CN1934254A

CN1934254A - 与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记及其利用

Info

Publication number: CN1934254A
Application number: CN 200580009514
Authority: CN
Inventors: 武田和义; 佐藤和广
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2005-03-23
Publication date: 2007-03-21

Abstract

制作大麦的详细的连锁图，进行QTL解析，由此发现：位于大麦1H染色体上与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的5个遗传标记，位于大麦2H染色体上与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的2个遗传标记，位于大麦3H染色体上与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的5个遗传标记，位于大麦4H染色体上与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的4个遗传标记，位于大麦5H染色体上与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的2个遗传标记。

Description

与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记及其利用

技术领域

本发明涉及新的遗传标记及其利用法，特别涉及大麦的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记及其利用。

背景技术

大麦黄花叶病是以大麦黄花叶病毒(barley yellow mosaic virus、以下简称为“BaYMV”)或大麦和性花叶病毒(barley mild mosaic virus、以下简称为“BaMMV”)作为原因病毒，并以藻菌类的禾谷多粘霉(Polymyxagraminis)为介体的土壤传染性的病毒病。一旦发病，则会导致叶的坏死斑点或变黄、分株减少、发育不良、枯死等，而且，一旦发病则即使其土壤停止耕种4～5年也不会没病，因此成为严重的问题。特别是啤酒用大麦易于发病，随着啤酒用大麦的栽培变多，不仅在日本，在中国及德国也发生，而成为问题，即使在还未发病的国家，也认为应积极地赋予防备发病的抵抗性。因此，大麦黄花叶病抵抗性成为极其重要的育种目标。

现在，大麦黄花叶病的最佳防除法是栽培抵抗性品种，在污染田地中栽培耐病性强的品种。以往，农作物的育种必须将具有目标性状的栽培品种及野生品种等进行杂交，实际培养多个个体后选拔出具有目标性状的个体，并必需将该目标性状遗传性地固定下来，因此，必需广阔的田地、大量的人力及相当的年月。例如，以相对于BaYMV的大麦黄花叶病抵抗性作为目标性状时，由于BaYMV的人工接种很困难，因此必须在土壤中感染有BaYMV的田地中检测在培育系统中是否导入有大麦黄花叶病抵抗性基因，并选拔出具有抵抗性的个体，必需花费时间和工夫。

因此，近年来为了缩短育种时间、缩减劳动力及田地面积、准确地选拔出有用基因，开始使用通过以遗传标记作为指标来选拔的育种法。在使用这样的遗传标记的育种中，根据标记的基因型能够在幼苗阶段进行选拔，实际上无需在土壤里感染有大麦黄花叶病的田地中进行栽培，还易于确认目标性状的有无。因此，只要利用遗传标记就可以实现高效的育种。接着，为了实现利用了遗传标记的育种，必须开发出与目标性状密切连锁的遗传标记。

然而，大麦黄花叶病抵抗性等的农业上重要性状的大部分在杂种后代中往往显示出连续的变异。由于这样的性状可以通过用时间或长度等数量的尺度来测定而被称为数量性状。数量性状一般不是单一主动基因支配的性状，而常常是通过多个基因的作用来决定的。在农作物的育种中作为改良对象的性状的多数常常是如收获量、品质·味道等这样的数量性状。

将负责这样的数量性状的基因在染色体上所占的遗传位置称为QTL(Quantitative Trait Loci，数量性状基因位点)。作为推定QTL的方法，使用利用存在于QTL附近的遗传标记的QTL解析。所述的QTL解析是通过统计地解析染色体上的哪个区域对作为目的的数量性状有影响，并发现位于该区域附近的DNA标记来进行的。以利用所发现的DNA标记而制成的遗传图(连锁图)信息为基础，不断缩小对目标形状带来影响的区域，最终能够确定·分离该基因。从二十世纪八十年代后半期DNA标记问世以来，利用DNA标记制作详细的连锁图大为发展，根据该连锁图得以在很多生物中进行QTL解析。

如上所述，可以说与目标性状连锁的遗传标记的开发能够通过根据可覆盖全部染色体的详细的连锁图进行精度高的QTL解析而实现，可以利用所得到的遗传标记来实现高效的育种。作为大麦黄花叶病抵抗性相关的QTL，例如被本发明人等在来源于中国种的六条大麦木石港3的3H染色体长臂、在4H染色体着丝点附近及7H染色体短臂上发现(参照ChikaraMiyazaki，Eiichi Osanai，Kazutoshi Ito，Takeo Konishi，Kazuhiro Sato andAkira Saito.2001.“Mapping of quantitative trait loci conferring resistance tobarley yellow mosaic virus in a Chinese barley landrance Mokusekko 3.”Breeding Science 51：171-177.)。

如上所述，大麦黄花叶病抵抗性是极为重要的育种目标之一。然而，大麦黄花叶病抵抗性往往与多个基因位点相关，因此，通过杂交等的方法，难以确认是否准确地选拔出大麦黄花叶病抵抗性相关的基因(基因位点)。因此，在导入有大麦黄花叶病抵抗性的大麦育种中利用遗传标记是非常有效的。只要能够开发出、利用与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，则可以实现大麦黄花叶病抵抗性大麦的育种的大幅度高效化。

本发明是鉴于上述课题完成的，其目的在于提供大麦的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的新的遗传标记及其代表性的利用方法。

发明内容

为了解决上述课题，本发明人等根据发明人等所拥有的大麦EST序列设计引物对(プライマ一セツト)，并通过利用该引物对进行扩增的大麦基因组片断有无多态性来开发出了遗传标记(DNA标记)。进而，把由酿造用大麦“春名二条”和野生大麦“H602”杂交F1而培育成的双单倍体集团(以下将双单倍体系统简称为DH、将该系统称为DHHS集团)作为材料，检测上述遗传标记之间的连锁，制作该DHHS集团的连锁图，进行以该连锁图为基础的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的QTL解析。其结果为，在1H染色体上检测出1个大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点，在3H染色体上检测出1个。本发明人等进一步进行解析，发现在这些与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点分别连锁的新的遗传标记。

此外，本发明人等除了以由对大麦黄花叶病的抵抗性大为相异的大麦品种Russia6(二条、抵抗性)和H.E.S.4(六条、患病性)杂交而培育成的RI系统(以下称为“RI1集团”))作为材料之外，还以由Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey 6(患病性)杂交而培育成的RI系统(以下称为“RI2集团”)以及由春名二条(抵抗性)和H602(患病性)杂交而培育成的DHHS集团作为材料，进一步进行了大麦黄花叶病抵抗性相关的QTL解析。其结果为，重新在RI1集团中于4H染色体上检测出2个QTL，在RI2集团中于2H、3H、5H染色体上分别检测出1个QTL，在DHHS集团中于1H染色体上检测出1个QTL。进一步发现与该QTL连锁的遗传标记。

本发明是根据上述新的发现完成的，包括如下发明。

即，本发明所述的遗传标记存在于大麦的1H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，使用第一引物对进行扩增，所述第一引物对是具有序列号1所示的碱基序列的引物和具有序列号2所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的1H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，使用第二引物对进行扩增，所述第二引物对是具有序列号3所示的碱基序列的引物和具有序列号4所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的1H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，使用第五引物对进行扩增，所述第五引物对是具有序列号19所示的碱基序列的引物和具有序列号20所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的1H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，使用第六引物对进行扩增，所述第六引物对是具有序列号21所示的碱基序列的引物和具有序列号22所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的1H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，使用第七引物对进行扩增，所述第七引物对是具有序列号23所示的碱基序列的引物和具有序列号24所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的2H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第八引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第八引物对是具有序列号25所示的碱基序列的引物和具有序列号26所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的2H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，使用第九引物对进行扩增，所述第九引物对是具有序列号27所示的碱基序列的引物和具有序列号28所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的3H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，使用第三引物对进行扩增，所述第三引物对是具有序列号5所示的碱基序列的引物和具有序列号6所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的3H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，使用第四引物对进行扩增，所述第四引物对是具有序列号7所示的碱基序列的引物和具有序列号8所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的3H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十引物对是具有序列号29所示的碱基序列的引物和具有序列号30所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的3H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十一引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十一引物对是具有序列号31所示的碱基序列的引物和具有序列号32所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的3H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，使用第十二引物对进行扩增，所述第十二引物对是具有序列号33所示的碱基序列的引物和具有序列号34所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的4H染色体中、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十三引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十三引物对是具有序列号35所示的碱基序列的引物和具有序列号36所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的4H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十四引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十四引物对是具有序列号37所示的碱基序列的引物和具有序列号38所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的4H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十五引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十五引物对是具有序列号39所示的碱基序列的引物和具有序列号40所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的4H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十六引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十六引物对是具有序列号41所示的碱基序列的引物和具有序列号42所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的5H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十七引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十七引物对是具有序列号43所示的碱基序列的引物和具有序列号44所示的碱基序列的引物的组合。

此外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的5H染色体中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十八引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十八引物对是具有序列号45所示的碱基序列的引物和具有序列号46所示的碱基序列的引物的组合。

另一方面，本发明所述的DNA片断的分离方法，其特征在于，使用上述本发明所述的遗传标记的任一个来分离含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断。

另一方面，本发明所述的大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产方法，其特征在于，在大麦的基因组DNA中导入通过上述本发明所述的DNA片断的分离方法而得到的含有所述大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断。

另一方面，本发明所述的大麦黄花叶病抵抗性大麦，其是通过上述本发明所述的大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产方法而得到的。

另一方面，本发明所述的选拔大麦黄花叶病抵抗性大麦的方法，其是以上述本发明所述的遗传标记的任一个作为指标来选拔大麦黄花叶病抵抗性大麦的方法。

另外，本发明还可以是以下的形式。即，本发明所述的遗传标记存在于大麦的基因组DNA中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，位于从所述大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始0～18厘摩范围内的距离。所述遗传标记由于与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点强连锁，因此在该遗传标记与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点之间分离后重组的发生概率低。所以通过使用上述遗传标记，可以得到例如含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断、进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产(培育出)·辨别等。

另外，本发明所述的遗传标记存在于大麦的基因组DNA中、并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，其特征在于，位于从所述大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始0～14厘摩范围内的距离。所述遗传标记由于与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点强连锁，因此在该遗传标记与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点之间分离后重组的发生概率低。所以通过使用上述遗传标记，可以得到例如含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断、进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产(培育出)·辨别等。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，所述基因组DNA是1H染色体。所以通过使用所述遗传标记，可以得到含有存在于大麦1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断、进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产(培育出)·辨别等。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，使用第一引物对进行扩增，所述第一引物对是具有序列号1所示的碱基序列的引物和具有序列号2所示的碱基序列的引物的组合。只要使用上述第一引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，使用第二引物对进行扩增，所述第二引物对是具有序列号3所示的碱基序列的引物和具有序列号4所示的碱基序列的引物的组合。只要使用上述第二引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，使用第五引物对进行扩增，所述第五引物对是具有序列号19所示的碱基序列的引物和具有序列号20所示的碱基序列的引物的组合。只要使用上述第五引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，使用第六引物对进行扩增，所述第六引物对是具有序列号21所示的碱基序列的引物和具有序列号22所示的碱基序列的引物的组合。只要使用上述第六引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，使用第七引物对进行扩增，所述第七引物对是具有序列号23所示的碱基序列的引物和具有序列号24所示的碱基序列的引物的组合。只要使用上述第七引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，所述基因组DNA是2H染色体。所以通过使用所述遗传标记，可以得到含有存在于大麦2H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断、进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产(培育出)·辨别等。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，为了解决上述课题，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第八引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第八引物对是具有序列号25所示的碱基序列的引物和具有序列号26所示的碱基序列的引物的组合。

只要使用上述第八引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，使用第九引物对进行扩增，所述第九引物对是具有序列号27所示的碱基序列的引物和具有序列号28所示的碱基序列的引物的组合。只要使用上述第九引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，所述基因组DNA是3H染色体。所以通过使用所述遗传标记，可以得到含有存在于大麦3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断、进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产(培育出)·辨别等。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，使用第三引物对进行扩增，所述第三引物对是具有序列号5所示的碱基序列的引物和具有序列号6所示的碱基序列的引物的组合。只要使用上述第三引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，使用第四引物对进行扩增，所述第四引物对是具有序列号7所示的碱基序列的引物和具有序列号8所示的碱基序列的引物的组合。只要使用上述第四引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，为了解决上述课题，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十引物对是具有序列号29所示的碱基序列的引物和具有序列号30所示的碱基序列的引物的组合。

只要使用上述第十引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，为了解决上述课题，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十一引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十一引物对是具有序列号31所示的碱基序列的引物和具有序列号32所示的碱基序列的引物的组合。

只要使用上述第十一引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，使用第十二引物对进行扩增，所述第十二引物对是具有序列号33所示的碱基序列的引物和具有序列号34所示的碱基序列的引物的组合。只要使用上述第十二引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，所述基因组DNA是4H染色体。所以通过使用所述遗传标记，可以得到含有存在于大麦4H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断、进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产(培育出)·辨别等。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，为了解决上述课题，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十三引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十三引物对是具有序列号35所示的碱基序列的引物和具有序列号36所示的碱基序列的引物的组合。

只要使用上述第十三引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，为了解决上述课题，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十四引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十四引物对是具有序列号37所示的碱基序列的引物和具有序列号38所示的碱基序列的引物的组合。

只要使用上述第十四引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，为了解决上述课题，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十五引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十五引物对是具有序列号39所示的碱基序列的引物和具有序列号40所示的碱基序列的引物的组合。

只要使用上述第十五引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，为了解决上述课题，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十六引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十六引物对是具有序列号41所示的碱基序列的引物和具有序列号42所示的碱基序列的引物的组合。

只要使用上述第十六引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，所述基因组DNA是5H染色体。所以通过使用所述遗传标记，可以得到含有存在于大麦5H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断、进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产(培育出)·辨别等。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，为了解决上述课题，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十七引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十七引物对是具有序列号43所示的碱基序列的引物和具有序列号44所示的碱基序列的引物的组合。

只要使用上述第十七引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

本发明所述的遗传标记的特征还在于，为了解决上述课题，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十八引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十八引物对是具有序列号45所示的碱基序列的引物和具有序列号46所示的碱基序列的引物的组合。

只要使用上述第十八引物对进行PCR等扩增反应，则可以容易地对该遗传标记进行扩增·检测，可以容易地进行大麦黄花叶病抵抗性大麦的辨别。

另一方面，本发明所述的DNA片断的分离方法，其特征在于，使用上述本发明所述的遗传标记分离含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断。本发明所述的遗传标记是与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点强连锁的，因此只要将上述遗传标记作为目标进行克隆，则可以容易地分离出含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断。

此外，本发明所述的大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产方法，其特征在于，在大麦的基因组DNA中导入通过上述本发明所述的DNA片断的分离方法而得到的含有所述大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断。通过该生产方法，可以生产大麦黄花叶病抵抗性大麦。

此外，本发明所述的大麦黄花叶病抵抗性大麦的特征在于，其是通过上述本发明所述的大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产方法而得到的。通过该大麦黄花叶病抵抗性大麦，容易且准确地选拔出对大麦黄花叶病具有抵抗性的个体，因此可以防止由于大麦黄花叶病导致的大麦的收获量减少。

此外，本发明所述的选拔大麦黄花叶病抵抗性大麦的方法，其是以上述本发明所述的遗传标记作为指标来选拔大麦黄花叶病抵抗性大麦的方法。上述本发明所述的遗传标记由于与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点强连锁，因此在该遗传标记与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点之间分离后重组的发生概率低。所以通过检测上述遗传标记，可以容易地辨别试验对象大麦中的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的基因型，可以容易地发现待选拔个体。

本发明所述的遗传标记由于与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，因此可以把该遗传标记作为指标来进行导入有大麦黄花叶病抵抗性的大麦的育种。因此，可以发挥能够实现大麦黄花叶病抵抗性大麦的高效育种的效果。更具体而言，由于能够在幼苗阶段进行选拔目的个体，因此实际上无需在土壤里感染有大麦黄花叶病的田地中栽培大麦，在观察各个体的大麦黄花叶病抵抗性后来选拔目的个体，发挥能够缩短育种期间的效果。此外，由于能够同时选拔多个基因位点，因此即使通过观察进行选择，也能够准确地得到作为目的的基因型。进而，发挥能够缩减劳动力和田地的效果。

进而，对于以所述遗传标记作为指标来选择型育种的大麦黄花叶病抵抗性大麦而言，即使在被大麦黄花叶病病毒污染的土壤中也可以栽培，因此发挥能够确保稳定的收获量的效果。

本发明的其他目的、特征及优点可通过如下所示的描述而充分理解。本发明的好处在下述的说明中可明了。

附图说明

图1：表示大麦EST克隆：baak1j14的碱基序列及根据该序列设计的引物序列的位置的图。

图2：表示遗传标记k00256中的H602与春名二条之间的SNP和SNP周围的碱基序列的图。

图3：表示大麦EST克隆：bags32m16的碱基序列及根据该序列设计的引物序列的位置的图。

图4：表示在实施例13中遗传标记k02948的H602与春名二条之间的片断长度多态性的电泳图。

图5：表示大麦EST克隆：bah41103的碱基序列及根据该序列设计的引物序列的位置的图。

图6：表示遗传标记k04143的H602与春名二条之间的SNP和SNP周围的碱基序列的图。

图7：表示大麦EST克隆：baak14i02的碱基序列及根据该序列设计的引物序列的位置的图。

图8：表示遗传标记k00169的H602与春名二条之间的SNP和SNP周围的碱基序列的图。

图9：表示遗传标记k03616的H602与春名二条之间的SNP和SNP周围的碱基序列的图。

图10：表示遗传标记k02325的H602与春名二条之间的SNP和SNP周围的碱基序列的图。

图11：表示遗传标记k07966的H602与春名二条之间的SNP和SNP周围的碱基序列的图。

图12：表示在实施例2中进行遗传标记“FEggaMtgg116”的多态性检测的结果的电泳图。

图13：表示在实施例3中进行遗传标记“FEgggMcaa585”的多态性检测的结果的电泳图。

图14：表示在实施例4中进行遗传标记“MEcatMagc467”的多态性检测的结果的电泳图。

图15：表示在实施例5中进行遗传标记“MEataMatg396”的多态性检测的结果的电泳图。

图16：表示在实施例6中进行遗传标记“MMattEacg162”的多态性检测的结果的电泳图。

图17：表示在实施例7中进行遗传标记“FMataEgga331”的多态性检测的结果的电泳图。

图18：表示在实施例8中进行遗传标记“FMacgEgat88”的多态性检测的结果的电泳图。

图19：表示在实施例9中进行遗传标记“MMacgEgga74”的多态性检测的结果的电泳图。

图20：表示在实施例10中进行遗传标记“FMaccEacg402”的多态性检测的结果的电泳图。

图21：表示在实施例11中进行遗传标记“HVM36”的多态性检测的结果的电泳图。

图22：表示在实施例12中进行遗传标记“k00256”的多态性检测的结果的电泳图。

图23：表示在实施例14中进行遗传标记“k03861”的多态性检测的结果的电泳图。

图24：表示在实施例15中进行遗传标记“k03616”的多态性检测的结果的电泳图。

图25：表示在实施例16中进行遗传标记“k02325”的多态性检测的结果的电泳图。

图26：表示在实施例17中进行遗传标记“k00169”的多态性检测的结果的电泳图。

图27：表示在实施例18中进行遗传标记“k07966”的多态性检测的结果的电泳图。

图28：表示在实施例19中进行遗传标记“k04143”的多态性检测的结果的电泳图。

具体实施方式

如下，对本发明的一种实施方式进行说明。但本发明并不限于此。

本发明涉及大麦中的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记及其应用之一例。以下，对本发明所述的遗传标记、本发明的利用之一例进行说明。

(1)本发明所述的遗传标记

本发明所述的遗传标记只要存在于大麦的基因组DNA中，并与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁即可。

如上所述，大麦黄花叶病是以BaYMV或BaMMV作为原因病毒，并以藻菌类的禾谷多粘霉(Polymyxa graminis)为介体的土壤传染性的病毒病。大麦黄花叶病导致叶的坏死斑点或变黄、分株减少、发育不良、枯死等，而且，一旦发病则即使其土壤停止耕种4～5年也不会无病化，而对收获量带来巨大的影响，因此成为严重的病害之一。因此，大麦黄花叶病抵抗性成为极其重要的育种目标。

大麦黄花叶病抵抗性有时由数量性状决定有时由质量性状决定，抵抗性由多个基因位点决定。数量性状通过QTL解析，可以推断与该数量性状相关的基因位点的染色体上的位置。以下，本发明人等对在大麦中开发出的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记进行详细的说明。但本发明所述的遗传标记并不限于此。

本发明人等使用由酿造用大麦“春名二条”和野生大麦“H602”杂交F1而培育成的DHHS集团，制作出高密度连锁图。即，使用根据本发明人等所拥有的大麦EST(expressed sequence tag)序列设计的引物对来对大麦基因组DNA进行扩增，确定在“春名二条”和“H602”之间具有扩增片断长度的多态性的序列、或用限制性内切酶进行消化的扩增片断长度的具有不同图案的多态性的序列，并构建包括含有这些DNA标记的约490基因位点的连锁图。根据该连锁图及本发明人等观察到的上述DHHS集团93个体的大麦黄花叶病抵抗性的数据，进行了大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的QTL解析。其结果为，在1H染色体上检测出1个大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点，在3H染色体上检测出1个。本发明所述的遗传标记是夹着位于1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点且位于其最近处的2个遗传标记，以及是夹着位于3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点且位于其最近处的2个遗传标记。本发明人等将在1H染色体上检测出的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记命名为“k00256”和“k02948”，将在3H染色体上检测出的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记命名为“k04143”和“k00169”。

k00256是使用第一引物对以大麦基因组DNA为模板进行扩增的DNA标记，其位于从上述1H染色体上检测出的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在短臂侧约7.8厘摩(以下表示为cM)的距离，所述第一引物对是具有示为CTTGGCCTTGATCTTCTGCT(序列号1)的碱基序列的引物和具有示为GACCGTGTCAGGAAAGCAAT(序列号2)的碱基序列的引物的组合。上述引物序列是根据本发明人等独立开发出的大麦EST序列之一(EST克隆名称：baak1j14、序列号15)进行设计的。图1示出该EST的碱基序列。有下划线的部分是上述引物序列(序列号1)和上述引物序列(序列号2)的互补序列。春名二条的扩增产物与H602的扩增产物之间具有SNP(single nucleotide polymorphism、一碱基多态性)。图2表示两者的扩增产物的碱基序列中含有上述SNP的部分碱基序列。上面为抵抗性型(H602型)的碱基序列(序列号9)，下面为患病性型(春名二条型)的碱基序列(序列号10)。用□(四边形)括起来的碱基是SNP。下划线部分表示限制性内切酶PstI的识别序列(CTGCAG)。由图2可知，抵抗性型(H602型)的扩增产物由于具有限制性内切酶PstI的识别序列(CTGCAG)而被PstI切断，由于患病性型(春名二条型)的扩增产物的上述识别序列部分的G变异成A(CTGCAA)而不被限制性内切酶PstI切断。即，本遗传标记k00256是CAPS(cleaved amplified polymorphicsequence)标记，如果用上述第一引物对进行扩增，则通过扩增产物的限制性内切酶PstI切断，可以对对象个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

另外，本遗传标记连锁的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点是大麦黄花叶病患病性型品种的H602所具有的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点。因此，检测本遗传标记时，春名二条型成为患病性型，H602型成为抵抗性型。

k02948是使用第二引物对以大麦基因组DNA为模板进行扩增的遗传标记，其位于从上述1H染色体上检测出的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在长臂侧约0.0cM的距离，所述第二引物对是具有示为TCTTTCCTGGGTTGGTGAAC(序列号3)的碱基序列的引物和具有示为GCAGCTTTTGAGTTCGTTCC(序列号4)的碱基序列的引物的组合。上述引物序列是根据本发明人等独立开发出的大麦EST序列之一(EST克隆名称：bags32m16、序列号16)进行设计的。图3示出该EST的碱基序列。有下划线的部分是上述引物序列(序列号3)和上述引物序列(序列号4)的互补序列。春名二条的扩增产物与H602的扩增产物之间具有片断长度多态性，以患病性型(春名二条型)的基因组DNA为模版进行扩增的片断的大小为约389bp，不同于以抵抗性型(H602型)的基因组DNA为模版进行扩增的片断的大小为约358bp。图4示出使用第二引物对通过PCR进行扩增得到的片断的电泳图像。图4的上段、下段及两端是分子量标记。图4上段是从左端(除了分子量标记)开始依次为患病性型(春名二条型)、抵抗性型(H602型)、春名二条型与H602型的杂交F1、DHHS集团的1～45的扩增片断。图4下段是从左端(除了分子量标记)开始依次为DHHS集团的46～93的扩增片断。由图4可知，通过确认扩增产物的大小，就可以对对象个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有患病性型(春名二条型)的基因型还是含有抵抗性型(H602型)的基因型。

k04143是使用第三引物对以大麦基因组DNA为模板进行扩增的遗传标记，其位于从上述3H染色体上检测出的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在短臂侧约0.0～13.1cM的距离，所述第三引物对是具有示为CTGTTTGGATGACTGCGAGA(序列号5)的碱基序列的引物和具有示为ATTACGCAACCTGATGGAGC(序列号6)的碱基序列的引物的组合。上述引物序列是根据本发明人等独立开发出的大麦EST序列之一(EST克隆名称：bah41103、序列号17)进行设计的。图5示出该EST的碱基序列。有下划线的部分是上述引物序列(序列号5)和上述引物序列(序列号6)的互补序列。春名二条的扩增产物与H602的扩增产物之间具有SNP。图6表示两者的扩增产物的碱基序列中含有上述SNP的部分碱基序列。上面为患病性型(H602型)的碱基序列(序列号11)，下面为抵抗性型(春名二条型)的碱基序列(序列号12)。用□(四边形)括起来的碱基是SNP。下划线部分表示限制性内切酶ApaLI的识别序列(GTGCAC)。由图6可知，H602的扩增产物由于具有限制性内切酶ApaLI的识别序列(GTGCAC)而被ApaLI切断，由于春名二条的扩增产物的上述识别序列部分的G变异成A(ATGCAC)而不被限制性内切酶ApaLI切断。即，本遗传标记k04143是CAPS标记，如果用上述第三引物对进行扩增，则通过扩增产物的限制性内切酶ApaLI切断，可以对对象个体位于该3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性型(春名二条型)的基因型还是含有患病性型(H602型)的基因型。

k00169是使用第四引物对以大麦基因组DNA为模板进行扩增的遗传标记，其位于从上述3H染色体上检测出的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在长臂侧约0.3～13.4cM的距离，所述第四引物对是具有示为ACCCCGGAAGCTAAGATGAT(序列号7)的碱基序列的引物和具有示为AGTCGGAACATGCGGTACAC(序列号8)的碱基序列的引物的组合。上述引物序列是根据本发明人等独立开发出的大麦EST序列之一(EST克隆名称：baak14i02、序列号18)进行设计的。图7示出该EST的碱基序列。有下划线的部分是上述引物序列(序列号7)和上述引物序列(序列号8)的互补序列。春名二条的扩增产物与H602的扩增产物之间具有SNP。图8表示两者的扩增产物的碱基序列中含有上述SNP的部分碱基序列。上面为患病性型(H602型)的碱基序列(序列号13)，下面为抵抗性型(春名二条型)的碱基序列(序列号14)。用□(四边形)括起来的碱基是SNP。下划线部分表示限制性内切酶AluI的识别序列(AGCT)。由图8可知，H602的扩增产物由于具有限制性内切酶AluI的识别序列(AGCT)而被AluI切断，由于春名二条的扩增产物的上述识别序列部分的T变异成C(AGCC)而不被限制性内切酶AluI切断。即，本遗传标记k00169是CAPS标记，如果用上述第四引物对进行扩增，则通过扩增产物的限制性内切酶AluI切断，可以对对象个体位于该3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性型(春名二条型)的基因型还是含有患病性型(H602型)的基因型。

进而，本发明人等使用由Russia6(二条、抵抗性)和H.E.S.4(六条、患病性)杂交而培育成的RI系统(RI1集团)、Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey6(患病性)杂交而培育成的RI系统(RI2集团)以及由春名二条(抵抗性)和H602(患病性)杂交而培育成的RI系统(DHHS集团)作为材料，进行与大麦的大麦黄花叶病抵抗性相关的QTL解析。

所述的QTL解析的结果为，在RI1集团中于4H染色体上检测出2个QTL，在RI2集团中于2H、3H、5H染色体上分别检测出1个QTL，在DHHS集团中于1H染色体上检测出1个QTL。还发现与该QTL连锁的新的遗传标记。

从RI1集团中检测出的在4H染色体上的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的新的遗传标记，可例举出“FEggaMtgg116”、“FEgggMcaa585”、“MEcatMagc467”、“MEataMatg396”。

“FEggaMtgg116”是通过如下方法检测到的遗传标记：在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有示为GACGATGAGTCCTGAG(序列号47)和TACTCAGGACTCAT(序列号48)的碱基序列的MseI连接物以及具有示为CTCGTAGACTGCGTACC(序列号49)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列号50)的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有示为GATGAGTCCTGAGTAA(序列号51)的碱基序列的MseI通用引物和具有示为GACTGCGTACCAATTC(序列号52)的碱基序列的EcoRI通用引物对连接后的DNA片断进行预备扩增；进而，使用第十三引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十三引物对是具有示为GATGAGTCCTGAGTAATGG(序列号35)的碱基序列的引物和具有示为GACTGCGTACCAATTCGGA(序列号36)的碱基序列的引物的组合，即所谓的AFLP(Amplified FragmentLength Polymorphisms)。该遗传标记位于从上述4H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在短臂侧(5’末端侧)约4.0厘摩(以下表示为cM)的位置。

另外，上述AFLP及以下说明中的AFLP的检测顺序没有特别的限定，例如，可以依照文献(Pieter Vos，Rene Hogers，Marjo Bleeker，Martin Reijans，Theo van de Lee，Miranda Hornes，Adrie Frijters，Jerina Pot，Johan Peleman，Martin Kuiper and Marc Zabeau.(1995)AFLP：a new technique for DNAfingerprinting.Nucleic Asids Research.23：21：4407-4414.)的方法或其改变法进行。此外，PCR等扩增反应的各种条件，可以在通常的条件下进行，或者可以在研究最佳条件的基础上适当采用。

在使用上述第十三引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Russia6型)的长度为0bp，患病性型(H.E.S.4型)的长度为约116bp。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Russia6型)不能得到约116bp的扩增片断，与此相对，患病性型(H.E.S.4型)可以得到约116bp的扩增片断。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述AFLP的检测操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该4H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

“FEgggMcaa585”是通过如下方法检测到的遗传标记：在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有示为GACGATGAGTCCTGAG(序列号47)和TACTCAGGACTCAT(序列号48)的碱基序列的MseI连接物以及具有示为CTCGTAGACTGCGTACC(序列号49)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列号50)的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有示为GATGAGTCCTGAGTAA(序列号51)的碱基序列的MseI通用引物和具有示为GACTGCGTACCAATTC(序列号52)的碱基序列的EcoRI通用引物对上述连接后的DNA片断进行预备扩增；进而，使用第十四引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十四引物对是具有示为GATGAGTCCTGAGTAACAA(序列号37)的碱基序列的引物和具有示为GACTGCGTACCAATTCGGG(序列号38)的碱基序列的引物的组合，即所谓的AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphisms)。该遗传标记位于从上述4H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在长臂侧(3’末端侧)约13.9cM的位置。

在使用上述第十四引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Russia6型)的长度为0bp，患病性型(H.E.S.4型)的长度为约585bp。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Russia6型)不能得到约585bp的扩增片断，与此相对，患病性型(H.E.S.4型)可以得到约585bp的扩增片断。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述AFLP的检测操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该4H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

“MEcatMagc467”是通过如下方法检测到的遗传标记：在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有示为GACGATGAGTCCTGAG(序列号47)和TACTCAGGACTCAT(序列号48)的碱基序列的MseI连接物以及具有示为CTCGTAGACTGCGTACC(序列号49)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列号50)的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有示为GATGAGTCCTGAGTAA(序列号51)的碱基序列的MseI通用引物和具有示为GACTGCGTACCAATTC(序列号52)的碱基序列的EcoRI通用引物对上述连接后的DNA片断进行预备扩增；进而，使用第十五引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十五引物对是具有示为GATGAGTCCTGAGTAAACG(序列号39)的碱基序列的引物和具有示为GACTGCGTACCAATTCCAT(序列号40)的碱基序列的引物的组合，即所谓的AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphisms)。该遗传标记位于从上述4H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在短臂侧(5’末端侧)约7.4cM的位置。

在使用上述第十五引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Russia6型)的长度为约467bp，患病性型(H.E.S.4型)的长度为0bp。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Russia6型)可以得到约467bp的扩增片断，与此相对，患病性型(H.E.S.4型)不能得到约467bp的扩增片断。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述AFLP的检测操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该4H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

“MEataMatg396”是通过如下方法检测到的遗传标记：在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有示为GACGATGAGTCCTGAG(序列号47)和TACTCAGGACTCAT(序列号48)的碱基序列的MseI连接物以及具有示为CTCGTAGACTGCGTACC(序列号49)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列号50)的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有示为GATGAGTCCTGAGTAA(序列号51)的碱基序列的MseI通用引物和具有示为GACTGCGTACCAATTC(序列号52)的碱基序列的EcoRI通用引物对上述连接后的DNA片断进行预备扩增；进而，使用第十六引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十六引物对是具有示为GATGAGTCCTGAGTAAATG(序列号41)的碱基序列的引物和具有示为GACTGCGTACCAATTCATA(序列号42)的碱基序列的引物的组合，即所谓的AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphisms)。该遗传标记位于从上述4H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在长臂侧(3’末端侧)约0.6cM的位置。

在使用上述第十六引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Russia6型)的长度为约396bp，患病性型(H.E.S.4型)的长度为0bp。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Russia6型)可以得到约396bp的扩增片断，与此相对，患病性型(H.E.S.4型)不能得到约396bp的扩增片断。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述AFLP的检测操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该4H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

此外，从RI2集团检测出的2H染色体上的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的新的遗传标记可举出“FMaccEacg402”、“HVM36”。

“FMaccEacg402”是通过如下方法检测到的遗传标记：在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有示为GACGATGAGTCCTGAG(序列号47)和TACTCAGGACTCAT(序列号48)的碱基序列的MseI连接物以及具有示为CTCGTAGACTGCGTACC(序列号49)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列号50)的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有示为GATGAGTCCTGAGTAA(序列号51)的碱基序列的MseI通用引物和具有示为GACTGCGTACCAATTC(序列号52)的碱基序列的EcoRI通用引物对上述连接后的DNA片断进行预备扩增；进而，使用第八引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第八引物对是具有示为GATGAGTCCTGAGTAAACC(序列号25)的碱基序列的引物和具有示为GACTGCGTACCAATTCACG(序列号26)的碱基序列的引物的组合，即所谓的AFLP(Amplified FragmentLength Polymorphisms)。该遗传标记位于从上述2H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在短臂侧(5’末端侧)约2.3cM的位置。

在使用上述第八引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的患病性型(Harbin 2-row型)和抵抗性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，患病性型(Harbin 2-row型)的长度为0bp，抵抗性型(Turkey6型)的长度为约402bp。换言之，对大麦黄花叶病为患病性型(Harbin 2-row型)不能得到约402bp的扩增片断，与此相对，抵抗性型(Turkey6型)可以得到约402bp的扩增片断。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述AFLP的检测操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该2H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

应说明的是，本遗传标记连锁的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点是大麦黄花叶病患病性型品种的Turkey6所具有的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点。因此，检测本遗传标记时，Harbin 2-row型成为患病性型，Turkey6型成为抵抗性型。

“HVM36”是使用第九引物对以大麦基因组DNA为模版进行扩增的遗传标记，该遗传标记位于从上述2H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在长臂侧约6.0cM的位置，所述第九引物对是具有示为TCCAGCCGAACAATTTCTTG(序列号27)的碱基序列的引物和具有示为AGTACTCCGACACCACGTCC(序列号28)的碱基序列的引物的组合。该遗传标记是所谓的SSR(Simple Sequence Repeat)标记。

“HVM36”的扩增方法没有特别的限定，可以在研究最佳条件的基础上适当采用。

在使用上述第九引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的患病性型(Harbin 2-row型)和抵抗性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，患病性型(Harbin 2-row型)的长度为约60～30bp，抵抗性型(Turkey6型)的长度为约90～60bp。换言之，对大麦黄花叶病为患病性型(Harbin 2-row型)可以得到约60～30bp的扩增片断，与此相对，抵抗性型(Turkey6型)可以得到约90～60bp的扩增片断。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该2H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

此外，从RI2集团检测出的3H染色体上的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的新的遗传标记可举出“MMattEacg162”、“FMataEgga331”。

“MMattEacg162”是通过如下方法检测到的遗传标记：在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有示为GACGATGAGTCCTGAG(序列号47)和TACTCAGGACTCAT(序列号48)的碱基序列的MseI连接物以及具有示为CTCGTAGACTGCGTACC(序列号49)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列号50)的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有示为GATGAGTCCTGAGTAA(序列号51)的碱基序列的MseI通用引物和具有示为GACTGCGTACCAATTC(序列号52)的碱基序列的EcoRI通用引物对上述连接后的DNA片断进行预备扩增；进而，使用第十引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十引物对是具有示为GATGAGTCCTGAGTAAATT(序列号29)的碱基序列的引物和具有示为GACTGCGTACCAATTCACG(序列号30)的碱基序列的引物的组合，即所谓的AFLP(Amplified FragmentLength Polymorphisms)。该遗传标记位于从上述3H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在短臂侧(5’末端侧)约0.6cM的位置。

在使用上述第十引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Harbin 2-row型)的长度为约162bp，患病性型(Turkey6型)的长度为约170bp。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Harbin 2-row型)可以得到约162bp的扩增片断，与此相对，患病性型(Turkey6型)可以得到约170bp的扩增片断。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述AFLP的检测操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

“FMataEgga331”是通过如下方法检测到的遗传标记：在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有示为GACGATGAGTCCTGAG(序列号47)和TACTCAGGA CTCAT(序列号48)的碱基序列的MseI连接物以及具有示为CTCGTAGACTGCGTACC(序列号49)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列号50)的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有示为GATGAGTCCTGAGTAA(序列号51)的碱基序列的MseI通用引物和具有示为GACTGCGTACCAATTC(序列号52)的碱基序列的EcoRI通用引物对上述连接后的DNA片断进行预备扩增；进而，使用第十一引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十一引物对是具有示为GATGAGTCCTGAGTAAATA(序列号31)的碱基序列的引物和具有示为GACTGCGTACCAATTCGGA(序列号32)的碱基序列的引物的组合，即所谓的AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphisms)。该遗传标记位于从上述4H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在长臂侧(3’末端侧)约6.2cM的位置。

在使用上述第十一引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Harbin 2-row型)的长度为0bp，患病性型(Turkey6型)的长度为约331bp。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Harbin 2-row型)不能得到约331bp的扩增片断，与此相对，患病性型(Turkey6型)可以得到约331bp的扩增片断。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述AFLP的检测操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

此外，从RI2集团检测出的5H染色体上的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的新的遗传标记可举出“FMacgEgat88”、“MMacgEgga74”。

“FMacgEgat88”是通过如下方法检测到的遗传标记：在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有示为GACGATGAGTCCTGAG(序列号47)和TACTCAGGA CTCAT(序列号48)的碱基序列的MseI连接物以及具有示为CTCGTAGACTGCGTACC(序列号49)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列号50)的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有示为GATGAGTCCTGAGTAA(序列号51)的碱基序列的MseI通用引物和具有示为GACTGCGTACCAATTC(序列号52)的碱基序列的EcoRI通用引物对上述连接后的DNA片断进行预备扩增；进而，使用第十七引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十七引物对是具有示为GATGAGTCCTGAGTAAACG(序列号43)的碱基序列的引物和具有示为GACTGCGTACCAATTCGAT(序列号44)的碱基序列的引物的组合，即所谓的AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphisms)。该遗传标记位于从上述5H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在短臂侧(5’末端侧)约3.8cM的位置。

在使用上述第十七引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Harbin 2-row型)的长度为0bp，患病性型(Turkey6型)的长度为约88bp。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Harbin 2-row型)不能得到约88bp的扩增片断，与此相对，患病性型(Turkey6型)可以得到约88bp的扩增片断。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述AFLP的检测操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该5H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

“MMacgEgga74”是通过如下方法检测到的遗传标记：在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有示为GACGATGAGTCCTGAG(序列号47)和TACTCAGGA CTCAT(序列号48)的碱基序列的MseI连接物以及具有示为CTCGTAGACTGCGTACC(序列号49)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列号50)的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有示为GATGAGTCCTGAGTAA(序列号51)的碱基序列的MseI通用引物和具有示为GACTGCGTACCAATTC(序列号52)的碱基序列的EcoRI通用引物对上述连接后的DNA片断进行预备扩增；进而，使用第十八引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十八引物对是具有示为GATGAGTCCTGAGTAAACG(序列号45)的碱基序列的引物和具有示为GACTGCGTACCAATTCGGA(序列号46)的碱基序列的引物的组合，即所谓的AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphisms)。该遗传标记位于从上述5H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在长臂侧(3’末端侧)约17.1cM的位置。

在使用上述第十八引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Harbin 2-row型)的长度为约74bp，患病性型(Turkey6型)的长度为0bp。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Harbin 2-row型)可以得到约74bp的扩增片断，与此相对，患病性型(Turkey6型)不能得到约74bp的扩增片断。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述AFLP的检测操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该5H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

此外，从DHHS集团检测出的1H染色体上的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的新的遗传标记可举出“k03861”、“k03616”、“k02325”。

“k03861”是使用第五引物对以大麦基因组DNA为模板进行扩增的遗传标记，其位于从上述1H染色体上检测出的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在长臂侧约15.5cM的距离，所述第五引物对是具有示为ACGATCGATCAAAAGGACCA(序列号19)的碱基序列的引物和具有示为AATCCGACGAAATCAACGAG(序列号20)的碱基序列的引物的组合。上述引物序列是根据本发明人等独立开发出的大麦EST序列之一(EST克隆名称：bah27k23、序列号53)进行设计的。

“k03861”的扩增方法没有特别的限定，可以在研究最佳条件的基础上适当采用。

在使用上述第五引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的患病性型(春名二条型)和抵抗性型(H602型)，患病性型(春名二条型)的扩增片断的长度为约379bp，与此相对，抵抗性型(H602型)的扩增片断的长度为约353bp。因此，用电泳等公知的方法确认通过上述检测操作所得到的扩增产物的片断长度，由此可以对对象大麦个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

另外，本遗传标记连锁的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点是大麦黄花叶病患病性型品种的H602所具有的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点。因此，检测本遗传标记时，春名二条成为患病性型，H602成为抵抗性型。

“k03616”是使用第六引物对以大麦基因组DNA为模板进行扩增的遗传标记，其位于从上述1H染色体上检测出的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在短臂侧约1.4cM的距离，所述第六引物对是具有示为CTCGATCATCAGCGACTTCA(序列号21)的碱基序列的引物和具有示为GAAGAGGCACCTTCTGCAAC(序列号22)的碱基序列的引物的组合。上述引物序列是根据本发明人等独立开发出的大麦EST序列之一(EST克隆名称：bah13e15、序列号54)进行设计的。

“k03616”的扩增方法没有特别的限定，可以在研究最佳条件的基础上适当采用。

在使用上述第六引物对进行最终扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(春名二条型)和患病性型(H602型)，两者之间具有SNP(single nucleotide polymorphism、一碱基多态性)。图9表示两者的扩增产物的碱基序列中含有上述SNP的部分碱基序列。上面为患病性型(H602型)的碱基序列(序列号55)，下面为抵抗性型(春名二条型)的碱基序列(序列号56)。用□(四边形)括起来的碱基是SNP。下划线部分表示限制性内切酶MboI的识别序列(GATC)。由图9可知，患病性型的扩增产物由于具有限制性内切酶MboI的识别序列(GATC)而被MboI切断，由于抵抗性型的扩增产物的上述识别序列部分的C变异成A(GATA)而不被限制性内切酶MboI切断。即，本遗传标记k03616是CAPS(cleavedamplified polymorphic sequence)标记，如果用上述第六引物对进行扩增，则通过扩增产物的限制性内切酶MboI切断，可以对对象个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

“k02325”是使用第七引物对以大麦基因组DNA为模板进行扩增的遗传标记，其位于从上述1H染色体上检测出的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在长臂侧约4.3cM的距离，所述第七引物对是具有示为AATGTGCACACCAAGGTTGA(序列号23)的碱基序列的引物和具有示为AGACAACAACCGCCTGTACC(序列号24)的碱基序列的引物的组合。上述引物序列是根据本发明人等独立开发出的大麦EST序列之一(EST克隆名称：bags1f22、序列号57)进行设计的。

“k02325”的扩增方法没有特别的限定，可以在研究最佳条件的基础上适当采用。

在使用上述第七引物对进行扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(春名二条型)和患病性型(H602型)，两者之间具有SNP(singlenucleotide polymorphism、一碱基多态性)。图10表示两者的扩增产物的碱基序列中含有上述SNP的部分碱基序列。上面为患病性型(H602型)的碱基序列(序列号58)，下面为抵抗性型(春名二条型)的碱基序列(序列号59)。用□(四边形)括起来的碱基是SNP。下划线部分表示限制性内切酶HapII的识别序列(CCGG)。由图10可知，抵抗性型的扩增产物由于具有限制性内切酶HapII的识别序列(CCGG)而被HapII切断，由于患病性型的扩增产物的上述识别序列部分的C变异成T(CTGG)而不被限制性内切酶HapII切断。即，本遗传标记k02325是CAPS(cleavedamplified polymorphic sequence)标记，如果用上述第七引物对进行扩增，则通过扩增产物的限制性内切酶HapII切断，可以对对象大麦个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

“k07966”是使用第十二引物对以大麦基因组DNA为模板进行扩增的遗传标记，其位于从上述3H染色体上检测出的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在长臂侧约4.8cM的距离，所述第十二引物对是具有示为ATGGACCCAACAAGTGGAAG(序列号33)的碱基序列的引物和具有示为AGGAAGACTTTGGAGGCCAT(序列号34)的碱基序列的引物的组合。上述引物序列是根据本发明人等独立开发出的大麦EST序列之一(EST克隆名称：BaGS7G14、序列号60)进行设计的。

“k07966”的扩增方法没有特别的限定，可以在研究最佳条件的基础上适当采用。

在使用上述第十二引物对进行扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(春名二条型)和患病性型(H602型)，两者之间具有SNP(single nucleotide polymorphism、一碱基多态性)。图11表示两者的扩增产物的碱基序列中含有上述SNP的部分碱基序列。上面为患病性型(H602型)的碱基序列(序列号61)，下面为抵抗性型(春名二条型)的碱基序列(序列号62)。用□(四边形)括起来的碱基是SNP。下划线部分表示限制性内切酶HapII的识别序列(CCGG)。由图11可知，抵抗性型的扩增产物由于具有限制性内切酶HapII的识别序列(CCGG)而被HapII切断，由于患病性型的扩增产物的上述识别序列部分的G变异成T(CCTG)而不被HapII切断。即，本遗传标记k07966是CAPS(cleaved amplifiedpolymorphic sequence)标记，如果用上述第十二引物对进行扩增，则通过扩增产物的限制性内切酶HapII切断，可以对对象大麦个体位于该3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因判定是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

在此，1厘摩(1cM)是表示2个基因位点之间以1％的频率引起交叉时的两基因位点之间的距离的单位。例如，1.4cM表示在大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点与遗传标记之间平均每个染色单体发生1000分之14次交换。即，此时表示约1.4％的重组率。

扩增时作为模板使用的基因组DNA可以用以往公知的方法从植物体中提取。具体而言，可以举出优选的例子，即用于从植物体提取基因组DNA的普通方法(参照Murray，M.G.and W.F.Thompson(1980)，NucleicAcids Res.8：4321-4325.等)。此外，上述基因组DNA还可以使用根、茎、叶、生殖器官等构成大麦植物体的任意组织来进行提取。根据情况，也可以从大麦的愈伤组织中提取。上述生殖器官还包括花器官(含有雄性·雌性生殖器官)及种子。基因组DNA的提取使用如大麦的幼芽期的叶来进行。其理由可以举出如下各点，即组织的磨碎较容易、多糖类等杂质的混合比例较少、而且可以在短时间内从种子培育成。还可以举出能够在幼苗阶段进行个体选拔，能够大幅度地缩短育种期间的优点。

以大麦的基因组DNA为模板，使用上述引物的组合来扩增的方法，可以采用以往公知的DNA扩增法。一般使用PCR法(聚合酶链反应法)或其改变法。使用PCR法或其改变法时的反应条件没有特别的限定，可以在与通常相同的条件下进行扩增。

通过使用本发明所述的遗传标记，可以分离含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断，通过使用上述DNA片断，可以用于大麦黄花叶病抵抗性相关的基因和大麦黄花叶病抵抗性机制的阐明中。此外，通过将上述DNA片断导入大麦的基因组DNA中，可以生产(育种)大麦黄花叶病抵抗性大麦。

此外，由于上述遗传标记与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，因此通过检测在作为试验对象的大麦的基因组DNA中的该遗传标记的多态性，就可以判定大麦是否具有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点。同样地，由于与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，因此通过检测在作为试验对象的大麦的基因组DNA中的该遗传标记的多态性，可以判定大麦是否是大麦黄花叶病抵抗性大麦。此外，如果将能够扩增上述遗传标记的引物或固定有上述遗传标记的DNA微阵列试剂盒化，则可以提供大麦有无大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的判定试剂盒以及大麦黄花叶病抵抗性大麦的判定试剂盒。

如上所述，明确本发明所述的遗传标记可以用于各种用途中。下面对上述本发明所述的遗传标记用途之一例进行详细说明。

(2)本发明的利用

[含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断的分离方法]

如上所述，本发明所述的遗传标记(k00256、K02948、k03861、k03616、k02325)与在大麦1H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，本发明所述的遗传标记(FMaccEacg402、HVM36)与在大麦2H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，本发明所述的遗传标记(k04143、k00169、k07966、MMattEacg162、FMataEgga331)与在大麦3H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，本发明所述的遗传标记(FEggaMtgg116、FEgggMcaa585、MEcatMagc467、MEataMatg396)与在大麦4H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁，本发明所述的遗传标记(FMacgEgat88、MMacgEgga74)与在大麦5H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁。

因此，通过使用k00256、k02948、k03861、k03616、k02325的遗传标记可以分离含有在大麦1H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断，通过使用FMaccEacg402、HVM36的遗传标记可以分离含有在大麦2H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断，通过使用k04143、k00169、k07966、MMattEacg162、FMataEgga331的遗传标记可以分离含有在大麦3H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断，通过使用FEggaMtgg116、FEgggMcaa585、MEcatMagc467、MEataMatg396的遗传标记可以分离含有在大麦4H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断，通过使用FMacgEgat88、MMacgEgga74的遗传标记可以分离含有在大麦5H染色体上检测到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断。

分离自然是指克隆目的的DNA片断，即克隆含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断，分离在广义上还包括通过用杂交F1集团回交等，选拔具有含有双亲本中一方的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断的个体，仅将该基因位点区域导入目的品种中的同源基因系统的制作。

使用本发明所述的遗传标记来分离含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断的方法没有特别的限定，例如可以举出如下的方法。

对于大麦而言，包括本发明人等不断开发的“春名二条”在内，已制成2种基因组DNA的BAC文库，现在多个BAC文库在开发中。因此，使用这种BAC文库，依照以往公知的定位克隆方法，用大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点和与该基因连锁的本发明的遗传标记来鉴定含有该标记的BAC克隆，由此制成BAC的叠连序列来确定碱基序列，从而最终可以到达大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点。

如上所述，通过将杂交F1与一方的亲本进行回交，可以将含有另一亲本的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断导入(广义的)目的品种之中来进行分离。

另外，分离以上述方法为代表的含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断时，选择位于相对于作为目的的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点尽可能近的遗传标记来使用是优选的。这是因为在作为目的的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点和遗传标记之间发生重组的概率变得更低，能够更准确地分离含有该大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点片断的缘故。

[大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产方法以及通过该生产方法得到的大麦黄花叶病抵抗性大麦]

通过在大麦的基因组DNA中导入含有通过含有上述本发明所述的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断的分离方法而得到的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断，可以生产大麦黄花叶病抵抗性改变大麦。然而，为了生产大麦黄花叶病抵抗性大麦，必需从大麦黄花叶病抵抗性品种中分离含有上述大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断，并导入到大麦黄花叶病敏感性的品种中。

导入上述DNA片断的方法没有特别的限定，可以适当选择公知的方法来使用。更具体而言，可以通过使用例如土壤杆菌法或基因枪法。例如，在杂志The Plant Journal(1997)11(6)，1369-1376中公开有由Sonia Tingay等人使用Agrobacterium tumefaciens来对大麦进行转化的方法，可以利用该方法生产转化大麦。

导入于大麦中的含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断无论是选自1H染色体上的DNA片断、2H染色体上的DNA片断、3H染色体上的DNA片断、4H染色体上的DNA片断、5H染色体上的DNA片断中的任意的DNA片断，都可以生产大麦黄花叶病抵抗性大麦，通过将多个DNA片断导入到同一大麦的基因组DNA中，可以生产大麦黄花叶病抵抗性进一步提高的大麦。

此外，通过杂交大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的基因型为抵抗性的大麦个体和要导入该DNA片断的大麦黄花叶病敏感性大麦个体，也可以导入含有抵抗性大麦个体的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断。

本发明所述的大麦黄花叶病抵抗性大麦是通过上述本发明所述的生产方法得到的。通过上述本发明所述的生产方法，可以容易且准确地生产出大麦黄花叶病抵抗性大麦，因此可以防大麦黄花叶病的发生于未然，可以有助于收获量的稳定增多。

[大麦黄花叶病抵抗性大麦的判定方法(选拔方法)]

本发明所述的大麦黄花叶病抵抗性大麦的判定方法(选拔方法)只要是以上述本发明所述的遗传标记作为指标来判定(选拔)大麦黄花叶病抵抗性大麦的方法即可，其它工序、条件、材料等没有特别的限定。例如，可以利用以往公知的农作物育种法。

更详细而言，可以例举出，提取通过杂交等制成的大麦的基因组DNA，以本发明所述的遗传标记的基因型为指标来判定(选拔)大麦的方法。检测遗传标记的方法可以例举出，把从作为对象的大麦中提取出的基因组DNA作为模板，对于使用上述第一～第十八引物对中的任意一对进行扩增的DNA片断，观察片断长度或片断的限制性内切酶消化图案。根据扩增片断，对于试验对象大麦个体与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，以各遗传标记为指标来判定是具有抵抗性的基因型还是具有患病性的基因型的方法，此方法如在上述本发明所述的遗传标记各项中所说明。

在此，本判定方法的判定准确度(概率)如下。位于从大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始1.4cM的距离的遗传标记，在大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点与遗传标记之间每个染色分体平均发生1000分之14次交换。即以约1.4％的概率发生重组。因此，在该遗传标记中，只要检测出大麦黄花叶病抵抗性型的基因，就可以说以98.6％的概率具有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点。因此，可以说大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点与遗传标记的距离越近，就可以高概率地判定有无大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点，即可以判定(选拔)大麦黄花叶病抵抗性大麦。

根据上述理由，检测多态性的遗传标记，无论是上述遗传标记的任意一种都可以判定有无大麦黄花叶病抵抗性，优选检测位于相对于各大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点尽可能近的遗传标记。例如，在本判定方法中检测1H染色体上的与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记时，可以说比起“k02325”(从大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始的距离：约4.3cM)更优选“k03616”(从大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始的距离：约1.4cM)。

此外，在本检测方法中，也可以检测多个遗传标记的多态性。特别是为了使判定准确度(概率)提高，可以选择具有夹持大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的关系的遗传标记来进行多态性检测。例如，有“k03616”(从大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在短臂侧约1.4cM)和“k02325”(从大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始的距离：约4.3cM)的组合。以所述组合为例，对该遗传标记分别单独地检测多态性时及检测双方的多态性时，对于本判定方法的准确度(概率)进行更具体的说明。

“k03616”位于从大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始在短臂侧约1.4cM的位置，单独检测该遗传标记的多态性时的本判定方法的准确度(概率)为(1-14÷1000)×100＝约98.6％。另一方面，“k02325”位于从大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点开始的距离：4.3cM的位置，同样地计算单独多态性地检测该遗传标记的多态性时的本判定方法的准确度(概率)，为95.7％。检测该2个遗传标记的多态性两者时，为(1-(14÷1000)×(43÷1000))×100＝99.940％，可以高概率地判定1H上有无大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点。

因此，优选检测具有夹持大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的关系的遗传标记来进行判定。除了上述“k03616”和“k02325”的组合之外，还可以举出“FEggaMtgg116”和“FEgggMcaa585”的组合、“MEcatMagc467”和“MEataMatg396”的组合、“MMattEacg162”和“FMataEgga331”的组合、“FMacgEgat88”和“MMacgEgga74”的组合、“FMaccEacg402”和“HVM36”的组合、“k02948”和“k03861”的组合、“k00169”和“k07966”的组合、“k04143”和“k00169”的组合、“k00256”和“k02948”的组合等。

另外，本判定方法可以用作大麦黄花叶病抵抗性大麦育种时的有效的筛选方法。例如，进行上述本发明所述的大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产方法时，可以从多个转化体候补中容易地筛选导入有含大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断的转化体大麦。也可以用作进行了其他药物制剂等的变异处理、杂交等育种处理的大麦的筛选方法。

[大麦黄花叶病抵抗性大麦的判定试剂盒]

此外，通过将用于进行上述“大麦黄花叶病抵抗性大麦的判定方法”所必需的试剂、酶类试剂盒化，可以构成大麦黄花叶病抵抗性大麦的判定试剂盒(以下有时称为“判定试剂盒”)。如在上述“大麦黄花叶病抵抗性大麦的判定方法”一项中所述，通过利用本发明所述的遗传标记，对于试验对象大麦个体的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，可以判定是具有抵抗性的基因型还是具有患病性的基因型。即，可以判断试验对象的大麦个体是大麦黄花叶病抵抗性还是患病性。因此，通过该判断试剂盒，发挥可以更简便地判断大麦黄花叶病抵抗性大麦的效果。

另外，在该判定试剂盒中，优选至少含有能够检测本发明所述的遗传标记的引物对(第一～第十八引物对)中的至少一对或更多。进一步优选含有上述引物对(第一～第十八引物对)全部。此外，还可以含有用于检测公知的与大麦黄花叶病抵抗性连锁的标记所必要的引物。

进而，在该判断试剂盒中，还可以含有用于进行PCR的酶、试剂类，还可以含有用于制备成为模板的基因组DNA所必需的试剂、缓冲液类、离心管，还可以含有检测目的DNA大小带所必需的遗传标记(k00256、k02948、k04143、k00169、FEggaMtgg116、FEgggMcaa585、MEcatMagc467、MEataMatg396、MMattEacg162、FMataEgga331、FMacgEgat88、MMacgEgga74、FMaccEacg402、HVM36、k03861、k03616、k02325、k07966)或适当的DNA大小标记。

[基因检测器具(DNA微阵列)]

通过将本发明所述的遗传标记(k00256、k02948、k04143、k00169、FEggaMtgg116、FEgggMcaa585、MEcatMagc467、MEataMatg396、MMattEacg162、FMataEgga331、FMacgEgat88、MMacgEgga74、FMaccEacg402、HVM36、k03861、k03616、k02325、k07966等)固定在适当的基板(玻璃、硅片、尼龙膜等)上，从而可以构成以DNA微阵列为代表的基因检测器具。对于该基因检测器具(DNA微阵列)，使其与由试验对象的大麦制成的探针反应，检测此时产生的信号，由此可以容易且同时地检测多个本发明所述的遗传标记。因此，该基因检测器具(DNA微阵列)可以作为检测本发明所述的遗传标记的多态性的装置使用。因此，可以作为在上述大麦黄花叶病抵抗性大麦的判定方法中的检测装置使用。此外，还可以将该DNA微阵列添加到上述大麦黄花叶病抵抗性大麦的判定试剂盒中。在这种情况下，在该试剂盒中也可以含有用于检测源自基因检测器具(DNA微阵列)的信号的试剂·器具·装置等。

可以在本基因检测器具(DNA微阵列)的基板上固定本发明所述的遗传标记(k00256、k02948、k04143、k00169、FEggaMtgg116、FEgggMcaa585、MEcatMagc467、MEataMatg396、MMattEacg162、FMataEgga331、FMacgEgat88、MMacgEgga74、FMaccEacg402、HVM36、k03861、k03616、k02325、k07966)中的至少1个或更多个的遗传标记。此外，可以固定抵抗性型的遗传标记、患病性型的遗传标记中的任意一方或两方。进而，为了更准确(概率)地判断大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的有无，优选固定具有夹持大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的关系的多个遗传标记的组合。所述的遗传标记的组合可以例举出“k00256”和“k02948”的组合、“k04143”和“k00169”的组合、“FEggaMtgg116”和“FEgggMcaa585”的组合、“MEcatMagc467”和“MEataMatg396”的组合、“MMattEacg162”和“FMataEgga331”的组合、“FMacgEgat88”和“MMacgEgga74”的组合、“FMaccEacg402”和“HVM36”的组合、“k02948”和“k03861”的组合、“k03616”和“k02325”的组合、“k00169”和“k07966”的组合等。自然最优选固定所有的遗传标记(抵抗性型和患病性型)。

通过使用固定有上述多个遗传标记的基因检测器具(DNA微阵列)，可以在一次试验中简便地检测多个遗传标记。进而可以高准确度(概率)地进行有无大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的判断。

另外，在上述基因检测器具(DNA微阵列)中，不仅可以固定本发明所述的遗传标记，还可以固定位于其附近的其他遗传标记。

进而，优选在上述基因检测器具(DNA微阵列)中，将本发明所述的遗传标记按在大麦染色体上排列的顺序进行固定，或者给予对应于在大麦染色体上排列的顺序的序列位置信息后进行固定。这是能够使检测准确度进一步提高的缘故。即，在以往使用DNA微阵列的解析中，不能得到对于某位点的信号时，是真的不存在所要检测的遗传标记，还是由于解析实验中的错误而得不到信号，对此，不重新进行确认就不能进行正确地判定。对此，在使用按如上的遗传标记在大麦的染色体上排列的顺序来固定的、或者与在大麦的染色体上排列的顺序相对应的带有序列位置信息来固定的基因检测器具(DNA微阵列)时，由于被排序成能够确认所被固定的遗传标记的染色体上的顺序，因此可以容易地判定在上述那样的实验中是否有错误。

具体而言，例如在没有得到信号的位点前后的位点中获得了信号。在该基因检测器具(DNA微阵列)中，各位点被排序成能够确认在染色体上排列的顺序。通常，为了在染色体上仅重组在直线排列上紧邻的基因中的一个基因，必须在极为相近的距离内发生2次重组。这种现象发生的概率极低，因此没有得到信号的结果被判断是实验上的错误引起的。这样，在该基因检测器具(DNA微阵列)中，即使得不到对某位点的信号时，也可以容易地判定是否是实验上的错误，因此可以提高解析的准确度。

应说明的是，本发明不限于上述的各实施方式，可以在权利要求所述的范围内进行各种变更，适当组合在不同的实施方式中分别公开的技术方法而得到的实施方式也包括在本发明的技术范围中。

另外，本发明的说明中所使用的引物等的碱基序列只要能够扩增本发明所述的遗传标记，则可以使用具有1个或多个碱基被取代、缺失、附加的碱基序列的引物。

下面用实施例更具体地说明本发明，但本发明并不限于此。

[使用植物]

培养由酿造用大麦“春名二条”(Hordeum vulgare ssp.vulgare varietyHarunanijo、抵抗性)和野生大麦“H602”(Hordeum vulgare ssp.spontaneumH602、患病性)杂交而得到的F1的花粉，培育成的单倍体(haploid)，使用含有自然倍加而得的双单倍体(doubled haploid)93个的集团(DHHS集团)。

还使用由对大麦黄花叶病的抵抗性不同的大麦品种Russia6(二条、抵抗性)和H.E.S.4(六条、患病性)杂交而培育成的RI系统(RI1集团)、由Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey6(患病性)杂交而培育成的RI系统(RI2集团)。

[连锁图的制作]

将本发明人等所拥有的大麦EST序列约12万用phred再次进行碱基判定(ベ一スコ一ル)之后，用quality score 20进行修整、载体掩蔽(ベクタ一マスキング)，从而得到3’端约6万序列。由这些序列用phrap制成含有contig8753、singlet6686的Unigene。通过引物制作软件Primer3，制成以400bp为中心地扩增149-490bp的cDNA序列的引物对约11000。其中，对于约5100的引物对而言，为了检测春名二条和H602之间被扩增的基因组片断的多态性的有无，将各个基因组DNA进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳研究带的有无、带的数目、带的大小，从而选择能够成为标记的带。进而，在带的大小中没有多态性时，通过把扩增片断定向测序来检测碱基序列的差异，选择对39种限制性内切酶能够CAPS(cleavedamplified polymorphic sequence)化的物质作为标记。

由此，对于上述源自春名二条和H602的杂交F1的DHHS集团而言，构建了含有合计499基因位点的标记的连锁图。该连锁图的平均标记密度为3.0cM/locus，全长为1470cM。

[基因型的判定]

DHHS集团各个体的基因型的判定是在上述DHHS集团的连锁图上用作图的标记来进行。即，以从各个体的新鲜叶组织分离出的DNA作为模版，使用根据EST序列设计成的引物对来进行PCR。对于片断长度多态性标记，用PCR产物的电泳判定基因型。对于CAPS(cleaved amplifiedpolymorphic sequence)标记，将PCR产物用限制性内切酶消化，并通过电泳判定基因型。

[大麦黄花叶病抵抗性的检测]

在被认为大麦黄花叶病的发病显著的冈山大学资源生物科学研究所的田地里，栽培Russia6、H.E.S.4及RI1集团的各系统、Harbin 2-row、Turkey6和RI2集团的各系统、H602、春名二条和DHHS集团的各系统。然后，在3月初用肉眼确认各系统的花叶病病斑，进行评分，作为大麦黄花叶病抵抗性的程度。分数按花叶病病斑的程度如下进行分类。

分数1(高度抵抗性)：完全观察不到花叶病斑。

分数2(抵抗性)：部分观察到少量的花叶病斑。

分数3(抵抗性中等)：容易观察到花叶病斑。

分数4(患病性)：观察到强的花叶病斑。

分数5(高度患病性)：观察到显著的花叶病。

另外，对大麦黄花叶病具有高度抵抗性的来源于中国的六条大麦木石港3和将对大麦黄花叶病具有高度患病性的酿造用二条大麦甘木二条作为对照使用。

[实施例1：关于大麦的黄花叶病抵抗性的QTL解析]

在QTL解析的算法中，使用简单区间作图(simple interval mapping、以下简称为“SIM”)和复合区间作图(composite interval mapping、以下简称为“CIM”)，解析软件分别使用MAPMAKER/QTL和QTL Cartographer进行。LOD分数的阈值设为2，LOD分数超过2时，推定QTL存在于该2个标记区间内的LOD最大的位置。

[结果]

将DHHS集团的结果示于表1中，将RI1集团的结果示于表2中，将RI2集团的结果示于表3中。应说明的是，上述表1～3中的“集团”是指“进行了QTL解析的集团名”，“性状”是指“性状”，“染色体”是指“遗传标记所在的染色体”，“标记间隔(M1-A-QTL-B-M2)”是指“位于QTL的附近，夹着该QTL的2个遗传标记(M1、M2)”，“距离(cM)A+B”是指“夹着QTL的2个遗传标记间的距离”，“位置^a)(cM)A”是指“遗传标记M1和QTL之间的距离”，“位置(cM)B”是指“遗传标记M2和QTL之间的距离”，“LOD^b)分数”是指“LOD分数的峰值”，“Var.(％)^c)”是指“表示通过QTL的存在能够说明表现型的分散为多少(％)的值”，“重量^d)”是指“表示通过QTL的存在上述“切穗检测法”的分数提高多少的值”。

[表1]

集团	性状	解析算法	染色体	标记间隔(M1-A-QTL-B-M2)	距离(cM)A+B	位置^a)(cM)A	位置(cM)B	LOD^b)分数	Var.^c)(％)	重量^d)
集团	性状	解析算法	染色体	标记间隔(M1-A-QTL-B-M2)	距离(cM)A+B	位置^a)(cM)A	位置(cM)B	LOD^b)分数	Var.^c)(％)	重量^d)	DHHS	抵抗BaYMV
		SIMSIMCIMSIMCIMSIMCIM	1H3H3H1H1H3H3H	k00256-k02948k04143-k00169k04143-k00169k02948-k03861k03616-k02325k00169-k07966k04143-k00169	7.813.413.415.55.74.813.1	7.8013.101.4013.1	013.40.315.54.34.80	2.54.42.22.52.64.43.5	12.52.134.712.516.32.130.6	0.4-0.5-0.90.4-0.6-0.5-0.8	DHHS	抵抗BaYMV

a)：从左侧标记开始的LOD分数峰值位置的距离

b)：显著标记间隔的LOD分数峰值

c)：LOD分数峰值的方差说明

d)：预测的附加效果

由表1可知，用SIM在1H染色体上，检测出位于夹在k00256和k02948的位置的QTL，检测出位于夹在k02948和k03861的位置的QTL。然而，在连锁图上从短臂侧按k00256、k02948、k03861的顺序排序这些标记，因此，通过k00256和k02948检测出的QTL和通过k02948和k03861检测出的QTL表现为位于相同位置(k02948的位置上有QTL)。

此外，用SIM在3H染色体上，检测出位于夹在k04143和k00169的位置的QTL，检测出位于夹在k00169和k07966的位置的QTL。进而，用CIM在3H染色体上，检测出位于夹在k04143和k00169的位置的QTL。用CIM在1H染色体上，检测出位于夹在k03616和k02325的位置的QTL然而，在3H染色体的连锁图上从短臂侧按k04143、k00169、k07966的顺序排序这些标记，则用CIM喻示QTL存在于极为靠近k00169的位点(从k00169开始在长臂侧约0.3cM)，因此通过SIM和CIM在3H染色体上检测出的QTL被认为是相同的QTL。

因此，对于大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的QTL解析的结果为：在1H染色体上检测出2个QTL，即位于夹在k00256、k02948和k03861的位置的QTL和位于夹在k03616和k02325的位置的QTL。此外，在3H染色体上检测出1个QTL，即位于夹在k04143、k00169和k07966的位置的QTL。

用SIM在1H染色体上检测出的QTL，位于按从遗传标记k00256开始在长臂侧约7.8cM的距离、从遗传标记k02948开始0.0cM的距离、从遗传标记k03861开始在短臂侧15.5cM的距离被这些遗传标记所夹的位置，LOD分数为2.5。可以用该QTL说明表现型分散的12.5％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.4稍弱。

用SIM在3H染色体上检测出一方的QTL，位于按从遗传标记k04143开始0.0cM的距离、从遗传标记k00169开始在短臂侧13.4cM的距离被两个遗传标记所夹的位置，LOD分数为4.4。可以用该QTL说明表现型分散的2.1％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.5稍强。

用SIM在3H染色体上检测出另外的QTL，位于按从遗传标记k00169开始0.0cM的距离、从遗传标记k07966开始在短臂侧4.8cM的距离被两个遗传标记所夹的位置，LOD分数为4.4。可以用该QTL说明表现型分散的2.1％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.5稍强。

用CIM在1H染色体上检测出的QTL，位于按从遗传标记k03616开始在长臂侧1.4cM的距离、从遗传标记k02325开始在短臂侧4.3cM的距离被两个遗传标记所夹的位置，LOD分数为2.6。可以用该QTL说明表现型的16.3％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.6稍强。

用CIM进行的3H染色体上的QTL的检测，进行2次。在第1次检测中，QTL位于按从遗传标记k04143开始在长臂侧13.1cM的距离、从遗传标记k00169开始0.0cM的距离被两个遗传标记所夹的位置，LOD分数为2.2。可以用该QTL说明表现型分散的34.7％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.9稍强。在第2次检测中，QTL位于按从遗传标记k04143开始在长臂侧13.1cM的距离、从遗传标记k00169开始0.0cM的距离被两个遗传标记所夹的位置，LOD分数为3.5。可以用该QTL说明表现型分散的30.6％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.8稍强。

[表2]

集团	性状	解析算法	染色体	标记间隔(M1-A-QTL-B-M2)	距离(cM)A+B	位置^a)(cM)A	位置(cM)B	LOD^b)分数	Var.^c)(％)	重量^d)
集团	性状	解析算法	染色体	标记间隔(M1-A-QTL-B-M2)	距离(cM)A+B	位置^a)(cM)A	位置(cM)B	LOD^b)分数	Var.^c)(％)	重量^d)	RI1	抵抗BaYMV
		SIMCIM	4H4H	FEggaMtgg116-FEggMcaa585MEcatMagc467-MEataMatg396	17.98.0	4.07.4	13.90.6	2.94.2	15.021.9	-0.4-0.6	RI1	抵抗BaYMV

a)：从左侧标记开始的LOD分数峰值位置的距离

b)：显著标记间隔的LOD分数峰值

c)：LOD分数峰值的方差说明

d)：预测的附加效果

由表2可知，在RI1集团中，在4H染色体上检测出2个与大麦黄花叶病抵抗性相关的QTL。

另一方面，用SIM检测出的QTL，位于按从遗传标记FEggaMtgg116开始在长臂侧4.0cM的距离、从遗传标记FEgggMcaa585开始在短臂侧13.9cM的距离被两个遗传标记所夹的位置，LOD分数为2.9。可以用该QTL说明表现型分散的15.0％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.4稍强。

另一方面，用CIM检测出的QTL，位于按从遗传标记MEcatMagc467开始在长臂侧约7.4cM的距离、从遗传标记MEataMatg396开始在短臂侧0.6cM的距离被两个遗传标记所夹的位置，LOD分数为4.2。可以用该QTL说明表现型的21.9％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.6稍强。

[表3]

集团	性状	解析算法	染色体	标记间隔(M1-A-QTL-B-M2)	距离(cM)A+B	位置^a)(cM)A	位置(cM)B	LOD^b)分数	Var.^c)(％)	重量^d)
集团	性状	解析算法	染色体	标记间隔(M1-A-QTL-B-M2)	距离(cM)A+B	位置^a)(cM)A	位置(cM)B	LOD^b)分数	Var.^c)(％)	重量^d)	RI2	抵抗BaYMV
		SIMCIMCIM	3H5H2H	MMattEacg162-FMataEgga331FMacgEgat88-MMacgEgga74FMaccEacg402-HVM36	6.820.99.3	0.63.82.3	6.217.16.0	2.52.83.4	11.69.518.7	-0.6-0.60.6	RI2	抵抗BaYMV

a)：从左侧标记开始的LOD分数峰值位置的距离

b)：显著标记间隔的LOD分数峰值

c)：LOD分数峰值的方差说明

d)：预测的附加效果

由表3可知，在RI2集团中，在2H染色体上检测出1个大麦黄花叶病抵抗性相关的QTL，在3H染色体上检测出1个大麦黄花叶病抵抗性相关的QTL，在5H染色体上检测出1个大麦黄花叶病抵抗性相关的QTL。

2H染色体上的QTL是用CIM检测出的，其位于按从遗传标记FMaccEacg402开始在长臂侧约2.3cM的距离、从遗传标记HVM36开始在短臂侧6.0cM的距离被两个遗传标记所夹的位置，LOD分数为3.4。可以用该QTL说明表现型的18.7％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.6稍弱。

3H染色体上的QTL是用SIM检测出的，其位于按从遗传标记MMattEacg162开始在长臂侧约0.6cM的距离、从遗传标记FMataEgga331开始在短臂侧6.2cM的距离被两个遗传标记所夹的位置，LOD分数为2.5。可以用该QTL说明表现型的11.6％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.6稍强。

5H染色体上的QTL是用CIM检测出的，其位于按从遗传标记FMacgEgat88开始在长臂侧3.8cM的距离、从遗传标记MMacgEgga74开始在短臂侧17.1cM的距离被两个遗传标记所夹的位置，LOD分数为2.8。可以用该QTL说明表现型的9.5％。此外，由于该QTL的存在，大麦黄花叶病抵抗性的分数变成0.6稍强。

[实施例2：遗传标记“FEggaMtgg116”的检测]

(方法)

对50ng的试验对象大麦的基因组DNA用各1.5U的EcoRI(TAKARABIO公司制)和MseI(NEW ENGLAND Biolabs公司制)在合计25μl的反应体系中于37℃下进行双消化12小时。在限制性内切酶处理后的DNA上，与5μM的EcoRI连接物(碱基序列示于序列号49和序列号50中)和50μM的MseI连接物(碱基序列示于序列号47和序列号48中)用25U的T4连接酶(TAKARABIO公司制)于37℃下进行3小时连接。对上述连接后的DNA片断用EcoRI通用引物(碱基序列示于序列号52中)和MseI通用引物(碱基序列示于序列号51中)进行预扩增(预备扩增)。在0.07mg/ml的预扩增反应溶液中，使用具有序列号36所示的碱基序列的EcoRI的选择引物和具有序列号35所示的碱基序列的MseI的选择引物来进行扩增反应(本扩增)。另外，在扩增反应中使用TaKaRa Ex Taq(TAKARABIO公司制)。

上述预备扩增的反应循环为，在94℃进行2分钟后，进行94℃30秒→56℃1分钟→72℃1分钟的工序20次。

本扩增的反应循环为，在94℃30秒→68℃30秒→72℃1分钟之后，在94℃30秒→68℃30秒→72℃30秒→94℃30秒→67.3℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→66.6℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→65.9℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→65.2℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→64.5℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→63.8℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→63.1℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→62.4℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→61.7℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→61.0℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→60.3℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→59.6℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→58.9℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→58.2℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→57.5℃30秒→72℃1分钟→94℃30秒→56.8℃30秒→72℃1分钟之后，进行94℃30秒→56℃30秒→72℃1分钟的工序23次。

(结果)

对通过扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图12中。图12中的左端泳道和右端2泳道表示大小标记，从同图中左端泳道开始第2泳道显示对大麦黄花叶病抵抗性大麦品种Russia6进行上述AFLP检测所得的结果，从同图中左端泳道开始第3泳道显示对大麦黄花叶病患病性大麦品种H.E.S.4进行上述AFLP检测所得的结果。其他泳道显示对由Russia6和H.E.S.4杂交培育而成的重组近交系统(RI系统)RI1集团进行上述AFLP检测所得的结果。

由图12的结果可知，在通过上述操作被扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Russia6型)为0bp，患病性型(H.E.S.4型)为约116bp(图中用箭头表示)。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Russia6型)不能得到约116bp的扩增片断，与此相对，患病性型(H.E.S.4型)可以得到约116bp的扩增片断。

因此，对试验对象大麦进行上述AFLP的检测操作，以有无约116bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该4H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例3：遗传标记“FEgggMcaa585”的检测]

方法为，使用具有序列号38所示的碱基序列的EcoRI的选择引物和具有序列号37所示的碱基序列的MseI的选择引物来进行扩增反应(本扩增)，除此之外，采用与上述实施例2所示同样的方法。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图13中。图13中的左端泳道和右端泳道表示大小标记，从同图中左端泳道开始第2泳道显示对大麦黄花叶病抵抗性大麦品种Russia6进行上述AFLP检测所得的结果，从同图中左端泳道开始第3泳道显示对大麦黄花叶病患病性大麦品种H.E.S.4进行上述AFLP检测所得的结果。其他泳道显示由Russia6和H.E.S.4杂交培育而成的重组近交系统(RI系统)RI1集团进行上述AFLP检测所得的结果。

由图13的结果可知，在通过上述操作被扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Russia6型)为0bp，患病性型(H.E.S.4型)为约585bp(图中用箭头表示)。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Russia6型)不能得到约585bp的扩增片断，与此相对，患病性型(H.E.S.4型)可以得到约585bp的扩增片断。

因此，对试验对象大麦进行上述AFLP的检测操作，以有无约585bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该4H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例4：遗传标记“MEcatMagc467”的检测]

方法为，使用具有序列号40所示的碱基序列的EcoRI的选择引物和具有序列号39所示的碱基序列的MseI的选择引物来进行扩增反应(本扩增)，除此之外，采用与上述实施例2所示同样的方法。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图14中。图14中的左端泳道表示大小标记，从同图中左端泳道开始第2泳道显示对大麦黄花叶病抵抗性大麦品种Russia6进行上述AFLP检测所得的结果，从同图中左端泳道开始第3泳道显示对大麦黄花叶病患病性大麦品种H.E.S.4进行上述AFLP检测所得的结果。不过，在这些电泳图像中不能明确地确认。其他泳道显示由Russia6和H.E.S.4杂交培育而成的重组近交系统(RI系统)RI1集团进行上述AFLP检测所得的结果。

由图14的结果可知，在通过上述操作被扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各个扩增片断的片断长度为，患病性型(H.E.S.4型)为0bp，抵抗性型(Russia6型)为约467bp(图中用箭头表示)。换言之，对大麦黄花叶病为患病性型(H.E.S.4型)不能得到约467bp的扩增片断，与此相对，抵抗性型(Russia6型)可以得到约467bp的扩增片断。

因此，对试验对象大麦进行上述AFLP的检测操作，以有无约467bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该4H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例5：遗传标记“MEataMatg396”的检测]

方法为，使用具有序列号42所示的碱基序列的EcoRI的选择引物和具有序列号41所示的碱基序列的MseI的选择引物来进行扩增反应(本扩增)，除此之外，采用与上述实施例2所示同样的方法。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图15中。图15中的左端的2泳道和右端的2泳道表示大小标记，从同图中左端泳道开始第3泳道显示对大麦黄花叶病抵抗性大麦品种Russia6进行上述AFLP检测所得的结果，从同图中左端泳道开始第4泳道显示对大麦黄花叶病患病性大麦品种H.E.S.4进行上述AFLP检测所得的结果。不过，在这些电泳图像中不能明确地确认。其他泳道显示由Russia6和H.E.S.4杂交培育而成的重组近交系统(RI系统)RI1集团进行上述AFLP检测所得的结果。

由图15的结果可知，在通过上述操作被扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各个扩增片断的片断长度为，患病性型(H.E.S.4型)为0bp，抵抗性型(Russia6型)为约396bp(图中用箭头表示)。换言之，对大麦黄花叶病为患病性型(H.E.S.4型)不能得到约396bp的扩增片断，与此相对，抵抗性型(Russia6型)可以得到约396bp的扩增片断。

因此，对试验对象大麦进行上述AFLP的检测操作，以有无约396bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该4H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例6：遗传标记“MMattEacg162”的检测]

方法为，使用具有序列号30所示的碱基序列的EcoRI的选择引物和具有序列号29所示的碱基序列的MseI的选择引物来进行扩增反应(本扩增)，除此之外，采用与上述实施例2所示同样的方法。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图16中。图16中的左端的1泳道和右端的2泳道表示大小标记，从同图中左端泳道开始第2泳道显示对大麦黄花叶病抵抗性大麦品种Harbin 2-row进行上述AFLP检测所得的结果，从同图中左端泳道开始第3泳道显示对大麦黄花叶病患病性大麦品种Turkey6进行上述AFLP检测所得的结果。其他泳道显示由Harbin 2-row和Turkey6杂交培育而成的重组近交系统(RI系统)RI2集团进行上述AFLP检测所得的结果。

由图16的结果可知，在通过上述操作被扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Harbin 2-row型)为约162bp(图中用箭头P1表示)，患病性型(Turkey6型)为约170bp(图中用箭头P2表示)。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Harbin 2-row型)可以得到约162bp的扩增片断，与此相对，患病性型(Turkey6型)可以得到约170bp的扩增片断。

因此，对试验对象大麦进行上述AFLP的检测操作，以有无约162bp的扩增片断和约170bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例7：遗传标记“FMataEgga331”的检测]

方法为，使用具有序列号32所示的碱基序列的EcoRI的选择引物和具有序列号31所示的碱基序列的MseI的选择引物来进行扩增反应(本扩增)，除此之外，采用与上述实施例2所示同样的方法。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图17中。图17中的左端的1泳道和右端的2泳道表示大小标记，从同图中左端泳道开始第2泳道显示对大麦黄花叶病抵抗性大麦品种Harbin 2-row进行上述AFLP检测所得的结果，从同图中左端泳道开始第3泳道显示对大麦黄花叶病患病性大麦品种Turkey6进行上述AFLP检测所得的结果。其他泳道显示由Harbin 2-row和Turkey6杂交培育而成的重组近交系统(RI系统)RI2集团进行上述AFLP检测所得的结果。

由图17的结果可知，在通过上述操作被扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，患病性型(Turkey6型)为约331bp(图中用箭头表示)，抵抗性型(Harbin 2-row型)为0bp。换言之，对大麦黄花叶病为患病性型(Turkey6型)可以得到约331bp的扩增片断，与此相对，抵抗性型(Harbin 2-row型)不能得到约331bp的扩增片断。

因此，对试验对象大麦进行上述AFLP的检测操作，以有无约331bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例8：遗传标记“FMacgEgat88”的检测]

方法为，使用具有序列号44所示的碱基序列的EcoRI的选择引物和具有序列号43所示的碱基序列的MseI的选择引物来进行扩增反应(本扩增)，除此之外，采用与上述实施例2所示同样的方法。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图18中。图18中的左端的1泳道和右端的2泳道表示大小标记，从同图中左端泳道开始第2泳道显示对大麦黄花叶病抵抗性大麦品种Harbin 2-row进行上述AFLP检测所得的结果，从同图中左端泳道开始第3泳道显示对大麦黄花叶病患病性大麦品种Turkey6进行上述AFLP检测所得的结果。其他泳道显示由Harbin 2-row和Turkey6杂交培育而成的重组近交系统(RI系统)RI2集团进行上述AFLP检测所得的结果。

由图18的结果可知，在通过上述操作被扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Harbin 2-row型)为0bp，患病性型(Turkey6型)为约88bp(图中用箭头表示)。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Harbin 2-row型)不能得到约88bp的扩增片断，与此相对，患病性型(Turkey6型)可以得到约88bp的扩增片断。

因此，对试验对象大麦进行上述AFLP的检测操作，以有无约88bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该5H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例9：遗传标记“MMacgEgga74”的检测]

方法为，使用具有序列号46所示的碱基序列的EcoRI的选择引物和具有序列号45所示的碱基序列的MseI的选择引物来进行扩增反应(本扩增)，除此之外，采用与上述实施例2所示同样的方法。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图19中。图19中的左端的1泳道和右端的2泳道表示大小标记，从同图中左端泳道开始第2泳道显示对大麦黄花叶病抵抗性大麦品种Harbin 2-row进行上述AFLP检测所得的结果，从同图中左端泳道开始第3泳道显示对大麦黄花叶病患病性大麦品种Turkey6进行上述AFLP检测所得的结果。其他泳道显示由Harbin 2-row和Turkey6杂交培育而成的重组近交系统(RI系统)RI2集团进行上述AFLP检测所得的结果。

由图19的结果可知，在通过上述操作被扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，抵抗性型(Harbin 2-row型)为约74bp(图中用箭头表示)，患病性型(Turkey6型)为0bp。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Harbin 2-row型)可以得到约74bp的扩增片断，与此相对，患病性型(Turkey6型)不能得到约74bp的扩增片断。

因此，对试验对象大麦进行上述AFLP的检测操作，以有无约74bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该5H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例10：遗传标记“FMaccEacg402”的检测]

方法为，使用具有序列号26所示的碱基序列的EcoRI的选择引物和具有序列号25所示的碱基序列的MseI的选择引物来进行扩增反应(本扩增)，除此之外，采用与上述实施例2所示同样的方法。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图20中。图20中的左端的1泳道和右端的2泳道表示大小标记，从同图中左端泳道开始第2泳道显示对大麦黄花叶病抵抗性大麦品种Harbin 2-row进行上述AFLP检测所得的结果，从同图中左端泳道开始第3泳道显示对大麦黄花叶病患病性大麦品种Turkey6进行上述AFLP检测所得的结果。其他泳道显示由Harbin 2-row和Turkey6杂交培育而成的重组近交系统(RI系统)RI2集团进行上述AFLP检测所得的结果。

由图20的结果可知，在通过上述操作被扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的患病性型(Harbin 2-row型)和抵抗性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，患病性型(Harbin 2-row型)为0bp，抵抗性型(Turkey6型)为约402bp(图中用箭头表示)。换言之，对大麦黄花叶病为抵抗性型(Turkey6型)可以得到约402bp的扩增片断，与此相对，患病性型(Harbin 2-row型)不能得到约402bp的扩增片断。

因此，对试验对象大麦进行上述AFLP的检测操作，以有无约402bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该2H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

如上所述，本遗传标记所连锁的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点是大麦黄花叶病患病性型品种Turkey6所具有的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点。因此，检测本遗传标记时，Harbin 2-row型成为患病性型，Turkey6型成为抵抗性型。

[实施例11：遗传标记“HVM36”的检测]

(方法)

使用具有序列号27和28所示的碱基序列的引物，以试验对象大麦的基因组DNA为模板，进行扩增反应。反应循环为，在94℃进行3分钟后，进行94℃1分钟→64℃1分钟(每个循环降低1℃)→72℃1分钟的循环10次，然后进行94℃1分钟→55℃1分钟→72℃1分钟的循环30次，然后在72℃进行5分钟。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图21中。图21中的左端泳道表示对大麦黄花叶病患病性大麦品种Turkey6的扩增片断的结果，从同图中左端泳道开始第2泳道显示大麦黄花叶病抵抗性大麦品种Harbin 2-row的扩增片断的结果。其他泳道显示由Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey6(患病性)杂交培育而成的重组近交系统(RI系统)RI2集团的扩增片断的结果。

由图21的结果可知，在通过上述操作被扩增的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的患病性型(Harbin 2-row型)和抵抗性型(Turkey6型)，各个扩增片断的片断长度为，患病性型(Harbin 2-row型)为约60bp～30bp(从左端开始第2泳道、图中用箭头P1表示)，抵抗性型(Turkey6型)为约90bp～60bp(左端泳道、图中用箭头P2表示)。

因此，对试验对象大麦进行上述检测操作，以有无约60bp～30bp或约90bp～60bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该2H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例12：遗传标记“k00256”的检测]

(方法)

使用具有序列号1和2所示的碱基序列的引物，以试验对象大麦的基因组DNA为模板，进行扩增反应。反应循环为，在94℃进行2分钟后，进行94℃30秒→65℃30秒(每1个循环降低1℃)→72℃2分钟的循环5次，然后进行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分钟的循环35次，然后在72℃进行7分钟。

对上述扩增产物用1.6U的PstI(TAKARABIO公司制)于37℃下进行15小时限制性内切酶消化。

(结果)

对通过上述限制性内切酶消化后的扩增片断进行电泳，其结果示于图22中。图22上段是从左端开始依次为春名二条、H602、春名二条与H602的杂交F1、DH集团的1～45的扩增片断。图4下段是从左端(除了分子量标记)开始依次为DH集团的46～93的扩增片断。图22上段中的左端泳道显示大麦黄花叶病抵抗性大麦品种春名二条的扩增片断的结果，从同图上段中左端泳道开始第2泳道显示大麦黄花叶病患病性大麦品种H602的扩增片断的结果，从同图上段中的左端泳道开始第3泳道显示这些F1扩增片断的结果。其他泳道显示由春名二条和H602杂交培育而得到的双单倍体系统(DH系统)的DHHS的扩增片断的结果。

如上所述，该遗传标记是CAPS标记。因此，限制性内切酶(PstI)的消化图案不同。由图22的结果可知，在进行上述操作得到的消化片断上，存在对大麦黄花叶病的患病性型(春名二条型)和抵抗性型(H602型)，各个扩增片断的消化片断长度为，春名二条型可观察到约362bp的片断(图中用箭头P1表示)，H602型可观察到约156bp、约206bp的片断(图中用箭头P2表示)。因此，对试验对象大麦进行上述操作，以消化片断的图案为指标，则可以对对象大麦个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

但是，如上所述，本遗传标记连锁的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点是大麦黄花叶病患病性型品种H602所含有的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点。因此，检测本遗传标记时，春名二条型为患病性型，H602型为抵抗性型。

[实施例13：遗传标记“k02948”的检测]

(方法)

使用具有序列号3和4所示的碱基序列的引物，以试验对象大麦的基因组DNA为模板，进行扩增反应。反应循环为，在94℃进行2分钟后，进行94℃30秒→65℃30秒(每1个循环降低1℃)→72℃2分钟的循环5次，然后进行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分钟的循环35次，然后在72℃进行7分钟。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图4中。图4上段、下段的两端都为分子量标记。图4上段是从左端(除去分子量标记)开始依次为春名二条、H602、春名二条与H602的杂交F1、DH集团的1～45的扩增片断。图4下段是从左端(除了分子量标记)开始依次为DH集团的46～93的扩增片断。由图4可知，通过确认扩增产物的大小，对对象个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有春名二条型的基因型还是含有H602型的基因型。

由图4的结果可知，在进行上述操作扩增得到的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的患病性型(春名二条型)和抵抗性型(H602型)，各个扩增片断的消化片断长度为，患病性型(春名二条型)可观察到约389bp的片断(图中用箭头P1表示)，抵抗性型(H602型)可观察到约358bp的片断(图中用箭头P2表示)。

因此，对试验对象大麦进行上述检测操作，以有无约389bp或约358bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例14：遗传标记“k03861”的检测]

(方法)

使用具有序列号19和20所示的碱基序列的引物，以试验对象大麦的基因组DNA为模板，进行扩增反应。反应循环为，在94℃进行2分钟后，进行94℃30秒→65℃30秒(每1个循环降低1℃)→72℃2分钟的循环5次，然后进行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分钟的循环35次，然后在72℃进行7分钟。

(结果)

对通过上述扩增反应得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图23中。图23的左端和右端泳道表示分子量标记，从同图中左端泳道开始第3泳道显示大麦黄花叶病抵抗性大麦品种春名二条的扩增片断的结果，第4泳道显示大麦黄花叶病患病性大麦品种H602的扩增片断的结果。其他泳道显示由春名二条和H602杂交培育而成的双单倍体系统(DH系统)DHHS集团的扩增片断的结果。

由图23的结果可知，在进行上述操作扩增得到的扩增片断上，存在对大麦黄花叶病的患病性型(春名二条型)和抵抗性型(H602型)，各个扩增片断的消化片断长度为，患病性型(春名二条型)可观察到约379bp的片断(图中用箭头P1表示)，抵抗性型(H602型)可观察到约353bp的片断(图中用箭头P2表示)。

因此，对试验对象大麦进行上述操作，以有无约379bp或约353bp的扩增片断为指标，则可以对对象大麦个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例15：遗传标记“k03616”的检测]

(方法)

使用具有序列号21和22所示的碱基序列的引物，以试验对象大麦的基因组DNA为模板，进行扩增反应。反应循环为，在94℃进行2分钟后，进行94℃30秒→65℃30秒(每1个循环降低1℃)→72℃2分钟的循环5次，然后进行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分钟的循环35次，然后在72℃进行7分钟。

对上述扩增产物用1.6U的MboI(TAKARABIO公司制)于37℃下进行15小时限制性内切酶消化。

(结果)

对上述限制性内切酶消化后的扩增片断进行电泳，其结果示于图24中。图24的左端泳道和右端泳道表示分子量标记。图24中从左端开始第2泳道显示大麦黄花叶病抵抗性大麦品种春名二条的扩增片断的结果，同图中从左端开始第3泳道显示大麦黄花叶病患病性大麦品种H602的扩增片断的结果。其他泳道显示由春名二条和H602杂交培育而成的双单倍体系统(DH系统)DHHS集团的扩增片断的结果。

如上所述，该遗传标记是CAPS标记。因此，限制性内切酶(MboI)的消化图案不同。由图24的结果可知，在进行上述操作得到的消化片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(春名二条型)和患病性型(H602型)，各个消化片断的长度为，春名二条型可观察到约323bp、约155bp、约135bp、约85bp、约79bp、约50bp的片断(图中用箭头P1表示)，H602型可观察到约172bp、约155bp、约151bp、约135bp、约85bp、约79bp、约50bp的片断(图中用箭头P2表示)。另外，H602型的约172bp、约155bp、约151bp的扩增片断在电泳解像度低时有时重复可见。

因此，对试验对象大麦进行上述操作，以消化片断的图案为指标，则可以对对象大麦个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例16：遗传标记“k02325”的检测]

(方法)

使用具有序列号23和24所示的碱基序列的引物，以试验对象大麦的基因组DNA为模板，进行扩增反应。反应循环为，在94℃进行2分钟后，进行94℃30秒→65℃30秒(每1个循环降低1℃)→72℃2分钟的循环5次，然后进行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分钟的循环35次，然后在72℃进行7分钟。

对上述扩增产物用1.6U的HapII(TAKARABIO公司制)于37℃下进行15小时限制性内切酶消化。

(结果)

对上述限制性内切酶消化后的扩增片断进行电泳，其结果示于图25中。图25中的左端泳道表示大麦黄花叶病抵抗性大麦品种“春名二条”的扩增片断的结果，同图中从左端开始第2泳道显示大麦黄花叶病患病性大麦品种H602的扩增片断的结果。同图中从左端开始第3泳道显示它们的F1的扩增片断的结果。其他泳道显示由春名二条和H602杂交培育而成的双单倍体系统(DH系统)DHHS集团的扩增片断的结果。

如上所述，该遗传标记是CAPS标记。因此，限制性内切酶(HapII)的消化图案不同。由图25的结果可知，在进行上述操作得到的消化片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(春名二条型)和患病性型(H602型)，各个消化片断的长度为，春名二条型可观察到约153bp、约145bp、约57bp、约56bp、约36bp的扩增片断(图中用箭头P1表示)，H602型可观察到约353bp、约94bp的扩增片断(图中用箭头P2表示)。另外，春名二条型的约153bp和约145bp的扩增片断、约57bp和约56bp和约36bp的扩增片断在电泳解像度低时有时重复可见。因此，对试验对象大麦进行上述操作，以消化片断的图案为指标，则可以对对象大麦个体位于该1H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例17：遗传标记“k00169”的检测]

(方法)

使用具有序列号7和8所示的碱基序列的引物，以试验对象大麦的基因组DNA为模板，进行扩增反应。反应循环为，在94℃进行2分钟后，进行94℃30秒→65℃30秒(每1个循环降低1℃)→72℃2分钟的循环5次，然后进行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分钟的循环35次，然后在72℃进行7分钟。

对上述扩增产物用1.6U的AluI(TAKARABIO公司制)于37℃下进行15小时限制性内切酶消化。

(结果)

对通过上述限制性内切酶消化后得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图26中。图26中的左端泳道表示大麦黄花叶病抵抗性大麦品种“春名二条”的扩增片断的结果，同图中从左端开始第2泳道显示大麦黄花叶病患病性大麦品种H602的扩增片断的结果。其他泳道显示由春名二条和H602杂交培育而成的双单倍体系统(DH系统)DHHS集团的扩增片断的结果。

如上所述，该遗传标记是CAPS标记。因此，限制性内切酶(AluI)的消化图案不同。由图26的结果可知，在进行上述操作得到的消化片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(春名二条型)和患病性型(H602型)，各个消化片断的长度为，春名二条型可观察到约245bp和约215bp的扩增片断(图中用箭头P1表示)，H602型可观察到约215bp、约165bp、约80bp的扩增片断(图中用箭头P2表示)。另外，春名二条型的约245bp和约215bp的扩增片断在电泳解像度低时有时重复可见。因此，对试验对象大麦进行上述操作，以消化片断的图案为指标，则可以对对象大麦个体位于该3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例18：遗传标记“k07966”的检测]

(方法)

使用具有序列号33和34所示的碱基序列的引物，以试验对象大麦的基因组DNA为模板，进行扩增反应。反应循环为，在94℃进行2分钟后，进行94℃30秒→65℃30秒(每1个循环降低1℃)→72℃2分钟的循环5次，然后进行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分钟的循环35次，然后在72℃进行7分钟。

(结果)

对通过上述限制性内切酶消化后得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图27中。图27中的左端泳道表示大麦黄花叶病抵抗性大麦品种“春名二条”的扩增片断的结果，同图中从左端开始第2泳道显示大麦黄花叶病患病性大麦品种H602的扩增片断的结果。同图中从左端开始第3泳道显示它们的F1的扩增片断的结果。其他泳道显示由春名二条和H602杂交培育而成的双单倍体系统(DH系统)DHHS集团的扩增片断的结果。

如上所述，该遗传标记是CAPS标记。因此，限制性内切酶(AluI)的消化图案不同。由图27的结果可知，在进行上述操作得到的消化片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(春名二条型)和患病性型(H602型)，各个消化片断的长度为，春名二条型可观察到约350bp和约208bp的扩增片断(图中用箭头P1表示)，H602型可观察到约558bp的扩增片断(图中用箭头P2表示)。因此，对试验对象大麦进行上述操作，以消化片断的图案为指标，则可以对对象大麦个体位于该3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

[实施例19：遗传标记“k04143”的检测]

(方法)

使用具有序列号5和6所示的碱基序列的引物，以试验对象大麦的基因组DNA为模板，进行扩增反应。反应循环为，在94℃进行2分钟后，进行94℃30秒→65℃30秒(每1个循环降低1℃)→72℃2分钟的循环5次，然后进行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分钟的循环35次，然后在72℃进行7分钟。

对上述扩增产物用1.6U的ApaLI(TAKARABIO公司制)于37℃下进行15小时限制性内切酶消化。

(结果)

对通过上述限制性内切酶消化后得到的扩增片断进行电泳，其结果示于图28中。图28中的左端泳道表示大麦黄花叶病抵抗性大麦品种“春名二条”的扩增片断的结果，同图中从左端开始第2泳道显示大麦黄花叶病患病性大麦品种H602的扩增片断的结果。同图中从左端开始第3泳道显示它们的F1的扩增片断的结果。其他泳道显示由春名二条和H602杂交培育而成的双单倍体系统(DH系统)DHHS集团的扩增片断的结果。

如上所述，该遗传标记是CAPS标记。因此，限制性内切酶(ApaLI)的消化图案不同。由图28的结果可知，在进行上述操作得到的消化片断上，存在对大麦黄花叶病的抵抗性型(春名二条型)和患病性型(H602型)，各个的消化片断的长度为，春名二条型可观察到约371bp的扩增片断(图中用箭头P1表示)，H602型可观察到约228bp和约143bp的扩增片断(图中用箭头P2表示)。因此，对试验对象大麦进行上述操作，以消化片断的图案为指标，则可以对对象大麦个体位于该3H染色体上的大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型还是含有患病性的基因型。

产业上的可利用性

本发明所述的遗传标记可以用于大麦黄花叶病抵抗性大麦的育种、大麦黄花叶病抵抗性相关的基因的分离等中，其被期待对育种的高效化能够做出巨大贡献。此外，通过利用本发明所述的遗传标记而制作的大麦黄花叶病抵抗性大麦，只要抑制大麦黄花叶病导致的病害，就可以防止收获量及品质的降低。因此，本发明可以广泛应用于所有农业中，且在以大麦为原料的食品产业中有效。

序列表

<110>独立行政法人科学技术振兴机构

<120>与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记及其利用

<130>A181-10PCT

<150>JP 2004-090644

<151>2004-3-25

<150>JP 2004-342737

<151>2004-11-26

<160>62

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>1

cttggccttg atcttctgct 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>2

gaccgtgtca ggaaagcaat 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>3

tctttcctgg gttggtgaac 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>4

gcagcttttg agttcgttcc 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>5

ctgtttggat gactgcgaga 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>6

attacgcaac ctgatggagc 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>7

accccggaag ctaagatgat 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>8

agtcggaaca tgcggtacac 20

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>9

atcttctgca ggcacttgtcg 21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>10

atcttctgca agcacttgtcg 21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>11

tgccgtggcc gtgcacgatga 21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>12

tgccgtggcc atgcacgatga 21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>13

attactcagc tacacacctat 21

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>14

attactcagc cacacacctat 21

<210>15

<211>688

<212>DNA

<213>大麦

<400>15

gcagtaagtg gaggacaaaa aggaatactg ggattagata gaatgtagcg acattctgcg 60

gggtggggtg gtataagtag atatacagaa cggaggaccg tctcctggtc ctcagctttg 120

ggtcttctct accttggcct tgatcttctg ctcgaggacc gccttctccg tgtcgaggtt 180

gaacatcctg ttgagggcgt gcatgttgtc gagcgtctcg tccagggtgc ggctgtcgct 240

gccatcgcat ctcaggtgct gcaacgggcc gtggaggagc ttgttcacta tgcccgtgct 300

cagctcttcg atagaccttc tcgtcttctt gttgaggttg tcttccccga tcttctgcag 360

gcacttgtcg agctcggatg ccctgatcct gtcggcatac gacctcagct ttttgatggt 420

cgggaccgtc tccagcgagt ccctccacgc ctcgaaccgc ttcagttctt gggtgatgat 480

tgcttgggcc tccattgctt tcctgacacg gtcttccttg ttggcttcca ccacctcttt 540

caagtcgtca acattgtata cccgtgcgtg ctccacttga gataggcagg caccgacgtt 600

ccttgggacg gatatgtcga cgaaaagccg aacaccaccc atggcaagag agataggagg 660

aagcgcctcc gcatgcccct tggtgaat 688

<210>16

<211>645

<212>DNA

<213>大麦

<400>16

agatgacagc taggccctga gcaggggaca catgaatatt tcccgctcac taccctatct 60

atactatcca gtatctacac atgaatattt ccagagattt tgctattatg atactgcgat 120

caagaactgt ctgcaaaatc aagaaacact attttgatta cgtccctatg atatactgct 180

agttcctata tatctttcct gggttggtga acttgagctt ctgactgact gcttggtagg 240

ttcatctccg tgttcctctg gacttgaagg tgtgaggaag ggcatgcctc cagagaagaa 300

aagcgtgttg tgtgcctacc aaacttgctt cgttgacagc ccaagggcag gtccccacgt 360

gtcgtcgctt tattttcctt cttttcataa acaccttcaa acttttttca accacgcgct 420

gcaactggaa gtaatgattg tacaggctct tctttaattc aaatcacacg caacgtcaca 480

aatactaacc ttgacatgcc tggaactggc agtgtggcta ccatccacct tcgcctagtt 540

gccatgtata aagatacggt ggagcttgtt ggcattgacc gcataaggaa cgaactcaaa 600

agctgcttaa tgaggacaag acatctaatg aagaacaatt gaaga 645

<210>17

<211>696

<212>DNA

<213>大麦

<220>

<221>不确定

<222>(10，24，30)

<400>17

catgcacatn aattgaatac aggnactagn aacttacaat acataagcgt gacgacattc 60

cataactcca atgtgatttt agtagtcacg tacaacatga tctaattatt attatggcgc 120

catccaattc ttagcgaccg acgagatgtt ttcatcgttg tttgtagtaa cacaaaacag 180

agtagactgt ttggatgact gcgagaagta agccaatagc agctgccatg agcccaacgg 240

caagccatgg gttcctcaag tacctctgcc ttagccaggc agtccacctc cgggggttgc 300

tctggaaccg cttctccagc ttcttgcatg tctcccgtag gtagttgcag ccggggtcat 360

cagggtcaaa cataatcccc ttgcaaaggt cgacgaagca tttggccacc tcttcgttgt 420

tgccgtggcc gtgcacgatg acgcctctcc tcaccaagag ctccacgtcc ttcgtggtgc 480

aggccatctg ggacatgaac acgcagtatg ccgtgacatg gctccccacc gtctcccggt 540

tcctctgctc cagctccatc aggttgcgta atagccgcca cgtctcggcg tcgatgtcca 600

ggacggggat ctccagcgta ccgccaccgc cgtccagctt cacgtcgagg atgcagcgga 660

tgacaccctt ctcgctcatg gccccgggcg ttgaac 696

<210>18

<211>738

<212>DNA

<213>大麦

<400>18

aatcttagca ttcctgttct ctatttacga attacctaat ggtaatgcat gagcagtagt 60

cacaggataa cttccgatac ctccaagcag ttgcaactca taagatgaaa ttatttacaa 120

agagtggcca tgactaccta ccctacctgc tatctacagt tttttttgga tatactattc 180

acagttggtg tcgaagagac gtaaccaatc taggaacata catgggcaag gaatgacccc 240

ggaagctaag atgatgaatt ggaagaggag tcatgtacac aacctactta tagactatat 300

ataattttag ggccatttct caaccaacac ctatttgaca agggcaagaa ttttacttcg 360

tattgatgaa acagatatca caattcacca ttacggcatt acttacctag ttgatgccaa 420

agaaacttaa taatatctaa gaaactatcc acctaaggaa tgaccagaga agctgagatg 480

atgaattgga aggagtcaaa tacagaaccc atttttagat tatatgtaca aaattttagg 540

gtcattactc agccacacac ctatttgaaa acaacaggaa gaattttact tagtcatgat 600

gaaacagatt tcttttaaca aataagaatt cgactactcc ttagatatct aaagatggat 660

gacgtagcca gataccatgt agaacactga aaaggcgtgt accgcatgtt ccgactgaag 720

actatcaatc atggtaag 738

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>19

acgatcgatc aaaaggacca 20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>20

aatccgacga aatcaacgag 20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>21

ctcgatcatc agcgacttca 20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>22

gaagaggcac cttctgcaac 20

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>23

aatgtgcaca ccaaggttga 20

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>24

agacaacaac cgcctgtacc 20

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>25

gatgagtcct gagtaaacc 19

<210>26

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>26

gactgcgtac caattcacg 19

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>27

tccagccgaa caatttcttg 20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>28

agtactccga caccacgtcc 20

<210>29

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>29

gatgagtcct gagtaaatt 19

<210>30

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>30

gactgcgtac caattcacg 19

<210>31

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>31

gatgagtcct gagtaaata 19

<210>32

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>32

gactgcgtac caattcgga 19

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>33

atggacccaa caagtggaag 20

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>34

aggaagactt tggaggccat 20

<210>35

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>35

gatgagtcct gagtaatgg 19

<210>36

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>36

gactgcgtac caattcgga 19

<210>37

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>37

gatgagtcct gagtaacaa 19

<210>38

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>38

gactgcgtac caattcggg 19

<210>39

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>39

gatgagtcct gagtaaacg 19

<210>40

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>40

gactgcgtac caattccat 19

<210>41

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>41

gatgagtcct gagtaaatg 19

<210>42

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>42

gactgcgtac caattcata 19

<210>43

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>43

gatgagtcct gagtaaacg 19

<210>44

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>44

gactgcgtac caattcgat 19

<210>45

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>45

gatgagtcct gagtaaacg 19

<210>46

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>46

gactgcgtac caattcgga 19

<210>47

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>47

gacgatgagt cctgag 16

<210>48

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>48

tactcaggac tcat 14

<210>49

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>49

ctcgtagact gcgtacc 17

<210>50

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>50

aattggtacg cagtctac 18

<210>51

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>51

gatgagtcct gagtaa 16

<210>52

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>52

gactgcgtac caattc 16

<210>53

<211>664

<212>DNA

<213>大麦

<220>

<221>不确定

<222>(10)

<400>53

tatatagatn ccttctcgac agaatgaacc agttaagata gctgaaatca caatttacag 60

ataagcactt ggtattcact aatccatgaa aatagttatt attcaaaaca cagggagatc 120

gcaagggagt ctgatctgaa aaggccctag aagccattca gtaaccacga gagtaacaag 180

ttgcagaaag ctagaaacaa ctggaatact taatcccttg acattcaaaa acatgaagaa 240

tgtcaaaatg atgattcata acacgatcga tcaaaaggac cagtcatctg gaagaactct 300

tggtagtcgt tcagtaacgg cgtggaggga accggtccag gagcctccca gatggacact 360

cgtaagccat gtgaccacga ccaccacagt tgttgcagat catgaaggcg ccacccatgc 420

agtcacggct catatggcca acctggttgc aggcccggca gaccatgtca ctgtagccac 480

cacggaagag agcaccgccg ccaccacgga agggagcatc gccaccacgg aacagagcat 540

cgccgccacg gaacagagcg tcaccgccac ggaacagagc gtcaccacca cggaagggag 600

gaggcccacc cctctcgttg atttcgtcgg atttggggca ttgacgggcc aaatgccctg 660

caac 664

<210>54

<211>545

<212>DNA

<213>大麦

<400>54

cagcataaat ctcgtaaccc atagcaggca tcaggtagaa gtattactgt atgcaggggg 60

gacatcattg tgataaatca taaggtaggt aattttccat aactcaaaat tttgatctaa 120

gcttctatct ttctctctct ctctctaata ggtgcctcga tcatcagcga cttcaggact 180

tgctcctcgt aacaaaccag ctgagtcttg acgaaacaat ccagaaagtc agcagcaagg 240

aagcaagccc tggggtcttc aaaaggcaat cgaccaatct tcttgtgtgg cctcagtggt 300

ggtctgttct actccgcctt cttggtccgg aagttcgacc tcattgacga aacctttttc 360

ttgcactgca ccactgtttt accagggaca gcagtagcta ctcgctccca tctttggttt 420

gcatccttgg gaaatgcctt caaagcttga acaagggcca gcacctgagc ctctgaccag 480

gcatctggat ctgttgcaga aggtgcctct tcggggacag gatcagcacc agttttctca 540

ttggc 545

<210>55

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>55

cttatgtgat cataatactgc 21

<210>56

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>56

cttatgtgat aataatactgc 21

<210>57

<211>514

<212>DNA

<213>大麦

<400>57

ttacaggagg gaacgcattc cttgtatgta tagaagaata tatctaagac atgttacaaa 60

acaacaatgt gcacaccaag gttgacagtt acacggctga cagctgttac aactcccaga 120

agaatgggtt ggcttttaca aagaagaaaa aaaatgatca aaaatttgcg tctccctccg 180

cagtgatcca agttcccaag ggcagcttct taggggagcc cctagatgca aatggatccg 240

ggcatccccg ccaagcgaac ttcttttgtg cgcgtggaag aagcagcctt ccaccggtat 300

catttacttg gcaattctac atccgtaaga actattcatc tatacagccg gaatttttag 360

aaggacgagt gagcagcaat acagacatac ggagatggca accccggcga tgaaattctg 420

gtacaggcgg ttgttgtctc tactgggaat gaaggctgcc ctcagcacgt ttgtgatctc 480

aaatactcgg tatgacagca aaagatagat tgat 514

<210>58

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>58

agccttccac tggtatcattt 21

<210>59

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>59

agccttccac cggtatcattt 21

<210>60

<211>540

<212>DNA

<213>大麦

<220>

<221>不确定

<222>(2)

<400>60

gnttaaattg gcgagattaa catttacatg aaaaatgatg gagatgatat tgctttgagc 60

ttgaccgaat ggacccaaca agtggaaggc attctatatg aattacagtt atagctccat 120

gacgttctac agtactatga cattacatcc atgatagcta attgtacaaa agagtgaatg 180

aaatgaacta cgaaaatcca gcatcatagt tctgcagtcg ggcttctcag aagtgagcca 240

agctgtatac tagagtccat gaaagcagga aaagggtgaa cgaggcaaag agcccctcct 300

gaagtagggc ggcatggcct ccaaagtctt cctcatcaat cttcagcaga tgtgcatagt 360

acaaatgaac tattacggtg gaaatagtaa agaatagggc gatccagaag gcgccgacga 420

gggggacggc gccccagagc aggccgcagg cgagccccac cgcctgccgg atccagtgca 480

ccgcgtccag cagctggtcc ttgtccaagg acgcgtcggg gtcgaggtac cgggcgagcc 540

<210>61

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>61

tttatgtgcc tgtagcggtt g 21

<210>62

<211>21

<212>DNA

<213>大麦

<400>62

tttatgtgcc ggtagcggtt g 21

Claims

1、遗传标记，其是位于大麦的1H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，使用第一引物对进行扩增，所述第一引物对是具有序列号1所示的碱基序列的引物和具有序列号2所示的碱基序列的引物的组合。

2、遗传标记，其是位于大麦的1H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，使用第二引物对进行扩增，所述第二引物对是具有序列号3所示的碱基序列的引物和具有序列号4所示的碱基序列的引物的组合。

3、遗传标记，其是位于大麦的1H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，使用第五引物对进行扩增，所述第五引物对是具有序列号19所示的碱基序列的引物和具有序列号20所示的碱基序列的引物的组合。

4、遗传标记，其是位于大麦的1H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，使用第六引物对进行扩增，所述第六引物对是具有序列号21所示的碱基序列的引物和具有序列号22所示的碱基序列的引物的组合。

5、遗传标记，其是位于大麦的1H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，使用第七引物对进行扩增，所述第七引物对是具有序列号23所示的碱基序列的引物和具有序列号24所示的碱基序列的引物的组合。

6、遗传标记，其是位于大麦的2H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第八引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第八引物对是具有序列号25所示的碱基序列的引物和具有序列号26所示的碱基序列的引物的组合。

7、遗传标记，其是位于大麦的2H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，使用第九引物对进行扩增，所述第九引物对是具有序列号27所示的碱基序列的引物和具有序列号28所示的碱基序列的引物的组合。

8、遗传标记，其是位于大麦的3H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，使用第三引物对进行扩增，所述第三引物对是具有序列号5所示的碱基序列的引物和具有序列号6所示的碱基序列的引物的组合。

9、遗传标记，其是位于大麦的3H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，使用第四引物对进行扩增，所述第四引物对是具有序列号7所示的碱基序列的引物和具有序列号8所示的碱基序列的引物的组合。

10、遗传标记，其是位于大麦的3H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十引物对是具有序列号29所示的碱基序列的引物和具有序列号30所示的碱基序列的引物的组合。

11、遗传标记，其是位于大麦的3H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和 50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十一引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十一引物对是具有序列号31所示的碱基序列的引物和具有序列号32所示的碱基序列的引物的组合。

12、遗传标记，其是位于大麦的3H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，使用第十二引物对进行扩增，所述第十二引物对是具有序列号33所示的碱基序列的引物和具有序列号34所示的碱基序列的引物的组合。

13、遗传标记，其是位于大麦的4H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十三引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十三引物对是具有序列号35所示的碱基序列的引物和具有序列号36所示的碱基序列的引物的组合。

14、遗传标记，其是位于大麦的4H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十四引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十四引物对是具有序列号37所示的碱基序列的引物和具有序列号38所示的碱基序列的引物的组合。

15、遗传标记，其是位于大麦的4H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十五引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十五引物对是具有序列号39所示的碱基序列的引物和具有序列号40所示的碱基序列的引物的组合。

16、遗传标记，其是位于大麦的4H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十六引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十六引物对是具有序列号41所示的碱基序列的引物和具有序列号42所示的碱基序列的引物的组合。

17、遗传标记，其是位于大麦的5H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十七引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十七引物对是具有序列号43所示的碱基序列的引物和具有序列号44所示的碱基序列的引物的组合。

18、遗传标记，其是位于大麦的5H染色体中的、与大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点连锁的遗传标记，其特征在于，在将大麦的基因组DNA用限制性内切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片断上，连接具有序列号47和48所示的碱基序列的MseI连接物以及具有序列号49和50所示的碱基序列的EcoRI连接物；使用具有序列号51所示的碱基序列的MseI通用引物和具有序列号52所示的碱基序列的EcoRI通用引物进行所述连接后的DNA片断的预备扩增；进而，使用第十八引物对扩增通过所述预备扩增而得到的预备扩增片断，所述第十八引物对是具有序列号45所示的碱基序列的引物和具有序列号46所示的碱基序列的引物的组合。

19、DNA片断的分离方法，其特征在于，使用权利要求1～18中的任一项所述的遗传标记分离含有大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断。

20、大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产方法，其特征在于，在大麦的基因组DNA中导入通过权利要求19所述的DNA片断的分离方法而得到的含有所述大麦黄花叶病抵抗性相关的基因位点的DNA片断。

21、大麦黄花叶病抵抗性大麦，其是通过权利要求20所述的大麦黄花叶病抵抗性大麦的生产方法而得到的。

22、选拔大麦黄花叶病抵抗性大麦的方法，其以权利要求1～18中的任一项所述的遗传标记作为指标。