DL2000Marker；1、母本，2、父本，3～18、杂交种；
图3是引物S4对“冠春”杂交种及其亲本的扩增结果，其中，M.DL2000Marker；1、母本，2、父本，3～18、杂交种；
图4是引物S73对“冠春”杂交种及其亲本的扩增图谱，其中，M.DL2000Marker；1.母本；2.父本；3～18.杂交种；
图5是引物S494对“冠春”杂交种及其亲本的扩增图谱，其中，M.DL2000Marker；1.母本；2.父本；3～19.杂交种
图6是引物S266对“冠春”杂交种及其亲本的扩增图谱，其中，M.DL2000Marker；1.母本；2.父本；3～19.杂交种；
图7SCl34-1200引物对“冠春”群体扩增的结果，其中，M.DL2000Marker；1.母本；2.父本；3～17.杂交种；
图8SC266-260引物对“冠春”群体扩增的结果，其中，M.DL2000Marker；1～2.母本；3～4.父本；5～20.杂交种；
以下结合附图和发明人进行“冠春”大白菜的品种鉴定和种子纯度检验对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本发明的具体实施按以下步骤进行：
1、材料的准备：
以春大白菜新品种“冠春”及其亲本种子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期单株编号，随机选取100-200株，于苗期取幼嫩叶片提取DNA备用。成株期根据品种特性鉴定生物学性状。
2、DNA提取
采用CTAB法，过程为，取0.2g幼嫩真叶，液氮研磨成粉末；加入750μLCTAB提取液后转入至1.5mL离心管中；然后65℃水浴30min，其间振荡混匀几次；分别用等体积的(Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)和等体积的(氯仿∶异戊醇＝24∶1)各抽提一次于12000r/min离心10min(2次，常温)。取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，于12000r/min离心15min(4℃)。用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入DNA贮存液(70％体积分数的乙醇，其中加入0.3moL/L NaAc溶液)后，经DNA纯度检测，证实纯化较好。存于-20℃冰箱中备用。
3、RAPD扩增
PCR采用25μL的反应体系，其中包括1×缓冲液，2.0mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs，0.3μmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30～50ng模板DNA。反应条件：预变性94℃/4min、94℃/60s、36℃/60s、72℃/90s，45个循环，72℃延伸10min。最后RAPD扩增产物在含5μg/mLEB的1.5％琼脂糖胶，120V下电泳1.0h，电泳后在紫外灯下观察并照相。
4、特异性引物的筛选
随机抽取父本、母本及杂交种各10株，分别建立混合池，进行RAPD引物筛选。在320条引物中有208条引物可扩增出稳定而清晰的条带，不同引物扩增的RAPD条带数目为0～11不等，RAPD片段大小在0.4kb～3.0kb之间，其中在亲本和杂交种中表现扩增多态性的引物有96个，占总引物的30％。经4次以上重复筛选，有6个引物能稳定扩增出特异条带，分别是S4、S47、S73、S134、S266、S494。
5、特异性引物对冠春群体的鉴定
1)S47及S134对“冠春”群体的鉴定
用引物S47对134个“冠春”杂交种单株DNA进行RAPD扩增，在母本及132个单株中都扩出S47-700的特征带，其中2个单株“13”(附图1)和“56”(未显示)及父本没有扩增出S47-700特征带，且其扩增谱带与父本带型相似，可以认为单株“13”和“56”可能是父本自交苗，检测杂交率为98.5％。
用引物S134进行相同的扩增时，表现一致的结果。母本及132个单株都扩出S134-1200的特征带，其中2个单株“17”(附图2，与附图1的“13”为同一单株)和“56”(未显示)未扩出S134-1200的特征带，而且单株“17”和“56”与父本的扩增带型相似，再次验证了这2个单株可能是父本自交苗，检测杂交率也为98.5％。
由此看出，利用引物S47及S134扩增出的母本特征谱带，均可以将混杂的父本种子检出，但无法区分母本与杂交种，因此对于鉴定反交种子是有效的。
2)引物S4对“冠春”群体的鉴定
用引物S4对134个“冠春”杂交种单株DNA进行RAPD扩增，结果表明，父本及130个单株都扩出S4-370特征带，其中4个单株“17”(附图3)、“20”、“66”和“78”(未显示)均未扩出此特征带，扩增出的带型与母本带型相似，说明这4株可能是母本自交苗，在用S47、S134时没有被发现。而前面发现的父本自交株“13”(附图1)没有表现出特异性，表明引物S4是父本特异性扩增引物，可以将母本与杂交种区分，其检测杂交率为97％。但无法将父本与杂交种区分，因此对于正交种子的鉴定是有效的，如果与母本特异性扩增引物联合使用，则可以同时鉴定出父本自交株和母本自交株。
3)引物S73及S494对“冠春”群体的鉴定
对134个冠春杂交种单株DNA用引物S73进行扩增，有128个单株同时扩增出与父本和母本条带，即父本的特征带S73-730和母本的特征带S73-660(附图4，部分图片)，有4株(附图4的“17”和“20”、“66”和“78”(未显示))扩增带型与母本带型相似；有2株(即附图1的“13”，“56”)扩增带型与父本带型相似，再次验证了在所选的134个单株中，可能有4株母本自交苗，2株父本自交苗(未显示)，其检测杂交率为95.5％。
在附图4中，单株“17”(即附图1中的“13”，附图2中的“17”)的扩增带型都与父本带型相似，没有扩出母本特征带S73-660，与引物S47及S134检验结果一致，再次提供了该单株可能为父本自交苗的证据；用引物S73对附图3中的单株“17”进行扩增，结果母本带型相似，再次验证该单株可能为母本自交苗(图片未显示)。
4)引物S266对“冠春”群体的鉴定
对134个冠春杂交种单株DNA用引物S266进行扩增，有128个单株扩增出不同于父本和母本条带，即特征带S266-260(附图6，部分图片)，有4株(附图4的“17”和“20”、“66”和“78”(未显示))扩增带型与母本带型相似；有2株(即附图1的“13”，“56”)扩增带型与父本带型相似，再次验证了在所选的134个单株中，可能有4株母本自交苗，2株父本自交苗(未显示)，其中附图6中的单株“14、15”为人为混杂的其它白菜种子，其检测杂交率为95.5％。
6、特异条带的测序及SCAR引物设计
将所需条带在紫外灯下挖出，放入1.5mL管中，用琼脂糖回收试剂盒回收片段，参照《分子克隆实验指南》中的方法进行重组质粒的转化与筛选。用PCR进行检测。目的片断委托博雅公司测序并提供结果。根据序列结果设计了8对SCAR引物并合成。结果如下：
1)随机引物S4：GGACTGGAGT
测序时标记名称：S4-414F，实测长度：383bp
GGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAACAAAAACTTGGTTTAGTGCTATTTTGGTCTTTTTCTCTTATT
TAAACTCAAGCTTGTACTCTTCATTCTTCTATGGCAAAGATTATATTTTCAAACTGAATTTTTTA
TATACATAGCCAAAAAAAATATGTTTAATAGTCCGTCCGTAGAGATTCAGATTAATCCATATACC
TAATCTGCATTGTTCTAAGCTCATGAGATATCTCAAGCACCAACCCTTGCATAATATTTTCAACT
ACATCAGAGACTACACCTTCAGATTCTCCACCACAATCCAACCAAAGACATGGCTTCATCAGATC
AACCTCGACGACCTGATCCAATGTCCTTGGAGAGT
CACAGCAGAGTAAACTCCAGTCC
SCAR引物：
fS4F：GGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAAC
rS4F：GGACTGGAGTTTACTCTGCTGTG
2)随机引物S47：TTGGCACGGG
测序时标记名称：S47-700M，实测长度：666bp
TTGGCACGGGATGTTGAGGTTGGTAAGCATCTATACCTAGCTCAGCCATTAGAGTTAGAGTCCAT
TCACGGCTAACTTACCACCAACGAAGAATTCCTCGCATAAAATGATTCTTACATTCTATAGATAC
TGTAAAAGCCAACTCATGTTTCTGCGAAAATAAATAAGAAAGCTCATTTTTTTCTTTTATTATGC
TAGCCTTTCTAAATATCCTTCTCTTGTTGATGAAGCGCCCCCTTATGGAGTTGAGCCTGACTTGG
GCAGCCGCTTTCATTGTTGTGCCATTATATTCTTTTTTCATGTCTTTTATGGATGGCTGTTCTCA
TTCCGTCGGAGGCGATGGAAGCGGTGCCAGCTCTTCGAAGCGACCGCGTCTCGACCTGCCCAGAA
CAACAGGAATAGTTTAATCTAAAAAAAAAATATGAAGAAGTAAGAAAGATCAAAATGGAGTTAGC
CGAACTGATTGGCTCCCTAATTGACCAAGCGAAAGAGGGGCTGCAATTTTCCGCCCATAAGGGGA
GTGCCTTCGCCACCGGTAATGTGTGGAAGAGCTAATAAACCGAATTGGGAACAATGAGAAGGCCA
GACCAGAAGGGAAAACGACCCCAATGGGGAGATTACCGATTTTATAAATAAAAAGAA
GTTCTTAA
AGCGGGCCCGTGCCAA
SCAR引物：
fs47-700m：TTGGCACGGGATGTTGAGGTTG
rs47-700m：TTGGCACGGGCCCGCTTTAAGAAC
3)随机引物S134：TGCTGCAGGT
测序时标记名称：S134-1200M，实测长度：1091bp
TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCAATATTTGACAATATATTGATCAGTGATGACCCGG
AATATGCAAGGAGCATGGTGGATGACTATTTTGCTCAGCACAGAGAGGTAGGCTTC
TCCATGCCTTTGGGATACCTTCTTTTTGCTTCTTTTTAGACAAAGTTAAATGAGTTTC
TGCATGATTTTATTATAGAAAATGTCTTATTAGTAATCTGATGTGCTTATATATACTCTT
CTGACCAGTCTGAGAAGGAGTTATTTGCGGAAGCTGAGAAAGAAAAAAAAGCTAG
AGAAGATGAGGTTTGTAGTTTTCAAAACAAGTCCTTACTTGCTTTTAAAATCTTCTC
TGTTTATCTTAATCATGATCTCATACAATTTGACGATTGCAGGAAGCTAGGATAGCAA
GAGAAGAAGGGGAACGTAGACGAAAAGAGAGGGGTGACCGGTATGGACACAGGG
ACAGGAGGCATCGTTACAAACGGGTACATACTCAATGAGACCAACTCAGTTCTACA
GTTTTCTTTCTCCTTCTCAACACTGTTAGTTCTGGAATATAAGTGAGTGACTAAGTAT
AAACGTTTTGTTTTGCAGCACCACCGACGTGGTTACATGGACGATTACCATGTAAGT
AAACTAAGTGGTTTTCTATTCAACCACTTTTAAATGCTTTATGCGTTTTAGTACTGAA
TCATCTTAACCGTTTTCGTGTAGGATGAGCTATAAGGCGCAGTGGTGGCCTGGTGG
GGGATTTGGCAATGACAACCAATAAAAGCAAGTATTCATTAAAGTCATCATACCTAG
AGAGCTGGAAACTATATGGTTGGTTTTTGTAGTTTGTATGATTGTAATATGTATCATAT
CACTTCTTTTTTTTTTTTGTCATCTGAAGTTTCATATATCACAAAGGTTAACATTGCA
AACACCTCCTTTACACGGAZCCAACACAAAAAGCAATTCTAAACCAAGGACAAAC
TAACACTCCAAAGTCTTTAGTGTACCAAAAAATTTTCGAAGGAGACAACTTCAAGT
CAAAGAGAGGCCAAACGTTTCTCATTTTCAAAGACGTCCTG
CAACCAAAAAGGATA
ACCTGCAGCA
SCAR引物：TGCTGCAGGT
fS134M：TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC
rS134M：TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG
4)随机引物S73：AAGCCTCGTC
测序时标记名称：S73-671M，实测长度：660bp
AAGCCTCGTCTGTGGTAAGAAATTAACCATCATGTTATCTTTGTCCTTGTGTTTTGGTCTCTGGG
TCCTAAGATTTACTCAATCATGTCTGACGTTCTCAGGATCTTAGCAAGAAGCAGTTTAAGAAGTC
TATGACCAAGAAATCACATTCATGGTGGTGGGACAGTCACAATTGTCCCAAGAACTCGAAGTGGC
TTGCTCAGAATCTGGAGAGTATGTTGCCTCACTTATCATTGAGATACCTATCTCCACTTAAATGT
AGATCTTGAACTTGTTCTTATTATGGCTTCTCAGAGATGGATGACCGTGTGAAACACATGTTAAA
GTTGATTGAAGAAGACGCAGACTCTTTTGCCAAGAAAGCTCAGATGTATTACCAGAAGCGTCCCG
AGTTAATCCACCTTGTGGAGGAGTTTTACCGCATGTATCGCGCTTTGGCTGAGCGTTATGATCAA
GCTAGTGGTGAACTTCAGAAAATTCATCTCTCTGGGATACAGTCACAGGGCTCTCTTGAGAAATC
ATCTCCTACTAATTCCCAAGAGAAATCGAGTCACCCTCATAAGGAAGAGGAAGACTCATCATCTC
TGTCTGATTCTGATTCTGACTCTAAATCGGTTCCTGATCATTCCTCTGTTAATGAT
GAAGATGGT
GACGAGGCTT
SCAR引物：
fs73F：AAGCCTCGTCTGTGGTAAG
rs73F：AAGCCTCGTCACCATCTTC
5)随机引物S73：AAGCCTCGTC
测序时标记名称：S73-750F，实测长度：728bp
AAGCCTCGTCTGATGTAAAACACACCGCTTGTGCTGTTTTTTGAAAGAAGCAGTGTCCATTTTCT
TCCTTTCTCGTTGACTAGATCTATCTCACAGGGCTTGTTGTGCTCATTAAACGACACAACCGTAA
AGTCTTTAGAAAGATCCTGGAAAAAAAACAAAGAAATAATACATCACTCACAGTATCATACACTT
GACTACTTACAAAAGGTAAACGAGGAGTGTAGTAATTAGTTACCAAACGATCTTTGATGGGGCTA
TAAGGTGTGACACGTGCTCTGAGGATACAAGAGAAACCTGCTTTTGTGCTCTTGTTCACCAAAAT
GTTCCCTGAATCACAACAATCTTCATTTACATTTTACTACCAAACCAAAAACTCAAAACATATAC
CACTTATGTCGTTTCAAGAAACGAAAACACCTTACCTGCGTCATCCTCTCCTCCATCGTCATCAT
CATCATATTCGTCTTCTCCATCCTCAGATTCAGAATAGTCATCATCAGTCTCAACATCGTCAGTA
TCAACCAAGCTAGGAGACGCGTGGTGACTTATGTCACAAGAATCCGACCGAGGGGACACAGATAC
ATGAAAGATCTCGTCTCCATCGTGTCTGAAAACCAAGAGGTCTCCGTCTCTGAAACTATGAGCTT
TGGCGAACTCTTCCCAGCCGCCGCCGGCGAGCCTGCTTCCCTCTAGTTTCACTTTC
CAAATCTTG
TCCGACGAGGCTT
SCAR引物：
fS73-750F：AAGCCTCGTCTGATGTAAAACAC
rS73-750F：AAGCCTCGTCGGACAAGATTTG
6)随机引物S494：GGACGCTTCA
测序时标记名称：S494-399M，实测长度：376bp
GGACGCTTCAATAATATTGAAATATATTTTTTAAAAAAATATAATAATTGGAATATTGCGTAATT
AAGTTTACGTTTTTGGGAATTTCACATATTAAATAATTAATTACATATTTTGAGGTAAATATTCA
AGAGACTGTGATTTTCATTAATCAATCATTAGAAGAGAATAAAAGCATTAAAAAAATCTTCAGTT
TATTTTAAAAGAAACAGTTGTGACAAATGTTTTTATCAGACAAGACAACAACAAATAATTAAAAA
GACAGTGTCCACCGCCAAAAGAAACTCAACTCTAAAGCTTAAATATGAAGAGAATCAAGTCAAAG
CCGGAGTCTCTGCAAACATATTGGAACACTTT
GTCTGAACCTGAAGCGTCC
SCAR引物：
fS494M：GGACGCTTCAATAATATTG
rS494M：GGACGCTTCAGGTTCAGAC
7)随机引物S494：GGACGCTTCA
测序时标记名称：S494-1770F，实测长度：1771bp
S494-1775F：(-47)
GGACGCTTCAGAAATATTTAATAAAATAAAAAAAAGACCACTAAAATCTTAAAGACTAAATAGTA
AAAAGATAAAGATACAAACGTGTGAAGCAAAACCCAAGCCGACACGTTCAATTCCATCGTTTTGA
TCCGGTTCCGGCAGGCACGAGCTTTAGGCCGGTTGGTTAAAACACGCGCTTTGGACCATTTAGGA
AACACAGTCAGGTTCTCGTGATTTCTTGCTTATAATGGGCCCCTCCCACCCATATGGTCAGCTAA
ACGAGTGAAATTCTAGGGCACACCTTTGATTATTTTTTTTAAATAATCAAAAAATTATTATTAGA
AACCGAAAATTATTATTTATTCCAAAGACATGAATTCCTACAAGTCCACAACTGTTGTTTATGGT
CAAATCATAAAGCAAAACTAATGTTTTCCAAATAGTTAATGGAAAAAAAGAAAAACAAAAGCAAA
TGCATCTTGCGTTGTTGGAATGCAAAAAGAGAGAAAACGATACGTACCTAATGTTAATTCTAATT
AGTTAGTTATAGAATGAGGAGGTACATTAAAAAGGAAAATTAGTATTAGTACTCAGTTAAGTATG
CACGTGTGTGGGAAGTATGGTGGCGAAACTATACAACCAACCCCTAGTAGATGGCTAGTTGTACA
TGTCTCGTGACGTATACATCATATATATAATAAATACGAACATAGAAATTAATAGGACTTAGTTG
TTGCGAATATACGTAAAATCAAATAAAACCAACCATTCAATGTTCTTGGTAAGTAACGAAATAAA
ACGGAAGCAAGAAGGAGAACCACATAAAAGGGAGCTAACTCCTGTACACGTTGTGCTTCATCTGC
CCGTCCGTCAAACTACCACACTCCCTTCTCTTTTCCCCTTTGTCATCTTGTATAATAATATCTCA
CTCTCCCATGCTTTCTAACAT
S494-1775F：(-48)
GGACGCTTCACGGAAGGGCGAAGGCCAAGGAGCTTGGTGAGCTGGTAGTCAGCACCAGGCATGTC
AACTCCAGAGGTGGTGCAGAAGACAACGTGTGTGACCTTGGACTTAGGCTGACCCCACTCCTTGA
TGGCCTTCACTGCTGCATCTTTGCCTAGCTTAGGGACTTCAACCACCACGAGGTCTTGTCTAGCG
TCGAGAGAAGGAGCCATGTAGGCGCACATGTTAGGGTTCTCTTTCAAGAACTCCTCGGTCAAGTG
CATGTGGCGTTTTCTTATGGTCGACTTATCGCCTATTAGAGTCATAATCAAGTTAACTATGTGAA
CATACTAATAAGTACAGTTTAAGGTAGAAGACTATTAAATTTTCGGTTTTATCTATTTAATACAT
TTTTTTTTGTTAGTTAATGAACTAAAAGATACGGATAAAACTGGTGAATTATTTAAATGTATTTT
GAAAATGTACAACAAATTTTAAAAACTAAAAATGATAAACGGATGAATTATATGCCAAAATTCTA
AATGGAAAAATACAAAGTAGGGTTTGTTAAGACATACACATGCGCTTGAACTTCTCCTTAAGGTC
GGTCTTGTGTTCACTGTTGGTGATGCGGAAGTAGTAGTCTGGATACTCAGCTTGGAGCACATGGT
TCGCAGGGTTGGCCGTACCTATCGCTAAGATGCCTGCAGGACCGTCTGCTCTCTGTGCCTTTCTG
ATCTCATCCAACGAAGAACGCCCCATCACCATATTAAACCAACTACGTTTTAACTAAGTGTGATC
GATGTGTTACTTTGCGTAATAAGCAAGTTATGTATGTATGTTTAGAAAGCATGCAGAGTA
SCAR引物：
fS494F：GGACGCTTCAGAAATATTTAATA
rS494F：GGACGCTTCACGGAAGGGCGAAG
8)随机引物S266：AGGCCCGATG
测序时标记名称：S266-260F，实测长度：294bp
AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGAAAATGGGTTTCGGCCGTTTTTAAAATAAAACATTGACGACA
AAAAAAAAAAAATAATTTGGCATCTCCCTCCATCTAAATCATGCATGACAAATGAATAAAAAGCT
TTTATTATCATATGACGTCTATACAATGCGTATAATATGTTTCCTTTACTTTATTTACTTGTCGT
CTTTATCTTATTATATTATATGCTACATTATAGTCATTGTTAAAGTCAGAGACTACAGGTATCAT
AAGGTTGCAA
CAATGATTTATCATCATCGGGCCT
SCAR引物：
fS266260F：AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAG
fS266260F：AGGCCCGATGATGATAAATCATTG
7、SCAR扩增与SCAR标记的验证
SCAR-PCR扩增：
采用25μL的PCR反应体系，其中包括1×缓冲液，2.0mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs，0.3μmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30ng～50ng模板DNA。反应程序：SCAR扩增程序为94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。扩增产物在含5μg/mLEB的1.5％琼脂糖胶，120V下电泳1.0h，电泳后在紫外灯下观察并照相。
将SCAR引物用于两亲本和F1的扩增，如果与RAPD扩增的目的片段大小位置相同则说明SCAR标记转化成功。在8对SCAR引物中，SC4-370、SC47-700、SC73-730和SC73-660、SC494-400和SC494-1770的引物在“冠春”杂交种群体及其亲本扩增时未表现出多态性，只有SC134-1200与SC266-260标记的2对引物对群体扩增的结果与RAPD的结果完全相符，说明SCAR标记转化成功。其引物如下：
母本特异性引物SC134-1200
fS134M：TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC
rS134M：TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG
杂种特异性引物SC266-260
fS266F：AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAG
fS266F：AGGCCCGATGATGATAAATCATTG
SCAR标记的特征：
A、SC134-1200标记：
用SC134-1200的SCAR引物对“冠春”群体鉴定，从附图7可以看出，在母本和杂交种中可以扩增出S134-1200的特异条带，而父本及其自交苗中不能扩出S134-1200的特异条带，因此利用该比较可以正确的鉴定“冠春”反交种子。鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率。
B、SC266-260标记：
用SC266-260的SCAR引物对“冠春”群体鉴定，在附图8中，可看出母本、父本均没有扩增带，只有真杂种有扩增带，没有扩增带的“10”和“15”等可能是假杂种。对134个“冠春”群体进行鉴定，发现有6株假杂种，与田间鉴定相一致。利用该比较可以正确的鉴定“冠春”正交、反交单收以及混收种子。鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率。8、SCAR标记对“冠春”群体的验证
用SCAR引物SC134-1200对“冠春”群体鉴定，其中父本未扩出S134-1200的特异条带，同样在杂交种中的“11”和“14”未扩出S134-1200的特异条带，而这2株也正是用RAPD引物鉴定出的两个父本自交苗，与RAPD扩增结果吻合。
用SCAR引物SC266-260对“冠春”群体鉴定，在母本、父本和杂种“10”和“15”均未扩出S266-260的特异条带，将此结果与RAPD扩增结果比较发现，“10”为母本自交苗，“15”为父本自交苗。
用SCAR引物S266-260和S134-1200对整个“冠春”群体进行鉴定与RAPD鉴定结果一致，与田间性状观察结果相吻合，即在对134个“冠春”群体进行鉴定，发现有2株父本自交苗，4株母本自交苗。
特异RAPD片断核酸序列及SCAR引物序列
1)随机引物S4：GGACTGGAGT
测序时标记名称：S4-414F，实测长度：383bp；
GGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAACAAAAACTTGGTTTAGTGCTATTTTGGTCTTTTTCTCTTATT
TAAACTCAAGCTTGTACTCTTCATTCTTCTATGGCAAAGATTATATTTTCAAACTGAATTTTTTA
TATACATAGCCAAAAAAAATATGTTTAATAGTCCGTCCGTAGAGATTCAGATTAATCCATATACC
TAATCTGCATTGTTCTAAGCTCATGAGATATCTCAAGCACCAACCCTTGCATAATATTTTCAACT
ACATCAGAGACTACACCTTCAGATTCTCCACCACAATCCAACCAAAGACATGGCTTCATCAGATC
AACCTCGACGACCTGATCCAATGTCCTTGGAGAGT
CACAGCAGAGTAAACTCCAGTCC
SCAR引物：
fS4F：GGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAAC
rS4F：GGACTGGAGTTTACTCTGCTGTG
2)随机引物S47：TTGGCACGGG
测序时标记名称：S47-700M，实测长度：666bp；
TTGGCACGGGATGTTGAGGTTGGTAAGCATCTATACCTAGCTCAGCCATTAGAGTTAGAGTCCAT
TCACGGCTAACTTACCACCAACGAAGAATTCCTCGCATAAAATGATTCTTACATTCTATAGATAC
TGTAAAAGCCAACTCATGTTTCTGCGAAAATAAATAAGAAAGCTCATTTTTTTCTTTTATTATGC
TAGCCTTTCTAAATATCCTTCTCTTGTTGATGAAGCGCCCCCTTATGGAGTTGAGCCTGACTTGG
GCAGCCGCTTTCATTGTTGTGCCATTATATTCTTTTTTCATGTCTTTTATGGATGGCTGTTCTCA
TTCCGTCGGAGGCGATGGAAGCGGTGCCAGCTCTTCGAAGCGACCGCGTCTCGACCTGCCCAGAA
CAACAGGAATAGTTTAATCTAAAAAAAAAATATGAAGAAGTAAGAAAGATCAAAATGGAGTTAGC
CGAACTGATTGGCTCCCTAATTGACCAAGCGAAAGAGGGGCTGCAATTTTCCGCCCATAAGGGGA
GTGCCTTCGCCACCGGTAATGTGTGGAAGAGCTAATAAACCGAATTGGGAACAATGAGAAGGCCA
GACCAGAAGGGAAAACGACCCCAATGGGGAGATTACCGATTTTATAAATAAAAAGAA
GTTCTTAA
AGCGGGCCCGTGCCAA
SCAR引物：
fs47-700m：TTGGCACGGGATGTTGAGGTTG
rs47-700m：TTGGCACGGGCCCGCTTTAAGAAC
3)随机引物S134：TGCTGCAGGT
测序时标记名称：S134-1200M，实测长度：1091bp；
TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCAATATTTGACAATATATTGATCAGTGATGACCCGGAATATGCA
AGGAGCATGGTGGATGACTATTTTGCTCAGCACAGAGAGGTAGGCTTCTCCATGCCTTTGGGATA
CCTTCTTTTTGCTTCTTTTTAGACAAAGTTAAATGAGTTTCTGCATGATTTTATTATAGAAAATG
TCTTATTAGTAATCTGATGTGCTTATATATACTCTTCTGACCAGTCTGAGAAGGAGTTATTTGCG
GAAGCTGAGAAAGAAAAAAAAGCTAGAGAAGATGAGGTTTGTAGTTTTCAAAACAAGTCCTTACT
TGCTTTTAAAATCTTCTCTGTTTATCTTAATCATGATCTCATACAATTTGACGATTGCAGGAAGC
TAGGATAGCAAGAGAAGAAGGGGAACGTAGACGAAAAGAGAGGGGTGACCGGTATGGACACAGGG
ACAGGAGGCATCGTTACAAACGGGTACATACTCAATGAGACCAACTCAGTTCTACAGTTTTCTTT
CTCCTTCTCAACACTGTTAGTTCTGGAATATAAGTGAGTGACTAAGTATAAACGTTTTGTTTTGC
AGCACCACCGACGTGGTTACATGGACGATTACCATGTAAGTAAACTAAGTGGTTTTCTATTCAAC
CACTTTTAAATGCTTTATGCGTTTTAGTACTGAATCATCTTAACCGTTTTCGTGTAGGATGAGCT
ATAAGGCGCAGTGGTGGCCTGGTGGGGGATTTGGCAATGACAACCAATAAAAGCAAGTATTCATT
AAAGTCATCATACCTAGAGAGCTGGAAACTATATGGTTGGTTTTTGTAGTTTGTATGATTGTAAT
ATGTATCATATCACTTCTTTTTTTTTTTTGTCATCTGAAGTTTCATATATCACAAAGGTTAACAT
TGCAAACACCTCCTTTACACGGATCCAACACAAAAAGCAATTCTAAACCAAGGACAAACTAACAC
TCCAAAGTCTTTAGTGTACCAAAAAATTTTCGAAGGAGACAACTTCAAGTCAAAGAGAGGCCAAA
CGTTTCTCATTTTCAAAGACGTCCTGCAACCAAAAAGGATAACCTGCAGCA
SCAR引物：TGCTGCAGGT
fS134M：TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC
rS134M：TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG
4)随机引物S73：AAGCCTCGTC
测序时标记名称：S73-671M，实测长度：660bp；
AAGCCTCGTCTGTGGTAAGAAATTAACCATCATGTTATCTTTGTCCTTGTGTTTTGGTCTCTGGG
TCCTAAGATTTACTCAATCATGTCTGACGTTCTCAGGATCTTAGCAAGAAGCAGTTTAAGAAGTC
TATGACCAAGAAATCACATTCATGGTGGTGGGACAGTCACAATTGTCCCAAGAACTCGAAGTGGC
TTGCTCAGAATCTGGAGAGTATGTTGCCTCACTTATCATTGAGATACCTATCTCCACTTAAATGT
AGATCTTGAACTTGTTCTTATTATGGCTTCTCAGAGATGGATGACCGTGTGAAACACATGTTAAA
GTTGATTGAAGAAGACGCAGACTCTTTTGCCAAGAAAGCTCAGATGTATTACCAGAAGCGTCCCG
AGTTAATCCACCTTGTGGAGGAGTTTTACCGCATGTATCGCGCTTTGGCTGAGCGTTATGATCAA
GCTAGTGGTGAACTTCAGAAAATTCATCTCTCTGGGATACAGTCACAGGGCTCTCTTGAGAAATC
ATCTCCTACTAATTCCCAAGAGAAATCGAGTCACCCTCATAAGGAAGAGGAAGACTCATCATCTC
TGTCTGATTCTGATTCTGACTCTAAATCGGTTCCTGATCATTCCTCTGTTAATGAT
GAAGATGGT
GACGAGGCTT
SCAR引物：
fs73F：AAGCCTCGTCTGTGGTAAG
rs73F：AAGCCTCGTCACCATCTTC
5)随机引物S73：AAGCCTCGTC
测序时标记名称：S73-750F，实测长度：728bp；
AAGCCTCGTCTGATGTAAAACACACCGCTTGTGCTGTTTTTTGAAAGAAGCAGTGTCCATTTTCT
TCCTTTCTCGTTGACTAGATCTATCTCACAGGGCTTGTTGTGCTCATTAAACGACACAACCGTAA
AGTCTTTAGAAAGATCCTGGAAAAAAAACAAAGAAATAATACATCACTCACAGTATCATACACTT
GACTACTTACAAAAGGTAAACGAGGAGTGTAGTAATTAGTTACCAAACGATCTTTGATGGGGCTA
TAAGGTGTGACACGTGCTCTGAGGATACAAGAGAAACCTGCTTTTGTGCTCTTGTTCACCAAAAT
GTTCCCTGAATCACAACAATCTTCATTTACATTTTACTACCAAACCAAAAACTCAAAACATATAC
CACTTATGTCGTTTCAAGAAACGAAAACACCTTACCTGCGTCATCCTCTCCTCCATCGTCATCAT
CATCATATTCGTCTTCTCCATCCTCAGATTCAGAATAGTCATCATCAGTCTCAACATCGTCAGTA
TCAACCAAGCTAGGAGACGCGTGGTGACTTATGTCACAAGAATCCGACCGAGGGGACACAGATAC
ATGAAAGATCTCGTCTCCATCGTGTCTGAAAACCAAGAGGTCTCCGTCTCTGAAACTATGAGCTT
TGGCGAACTCTTCCCAGCCGCCGCCGGCGAGCCTGCTTCCCTCTAGTTTCACTTTC
CAAATCTTG
TCCGACGAGGCTT
SCAR引物：
fS73F：AAGCCTCGTCTGATGTAAAACAC
rS73F：AAGCCTCGTCGGACAAGATTTG
6)随机引物S494：GGACGCTTCA
测序时标记名称：S494-399M，实测长度：376bp；
GGACGCTTCAATAATATTGAAATATATTTTTTAAAAAAATATAATAATTGGAATATTGCGTAATT
AAGTTTACGTTTTTGGGAATTTCACATATTAAATAATTAATTACATATTTTGAGGTAAATATTCA
AGAGACTGTGATTTTCATTAATCAATCATTAGAAGAGAATAAAAGCATTAAAAAAATCTTCAGTT
TATTTTAAAAGAAACAGTTGTGACAAATGTTTTTATCAGACAAGACAACAACAAATAATTAAAAA
GACAGTGTCCACCGCCAAAAGAAACTCAACTCTAAAGCTTAAATATGAAGAGAATCAAGTCAAAG
CCGGAGTCTCTGCAAACATATTGGAACACTTT
GTCTGAACCTGAAGCGTCC
SCAR引物：
fS494M：GGACGCTTCAATAATATTG
rS494M：GGACGCTTCAGGTTCAGAC
7)随机引物S494：GGACGCTTCA
测序时标记名称：S494-1770F，实测长度：1771bp；
S494-1775F：(-47)
GGACGCTTCAGAAATATTTAATAAAATAAAAAAAAGACCACTAAAATCTTAAAGACTAAATAGTA
AAAAGATAAAGATACAAACGTGTGAAGCAAAACCCAAGCCGACACGTTCAATTCCATCGTTTTGA
TCCGGTTCCGGCAGGCACGAGCTTTAGGCCGGTTGGTTAAAACACGCGCTTTGGACCATTTAGGA
AACACAGTCAGGTTCTCGTGATTTCTTGCTTATAATGGGCCCCTCCCACCCATATGGTCAGCTAA
ACGAGTGAAATTCTAGGGCACACCTTTGATTATTTTTTTTAAATAATCAAAAAATTATTATTAGA
AACCGAAAATTATTATTTATTCCAAAGACATGAATTCCTACAAGTCCACAACTGTTGTTTATGGT
CAAATCATAAAGCAAAACTAATGTTTTCCAAATAGTTAATGGAAAAAAAGAAAAACAAAAGCAAA
TGCATCTTGCGTTGTTGGAATGCAAAAAGAGAGAAAACGATACGTACCTAATGTTAATTCTAATT
AGTTAGTTATAGAATGAGGAGGTACATTAAAAAGGAAAATTAGTATTAGTACTCAGTTAAGTATG
CACGTGTGTGGGAAGTATGGTGGCGAAACTATACAACCAACCCCTAGTAGATGGCTAGTTGTACA
TGTCTCGTGACGTATACATCATATATATAATAAATACGAACATAGAAATTAATAGGACTTAGTTG
TTGCGAATATACGTAAAATCAAATAAAACCAACCATTCAATGTTCTTGGTAAGTAACGAAATAAA
ACGGAAGCAAGAAGGAGAACCACATAAAAGGGAGCTAACTCCTGTACACGTTGTGCTTCATCTGC
CCGTCCGTCAAACTACCACACTCCCTTCTCTTTTCCCCTTTGTCATCTTGTATAATAATATCTCA
CTCTCCCATGCTTTCTAACAT
S494-1775F：(-48)
GGACGCTTCACGGAAGGGCGAAGGCCAAGGAGCTTGGTGAGCTGGTAGTCAGCACCAGGCATGTC
AACTCCAGAGGTGGTGCAGAAGACAACGTGTGTGACCTTGGACTTAGGCTGACCCCACTCCTTGA
TGGCCTTCACTGCTGCATCTTTGCCTAGCTTAGGGACTTCAACCACCACGAGGTCTTGTCTAGCG
TCGAGAGAAGGAGCCATGTAGGCGCACATGTTAGGGTTCTCTTTCAAGAACTCCTCGGTCAAGTG
CATGTGGCGTTTTCTTATGGTCGACTTATCGCCTATTAGAGTCATAATCAAGTTAACTATGTGAA
CATACTAATAAGTACAGTTTAAGGTAGAAGACTATTAAATTTTCGGTTTTATCTATTTAATACAT
TTTTTTTTGTTAGTTAATGAACTAAAAGATACGGATAAAACTGGTGAATTATTTAAATGTATTTT
GAAAATGTACAACAAATTTTAAAAACTAAAAATGATAAACGGATGAATTATATGCCAAAATTCTA
AATGGAAAAATACAAAGTAGGGTTTGTTAAGACATACACATGCGCTTGAACTTCTCCTTAAGGTC
GGTCTTGTGTTCACTGTTGGTGATGCGGAAGTAGTAGTCTGGATACTCAGCTTGGAGCACATGGT
TCGCAGGGTTGGCCGTACCTATCGCTAAGATGCCTGCAGGACCGTCTGCTCTCTGTGCCTTTCTG
ATCTCATCCAACGAAGAACGCCCCATCACCATATTAAACCAACTACGTTTTAACTAAGTGTGATC
GATGTGTTACTTTGCGTAATAAGCAAGTTATGTATGTATGTTTAGAAAGCATGCAGAGTA
SCAR引物：
fS494F：GGACGCTTCAGAAATATTTAATA
rS494F：GGACGCTTCACGGAAGGGCGAAG
8)随机引物S266：AGGCCCGATG
测序时标记名称：S266-260F，实测长度：294bp；
AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGAAAATGGGTTTCGGCCGTTTTTAAAATAAAACATTGACGACA
AAAAAAAAAAAATAATTTGGCATCTCCCTCCATCTAAATCATGCATGACAAATGAATAAAAAGCT
TTTATTATCATATGACGTCTATACAATGCGTATAATATGTTTCCTTTACTTTATTTACTTGTCGT
CTTTATCTTATTATATTATATGCTACATTATAGTCATTGTTAAAGTCAGAGACTACAGGTATCAT
AAGGTTGCAA
CAATGATTTATCATCATCGGGCCT
SCAR引物：
fS266F：AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAG
fS266F：AGGCCCGATGATGATAAATCATTG。
Claims (5)
1.一种利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，其特征在于，该方法以“冠春”父母本及F1代种子为研究材料进行PCR反应体系优化，筛选特异性引物，进一步对特异片段克隆测序，转化为SCAR标记，并将该SCAR标记用于“冠春”大白菜品种鉴定和种子纯度检验，具体包括以下步骤：
1)材料的准备：
以春大白菜新品种“冠春”及其亲本种子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期单株编号，随机选取100-200株，于苗期取幼嫩叶片提取DNA备用，成株期根据品种特性鉴定生物学性状；
2)DNA提取：
采用CTAB法，其过程为，取0.2g幼嫩叶片，液氮下研磨成粉末；加入750μL CTAB提取液后转入至1.5mL离心管中；然后65℃水浴30min，其间振荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各抽提一次，于常温下在12000r/min条件下离心2次，每次10min；取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4℃条件下离心15min；离心转速为12000r/min，离心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入DNA贮存液，经DNA纯度检测证实纯化度，存于-20℃冰箱中备用；
3)SCAR引物设计：
母本特异性引物SC134-1200
fS134M：TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC
rS134M：TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG
杂种特异性引物SC266-260
fS266-260F：AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAG
fS266-260F：AGGCCCGATGATGATAAATCATTG
4)SCAR-PCR扩增：
采用25μL的PCR反应体系，其中包括1×缓冲液，2.0mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs，0.3μmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30～50ng模板DNA；反应程序：SCAR扩增程序为，94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min；
扩增产物在含5μg/mLEB的1.5％琼脂糖胶，120V下电泳1.0h，电泳后在紫外灯下观察并照相；
5)SCAR标记的特征：
A、SC134-1200标记：
用SC134-1200的SCAR引物对“冠春”群体鉴定，在母本和杂交种中可以扩增出S134-1200的特异条带，而父本及其自交苗中不能扩出S134-1200的特异条带，因此利用该比较可以正确的鉴定“冠春”反交种子；鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率；
B、SC266-260标记：
用SC266-260的SCAR引物对“冠春”群体鉴定，母本、父本均没有扩增带，只有真杂种有扩增带，没有扩增带的可能是假杂种；利用该比较可以正确的鉴定“冠春”正交、反交单收以及混收种子；鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率。
2.如权利要求1所述的利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，其特征在于，所述的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液的体积比为：Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1；所述的氯仿、异戊醇混合溶液的体积比为：氯仿∶异戊醇＝24∶1。
3.如权利要求1所述的利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，其特征在于，所述的DNA贮存液的组成为：70％体积分数的乙醇，其中加入0.3moL/L NaAc溶液。
4.如权利要求1所述的利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，其特征在于，所述的SC134-1200标记的特异片断全长1091bp，其核酸序列为：
TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCAATATTTGACAATATATTGATCAGTGATGACCCGG
AATATGCAAGGAGCATGGTGGATGACTATTTTGCTCAGCACAGAGAGGTAGGCTTC
TCCATGCCTTTGGGATACCTTCTTTTTGCTTCTTTTTAGACAAAGTTAAATGAGTTTC
TGCATGATTTTATTATAGAAAATGTCTTATTAGTAATCTGATGTGCTTATATATACTCTT
CTGACCAGTCTGAGAAGGAGTTATTTGCGGAAGCTGAGAAAGAAAAAAAAGCTAG
AGAAGATGAGGTTTGTAGTTTTCAAAACAAGTCCTTACTTGCTTTTAAAATCTTCTC
TGTTTATCTTAATCATGATCTCATACAATTTGACGATTGCAGGAAGCTAGGATAGCAA
GAGAAGAAGGGGAACGTAGACGAAAAGAGAGGGGTGACCGGTATGGACACAGGG
ACAGGAGGCATCGTTACAAACGGGTACATACTCAATGAGACCAACTCAGTTCTACA
GTTTTCTTTCTCCTTCTCAACACTGTTAGTTCTGGAATATAAGTGAGTGACTAAGTAT
AAACGTTTTGTTTTGCAGCACCACCGACGTGGTTACATGGACGATTACCATGTAAGT
AAACTAAGTGGTTTTCTATTCAACCACTTTTAAATGCTTTATGCGTTTTAGTACTGAA
TCATCTTAACCGTTTTCGTGTAGGATGAGCTATAAGGCGCAGTGGTGGCCTGGTGG
GGGATTTGGCAATGACAACCAATAAAAGCAAGTATTCATTAAAGTCATCATACCTAG
AGAGCTGGAAACTATATGGTTGGTTTTTGTAGTTTGTATGATTGTAATATGTATCATAT
CACTTCTTTTTTTTTTTTGTCATCTGAAGTTTCATATATCACAAAGGTTAACATTGCA
AACACCTCCTTTACACGGATCCAACACAAAAAGCAATTCTAAACCAAGGACAAAC
TAACACTCCAAAGTCTTTAGTGTACCAAAAAATTTTCGAAGGAGACAACTTCAAGT
CAAAGAGAGGCCAAACGTTTCTCATTTTCAAAGACGTCCTG
CAACCAAAAAGGATA
ACCTGCAGCA。
5.如权利要求1所述的利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，其特征在于，所述的SC266-260标记的特异片断全长294bp，其核酸序列为：
AGGCCCCGATGGAGTTTGTGTAAGAAAATGGGTTTCGGCCGTTTTTAAAATAAAACATTGACGACA
AAAAAAAAAAAATAATTTGGCATCTCCCTCCATCTAAATCATGCATGACAAATGAATAAAAAGCT
TTTATTATCATATGACGTCTATACAATGCGTATAATATGTTTCCTTTACTTTATTTACTTGTCGT
CTTTATCTTATTATATTATATGCTACATTATAGTCATTGTTAAAGTCAGAGACTACAGGTATCAT
AAGGTTGCAA
CAATGATTTATCATCATCGGGCCT。
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