CN111387050A - 一种评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于转基因大豆生态安全评估领域，具体涉及一种评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，统计测定野生大豆、杂交或回交后代整个生活史周期中最能够反映生存能力和繁殖能力的性状，包括营养期4个性状和生殖期8个性状，最后利用总适合度可以明确得到转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度高低。本发明解决了目前没有评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度方法的问题。对科学评估转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度具有重要作用，适合度的评估是安全释放转基因大豆的重要环节，根据转基因大豆基因漂移到野生大豆后对野生大豆适合度的影响提前做好基因漂移的防范工作。

Description

一种评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的 方法

技术领域

本发明涉及一种评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，属于转基因大豆生态安全评估领域。

背景技术

自1996年世界首例转基因作物(转基因耐储藏番茄)商品化种植以来，转基因生物技术以及转基因产品的研究和应用得到极大发展，2019年12月30日，农业农村部科技教育司公式了拟批准颁发农业转基因生物安全证书目录，其中就包含了抗草甘膦转基因大豆品种SHZD32-01。转基因生物技术的迅速发展以及转基因作物在全球的商品化应用，为提高农作物产量、减少资源的投入和降低劳动成本提供了一种新的选择，也为世界粮食安全的保障提供了新的机遇。至2018年，转基因作物的种植面积增至1.917亿公顷。在所有转基因作物中转基因大豆(Glycine max)的种植面积最大，2018年达到0.959亿公顷，占全球转基因作物种植面积的50％。近年来，中国大豆进口量持续增长，到2017年已达9553万吨，随着转基因大豆的进口，在运输、加工等环节可能会造成转基因大豆的散落并长成植株，而转基因大豆的花粉可能会漂移到野生大豆中，造成基因的逃逸。转基因作物的全球大规模种植，在带来巨大经济和社会利益的同时，也引起了全球对转基因的生物安全的广泛关注，在众多的环境生物安全顾虑中，外源转基因通过花粉介导的基因漂移或基因流(gene flow)从转基因作物逃逸到作物的野生近缘物种以及带来的潜在环境风险，是令全世界最关注的生物安全问题之一。经过生物技术和生物工程的方法转移到栽培作物的转基因，可以通过天然杂交逃逸到邻近的野生近缘种群体。由于有些经过人工修饰或改良的转基因(如抗除草剂、抗虫和抗病基因)，在特定的环境条件下，具有较强的自然选择优势。当这些转基因通过基因漂移转移到野生近缘种的群体，就可能改变这些野生群体的生存和繁殖能力，甚至入侵能力，使得其迅速扩展分布空间，或形成难以控制的杂草，从而导致不可预测的环境影响。因此，转基因逃逸及其带来的潜在环境或生态风险，是任何转基因作物在进入商品化生产或大规模种植之前必须进行安全评价的内容。

野生大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc.)和大豆染色体数相同2n＝40，同属G染色体组，是大豆直接的祖先，是其遗传资源的重要组成部分，在大豆起源与进化的研究中具有重要的价值。调查发现，中国除海南省外其余大豆种植区均有野生大豆的分布，且随着大豆种植面积的增加，栽培大豆种植区域与野生大豆分布区域的重叠面积也逐步增加。大豆与野生大豆之间没有生殖隔离，极容易杂交，目前已有相关研究表明栽培大豆与野生大豆在自然环境中发生了基因互渗。适合度可以定义为在特定环境中一个个体能够生存并成功繁殖后代的相对能力。适合度是生物个体存活力和繁殖成功率的度量，具有较强生长和繁殖能力的个体，其适合度较高，成功进化的几率较大。在评价适合度时，应当按照转基因的特性设计具有不同选择压的环境条件，将试验群体种植在具有不同选择压的环境条件下来进行比较。我国野生大豆居群的分布主要在河流和湖泊及湿地、水塘和湿润处、山坡、公路沿线、农田生态系统(田边、地头、田埂、引水渠、农用路、村落附近等)，分布范围较广，生境多样。所以设置了有杂草竞争和无杂草竞争两种种植条件；豆科植物兼具吸收土壤氮和固氮两种氮的来源方式，对氮的代谢较为复杂，土壤条件是影响豆科植物代谢和植株性状的重要因素，因此在设立了有无杂草竞争两种种植条件的同时，设立了农田土和荒地土这两种种植条件。利用野生大豆及转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代在四种不同种植条件下的同质园种植试验中表现，同时结合野外竞争试验的结果，就可以通过统计和比较分析，检测转基因大豆的基因漂移后对野生大豆的适合度影响，为转基因从栽培大豆逃逸到野生大豆环境风险的评价提供重要的信息和数据。

转基因的成功漂移依赖于携带抗性基因后代的适合度，因此，提供一种科学的转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的评价方法，不仅能为转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度评价提供科学的实验方法，更能为评估转基因大豆向野生大豆基因漂移的生态风险研究提供理论基础。

发明内容

针对现存的问题，本发明提供一种评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法。本发明可以科学精确地对转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度进行评估。

本项发明的技术方案是：

一种评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，所述方法包括：

对转基因大豆与野生大豆分批种植，使二者的花期相遇；通过人工杂交方式获得转基因大豆与野生大豆的杂交后代或回交后代，再通过杂交后代或回交后代的自交获得更多世代的试验材料；

开展杂交后代或回交后代与其亲本的同质园种植比较试验；

测定并计算试验材料的各适合度性状，得到试验材料适合度性状的相对适合度，以及各供试材料的总适合度；

适合度性状的相对适合度计算方法：以野生大豆为比较的标准“1”，相应杂交或回交后代的各适合度性状与野生大豆的该适合度性状之比为相对适合度值，总适合度值是其各适合度性状的相对适合度值的平均数。

进一步的，所述适合度性状包括出苗率、子叶真叶大小、株高、地上部干生物量、花器大小、花粉活力、单株结荚数、单株饱粒种子数、结实率、百粒重、种子落粒率、种子活力持续能力。

进一步的，杂交或回交后代在移栽到盆钵前需要进行分子鉴定，移栽携带抗性基因的植株；分子鉴定步骤为：以野生大豆为阴性对照，转基因大豆为阳性对照，提取杂交后代植株的总DNA，采用PCR后进行琼脂糖凝胶电泳的方法，检测转基因大豆与野大豆的杂交或回交后代中转基因是否存在。

进一步的，适合度性状的调查方法为：

出苗率：将幼苗真叶展开视为出苗，统计播种材料苗期出苗数，出苗率＝出苗数/播种种子数×100％；

子叶真叶大小：第一片复叶未展开时期，利用游标卡尺测量子叶的长度宽度、真叶的长度宽度，子叶真叶大小值为子叶长×宽+真叶长×宽；

株高：第三个三出复叶期利用直尺测量植株顶端到根茎部的高度；

地上部干生物量：成熟后收获植株地上部晒干并称重；

花器大小：在植株盛花期，随机选取单株上不少于50朵完全盛开的花朵，测量萼片长度、翼瓣长度、龙骨瓣长度、花瓣外露长度、沟槽长度，花器大小为五个数值之和；

花粉活力：花粉置于培养基开始后100min时测量有活力的花粉数目；花粉活力＝已萌发的花粉粒数/总花粉粒数；

单株饱粒种子数：统计植株单株饱满种子总数量；

结实率：统计每个荚内的种子粒数和饱满种子粒数，结实率＝每荚饱粒数/每荚总粒数；

百粒重：称量100粒饱满种子的重量；

种子落粒率：统计植株生理成熟(植株上50％的荚其颜色转变为黑褐色)后10d内的落粒种子数，再根据单株种子数计算种子落粒率。种子落粒率＝落粒种子数/单株种子数；

种子活力持续能力：将收获的种子进行土壤埋藏试验，每隔3个月对埋藏种子进行取样，不少于8次，每次取样后对埋藏种子进行种子萌发试验，计算活力指数，活力指数Vi＝Gi×St[Gi：发芽指数；St：发芽t天后幼苗的鲜重，发芽指数Gi＝∑(Gt/Dt)(Gt：在t日内的发芽数；Dt：发芽日数)]，比较同一取样时间点野生大豆与其杂交或回交后代活力指数的差值，当二者出现最大差值时，此时二者的活力指数作为总适合度的计算指标。

进一步的，杂交后代或回交后代与其亲本的同质园种植比较试验分为单种农田土、单种荒地土、混种农田土、混种荒地土四个种植条件；

单种时：先利用刀片划破野生大豆种子及其杂交或回交后代种子的硬实表皮，处理程度应当划破种皮但不伤及种胚，然后播种于底部打孔的一次性塑料杯，每杯播种1粒；待幼苗真叶完全展开后移栽至直径不小于50cm，高度不低于35cm底部有孔的塑料盆钵，每盆前后左右间隔不少于60cm，分别采用农田土壤和荒地土壤，每种种植条件各移栽不少于20株，进行正常田间管理；

混种时：种子处理及播种方式如上，但是在移栽的同时需要在盆子四周均匀播种杂草种子，包括狗尾草(Setaria viridis(L.)Beauv.)、牛筋草(Eleusineindica(L.)Gaertn.)、马唐(Digitaria sanguinalis(L.)Scop.)、稗草(Echinochloaspp.)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)，分别采用农田土壤和荒地土壤，每种种植条件各移栽不少于20株，进行正常田间管理。

进一步的，测定花器大小时，具体方法为：

萼片长度：旗瓣正对着的萼片，其顶部到基部的长度；

翼瓣长度：翼瓣顶部到花托的长度；

龙骨瓣长度：龙骨瓣顶端到花托的长度；

花瓣外露长度：旗瓣顶端到花托的长度-萼片长度；

沟槽长度：旗瓣正对着的萼片，其顶端到萼裂片V形底端长度；

进一步的，花粉活力的具体测定方法为：于早晨7点采摘含苞待放的花蕾放置冰盒低温保存；滴1-2滴花粉萌发培养基于凹面载玻片上，取5-10朵花，分别用镊子剥去花萼、花瓣，将花粉轻蘸于培养基中；将载玻片放入带有润湿滤纸的培养皿中，于100min后在显微镜下观察花粉萌发情况；以花粉管长度超过花粉直径的作为萌发标准，统计花粉萌发率，计算如式：花粉活力＝已萌发的花粉粒数/总花粉粒数。

进一步的，土壤埋藏试验具体操作方法为：每个种群挑选50粒饱满无蛀虫种子装入透气尼龙网袋中，不少于32袋，将装有种子的尼龙网袋单层平铺在沟槽底部，并使种子在网袋内呈1-2层平铺于地面，保证种子充分接触网袋上下两侧土壤，土壤埋藏深度为10-15cm。自埋藏起每隔3个月对埋藏种子进行取样，每次随机取出4个网袋，每次间隔时间为2-3个月，不少于8次，每次取样后对埋藏种子进行种子萌发试验。

进一步的，花粉萌发培养基包括：19.2g/L蔗糖、0.0689g/L赤霉素、0.015g/L硼酸、0.05g/L氯化钙、7.5g/L聚乙二醇，溶于去离子水中。

进一步的，在进行杂交后代或回交后代与其亲本的同质园种植比较试验时，应当同时进行杂交后代或回交后代与其亲本的竞争试验，将杂交或回交后代与野生大豆播种于农田和荒地，在这两种环境条件下设置3种不同种植密度的竞争试验。

所述农田为玉米田；选取6个不小于4m²样方，样方中玉米株数相同，在其中3个样方中分别播种密度低、中、高的杂交或回交后代种子；剩下3个样方中分别播种密度低、中、高的野生大豆种子；每种播种方式重复4次；

所诉荒地为在野外选取杂草密度较一致的荒地；先选取6个不小于4m²样方，样方中杂草数量相当，在其中3个样方中分别播种密度低、中、高的杂交或回交后代种子；剩下3个样方中分别播种密度低、中、高的野生大豆种子；每种播种方式重复4次。

竞争试验的适合度统计测量指标与田间同质园试验相同。

有益效果

本发明充分研究了野生大豆生长特点，设置了单种农田土、单种荒地土、混种农田土、混种荒地土四个种植条件的同质园种植比较试验；农田和荒地两种环境条件下3种不同种植密度的竞争试验；在此基础上测定了野生大豆与其杂交或回交后代整个生活史周期中最能够反映生存能力和繁殖能力的性状。这就保证了所测定的性状能够充分的反应试验材料的适合度效应。

本发明能提供一种评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，解决了目前没有评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度方法的问题。对科学评估转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度具有重要作用，适合度的评估是安全释放转基因大豆的重要环节，因此可以根据转基因带来的适合度效应提前对转基因大豆的释放做好防范工作。

附图说明

图1为BY-21野生大豆及其F2代出苗率比较

注：*表示BY-21野生大豆与其F2代在同种种植条件下所做的独立样本T检验，在二者具有显著性时，在高者标*，下图同；

图2为BY-21野生大豆及其F2代子叶、真叶大小比较；

图3为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下株高比较；

图4为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下单株干生物量比较

注：字母abc表示同一实验材料在不同种植条件下所做的单因素ANOVA分析，当存在显著性差异时，从高到低依次标上abc，下图同；

图5为BY-21野生大豆及其F2代在无杂草竞争下花器大小比较；

图6为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下单株结荚数比较；

图7为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下单株荚重比较；

图8为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下荚大小比较；

图9为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下荚色荚形比较；

图10为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下单株种子数比较；

图11为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下单株饱粒数比较；

图12为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下单株种子重比较；

图13为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下单株饱粒重比较；

图14为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下每荚种子粒数、每荚饱粒种子数比较；

图15为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下结实率比较；

图16为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下种子大小比较；

图17为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下百粒重比较；

图18为BY-21野生大豆及其F2代在四种种植种条件下总适合度比较。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行进一步的详细说明。

实施例1

抗草甘膦转基因大豆与BY-21野生大豆杂交F2代适合度评价

建立转基因大豆与野生大豆杂种及其后代实验材料：

在充分了解转基因大豆与BY-21野生大豆生长特点的基础上，对转基因大豆与BY-21野生大豆分批种植，使二者的花期相遇；通过人工杂交方式获得转基因大豆与BY-21野生大豆的杂交F1代，再通过F1的自交获得F2代试验材料。

开展杂交后代与其亲本的同质园种植比较试验：

试验分为单种农田土、单种荒地土、混种农田土、混种荒地土四个种植条件。

单种时：先利用刀片划破BY-21野生大豆种子及F2代种子的硬实表皮，处理程度应当划破种皮但不伤及种胚，然后播种于直径7cm，高7.5cm，底部打孔的一次性塑料杯，每杯播种1粒。待幼苗真叶完全展开后同时移栽至直径52cm，高35cm底部有孔的塑料盆钵(后代经分子鉴定后选择携带抗性基因的植株进行移栽)，每盆前后左右间隔60cm，分别采用农田土壤和荒地土壤，每种种植条件各移栽20株，进行正常田间管理。

混种时：种子处理和播种方式如上，但是在移栽的同时需要在盆子四周均匀播种杂草种子，其中狗尾草(Setaria viridis(L.)Beauv.)0.5g、牛筋草(Eleusineindica(L.)Gaertn.)0.25g、马唐(Digitaria sanguinalis(L.)Scop.)0.5g、稗草(Echinochloa spp.)0.5g、反枝苋(Amaranthus retroflexus)0.2g，分别采用农田土壤和荒地土壤，每种种植条件各移栽20株，进行正常田间管理。

对BY-21F2进行了分子鉴定，分子鉴定步骤为：以BY-21野生大豆为阴性对照，抗草甘膦转基因大豆为阳性对照，提取F2代植株的总DNA，采用PCR后进行琼脂糖凝胶电泳的方法，检测转基因大豆与野大豆的杂交后代中转基因是否存在。EPSPS基因的扩增引物：CP4epsps-F:5′GGCACAAGGGATACAAACC3′，CP4epsps-R:5′ACCGCCGAACATGAAGGAC 3′。20μL反应体系：10μL MIX(2U/μL)[宝日医生物技术有限公司(Takara中国)]，6μL ddH2O，1μL各引物(10μM)，2μL 20-30ng/μL的植物组DNA。PCR扩增在Whatman BiometraTgradientThermocycler上进行。反应条件如下：95℃预变性5min，35个循环(95℃变性30sec，58℃退火50Sec，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min。扩增获得的313bp产物在2.5％琼脂糖凝胶和120V电压条件下电泳35min。最后在紫外灯下观察，对照Marker，胶条在313bp出现亮斑即判定为含转基因。

统计测定试验材料的各适合度性状：

统计测定了BY-21野生大豆和F2代整个生活史周期中能够反映生存能力和繁殖能力的性状，包括营养期指标：出苗率、子叶真叶大小、株高、地上部干生物量；生殖期指标：花器大小、花粉活力、荚形、荚大小、荚皮色、单株结荚数、单株荚重、单株种子数、单株种子重、单株饱粒种子数、单株饱粒种子重、每荚种子数、每荚种子饱粒数、结实率、百粒重、种子大小。

分析试验材料的各适合度性状和总适合度：

对BY-21野生大豆和F2代实验材料各性状测量而获得的数据进行比较和统计检验，确定在特定的环境条件下，特定的转基因是否会为野生近缘种带来适合度利益和适合度成本。利用SPSS 25软件对四种条件种植下的BY-21野生大豆和BY-21F2各项指标分别进行独立样本T检验，判断在同种种植条件下，BY-21野生大豆与BY-21F2在哪些指标上存在显著性差异；同时利用SPSS 25软件对分别对BY-21野生大豆、BY-21F2在四种种植条件下的各项指标进行单因素ANOVA检验，判断同一试验材料在不同种植条件下哪些指标存在显著性差异。最后利用SPSS 25软件对四种条件种植下的BY-21野生大豆和BY-21F2的总适合度分别进行独立样本T检验，分析二者在同一种植条件下是否存在显著性差异。

适合度调查性状的具体统计测定方法为：

表1适合度调查性状

生育期的具体划分为：

出苗期：播种量的50％已经长出子叶；

分支期：50％的植株分支数达到最大；

现蕾期：50％的植株长出花蕾；

初花期：50％的植株开始开花(旗瓣完全展开)；

盛花期：同一种群在同一天内有50％的植株开花量达到最大；

结荚期：同一种群在同一天内有50％的植株出现鼓粒荚；

成熟期：同一种群在同一天内有50％的植株的荚颜色加深至呈黑褐色。

测定花器大小时，具体方法为：

萼片长度：旗瓣正对着的萼片，其顶部到基部的长度；

翼瓣长度：翼瓣顶部到花托的长度；

龙骨瓣长度：龙骨瓣顶端到花托的长度；

花瓣外露长度：旗瓣顶端到花托的长度-萼片长度；

沟槽长度：旗瓣正对着的萼片，其顶端到萼裂片V形底端长度；

花粉活力的具体测定方法为：于早晨7点采摘含苞待放的花蕾放置冰盒低温保存，带回实验室，作为实验材料备用。花粉萌发培养基配比为：19.2g/L蔗糖、0.0689g/L赤霉素、0.015g/L硼酸、0.05g/L氯化钙、7.5g/L聚乙二醇，溶于去离子水中；滴1-2滴液体培养基于凹面载玻片上，取5-10朵花，分别用镊子剥去花萼、花瓣，将花粉轻蘸于培养基中。将载玻片放入带有润湿滤纸的培养皿中，分别于20min、40min、60min、80min、100min后在显微镜下观察花粉萌发情况。每次观察3个视野，每个种群重复3次。以花粉管长度超过花粉直径的作为萌发标准，统计花粉萌发率，计算如式：花粉活力＝已萌发的花粉粒数/总花粉粒数。

测量荚大小时，在植株成熟期统计，随机选取单株中部的20个成熟的荚，使用游标卡尺测定荚最长、最宽、最厚处的长度。

统计每荚种子数时，在植株成熟期统计，随机选取单株中部的20个成熟的荚，统计每个荚中的种子数量。

统计每荚饱粒种子数时，在植株成熟期统计，随机选取单株中部的20个成熟的荚，统计每个荚中的饱粒种子数量。

测量种子大小时，在收获的单株种子中，随机选取20粒种子，使用游标卡尺测定种子的最长、最宽、最厚处的长度。

结果分析

1.营养期指标

1.1出苗率

BY-21野生大豆出苗率为80.7％，其F2代出苗率为94％，F2代出苗率显著高于母本野生大豆13.3％。从出苗情况来看，BY-21F2的出苗率明显高于其母本野生大豆的出苗率，这说明F2的生存能力强于其母本野生大豆。

1.2子叶、真叶大小

子叶大小：BY-21野生大豆的子叶长介于6.24-12.09mm，宽介于5.46-11.12mm，长和宽的平均值分别为10.38mm和6.27mm。F2的子叶长介于10.35-13.59mm，宽介于5.03-7.12mm，长和宽的平均值分别为11.63mm和12.64mm。其中F2代的子叶长显著高于野生大豆，而子叶宽无显著性差异。

真叶大小：BY-21野生大豆种群的真叶长介于11.19-18.31mm，宽介于8.91-14.18mm，长和宽的平均值分别为14.61mm和12.17mm。F2的真叶长介于14.4-23.95mm，宽介于9.49-15.79mm，长和宽的平均值分别为19.05mm和12.86mm。其中F2代的真叶长显著高于野生大豆，而真叶宽无显著性差异。

1.3株高

在四种种植条件下，BY-21F2的株高均显著高于野生大豆。在单种荒地土种植条件下，BY-21F2的株高显著高于野生大豆3.1cm；在单种农田土种植条件下，BY-21F2的株高显著高于野生大豆4.04cm；在混种荒地土种植条件下，BY-21F2的株高显著高于野生大豆2.68cm；在混种农田土种植条件下，BY-21F2的株高显著高于野生大豆3.72cm。

1.4地上部干生物量

在四种种植条件下，BY-21F2的单株干生物量显著高于野生大豆2.65-3.84倍。BY-21与BY-21F2在无杂草竞争时，两种土壤下的单株干生物量均显著高于有杂草竞争时的单株干生物量，说明在单种时，无论是BY-21还是BY-21F2的单株干生物量均显著高于混种。

2.生殖期指标

2.1生育期

表1 BY-21野生大豆及其F2代生育期表

注：BY-21及其杂交F2代于5月6日播种，表中“+”表示BY-21F2较BY-21到达同一生育期延迟的天数

同一实验材料在荒地土和农田土下的生育期无明显差异。BY-21F2进入生殖生长的时间明显晚于母本野生大豆，F2花期较母本野生大豆晚将近2个月，成熟期较其母本野生大豆则推迟2个月以上。

2.2花器大小

BY-21F2的萼片长度、翼瓣长度、龙骨瓣长度、花瓣外露长度、沟槽长度在两种土壤条件下均显著高于BY-21野生大豆。BY-21F2的花器显著大于BY-21野生大豆。

2.3花粉活力

表2 BY-21野生大豆及其F2代花粉活力

BY-21及其杂交F2代在4种种植条件下的花粉活力均随着时间的增加而增加，从花粉置于培养基时开始计时，可以发现达到100min时，花粉活力趋于稳定，所以将花粉置于培养基后100min时的花粉活力作为总适合度计算指标。无杂草竞争时，农田土条件下BY-21野生大豆在100min时的花粉活力显著高于其F2，荒地土下二者无显著性差异；有杂草竞争时，两种土壤条件下F2代在100min时的花粉活力均显著高于BY-21野生大豆。

2.4单株结荚数

在四种种植条件下，BY-21F2的单株结荚数均显著高于野生大豆。在单种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株结荚数显著多于野生大豆4.96倍；在单种农田土种植条件下，BY-21F2的单株结荚数显著多于野生大豆5.29倍；在混种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株结荚数显著多于野生大豆4.92倍；在混种农田土种植条件下，BY-21F2的单株结荚数显著多于野生大豆4.17倍，BY-21F2的结荚能力强于BY-21野生大豆。对于相同种群，无杂草竞争时的单株结荚数均显著多于有杂草竞争时。BY-21F2较BY-21可以结出更多的荚。

2.5单株荚重

在四种种植条件下，BY-21F2的单株荚重均显著高于野生大豆。在单种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株荚重显著高于野生大豆3.86倍；在单种农田土种植条件下，BY-21F2的单株荚重显著高于野生大豆4.47倍；在混种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株荚重显著高于野生大豆4.16倍；在混种农田土种植条件下，BY-21F2的单株荚重显著高于野生大豆3.35倍。对于相同种群，无杂草竞争时的单株荚重均显著高于有杂草竞争时。

2.6荚大小

荚长：在四种种植条件下，BY-21F2的荚长均显著长于BY-21野生大豆。对于BY-21野生大豆来说，在四种种植条件下的荚长无显著性差别；而BY-21F2的荚长在有杂草竞争时要显著长于无杂草竞争。

荚宽：BY-21野生大豆在单种农田土条件下的荚宽要显著长于BY-21F2，在其余种植条件二者无显著性差异。对于BY-21野生大豆来说，在单种荒地土种植条件下的荚宽要显著低于其余种植条件；BY-21F2荚宽在混种荒地土种植条件下最大，单种荒地土种植条件下最小。

荚厚：BY-21F2在混种荒地土条件下的荚厚要显著高于BY-21野生大豆，其余种植条件二者无显著性差异。BY-21野生大豆在单种农田土种植条件下荚厚显著高于其余种植条件；而BY-21F2在四种种植条件下荚厚无显著性差异。

2.7荚色、荚形

荚色：根据荚的颜色，分为深褐色、黑褐色、披棕色、黄色，分别赋值为1、2、3、4以便于统计分析，数值越大，颜色越浅。BY-21F2的荚色在四种种植条件下均显著比BY-21野生大豆浅；同一实验材料在四种种植条件下无显著性差异。

荚形：根据荚的形状，分为直线形、弯镰形、弓形，分别赋值为1、2、3以便于统计分析，数值越大，荚越弯。除混种农田土种植条件，其余三种条件BY-21F2的荚显著弯于BY-21野生大豆。BY-21F2在四种种植条件下的荚形无显著性差异，而BY-21野生大豆在混种荒地土种植条件下的荚形要显著直于其他三种种植条件。

2.8单株种子数

BY-21F2在四种种植条件下的单株种子数均显著高于BY-21野生大豆，说明F2代能够得到更多的后代，繁殖力强于野生大豆。在单种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株种子数显著高于野生大豆4.92倍；在单种农田土种植条件下，BY-21F2的单株种子数显著高于野生大豆5.54倍；在混种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株种子数显著高于野生大豆4.83倍；在混种农田土种植条件下，BY-21F2的单株种子数显著高于野生大豆4.05倍。同一实验材料在在两种土壤条件下，单种时的单株种子数显著高于混种。BY-21野生大豆无论有无杂草竞争，两种土壤种植下的单株种子数无显著性差异，而BY-21F2在无杂草竞争时，农田土种植下的单株种子数显著高于荒地土，而在有杂草竞争时，农田土种植下的单株种子数显著低于荒地土。

2.9单株饱粒数

BY-21F2在四种种植条件下的单株饱粒数均显著高于BY-21野生大豆。在单种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株饱粒数显著高于野生大豆4.86倍；在单种农田土种植条件下，BY-21F2的单株饱粒数显著高于野生大豆5.73倍；在混种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株饱粒数显著高于野生大豆5.04倍；在混种农田土种植条件下，BY-21F2的单株饱粒数显著高于野生大豆4.55倍。同一实验材料在两种土壤条件下，单种时的单株饱粒数显著高于混种。BY-21野生大豆无论有无杂草竞争，两种土壤种植下的单株饱粒数无显著性差异，而BY-21F2在无杂草竞争时，农田土种植下单株饱粒数显著高于荒地土，在有杂草竞争时，两种土壤无显著性差异。

2.10单株种子重

BY-21F2在四种种植条件下的单株种子重均显著高于BY-21野生大豆。在单种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株种子重显著高于野生大豆3.64倍；在单种农田土种植条件下，BY-21F2的单株种子重显著高于野生大豆4.28倍；在混种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株种子重显著高于野生大豆3.54倍；在混种农田土种植条件下，BY-21F2的单株种子重显著高于野生大豆2.87倍。同一实验材料在两种土壤条件下，单种时的单株种子重显著高于混种。BY-21野生大豆无论有无杂草竞争，两种土壤种植下的单株种子重无显著性差异，而BY-21F2在无杂草竞争时，农田土种植下的单株种子重显著高于荒地土，而在有杂草竞争时，农田土种植下的单株种子重显著低于荒地土。

2.11单株饱粒重

BY-21F2在四种种植条件下的单株饱粒重均显著高于BY-21野生大豆。在单种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株饱粒重显著高于野生大豆3.88倍；在单种农田土种植条件下，BY-21F2的单株饱粒重显著高于野生大豆4.68倍；在混种荒地土种植条件下，BY-21F2的单株饱粒重显著高于野生大豆3.49倍；在混种农田土种植条件下，BY-21F2的单株饱粒重显著高于野生大豆2.81倍。同一实验材料在两种土壤条件下，单种时的单株饱粒重显著高于混种。BY-21野生大豆无论有无杂草竞争，两种土壤种植下的单株饱粒重无显著性差异，而BY-21F2在无杂草竞争时，农田土种植下的单株饱粒重显著高于荒地土，而在有杂草竞争时，农田土种植下的单株饱粒重显著低于荒地土。

2.12每荚种子粒数、每荚饱粒种子数

每荚种子粒数：BY-21野生大豆在四种种植条件下的每荚种子粒数与BY-21F2均无显著性差异。BY-21野生大豆每荚种子粒数介于2.82-3，BY-21F2每荚种子粒数介于2.83-2.95。BY-21野生大豆每荚种子粒数在混种荒地土条件下显著高于其余三种种植条件；而BY-21F2的每荚种子粒数在四种种植条件下无显著性差异。

每荚饱粒种子数：BY-21野生大豆在四种种植条件下的每荚饱粒种子数与BY-21F2均无显著性差异。BY-21野生大豆每荚饱粒种子数介于2.47-2.75，BY-21F2每荚饱粒种子数介于2.54-2.77。BY-21在有杂草竞争时，荒地土种植下的每荚饱粒种子数显著高于农田土；而BY-21F2的每荚饱粒种子数在四种种植条件下无显著性差异。

2.13结实率

BY-21野生大豆在四种种植条件下的结实率与BY-21F2均无显著性差异。BY-21野生大豆结实率介于86.8％-95.5％，BY-21F2结实率介于90.1-97.5。BY-21野生大豆在混种农田土种植下的结实率为86.8％，显著低于其余三种种植条件。BY-21F2无论有无杂草竞争条件下，两种土壤的结实率均无显著性差异，但是在农田土种植条件下，单种时的结实率显著高于混种。

2.14种子大小

种长：BY-21在单种农田土种植条件下的种长显著高于BY-21F2，其余三种种植条件下二者无显著性差异。BY-21在两种土壤条件下，单种时的种长显著高于混种；而BY-21F2只在农田土种植下，单种时的种长显著高于混种。

种宽：BY-21在无杂草竞争条件下的种宽显著高于BY-21F2，在有杂草竞争条件下二者无显著性差异。BY-21在两种土壤条件下，单种时的种宽显著高于混种；而BY-21F2只在农田土种植下，单种时的种宽显著高于混种。

种厚：BY-21在单种农田土种植条件下的种厚显著高于BY-21F2，其余三种种植条件下二者无显著性差异。BY-21在四种种植条件下的种厚均无显著性差异；而BY-21F2只在农田土种植下，单种时的种宽显著高于混种。由此可见，BY-21的种子大小要大于其F2。

2.15百粒重

BY-21野生大豆的百粒重在四种种植条件下均显著高于BY-21F2。在单种荒地土种植条件下，BY-21F2的百粒重显著高于野生大豆0.80g；在单种农田土种植条件下，BY-21F2的百粒重显著高于野生大豆0.67g；在混种荒地土种植条件下，BY-21F2的百粒重显著高于野生大豆0.88g；在混种农田土种植条件下，BY-21F2的百粒重显著高于野生大豆0.57g。BY-21在混种农田土种植条件下的百粒重显著低于其余三种种植条件；BY-21F2在农田土壤下，单种时的百粒重显著高于混种。

3.总适合度

根据上述结果，选择出苗率、子叶真叶大小、株高、地上部干生物量、花器大小、花粉活力、单株结荚数、单株饱粒种子数、结实率、百粒重10个指标用以计算总适合度，对转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度进行评估，各适合度性状的相对适合度值计算方法：以野生大豆为比较的标准“1”，相应杂交或回交后代的各适合度性状与野生大豆的该适合度性状之比为相对适合度值，总适合度值是其各适合度性状的相对适合度值的平均数，本试验中总适合度＝∑(各指标相对适合度值)/10。这10个指标能直接反映适合度高低的指标，其相对适合度值越大则说明适合度越高。

单种荒地土条件下BY-21F2的总适合度为2.15，显著高于BY-21野生大豆；单种农田土条件下BY-21F2的总适合度为2.26，显著高于BY-21野生大豆；混种荒地土条件下BY-21F2的总适合度为2.07，显著高于BY-21野生大豆；混种农田土条件下BY-21F2的总适合度为1.99，显著高于BY-21野生大豆。所以在四种种植条件下，BY-21F2的总适合度均显著高于BY-21野生大豆。

Claims (10)

1.一种评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，其特征在于，所述方法包括：

对转基因大豆与野生大豆分批种植，使二者的花期相遇；通过人工杂交方式获得转基因大豆与野生大豆的杂交后代或回交后代，再通过杂交后代或回交后代的自交获得更多世代的试验材料；

开展杂交后代或回交后代与其亲本的同质园种植比较试验；

测定并计算试验材料的各适合度性状，得到试验材料适合度性状的相对适合度，以及各供试材料的总适合度；

适合度性状的相对适合度计算方法：以野生大豆为比较的标准“1”，相应杂交或回交后代的各适合度性状与野生大豆的该适合度性状之比为相对适合度值，总适合度值是其各适合度性状的相对适合度值的平均数。

2.根据权利要求1所述的评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，其特征在于，所述适合度性状包括出苗率、子叶真叶大小、株高、地上部干生物量、花器大小、花粉活力、单株结荚数、单株饱粒种子数、结实率、百粒重、种子落粒率、种子活力持续能力。

3.根据权利要求2所述的评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，其特征在于，杂交或回交后代在移栽到盆钵前需要进行分子鉴定，移栽携带抗性基因的植株；分子鉴定步骤为：以野生大豆为阴性对照，转基因大豆为阳性对照，提取杂交后代植株的总DNA，采用PCR后进行琼脂糖凝胶电泳的方法，检测转基因大豆与野大豆的杂交或回交后代中转基因是否存在。

4.根据权利要求2所述的评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，其特征在于，适合度性状的调查方法为：

出苗率：将幼苗真叶展开视为出苗，统计播种材料苗期出苗数，出苗率＝出苗数/播种种子数×100％；

子叶真叶大小：第一片复叶未展开时期，利用游标卡尺测量子叶的长度宽度、真叶的长度宽度，子叶真叶大小值为子叶长×宽+真叶长×宽；

株高：第三个三出复叶期利用直尺测量植株顶端到根茎处的高度；

地上部干生物量：成熟后收获植株地上部晒干并称重；

花器大小：在植株盛花期，随机选取单株上不少于50朵完全盛开的花朵，测量萼片长度、翼瓣长度、龙骨瓣长度、花瓣外露长度、沟槽长度，花器大小为五个数值之和；

花粉活力：花粉置于培养基开始后100min时测量有活力的花粉数目；花粉活力＝已萌发的花粉粒数/总花粉粒数；

单株饱粒种子数：统计植株单株饱满种子总数量；

结实率：统计每个荚内的种子粒数和饱满种子粒数，结实率＝每荚饱粒数/每荚总粒数；

百粒重：称量100粒饱满种子的重量；

种子落粒率：统计植株生理成熟(植株上50％的荚其颜色转变为黑褐色)后10d内的落粒种子数，再根据单株种子数计算种子落粒率。种子落粒率＝落粒种子数/单株种子数；

种子活力持续能力：将收获的种子进行土壤埋藏试验，每隔3个月对埋藏种子进行取样，不少于8次，每次取样后对埋藏种子进行种子萌发试验，计算活力指数，活力指数Vi＝Gi×St；Gi：发芽指数；St：发芽t天后幼苗的鲜重，发芽指数Gi＝∑(Gt/Dt)；Gt：在t日内的发芽数；Dt：发芽日数；比较同一取样时间点野生大豆与其杂交或回交后代活力指数的差值，当二者出现最大差值时，此时二者的活力指数作为总适合度的计算指标。

5.根据权利要求1所述的评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，其特征在于，杂交后代或回交后代与其亲本的同质园种植比较试验分为单种农田土、单种荒地土、混种农田土、混种荒地土四个种植条件；

单种时：先利用刀片划破野生大豆种子及其杂交或回交后代种子的硬实表皮，处理程度应当划破种皮但不伤及种胚，然后播种于底部打孔的一次性塑料杯，每杯播种1粒；待幼苗真叶完全展开后移栽至直径不小于50cm，高度不低于35cm底部有孔的塑料盆钵，每盆前后左右间隔不少于60cm，分别采用农田土壤和荒地土壤，每种种植条件各移栽不少于20株，进行正常田间管理；

混种时：种子处理及播种方式如上，但是在移栽的同时需要在盆钵四周均匀播种杂草种子，包括狗尾草(Setaria viridis(L.)Beauv.)、牛筋草(Eleusine indica(L.)Gaertn.)、马唐(Digitaria sanguinalis(L.)Scop.)、稗草(Echinochloa spp.)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)，分别采用农田土壤和荒地土壤，每种种植条件各移栽不少于20株，进行正常田间管理。

6.根据权利要求4所述的评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，其特征在于，测定花器大小时，具体方法为：

萼片长度：旗瓣正对着的萼片，其顶部到基部的长度；

翼瓣长度：翼瓣顶部到花托的长度；

龙骨瓣长度：龙骨瓣顶端到花托的长度；

花瓣外露长度：旗瓣顶端到花托的长度-萼片长度；

沟槽长度：旗瓣正对着的萼片，其顶端到萼裂片V形底端长度。

7.根据权利要求4所述的评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，其特征在于，花粉活力的具体测定方法为：于早晨7点采摘含苞待放的花蕾放置冰盒低温保存；滴1-2滴花粉萌发培养基于凹面载玻片上，取5-10朵花，分别用镊子剥去花萼、花瓣，将花粉轻蘸于培养基中；将载玻片放入带有润湿滤纸的培养皿中，于100min后在显微镜下观察花粉萌发情况；以花粉管长度超过花粉直径的作为萌发标准，统计花粉萌发率，计算如式：萌发活力＝已萌发的花粉粒数/总花粉粒数。

8.根据权利要求4所述的评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，其特征在于，种子活力持续能力测定时进行的土壤埋藏试验具体操作方法为：每个种群挑选不少于50粒饱满无蛀虫种子装入透气尼龙网袋中，不少于32袋，将装有种子的尼龙网袋单层平铺在沟槽底部，并使种子在网袋内呈1-2层平铺于地面，保证种子充分接触网袋上下两侧土壤，土壤埋藏深度为10-15cm；自埋藏起每隔3个月对埋藏种子进行取样，每次随机取出4个网袋，每次间隔时间为2-3个月，不少于8次，每次取样后对埋藏种子进行种子萌发试验。

9.根据权利要求7所述的评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，其特征在于，花粉萌发培养基包括：19.2g/L蔗糖、0.0689g/L赤霉素、0.015g/L硼酸、0.05g/L氯化钙、7.5g/L聚乙二醇，溶于去离子水中。

10.根据权利要求5所述的评价转基因大豆与野生大豆杂交或回交后代适合度的方法，其特征在于，在进行杂交后代或回交后代与其亲本的同质园种植比较试验时，应当同时进行杂交后代或回交后代与其亲本的竞争试验，将杂交或回交后代与野生大豆播种于农田和荒地，在这两种环境条件下设置3种不同种植密度的竞争试验。

所述农田为玉米田；选取6个不小于4m²样方，样方中玉米株数相同，在其中3个样方中分别播种密度低、中、高的杂交或回交后代种子；剩下3个样方中分别播种密度低、中、高的野生大豆种子；每种播种方式重复4次；

所述荒地为在野外选取杂草密度较一致的荒地；先选取6个不小于4m²样方，样方中杂草数量相当，在其中3个样方中分别播种密度低、中、高的杂交或回交后代种子；剩下3个样方中分别播种密度低、中、高的野生大豆种子；每种播种方式重复4次。

竞争试验的适合度统计测量指标与田间同质园试验相同。

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