CN1251138A - 一种鉴定与性状基因座相关的遗传标记基因座的方法 - Google Patents

一种鉴定与性状基因座相关的遗传标记基因座的方法 Download PDF

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Abstract

披露了一种利用遗传标记基因座鉴定性状基因座的新方法,以及遗传标记基因座作为筛选方法的用途。该方法包括比较由用于进行基因型调查的相同的登录品种收集到的基因型调查数据和表型数据,并鉴定与性状相关的遗传标记基因座。该方法通过用特定的遗传标记基因座进行基因分型可以在植物育种程序中鉴定并筛选到新的优良植株。

Description

一种鉴定与性状基因座相关的遗传标记基因座的方法
               对相关申请的交叉引用
本申请要求于1997年3月20日提交的美国临时申请No.60/039,844和于1997年3月27日提交的美国非临时申请No.08/826,409的优先权。
                       本发明领域
本发明属于植物育种和分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及利用遗传标记基因座鉴定性状基因座，以及将遗传标记用作筛选方法用于植物育种程序中的用途。
                       本发明背景
植物育种是通过遗传学操作提高植物的价值的艺术和科学。植物育种者让具有不同遗传学背景的植物相互交配，以期鉴定并筛选具有优良的遗传组合，并且因而具有优良的表型性状的后代。植物育种者所遇到的一道难题是精确确定最佳基因型是什么。他或她必须根据表型测定来了解其基因型。
很多重要性状，如谷物产量是定量测定的。这些数量性状通常表现为非分离的表型分布，这是许多遗传学和环境因素作用的结果。其直接的后果是，表型通常只是基因型的一种弱的预测指标。因此，优良基因型的筛选可能是一项挑战性的工作。
有人提出将基于遗传标记的性状筛选作为筛选优良基因型的更直接的方法。不过，为了成功进行基于遗传标记的筛选，首先，必须确定标记基因座和性状基因座之间的关系。该方法的第一步是将数量性状分离成独立的遗传因素。
存在着许多具有遗传标记的数量性状的遗传剖分的例子(Stuber，C.W.1992.植物育种综述9：37-61)。上述及其它研究都试图鉴定数量性状基因座(QTLs)相对连锁的标记基因座的位置。这种遗传连锁关系的发现，是遗传标记能否成功用于筛选连锁的QTLs的关键。一旦确定这种联系，就可以基于标记基因型进行筛选。
有4种用于鉴定与一种数量性状连锁并预测该性状的标记基因座的通用方法。上述方法中的两种测定随着筛选而发生的标记等位基因频率的变化。Stuber等所披露的方法(Stuber，C.W.等，1980.遗传学95：225-236)是上述分析方法的一种典范。在特定群体中，在测定之前和之后测定标记等位基因的频率。推测在标记基因座上的等位基因频率的显著变化，是由于标记基因座与筛选性状基因座之间的连锁。
US5,437,697还披露了将等位基因频率的变化作为鉴定预测性标记基因座的手段。将良种系的标记等位基因频率与其亲代的等位基因频率加以比较。通过检验过的良种系之间的标记等位基因频率的非随机变化，鉴定与QTLs连锁的标记基因座。推测这种非随机标记等位基因频率变化是由于与标记基因座连锁的性状基因座的表型筛选。
用于鉴定标记-QTL关系的第三种方法分析源于两个亲本系交配的分离群体(Etdwards，M.D.等，1987.遗传学116：113-125；Nienhuis，J.等，1987.作物科学27：797-803)。通常，筛选表型和遗传型不一致的亲本系。该研究试图利用存在于F2中的高度遗传不平衡，回交，并与重组程度较低的近交群体杂交。通过降低重组的可能性，就没有必要使标记基因座与QTLs紧密连锁以便建立显著的联系。通过对标记等位基因族的平均表型性状进行基因座一基因座的比较，鉴定与QTLs连锁的标记基因座。推测具有不等的表型平均值的标记基因座与一个或几个QTLS连锁。
Lander和Botstein(E.S.Lander和D.Botstein，1989.遗传学121：185-199)提出了单一标记分析的一种替代方案，后来被用于在植物种中对QTLs进行作图(Paterson，A.H.等，1988.自然315：721-726)。这种方法被称为间隔作图，由该方法测定位于标记基因座之间的预定间隔处QTL的统计学可能性。单一标记分析和间隔作图均使用以前所披露的相同类型的实验群体。
所有基于作图的方法都取决于对表型的精确测定。对于具有高遗传力的性状来说这不是问题，不过，对于大多数有农艺价值的性状，特别是产量来说，精确测定该性状的能力是困难的，因为这些性状具有低的遗传力。性状的遗传力被广义地定义为遗传方差与总的表型方差的比例。很多农艺性状具有低的遗传力；即亲本植物的性状是子代性状的较差的预测指标。因此，与观察到的表型变异相比，具有低的遗传力的性状具有小的遗传方差分量。对植物育种者的影响是，在育种群体中，难于由农艺性状测定确定植物的遗传组成值。为了提高其分辨能力，育种者收集来自通过后代相关的个体和来自多种环境的多种测定值。这种方法是资源密集型的，因为它涉及使用大量的跟踪过程来取得植物改进方面的小的收获。
为了改善产量和具有低的遗传力的其它性状的指标，测定了重复的后代和多种环境(Stuber，C.W.等，1992.遗传学132：823-839)。遗憾的是，对表型的真正精确的评价需要对许多空间和时间环境进行更多的重复。
利用实验群体进行的研究还存在着更为严重的缺陷。这种研究局限于最多只有两个等位基因的分离。因此，分析仅能比较一个等位基因与另一个等位基因的作用。如果这些等位基因不具有足够的表型不一致性，就不能鉴定QTL。实际上，在所述种内可能存在着许多其它的等位基因，某些具有正的表型作用，如果鉴定到这种基因，可由植物育种者加以利用。
US5,437,697中披露了基于谱系的分析，试图克服现有方法的缺陷。该方法以及其它基于等位基因频率的方法的难题是，对表型筛选的依赖性，这种筛选是等位基因频率改变的动力。具有强的表型效应的等位基因在分离的育种群体始终会被筛选。利用基于等位基因频率的方法容易鉴定这些QTLs。不过，仅具有弱的表型效应的等位基因的基因座很可能只会被偶尔筛选到。因此，不能调查到许多含有这种潜在的需要的等位基因的QTLs。
使用披露于US5,437,697中的方法的另一个障碍是仅能测定与总的农艺适合度的性状基因座的关系。植物育种者同时筛选多种性状，并选择由其综合性状所体现的个体。根据其着重点，新的品种可能具有特定表型缺陷的改善(例如，抗病性或产量的总体改进)。因此，该方法完全取决于改变等位基因频率的植物育种设想。调查与特殊表型性状相关的基因座的能力受到损害。
现有的鉴定显著标记-QTL相关的方法的多种缺陷的后果是，较少鉴定到诸如产量的复杂数量性状的QTLs，而且发现了标记-QTL相关性的不一致性。Stromberg等的实验(Stromberg，L.D.等，1994.作物科学34：1221-1225)具体说明了这些困难。在他们的研究中，鉴定了产量的前8个和后10个QTLs，这只是实际上影响产量的QTLs的数量的一部分。尽管对直接来源于原始作图群体的系进行了重新作图，但在早代和后代实验之间仅存在一个共同的标记-QTL联系。
一旦确定了标记-QTL关系，即可标记基因座用作感兴趣的性状的指示指标。这种预测信息以两种方式加以利用，首先，利用基因型种质调查数据，选择亲本系的有力的基因型组合。其次，可以根据其与预测的具有最佳表型性状的基因型的相似性筛选育种群体中的分离后代(Stomberg，L.D.1994.作物科学34：1221-1225)。
标记信息作为产量预测指标的另一种用途是作为遗传不一致性的评估指标。利用亲本系的种质调查，Bernardo(Bernardo，R.1994，作物科学34：20-25)利用限制性片段长度多态性来估计共同祖先。将该统计与产量信息一起用于预测玉米的测交产量。Johnson(US5,492,547)也披露了利用标记不一致性和产量数据进行的类似的分析。这种研究不利用标记作为筛选工具，而试图利用标记数据降低费用高昂的产量追踪的数量。
                      本发明概述
业已发现了一种用于由作物种鉴定与性状基因座相关的遗传标记基因座的方法。该方法包括：a)利用多种祖先的种质产生一种作物种的基因型调查，所产生的调查利用了遗传标记，其中，所述种质调查的个体登录品种(entry)不是为了分析而产生的分离群体的成员；b)将所述基因型调查与从用于产生所述基因型调查的相同登录品种或其后代上收集到的表型数据加以比较；c)评估遗传标记基因座和性状基因座之间的相关性；和d)鉴定与所述性状基因座相关的遗传标记基因座。
在另一种实施方案中，本发明包括一种用于由生长在特定环境中的作物种鉴定与性状基因座相关的遗传标记基因座的方法，该方法包括：a)利用多种祖先的种质产生一种生长在特定环境中的作物种的基因型调查，所产生的调查利用了遗传标记，其中，所述种质调查的个体登录品种不是为了分析而产生的分离群体的成员；b)将所述基因型调查与从用于产生所述基因型调查的相同登录品种或其后代上收集到的表型数据加以比较；c)评估遗传标记基因座和性状基因座之间的相关性；和d)当所述作物种生长在特定环境中时，鉴定与所述性状基因座相关的遗传标记基因座。
用于实现本发明的优选遗传标记包括限制性片段长度多态性(RFLPs)，随机扩增多态DNAs(RAPDs)，简单序列重复(SSLs)，AFLPs，和同种异型酶。
该方法通过与鉴定遗传标记基因座进行基因分型，可以通过植物育种程序鉴定并筛选新的优良植株。该方法特别适用于具有来自植物育种程序的大量性状资料的作物种，如大豆、玉米、向日葵、油菜、小麦、大麦、燕麦、稻和高粱、番茄、马铃薯、黄瓜、洋葱、胡萝卜、菜豆、胡椒、和莴苣。不过，通过基因型种质调查和性状资料组的从头形成，可将本发明方法应用于任何作物种。本发明方法特别适用于诸如产量的、具有低的遗传力的性状，不过，可以鉴定并将遗传标记基因座用于筛选任何性状。
为了广泛应用于所有性状和作物种，需要使调查中的登录品种数量大于40个，而且具有20个以上的祖先，特别是在低遗传性状分析中尤其如此。使用较少的登录品种和/或祖先，会降低精确测定和估计通过标记等位基因预测的表型效应的能力。
                   附图的简要说明
图1是通过标记1443揭示的大豆的每一个等位基因的计算调节产量与成熟度类型的曲线。该图表明了各种性状等位基因的表型效应，这些性状等位基因与相应的遗传标记等位基因、不同的地理区域相关，以上结果是通过大豆成熟度类型确定的。
图2是通过标记1443揭示的大豆的每一个等位基因的计算调节产量与年份的曲线。该图表明了各种性状等位基因的表型效应，这些性状等位基因与相应的遗传标记等位基因相关，与大豆在每一年中所经历的不同环境条件相关。
                    本发明的详细说明
为了本说明书，我们对以下术语进行了定义：
育种。通过控制的遗传操作改善植物或动物种的技术和科学。
性状。一种生物的可观察的特征。
性状等位基因。对观察的特征具有特定作用的基因。
性状基因座。对一种观察特征起作用的一个或几个基因(等位基因)的集合的、遗传学上的特定位点。
农艺性状。对特定植物品种的可收获产量具有影响的性状的表现。农艺性状通常是以数量形式衡量，并表现出非分离的表型分布。
产量。单位面积上需要的植物产品的生产量。
抗倒伏性。植物保持竖立直到收获时节的能力，因此能够完全收获谷物。
高度。从地面到冠层顶部之间的植物长度。
成熟期。植物达到可收获状态所需要的时间。
抗病性。植物承受真菌、细菌或病毒病原体侵袭的能力。
抗虫性。植物承受昆虫或线虫侵袭的能力。
营养缺陷性。通过由不适当地添加必需元素引起的植物次优生长表现的状态。
谷物组成。描述收获的谷物的特征。其中包括诸如蛋白、油脂、碳水化合物和水的特定谷物特征的数量和质量。
作物种。为了生产可收获的产物而由人工栽培的植物种。在本文中，植物种包括大豆、玉米、向日葵、油菜、小麦、大麦、燕麦、稻、和高粱、番茄、马铃薯、黄瓜、洋葱、胡萝卜、菜豆、胡椒、和莴苣。
表型资料。由一个或几个个体获得的一组性状调查结果。
表型值。一个性状基因座上的等位基因的预期的表达指标。性状基因座上的等位基因的表型值取决于其相对其它等位基因的表达强度。一个个体的表型值，及其表型潜力，取决于在特定性状的所有基因座上的总的基因型组合。
遗传标记。能揭示DNA多态性的基于形态、生物化学、或核酸的任一种的表型差别。遗传标记的例子包括，但不限于RFLPs、RAPDs、AFLPs、同种异型酶和SSRs。
遗传标记基因座。通过基于形态、生物化学或核酸分析揭示的一种或几种DNA多态性的综合的遗传学上的特定位点。
遗传标记等位基因。在一个遗传标记基因座上观察到的一类DNA多态性。对于大多数类型的遗传标记(RFLPs、同种异型酶、SSRs、AFLPs、RAPDs)来说，等位基因是根据DNA片段的大小分类的。在一个标记基因座上具有相同的观察片段大小的个体具有相同的遗传标记等位基因，因此，属于相同的等位基因类型。
基因分型。用遗传标记测定个体的遗传组成的过程。
基因型。个体在研究条件下在遗传标记基因座上的等位基因组成。
基因型调查。基于遗传标记分析的遗传信息数据库。
多祖先种质。包括株、系、栽培种、品种、综合种、杂交种、植物引入种或其衍生物的登录品种的总称，其中，所述登录品种源于一个以上的共同遗传来源。
分离的群体。具有相同的遗传来源和相互关系的、遗传学上不一致的植物集合。分离群体的例子包括，但不限于回交、重组近交或子代群体。
育种群体。为了鉴定一个或几个具有需要的表型特征的个体而产生的遗传学上不一致的植物的集合。
超亲分离。其表型超过通过其亲本预测的表型变化的个体。
理想基因型。根据现有的遗传标记信息预测能表达最理想的表型效应的理论基因型。
数量性状基因座(QTLs)。其生物化学和/或调控功能影响多种测定性状的表型的基因的位点。
限制性片段长度多态性(RFLP)。一种基于DNA的遗传标记，其中，通过杂交观察到了限制性内切核酸酶产生的DNA片段的大小差别(Botstein，D.等1980.美国人类遗传学杂志32：314-331)。
随机扩增的多态性DNA(RAPD)。一种基于DNA扩增的遗传标记，其中，由短的、序列任意引物介导扩增。对所得到的扩增产物进行大小分离，并观察扩增方式上的差别(Williams，G.K.等1990.核酸研究18：6531-6535)。
简单序列重复(SSR)。一种基于DNA扩增的遗传标记，其中，对串联的重复序列基序的短的片段进行扩增。对所得到的扩增产物进行大小分离，并观察核苷酸重复在长度上的差别(Tautz，D.1989.核酸研究112：4127-4138)。
AFLP。一种基于DNA扩增的遗传标记，其中，将限制性内切核酸酶产生的DNA片段连接到能促进该限制性DNA片段扩增的短的DNA片段上(Vos，P.等1995.核酸研究23：4407-4414)。对扩增的片段进行大小分离，并观察扩增方式方面的差别。
同种异型酶。通过电泳分离的、并通过酶促活性染色调查的酶的变体(Stuber，C.W.和M.M.Goodman1983.USDA Agric.Res.Results，Southern Ser.，No.16)。
利用标记的筛选。利用遗传标记等位基因鉴定并筛选具有优良表型潜力的植株。将前面确定的与一个或多个性状基因座相关的遗传标记基因座，用于通过遗传标记基因座和性状基因座之间的连锁揭示性状基因座的基因型。根据在连锁的遗传标记基因座上的基因型选择含有需要的性状等位基因的植物。
本发明提供了一种用于鉴定与含有性状基因座的DNA片段相关的遗传标记基因座的方法。这种连锁关系的发现有利于将这种遗传标记基因座用作育种群体中的植物的基因型组成及其表型潜力的预测指标。
具体地讲，所述方法利用了来自几种具有不同的祖先的育种品系和品种的遗传标记分析的基因型信息。这种基因型种质调查用于分析从基因型调查中的相同品系上收集到的表型性状资料或来自其后代的性状资料。所述表型性状资料通过在所述调查的每一个登录品种的育种进程中收集到的测定结果表示。比较一个标记基因座上的每一个等位基因类型的表型平均值。把具有不同表型性状的等位基因类型的标记基因座，鉴定为与影响性状的性状基因座连锁。这些能产生需要的表型效应的与性状等位基因顺式连锁的遗传标记等位基因可以在育种程序中进行筛选。
本发明利用了收集到的大量的表型资料，并将其用于传统植物育种程序中。举例来说，一个成功的大豆品系的产量在该品系的选育过程中通常要测定数百次。如果测定300个品系，每个品系作300个产量测定，将有90,000个产量数据点可供分析。因此，每一个标记等位基因的估计产量结果基于数百个(就低频率等位基因而言)至数千个(就高频率等位基因而言)产量测定结果。由于产量数据是从经过几年选育的多个品系上收集到的，一个等位基因的表型效应是基于大量的时间和空间重复。通过确保适当再现已知的等位基因，可以测试所有等位基因的表型效应。
根据本发明的方法，可以使用任何类型的遗传标记。本领域技术人员可以理解，可以使用的各种遗传标记包括，但不限于限制性片段长度多态性(RFLPs)、随机扩增多态性DNAs(RAPDs)、简单序列重复(SSRs)、ALFPs、各种单碱基对调查方法、同种异型酶、和表型标记。
所述方法可应用于植物育种者感兴趣的任何性状，而且特别适用于分析低遗传力的性状。将大量的性状数据组用于补偿个体性状测定的较差的精确性。利用本方法还可以将具有高的遗传力的性状加以利用。由于这种性状可以较精确地测定，为了成功地利用本方法只需要较小的性状数据组。
用本方法鉴定的遗传标记基因座可被用于在育种程序中进行植物的利用标记的筛选。筛选可以根据一个或几个标记基因座的基因型进行。对本领域技术人员来说，显而易见的是，可以形成仅利用标记数据或与表型数据结合的预测模式，以测定个体基因型的育种值。还可以根据感兴趣的表型的预测值衡量单个的标记等位基因。可将上述模式用于从现有的育种群体中预测和筛选最理想的表型，以鉴定具有产生需要的后代的可能性的亲本系，并预测理想的基因型。另外，本发明具有同时筛选具有若干理想性状的植物的能力。
本发明的另一个实施方案是预测和筛选能适应特定的地点和环境的基因型的能力。通过分析从生长在特定地点或特定环境中的登录品种收集到的表型资料，可以鉴定影响在特定环境中的性状的遗传标记基因座及其相关的性状基因座。这样，可以预测一种性状等位基因在特定环境中的性状，并鉴定最理想的性状等位基因。通过筛选相关的遗传标记等位基因，可以育成在特定环境或地点具有优良性状的新品种。
本发明涉及与性状基因座连锁的遗传标记基因座的鉴定，以及随后将这些标记基因座用于通过育种程序选育优良品系。首先，对来自相同物种的多个登录品种进行基因型种质调查。所述调查中的登录品种是亲本材料和不同祖先的育种品系。可将任何类型的遗传标记用于实施本发明。不过，需要使用多个标记基因座，而且该类型的标记能揭示足够水平的多态性。
例如，如果将RFLP分析用于进行基因型种质调查，从所述每一个登录品种的植物组织中提取DNA，并用限制性内切核酸酶消化。然后通过琼脂糖凝胶电泳对该DNA进行大小分离，然后转移并固定在尼龙膜或硝酸纤维素上。利用克隆的DNA片段(DNA标记)作为杂交探针，观察固定在所述膜上的互补DNA片段。
对于利用基于核酸的遗传标记的每一种方法来说，比较各登录品种之间的观察DNA片段(标记等位基因)的相对大小，对每一个DNA标记来说，将具有相同的观察DNA片段大小的登录品种记为具有相同的遗传标记等位基因。因此，对每一个标记来说，将所述登录品种归类为观察的遗传标记等位基因大小类型中的一种。
该方法的第二个步骤是将遗传学调查资料与用相同的登录品种或其后代获得的性状资料进行比较。典型的性状资料组可以重新产生，或者通过植物育种程序中的常规资料收集而得到。对于具有低的遗传力的性状来说，希望性状资料组大，并且在时间上和空间上是重复的。
为了估算特定遗传标记基因座和性状基因座之间的联系，利用最小均方统计方法分别检验遗传标记基因座，由此发现了与性状基因座相关的遗传标记基因座。这种联系是遗传标记基因座和性状基因座之间的遗传学连锁造成的，并通过计算和比较一个遗传标记基因座上的每一个等位基因类型的平均性状性能进行鉴定。鉴定到的优选标记基因座/性状基因座联系的显著水平为p＜0.05，但可以用较高概率性的阈值鉴定。
由于性状资料通常是用几年时间，并在许多地点收集到的，为了提高调查标记等位基因型之间的显著差异需要降低非遗传学差异。这一目的可以通过采用非遗传学方差划分和所述数据组的协方差回归而实现。对本领域技术人员来说，显而易见的是可将其它统计学或模拟方法用于通过本发明方法调查标记基因座/性状基因座的联系。这些方法包括，但不限于，除了最小均方模式和方法之外，还包括多变方差模式和方法，模拟方法和最大可能性方法。
计算出的位于一个遗传标记基因座上的每一个类型的等位基因的表型值的平均值，是位于一个性状基因座上的顺式连锁的等位基因的表型值或育种值的估计值。因此，鉴定了位于性状基因座上的优良一个或多个等位基因，并可以利用遗传标记基因座数据资料进行筛选。通过基因分型，可以鉴定在标记基因座上具有高频率的理想的互补等位基因的亲本系，并选择用于杂交。可以对育种群体进行基因分型，并根据其基因型组成鉴定具有预期的优良表型性状的个体。
诸如ALFPs和RAPDs的某些遗传标记系统是主要的显性遗传标记系统。就显性遗传标记而言，在一个个体中仅能观察到一种类型的等位基因，即使该个体从遗传学上讲在调查的标记基因座上是杂合的。因此，无法区分杂合子和纯合子。另外就ALFPs和RAPDs而言，可能的等位基因类型的数量通常局限于每个基因座两个；观察到的等位基因是一种类型的等位基因，而所有不能观察到的其它的等位基因是第二种类型的等位基因。相反，RFLPs和SSRs通常是显性的标记系统。如果一个个体在标记基因座上是杂合的，可以观察到两种类型的等位基因，并可以对该个体进行全面的遗传学鉴定。就RFLPs或SSRs而言，通常可观察到许多类型的等位基因。因此，当利用ALFPs或RAPDs对多种不同祖先的品系进行分析时，可以通过电泳分离并分析扩增的DNA片段之后具有一条带(观察的等位基因)或缺乏该带(所有其它的等位基因)而对这些品系进行分类。在实施本发明方法时，被观察的等位基因的表型值是可以测定的，同时可以测定的还有未观察的等位基因的复合表型值。因此，连锁性状等位基因的值依据于存在一个性状基因座上的所有其它等位基因的平均值而测定。
这种对比分析采用了共显性标记系统(例如，RFLPs和SSRs)，其中，观察了其它等位基因。在这里，可以彼此区分的等位基因的数量取决于位于所述标记基因座上的多态性程度和由所采用的技术步骤提供的等位基因分辨水平。利用本方法可以测定所观察的每一个等位基因的表型值，因此，可以比较个体性状等位基因的表型值。
本方法相对鉴定并将遗传标记等位基因用于筛选性状等位基因的技术而言具有三个主要优点。首先，通过利用在植物育种程序中收集到的每一个登录品种的大量性状资料，可大大提高鉴定和精确估算标记等位基因/性状等位基因之间的联系的能力，因为所述性状资料组较大。这一点与传统分离群体分析相反，传统分析仅利用有限的重复和测试地点。
其次，通过测试多祖先的登录品种，可以优化形成标记/性状联系的遗传学环境。通过测试一个等位基因在多种遗传学背景下的值，可以估算出更精确的、更有价值的表型值。分析了每一个基因座上的许多(如果不是全部的话)可能的等位基因。这一点与传统分离群体分析相反，传统分析通常仅检验两个等位基因。另一个优点是，估算了性状等位基因的表型作用的遗传环境。当利用显性标记基因座/性状基因座联系鉴定到一个上位等位基因时，在所述性状基因座上用另一个等位基因取代所述等位基因的估计效果不会被过高的估计。这是因为所述效果是用很大的不同登录品种的集合作为参考群体估计的。对所述等位基因的筛选会导致接近由所述分析预测的表型的改进。在现有方法中，使用有限祖先的分离群体，在有限遗传背景的环境中估计一个等位基因的表型值(即仅有有限的性状基因座组具有对照等位基因)。其结果是通常会过高的估计一个性状等位基因的效果。而在其它群体中筛选相同的等位基因不可能导致相同的表型改善。这种过高的估计特别有问题，因为所选择的亲本系之一通常具有农艺缺陷，但之所以选择它是因为其表型和基因型不一致性。
最后，通过利用本方法调查标记基因座/性状基因座的联系，只有那些与性状基因座紧密连锁的遗传标记基因座能被鉴定。这是因为在该方法中测试的登录品种通常是若干育种循环的产物，在基因座之间已经发生了若干重组的机会。如果标记基因座是松散连锁的，会抑制基因座/性状基因座连锁关系的发现，尽管如此，将鉴定的标记用于在新的育种群体中进行利用标记的筛选也是有利的；这正是本发明的一个主要目的。相反，现有方法使用分离群体，其中，连锁不平衡性很大；即调查松散的标记基因座/性状基因座连锁关系的能力最大。因此，将鉴定的标记在其它群体中用作筛选工具是有问题的，因为，在遗传标记等位基因和需要的性状等位基因之间存在顺式连锁的可能性不大。
                         实施例
在以下实施例中将对本发明作进一步的说明。应当理解的是，这些实施例尽管指明是本发明的优选实施方案，但仅仅是以说明的形式给出的。通过上述说明和以下的实施例，本领域技术人员能够了解本发明的实质特征，并且在不超出本发明的构思和范围的前提下，对本发明作出各种改变和改进，以使其适应各种用途和条件。
                       实施例1
在大豆中鉴定具有产生优良的产量性状的等位基因的性状基因座。基因型种质调查育种
利用16个RFLP探针对总共314个大豆(Glycine max)品种、植物引进种(PIs)、和育种品系进行调查。在表I中示出的这些探针已先期保存在美国模式培养物保藏所(ATCC)，Rockville，MD。
                 表I
用于进行大豆品系的遗传学观察的RFLP探针
    探针                             保藏号
    1202                           ATCC 97082
    1203                           ATCC 97083
    1318                           ATCC 97084
    1329                           ATCC 97085
    1342                           ATCC 97086
    1443                           ATCC 97088
    1450                           ATCC 97089
    1487                           ATCC 97090
    1492                           ATCC 97091
    1503                           ATCC 97092
    1522                           ATCC 97093
    1525                           ATCC 97094
    1529                           ATCC 97095
    1587                           ATCC 97096
    1593                           ATCC 97097
    1596                           ATCC 97098
从温室生长的植株上采集大豆叶片组织，并用作DNA源。按照US5,437,697中所披露的方法进行RFLP分析。
分别统计每一个标记基因座，并为每一种遗传标记等位基因确定一个基因型代码(表II；独立的标记等位基因类型包括相同长度的限制性片段)。用其它代码命名杂合类型。因此，在一个基因座上具有相同基因型代码的登录品种具有相同的RFLP形式，并被视为在该基因座上从遗传学角度讲是相同的(表II)。
                       表II
          大豆品系的编码的RFLP标记基因型
(用1、2或3编码的基因型表示三种不同类型的纯合RFLP等位基因。用1/2编码的基因型表示等位基因1/等位基因2杂合子。未知的基因型用0编码，而理想品系的非显著基因座用ns编码。)产量数据收集
产量数据组跨越Asgrow种子公司育种试验中产量测定的10个年份。在所给出的10个年份的每一年中，不对单个的登录品种进行测试；相反，数据是就育种计划中，对于登录品种在主动评价登录品种的那些年份而给出。每一年，将登录品种种植在试验区中，每一个地点有1-3个试验区。在一个试验区内将登录品种重复2-3次。所选择的地点要同时体现生长环境的多样性并能反应各种大豆成熟类型。一个登录品种在任何特定年份里应当生长在最少6个，最多60个地点，平均每年10个地点。确定与控制产量的基因座连锁的遗传标记基因座
将所有的重复产量数据用于每一个登录品种，通过年份组合测定，计算每一个登录品种的平均产量。将所述平均值用于实际分析。用独立的分析分别测试标记基因座，其中，在一个基因座上调查的等位基因类型的数量取决于在该基因座上观察到的RFLP等位基因的数量。采用以下模型在方差分析中对每一个标记进行测试：Yijkl＝μ+αi+τj+ρk+β(Xij-X..)+(ατ)ij+(αρ)ik+(ατρ)ijk+εijkl其中：Yijkl＝第ijkl个登录品种的产量；
  μ＝总平均值；
  αi＝标记等位基因效应；
  τj＝年份效应；
  ρk＝成熟度效应；
  β＝Y对X的抑制系数，其中，Xij＝试验小区产量平均值；和
  εijkl＝误差
如该模型所示，为了降低非遗传变异量，将试验小区平均值用作协变量。结果，用位于标记基因座上的等位基因的调节过的平均产量进行F测试。该数据回归因为两种原因而有用：1)降低在不重叠的年份和地点进行产量测试的品种的影响，和2)消除因筛选改进后代登录品种的平均产量而产生的潜在混淆影响。另外，由于所述数据组的不平衡性，计算最小均方平均值，以估计通过每一个标记等位基因预测的结果。
表III是对标记1443进行的方差结果分析，它是本方法的典范。
                        表III
所有具有标记1443的代表性成熟度类型的大豆
产量的方差结果分析和最小均方平均值变异来源         自由度     均方        F值可能性     概率标记 1443          2       1.714         10.799       0.000成熟度             4       0.535         3.369        0.009年份               8       1.116         7.033        0.000小区协变量         1       10530.0       66338.7      0.000成熟度*1443        8       0.960         6.050        0.000年份*1443          15      0.863         5.434        0.000年份*成熟度        32      1.531         9.646        0.000Y*M*1443           33      1.091         6.867        0.000误差             24522     0.159
如果标记基因座F-测试为p＜0.05的显著水平，则认为该标记基因座与产量连锁并可预测产量。如表III所示，标记1443能够解释观察到的大豆产量的显著量的变异(p＝0.000)；因此，推测影响产量的一个或几个性状基因座与标记1443连锁。
以类似方式分析其余15个标记基因座。用于分析16个标记的每一个的模式是相同的，所不同的是，登录品种的数量、地点、成熟度类型和年份根据未知表型的频率和基因型数据而变化。
一旦发现一个标记基因座与大豆产量显著相关，下一个步骤就是确定哪一个标记等位基因预测最高的产量。为了比较不同标记等位基因及其相关性状等位基因的值，计算位于一个标记基因座上的每一种类型等位基因的最小均方平均产量。这些平均产量是预期的每一种标记等位基因在所有环境下的平均产量性状的估计值。在一个标记基因座上，预计能产生最佳大豆产量的等位基因因而具有最高的计算平均产量。在表IV中示出了在标记基因座1443上观察到的每一种类型等位基因的最小均方平均产量(平均产量)。
                         表IV
          在标记基因座1443上观察到的每一种
           类型等位基因的最小均方平均产量
        等位基因    平均产量(kg/英亩+/-标准误)
           1              4.0172+/-0.005
           2              3.9627+/-0.012
由表IV可以看出，推测标记1443上的决定大豆产量的最佳等位基因是等位基因1。
因此，本发明方法可以鉴定与大豆产量相关的标记基因座。该方法还能鉴定位于每一个标记基因座上的哪一个遗传标记等位基因能产生最佳产量性状。
                       实施例II
鉴定具有能在特定环境中产生优良的大豆产量性状的等位基因的性状基因座。
大豆品种的产量性状高度依赖于所述大豆品种生长的环境。根据所述大豆植物的遗传学组成，大豆可能适应或不适应其所生长的环境。基因型与环境的这种相互作用，导致了特别适应不同环境的大豆的育成。所述环境包括能影响大豆成熟度要求的诸如干旱或地理变化的非生物压力。由于在选育特别适应不同环境的大豆方面的重要性，鉴定能在特定环境中产生优良性状的遗传标记等位基因是具有价值的。通过检验模式相互作用鉴定能在特定环境中产生优良产量的遗传标记等位基因
进行实施例I所述的标记-标记分析的检验。在很多场合下，(例如，参见表III)，发现标记基因座与成熟度和/或年份之间存在显著相互作用(p＜0.05)。这种相互作用是单个等位基因对以地理区域(成熟度)和生长季节(年份)分类的特殊生长环境的效应的指标。在表III中，标记1443的上述相互作用(成熟度*1443，年份*1443)是高度显著的。因此，与标记1443等位基因连锁的每一个性状等位基因在不同的环境中具有不一致的产量结果。
为了确定哪一个等位基因最适合一种特定的成熟度，计算每一种成熟度类型内的每一个遗传标记等位基因所产生的平均产量。通过用位于标记1443上的每一个等位基因的平均产量对计算出该平均产量的每一种成熟度类型作图，可以清楚地看到从北到南通过美国的大豆种植地带时每一个等位基因的效应(图I)。在各种成熟度类型之间，等位基因1具有一致的产量，而等位基因2似乎最适合成熟度类型2和3。在成熟度类型5中，如果育种目标是高产的话，通过利用等位基因1的标记筛选，植物育种者可获得最佳结果。
通过检验每一种成熟度类型内的每一个遗传标记等位基因的估计平均产量，可以确定每一种地理环境中的最佳遗传标记等位基因及其相关的性状等位基因(通过成熟度类型确定)。因此，该方法能被用于鉴定和筛选对于地理区域来说重要的性状等位基因，这一目的是通过筛选在需要的地理区域中表现出高产的等位基因而实现的。
还要指出的是，可以其它方式确定地理区域，包括土壤类型、平均降雨量，平均热单位、纬度或可用于所述数据分析的任何其它空间分类方法。上述因素可以增加到上文所述的通用模型中，或者作为该模型的一个因素代替成熟度。
举例来说，为了鉴定一种成熟度类型的最佳等位基因，可以检验计算出的每一种土壤类型中的每一个等位基因的平均产量值。应当筛选对于特定土壤类型来说具有最高的计算平均产量的位于每一个标记基因座上的等位基因，以提高这种土壤类型的基因型产量潜力。
标记基因座-年份的相互作用也具有价值。一般，选择能在一种地理区域中的一定范围的环境中出现较高产量的大豆品种，需要的是能在最优和次优生长条件下具有优良性状的品种。在一种典型的育种程序中，要对大豆品系进行若干年的测试，通常只有那些表现出一致的优良性状的大豆品系才会入选。因此，尽管单个的性状等位基因存在环境特异性效应，在各种环境中具有最一致的效应的等位基因通常是有价值的。通过检验每一个标记等位基因在不同年份里的平均性状和筛选在不同年份之间具有一致的优良性状的相关的性状等位基因可以鉴定所述等位基因。
计算标记1443的每一个等位基因与年份组合的平均产量。将这些平均产量作图于图2中。检查图2发现，具有等位基因1的大豆登录品种与具有等位基因2的大豆登录品种相比，前者在不同年份之间表现出一致的产量性状。因此，对植物育种者来说，为了获得一致的产量性状，筛选具有标记1443的等位基因1是有利的。
所述分析还可以鉴定在诸如干旱压力的某种环境条件下特别重要的性状等位基因。例如，通过检验哪一个遗传标记等位基因能在低降雨量的年份中产生较高的产量，可以鉴定对于大豆干旱压力来说重要的等位基因。通过数据组划分鉴定能在特殊环境中产生高产的遗传标记等位基因
鉴定能在特定环境中产生较高的大豆产量的遗传标记等位基因的另一种方法是划分所述数据组。通过独立地分析从一种特定环境或特定区域采集到的数据，可以确定对试验的环境来说与有利的性状等位基因相关的遗传标记等位基因。
例如，大豆品种通常适应美国北方或南方的大豆种植区，并且通常作为独立的基因库进行处理。因此，根据成熟度将所述数据划分成北方和南方数据组是合理的。结果，分别对北方或南方的成熟度进行检验，并用于鉴定和预测对于在美国北方或南方进行的大豆改良来说最有价值的等位基因。
采用上文在例1中所述的模型，不过，仅分析来自北方成熟度或南方成熟度登录品种的数据。同样进行标记-标记分析，如果p＜0.05，则认为个标记基因座与大豆产量显著相关。为了确定哪一个遗传标记等位基因能产生最高的产量，计算每一种遗传标记等位基因的最小均方产量平均值。在表V中示出了北方成熟度数据组的在标记基因座上观察到的每一个等位基因的最小均方平均值(平均产量)。
                          表V
分析过的在北方成熟度区中与大豆产量显著相关的标记基因座(在北方成熟度区中与大豆产量相关并预测大豆产量的标记基因座用粗体表示(p＜0.05)。未用粗体表示的标记基因座(p＞0.05)未表现出与大豆产量的相关性。对于标记基因座上的每一个等位基因来说，示出了北方成熟度的登录品种的预测平均大豆产量。)
基因座        等位基因      平均产量(kg/英亩+/-标准误)
1202             1                4.0678+/-0.006
                 2                4.0010+/-0.008
                 3                4.0654+/-0.062
1203             1                3.9810+/-0.009
                 2                4.0185+/-0.005
1318             1                4.0492+/-0.008
                 2                4.0311+/-0.014
1329             1                4.0350+/-0.017
1342             1                3.9964+/-0.006
                 2                3.7818+/-0.032
1443             1                4.0335+/-0.005
                 2                4.0564+/-0.016
1450             1                4.0655+/-0.006
                 2                4.0384+/-0.072
                 1                4.0357+/-0.004
                 2                4.0208+/-0.016
1492             1                4.0408+/-0.005
              2                4.0371+/-0.009
1503          1                4.0696+/-0.007
              2                3.9788+/-0.023
              3                3.8866+/-0.036
1522          1                4.0359+/-0.006
              2                4.0352+/-0.005
1525          1                4.0227+/-0.004
              2                4.0388+/-0.012
1529          1                4.0354+/-0.004
1587          1                4.0679+/-0.007
1593          1                4.0373+/-0.006
              2                4.1176+/-0.056
1596          1                4.0774+/-0.012
              2                4.1179+/-0.012
              3                3.6624+/-0.078
在北方，有7个标记基因座(1202，1342，1443，1503，1525，1593和1596)被证实与大豆产量显著相关(表V)。对于每一种显著的标记基因座来说，最佳的等位基因可以被确定为具有最高的平均产量。在北方具有最高产量的大豆品种被推测具有由具有最高的计算平均产量的标记等位基因组成的基因型。
仅用来自南方成熟度的数据进行相同的分析，在表VI中示出了在南方的基因型的最小均方平均值(平均产量)。
                          表VI
分析过的在南方成熟度区中与大豆产量显著相关的标记基因座(在南方成熟度区中与大豆产量相关并预测大豆产量的标记基因座用粗体表示(p＜0.05)。未用粗体表示的标记基因座(p＞0.05)未表现出与大豆产量的相关性。对于标记基因座上的每一个等位基因来说，示出了南方成熟度的登录品种的预测平均大豆产量。)
基因座  等位基因    平均产量(kg/英亩+/-标准误)
1202        1              4.0276+/-0.013
            2              3.9446+/-0.023
1203        1              3.9740+/-0.012
            2              3.9695+/-0.013
1318        1              4.0192+/-0.014
            2              3.9444+/-0.023
1329        1              4.0311+/-0.026
1342        1              3.8389+/-0.016
            2              4.0253+/-0.024
1443        1              4.0431+/-0.017
            2              3.9133+/-0.026
1450        1              4.1220+/-0.021
            2              4.0469+/-0.065
1487        1              3.9915+/-0.014
            2              3.9967+/-0.021
1492        1              3.9957+/-0.019
            2              3.9501+/-0.020
1503        1              4.1258+/-0.018
            2              4.0167+/-0.061
            3              4.0982+/-0.030
1522        1              3.9660+/-0.014
            2              3.9979+/-0.036
1525        1              4.0271+/-0.013
            2              3.7564+/-0.058
1529        1              3.9968+/-0.012
1587        1              4.1194+/-0.022
1593        1              4.0120+/-0.021
1596        1              4.0686+/-0.019
            2              4.1299+/-0.023在南方，有5个标记基因座(1342，1443，1492，1525，和1596)与较高的大豆产量相关(表VI)。在每一种显著标记基因座上，与最高产量的性状等位基因相关的标记等位基因具有最大的平均产量。通过筛选位于每一个显著标记基因座上的最佳等位基因，可以育成较高产的南方品种。
通过划分数据组，可以确定每一种环境下的一组特有的标记基因座。比较表V和表VI发现，在每一个数据组中具有一组独特的标记基因座。即使在相同的标记被鉴定为与产量显著相关的情况下，最有益的等位基因也并非总是相同。例如，在标记基因座1342上，等位基因1在北方能产生高产，而在南方等位基因2是优选的。
可以用其它标准划分数据组。例如，可以根据生长天数、土壤类型、平均降雨量划分所述数据。对每一种类型的环境来说，可以确定能产生高产性状的标记等位基因。
                       实施例III
            鉴定控制大豆植株高度的性状基因座
本方法十分适用于分析育种中的很多感兴趣的性状。大豆的所述性状之一是植株高度。利用例1所述的相同的基因型种质调查，和在例1所述的相同试验小区中提到的高度数据。对标记基因座进行分析，以确定哪一个标记基因座与大豆植株高度相关，并能预测大豆的植株高度。与例1中的产量相似，在独立的最小均方分析中对每一个标记基因座进行分析。
采用以下方差模型分析每一个遗传标记基因座：Yijkl＝μ+αi+τj+ρk+β(Xij-X..)+(ατ)ij+(αρ)ik+(ατρ)ijk+εijkl其中：Yijkl＝第ijkl个登录品种的高度；
  μ＝总平均值；
  αi＝标记等位基因效应；
  τj＝年份效应；
  ρk＝成熟度效应；
  β＝Y对X的抑制系数，其中，Xij＝试验小区高度平均值；和
  εijkl＝误差
利用例II中所述的北方或南方成熟度数据组与例I中所使用的相同的16个RFLP标记基因座进行与植株高度相关的显著相关性测验。如果一个标记基因座的F-测验为p＜0.05的显著水平，则认为该标记基因座与北方或南方的植株高度连锁并能预测植株高度。如上文所述般地对16个标记基因座分别进行分析，并在表VII和VIII中示出了这16个标记基因座以及每一种类型标记等位基因的平均高度。用于分析所述16个标记基因的每一个的模型是相同的，所不同的是，登录品种的数量、地点、成熟度类型、和年份根据未知表型的频率和基因型数据而变化。
在北方，鉴定了4个与大豆植株高度显著相关的标记基因座(表VII)。
                        表VII分析过的在北方成熟度区中与大豆植株高度显著相关的标记基因座(在北方成熟度区中与大豆植株高度相关和能预测大豆植株高度的标记基因座用粗体表示(p＜0.05)。未用粗体表示的标记基因座(p＞0.05)未表现出与大豆植株高度的相关性。对于标记基因座上的每一个等位基因来说，登录品种的预测平均大豆植株高度表示北方的成熟度。)
基因座         等位基因      平均高度(英寸+/-标准误)
1202               1              28.869+/-0.072
                   2              28.689+/-0.091
                   3              29.835+/-0.512
1203               1              28.588+/-0.065
                   2              28.576+/-0.059
1318               1              28.408+/-0.050
                   2              29.036+/-0.174
1329               1              28.077+/-0.154
1342              1               28.865+/-0.085
                  2               28.663+/-0.175
1443              1               28.466+/-0.054
                  2               28.388+/-0.214
1450              1               28.607+/-0.071
                  2               28.593+/-0.947
1487              1               28.720+/-0.041
                  2               28.594+/-0.329
1492              1               28.734+/-0.052
                  2               28.403+/-0.072
1503              1               28.531+/-0.073
                  2               29.031+/-0.360
                  3               29.862+/-0.388
1522              1               28.683+/-0.072
                  2               28.654+/-0.055
1525              1               28.598+/-0.047
                  2               28.725+/-0.155
1529              1               28.633+/-0.042
1587              3               28.705+/-0.101
1593              1               28.803+/-0.068
                  2               28.413+/-0.664
1596              1               28.993+/-0.231
                  2               28.624+/-0.148
所述标记是1202、1318、1492、和1503。在每一种标记内，计算每一个标记等位基因的最小均方平均值，并示于表VII中。能产生较高的植株高度的等位基因具有最大的计算平均高度。为了在北方培育出较高的大豆品种，应当筛选这样的遗传标记等位基因。
用南方成熟度数据组进行相同的分析。在分析南方数据组时，仅有两个基因座与植株高度显著相关(表VIII)。
                     表VIII分析过的在南方成熟度区中与大豆植株高度显著相关的标记基因座(在南方成熟度区中与大豆植株高度相关和能预测大豆植株高度的标记基因座用粗体表示(p＜0.05)。未用粗体表示的标记基因座(p＞0.05)未表现出与大豆植株高度的相关性。对于标记基因座上的每一个等位基因来说，登录品种的预测平均大豆植株高度表示南方的成熟度。)
基因座         等位基因      平均高度(英寸+/-标准误)
1202               1             27.891+/-0.243
                   2             28.537+/-0.374
1203               1             28.205+/-0.227
                   2             28.029+/-0.283
1318               1             27.930+/-0.328
                   2             29.690+/-0.368
1329               1             28.377+/-0.346
1342               1             28.995+/-0.600
                   2             29.263+/-0.136
1443               1             27.846+/-0.289
                   2             28.266+/-0.399
1450               1             27.885+/-0.321
                   2             27.386+/-0.686
1487               1             27.902+/-0.282
                   2             28.123+/-0.278
1492               1             27.899+/-0.155
                   2             28.408+/-0.345
1503               1             27.710+/-0.274
                   2             28.331+/-0.799
                   3             28.638+/-0.279
1522               1             28.039+/-0.236
                   2             28.157+/-0.312
1525               1             28.990+/-0.235
                   2             28.194+/-0.780
1529               1             28.071+/-0.278
1587               1             27.857+/-0.365
1593               1             28.153+/-0.300
1596               1             26.885+/-0.176
                   2             28.045+/-0.318同样，计算每一种等位基因的最小均方平均值(平均高度)。对于南方大豆种质来说，筛选位于标记1503上的等位基因3和位于标记1596上的等位基因2预计能产生最高的大豆品种。
                    实施例IV
          利用遗传标记筛选优良的大豆植株
一旦利用本方法鉴定到需要的性状基因座/标记基因座连锁关系，即可将相同的遗传标记基因座用于产生新的优良品种。首先设想该方法有利于筛选用于杂交的亲本系，这些亲本系具有决定高产的等位基因的互补组合、抗病性、其它植株性状、或性状的组合。还设想所述标记基因座能被用于揭示育种群体中分离体的遗传潜力，并能够筛选具有最佳表型潜力的品系。筛选用于培育优良后代的亲本
重要的是确定在被用作亲本时最有可能产生具有优良性状的后代的亲本的品系。所述超亲分离后代可以由具有互补类型的等位基因的亲本杂交产生。利用本方法所提供的信息，可以了解一个标记基因座上的能产生需要的性状表现的遗传标记等位基因。通过在所述标记基因座上对所述品系进行基因分型，可以了解这些品系作为亲本的价值。例如，如果需要产生一种在5个独立的产量基因座(A-E)上具有优良等位基因的个体，人们可能需要鉴定并让一种包括基因座A、B、和C的需要等位基因的亲本与包括位于B、D、和E的需要的等位基因的亲本杂交。所述亲本是互补的，因为它们能产生在所有5个基因座上均含有需要的等位基因的后代。理想的是，选择在组合以后能确保最大限度的基因座互补的亲本，以便产生高频率的理想基因型。
作为亲本筛选的辅助手段，并作为本方法用途的一个例证，利用例1的分析结果(见表II)产生了决定产量的模拟理想基因型。这种理想基因型包括在所有成熟度类型分析中发现的预计能产生高产的遗传标记等位基因。然后将一组优良品种及其祖先与该理想基因型加以比较。通过在显性标记基因座上比较其基因型与理想基因型，计算每一个品系与理想基因型的百分遗传相似性，如果一个登录品种在等位基因组成方面与所述理想基因型在20个等位基因(10个基因座)中有18个相同，则它与所述理想基因型的百分相似性为90％。以上结果示于表IX中。
                        表IX
良种大豆及祖代大豆品种与包括选自10个RFLP标记基因座的等位基因的理想基因型的百分相似性，所述基因座被证实在试验过的成熟度类型中与产量显著相关
品种      类型      与理想基因型的相似性％
A3127     良种             90.0
A3205     良种             90.0
A4906     良种             87.5
A4271     良种             85.0
A1937     良种             80.0
A3966     良种             75.0
A4997     良种             70.0
A5474     良种             70.0
PI54610   祖先             70.0
A3307     良种             60.0
CNS       祖先             60.0
Roanoke   祖先             60.0
A4595     良种             55.6
Mukden    祖先             50.0
Tokyo     祖先             40.0
Mandarin  祖先             30.0A.K.Harrow  祖先             30.0
Manchu    祖先             25.0
Richland  祖先             16.7
在优良性和与理想基因型的相似性方面存在高度相关。表IX中的结果证实，在育成优良品种的过程中，存在着通过本方法预测为高产所需的等位基因的积累。通过重组筛选的优良亲本，可进一步接近产生在遗传上与所述理想基因型相同的品系。因此，植物育种者能够根据由遗传标记基因座揭示的遗传组成筛选亲本，其目的是产生具有与假想的理想基因型相同的基因型的较高产的品系。在育种群体中筛选有利的基因型
在育种群体中，理想基因型的筛选通常取决于通过观察表型而成功发现的优良基因型。通过分析分离群体中与一种性状相关的标记基因座，可将基于标记的筛选有效应用于鉴定和筛选需要的基因型。最理想的基因型的筛选是通过利用这些有参考价值的标记基因座分析群体中的个体而实现的。有利的基因型具有最高频率的理想等位基因，而且，一旦通过遗传标记分析发现其基因型，即可筛选这种基因型。另外，通过了解杂交中基因座分离的数量，植物育种者可以更好地优化所采用的育种方法和筛选强度，以期最大限度地获得理想的基因型。
                         实施例V
         利用简单序列重复遗传标记鉴定在大豆中具有
         产生优良产量性状的等位基因的性状基因座基因型种质调查育种
可以利用任何和所有类型的遗传标记实施本方法。一种类型的所述遗传标记是简单序列重复(SSR’s)。这种短的、串联的重复序列因为其高度的多态性而特别有用。利用15个SSR标记基因座对总共872个大豆(Glycine max)品种、植物引进种、和育种品系进行调查。鉴定每一种SSR标记基因座的特殊引物序列示于表X中。
                          表X
  用于进行大豆品系的遗传学调查的SSR标记基因座引物序列标记        序列(5’-3’)         引物类型    序列号：1003ssr  AGCTAAAACATTAATTTCCTATAT   正向         1
     AATCATCCTATCTTTTCATTCT     反向         21006ssr  CAATCAGGTTAGTGGTCCTACC     正向         3
     CAAAAGGTTTTCAGTGGTGG       反向         41011ssr  TCATAATAACAAAATTCAATTACA   正向         5
     GTGAAGAGATATTGTCTTAAAAAA   反向         61018ssr  CGGTTTAATTAAGAGAGTTAAGA    正向         7
     CAAATTTTATTGTATTTCTCTGTC   反向         81030ssr  CCAATCTAATGAAATTGACCT      正向         9
     CAAAACCTTTTATGAGTATTTACG   反向         101031ssr  CTAATTGGCAACTTTAACATACCC   正向         11
     CTCAAGGTCTCACTTTCAATTTC      反向      121032ssr  TTTGTTTGATCTATGCACTTGC       正向      13
     GCCAAGTCACACACACCAAG         反向      141035ssr  ACCAATAAAGATAACCGAAAAACA     正向      15
     GCTTTGCTTAGGTTTTGTTCTC       反向      161036ssr  CTTATGCTGCACTCGCCG           正向      17
     TGTGTCAGTACTTGAGTGAATGAA     反向      181038ssr  GTGAAACGGAAAGCCTCTTAC        正向      19
     GCACTGCCAACCAGTAACTAA        反向      201039ssr  GCGGACTGGAGGTCATAAC          正向      21
     GAATAACCCAATCCTTCTTTCC       反向      221040ssr  GACTTGAGTTGAGTCACAGTCATC     正向      23
     GAACCTTCAGAACCCATGATT        反向      241042ssr  CCCAAAGAGATAAAATGGAAAC       正向      25
     CTCCATCACTCCAACAACACA        反向      261043ssr  CCAAAGAGATAAAATGGAAACTG      正向      27
     TCACTGTGTCGTCCTTTTCTC        反向      281044ssr  CATTGTGCCTTATTCCTTG          正向      29
     AAATGATGTAAGAGAAACCAA        反向      30
从温室生长的植株上采集大豆叶片组织，用作DNA来源。利用自动DNA提取装置，根据由Murray和Thompson所披露的化学提取方法(Murray，M.P.和Thompson，W.F.(1980)核酸研究8：4321-4325)进行DNA提取。将提取的DNA用作模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增每一种SSR。反应混合物如表XI所示。
                     表XI
用于扩增大豆中的简单序列重复基因座的扩增混合物
试剂                         最终浓度
10X PCR缓冲液*                1X
dNTPs的锂盐                   200μM
正向引物                      0.3μM
反向引物                      0.3μM
Ampli Taq聚合酶TM            0.5单位*10X PCR缓冲液含有900mM Tris-OH和200mM硫酸铵，用盐酸将最终pH调整到9.0。
PCR反应的最终体积为15μl。将扩增混合物热循环32个轮次：94℃ 50秒，54℃ 50秒，72℃ 85秒。在经过32个轮次的扩增以后，在72℃下进行8分钟的延伸。在2％的Metaphor琼脂糖凝胶上(FMC)在7.3V-cm-1-h-1的条件下对DNA扩增产物进行大小分离。
大体上按例I所述方法统计。对每一个SSR标记基因座分别进行统计，并为每一种类型的遗传标记等位基因确定一个基因型代码，其中每一种类型的等位基因是具有相同分子量的观察的DNA片段。用其它代码命名杂合类型。因此，在一个基因座上具有相同基因型代码的登录品种具有相同的SSR形式，并被视为在该基因座上从遗传学上讲是相同的。产量数据采集
产量数据组跨越在Asgrow种子公司育种试验中测定的跨越10个年份的产量测定。在所给出的10个年份的每一年中，不对单个的登录品种进行测试；相反，在与育种程序中对登录品种进行积极评价的那些年份所收集到的登录品种中的数据。每一年，将登录品种种植在试验区中，每一个地点有1-3个试验区。在一个试验区内将登录品种重复2-3次。所选择的地点要同时体现生长环境的多样性并能反应各种大豆成熟类型。一个登录品种在任何特定年份里应当生长在最少6个，最多60个地点，平均每年10个地点。确定与控制产量的基因座连锁的遗传标记基因座
对每一个登录品种来说，仅利用来自北方大豆种质的重复的产量数据(见例II)，通过测试年份的组合，计算每一个登录品种的平均产量。将这种平均值用于实际分析。利用独立的分析分别测定标记基因座，其中，所调查的位于一个基因座上的等位基因类型的数量取决于在该基因座上观察到的SSR等位基因的数量。利用以下模型在方差分析中对每一个标记进行测定：Yijkl＝μ+αi+τj+ρk+β(Xij-X..)+(ατ)ij+(αρ)ik+(ατρ)ijk+εijkl其中：Yijkl＝第ijkl个登录品种的产量；
  μ＝总平均值；
  αi＝标记等位基因效应；
  τj＝年份效应；
  ρk＝成熟度效应；
  β＝Y对X的抑制系数，其中，Xij＝试验小区产量平均值；和
  εijkl＝误差
利用前面的模型对15个SSR标记基因座中的每一个分别进行测试。如果一个标记基因座的F-测试为p＜0.05的显著水平，则认为该基因座与北方大豆成熟度区的产量连锁并能预测产量。在表XII中示出了所述15个SSR标记基因座，和每一种类型标记等位基因的平均产量。用于分析所述15个标记中的每一个的模型是相同的，所不同的是，登录品种的数量、地点、成熟度类型、和年份根据未知表型频率和基因数据而变化。
在北方，15个SSR标记基因座中的4个被鉴定为与大豆产量显著相关(表XII)。
                        表XII
     在北方成熟度区与大豆产量显著相关的标记基因座(示出了在北方成熟度区与大豆产量相关并能预测大豆产量的标记基因座(p＜0.05)。对于标记基因座上的每一个等位基因来说，示出了北方成熟度的登录品种的预测平均大豆产量。)
基因座      等位基因      平均产量(千克/英亩+/-标准误)
ssr1011         1                 3.5128+/-0.031
                2                 3.4702+/-0.014
                3                 3.5616+/-0.002
ssr1032         1                 3.5819+/-0.002
                2                 3.6056+/-0.005
ssr1036         1                 3.4806+/-0.003
                2                 3.5658+/-0.002
ssr1038         1                 3.5510+/-0.002
                2                 3.5739+/-0.006
就RFLP标记而言，可以得出性状基因座和其它类型遗传标记基因座之间的成功联系。利用SSR标记，通过基因分型可以筛选产量的连锁性状基因座，并筛选产生最高平均产量的SSR标记等位基因。因此，该方法的使用独立于所使用的标记类型，并能够利用所有类型的遗传标记进行成功地鉴定和筛选。
                      序列表
(1)一般资料：
  (i)申请人：
     (A)收件人：E.I.杜邦德纳幕尔及公司
     (B)街道：1007市场大街
     (C)城市：惠明顿
     (D)州：德拉华
     (E)国家：美国
     (F)邮编：19898
     (G)电话：302-992-4926
     (H)传真：302-773-0164
     (I)电板：6717325
  (ii)发明名称：一种鉴定与性状基因座相关的遗传标记基因座的方法
  (iii)序列数：30
  (iv)计算机可读形式：
     (A)媒体类型：3.5寸盘
     (B)计算机：IBM PC兼容
     (C)操作系统：微软windows95
     (D)软件：微软word7.0A
  (v)当前申请数据：
     (A)申请号：
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     (C)分类号：
  (vi)在先申请数据：
     (A)申请号：60/039,844
     (B)申请日：1997年3月20日
  (vii)律师/代理人资料：
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Claims (15)

1.一种用于由作物种鉴定与性状基因座相关的遗传标记基因座的方法，该方法包括：
a)利用多种祖先的种质产生一种作物种的基因型调查，所产生的调查利用了遗传标记，其中，所述种质调查的个体登录品种不是为了分析而产生的分离群体的成员；
b)将所述基因型调查与从用于产生所述基因型调查的相同登录品种或其后代上收集到的表型数据加以比较；
c)评估遗传标记基因座和性状基因座之间的相关性；和
d)鉴定与所述性状基因座相关的遗传标记基因座。
2.一种用于由生长在特定环境中的作物种鉴定与性状基因座相关的遗传标记基因座的方法，该方法包括：
a)利用多种祖先的种质产生一种生长在特定环境中的作物种的基因型调查，所产生的调查利用了遗传标记，其中，所述种质调查的个体登录品种不是为了分析而产生的分离群体的成员；
b)将所述基因型调查与从用于产生所述基因型调查的相同登录品种或其后代上收集到的表型数据加以比较；
c)评估遗传标记基因座和性状基因座之间的相关性；和
d)当所述作物种生长在所述特定环境中时，鉴定与所述性状基因座相关的遗传基因座。
3.如权利要求1或2的方法，其中，所述作物种是大豆。
4.如权利要求1或2的方法，其中，所述作物种是玉米。
5.如权利要求1或2的方法，其中，所述性状基因座能产生一种可观察的性状，这些性状选自下列一组：产量、倒伏、高度、成熟度、抗病性、抗虫性、营养缺陷性和谷物组成。
6.如权利要求1或2的方法，其中，所述遗传标记选自下列一组：RFLPs、SSRs、RAPDs、AFLPs和同种异型酶。
7.一种用于产生包括一种理想性状的超亲分离植物的方法，该方法包括：
a)按照权利要求1的方法鉴定一个或几个与性状基因座相关的遗传标记基因座；
b)利用在步骤a)中鉴定的遗传标记基因座对潜在的亲本系进行基因分型；
c)筛选包括所述理想性状相关的遗传标记等位基因互补类型的亲本系；
d)让步骤c)的亲本系杂交；和
e)回收步骤d)的杂交的后代植株；
其中，所述后代植株是相对所述理想性状而言的超亲分离植株。
8.如权利要求7的方法，其中，所述超亲分离植株是一种作物种的一员。
9.如权利要求8的方法，其中，所述作物种是大豆。
10.如权利要求8的方法，其中，所述作物种是玉米。
11.一种用于从育种群体中筛选包括与一种性状相关的高频率的理想等位基因的植物的方法，该方法包括：
a)按照权利要求1的方法鉴定一个或几个与性状基因座相关的遗传标记基因座；
b)利用步骤a)中鉴定的遗传标记基因座对选自一个分离育种群体的植物进行基因分型；和
c)筛选具有高频率的与理想的性状等位基因相关的遗传标记等位基因的植物；
其中，所筛选的植物包括高频率的与一种性状相关的理想等位基因。
12.如权利要求11的方法，其中，所述植物包括一种作物种的一员。
13.如权利要求12的方法，其中，所述作物种是大豆。
14.如权利要求12的方法，其中，所述作物种是玉米。
15.如权利要求7或11的方法，其中，所述性状选自下列一组：产量、倒伏、高度、成熟度、抗病性、抗虫性、营养缺陷性和谷物组成。
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