CN110724754A - 构建杏种质分子身份证的一种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了构建杏种质分子身份证的一种方法，属于果树种质资源领域，分子身份证由BPPCT 002、BPPCT 038、BPPCT 039、BPPCT 040、UDP98‑409和UDAp‑471六个标记的编码构成，UDAp‑471标记的扩增产物谱带复杂，以最小和最大特征谱带的两条特征条带编码代表该标记；某些标记在一些种质上的扩增产物除正常编码的谱带外，出现第三个附加谱带，以附加谱带的特征条带编码作为这些种质分子身份证的第13位编码；当种质不能用上述方法区分时，比较种质的UDAp‑471标记扩增产物谱带，发现种质有特异条带时，将一个特异条带编码作为该种质分子身份证的第13位编码以区别种质。该方法利用分子身份证识别果树种质，利用实验结果信息充分，区别种质多。
Description
技术领域
本发明属于果树种质资源领域，具体地说就是果树种质的一种分子识别方法。
背景技术
杏(Prunus armeniaca L.)原产中国，栽培历史悠久，种质资源丰富、品种众多，有9个种13个变种，2000多份种质资源(张加延等，1999)；近年来，随着新品种数量的增长、植物品种权保护的需要以及果树种质交流的增多，准确地鉴别杏种质和品种日益重要。
果树种质和品种鉴定的一种主要方法是SSR标记分析。SSR标记具有许多优点(Morgante等，1993)，近年来被广泛应用于果树种质和品种的指纹图谱/分子身份证构建。目前，已建立甜樱桃品种SSR指纹图谱数据库(艾呈祥等，2007)和92个梨品种的SSR标记指纹图谱(高源等，2012)；已构建分子身份证的有18份扁桃种质(Dangl等，2009)、95份苹果种质(Moriya等，2011)、40个苹果主要栽培品种(王立新等，2012)、120份苹果种质资源(高源等，2015)、80份葡萄种质资源(杜晶晶等，2013)、20个犁栽培品种(张靖国等，2014)、15份杏种质(苑克俊等，2018)以及中国桃(陈昌文等，2011)。
与过去常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法相比，基于DNA测序的荧光引物SSR标记毛细管电泳检测方法可更准确检测目标DNA片段的大小，更适合用于构建指纹图谱和分子身份证(徐雷锋等，2014)。目前，SSR荧光标记毛细电泳检测技术已成功应用于无花果、苹果、枣、梨和杏等果树的研究(Achtak等，2009；Moriya等，2011；王立新等，2012；麻丽颍等，2012；高原等，2012；苑克俊等，2018)。
利用SSR标记研究杏的遗传多样性报道较多。何天明等(2006)分析了新疆栽培杏的群体遗传结构，张淑青等(2010)分析了69个普通杏品种的遗传多样性，王玉安等(2013)分析了甘肃地方杏品种资源的遗传多样性。Dirlewanger等(2002)在桃和樱桃中开发的一些SSR标记，Dondini等(2007)通过实验证明可用于分析杏，并将这些SSR标记定位到杏的各个连锁群中。这些工作为选择利用SSR引物构建杏种质的分子身份证奠定了良好基础。
通过杏的杂交育种工作(苑克俊等，2013，2014)，我们培育出‘玉华’、‘夏华’和‘立园’3个新品种，‘玉华’和‘夏华’已获得植物新品种权，‘立园’已获得林木良种证。本研究利用前期研究确定的SSR标记和新选取的分布在不同连锁群上的2个SSR标记引物，以包括3个新品种的22份杏种质为试材，通过SSR荧光标记PCR扩增产物毛细管电泳检测实验确定构成分子身份证的6个标记，然后利用6个标记和前期研究中提出的图谱带型双代码编码方式构建包括杏新品种的37份种质分子身份证，以期为利用分子鉴定进行杏新品种的品种权保护提供依据。
本发明创立SSR标记扩增产物谱带复杂时用最小和最大的两个特征条带编码代表该标记的方法，首次提出某些SSR标记的附加特征条带可以利用，并创立附加特征条带的编码方法；通过实验找出特征条带数相对少的BPPCT 002标记作为分子身份证第一个标记，有助于比较和区别种质。
参考文献
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发明内容
本发明提供一种构建杏种质分子身份证的方法，具体就是分子身份证由BPPCT002、BPPCT 038、BPPCT 039、BPPCT 040、UDP98-409和UDAp-471六个标记的编码构成，其中UDAp-471标记的扩增产物谱带复杂，以最小和最大特征谱带的两条特征条带编码代表该标记；BPPCT 038、BPPCT 039、BPPCT 040和UDP98-409四个标记在一些种质上的扩增产物除正常编码的谱带外，出现第三个附加谱带，以附加谱带的特征条带编码作为这些种质分子身份证的第13位编码；当种质不能用上述方法区分时，比较种质的UDAp-471标记扩增产物谱带，发现一份种质有特异条带时，将一个特异条带编码作为该种质分子身份证的第13位编码以区别种质。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：(1)以包括3个新品种的22份杏种质为试材，新试验2个荧光SSR标记UDP98-409和UDAp-471，它们与前期研究选出的4个荧光SSR标记BPPCT 002、BPPCT 038、BPPCT 039和BPPCT 040一起分布在6个不同连锁群。试验方法是进行PCR实验，通过采用毛细管电泳技术检测22份种质的PCR扩增产物，获得种质的分子图谱和谱带数据。试验结果表明，利用2个新标记共检测到33个编码用特征条带和32个带型，平均每个标记获得16个带型；利用前期选出的4个标记共检测到48个编码用特征条带和59个带型，平均每个标记获得14.75个带型。这些结果证明，上述6个标记多态性好，适合用于构建种质分子身份证。然后，利用上述6个标记构建37份种质的分子身份证，方法是获得37份种质的分子图谱和谱带数据后，找出特征条带用个位数字和字母作为代码，对某一标记的不同图谱带型用两位代码进行编码、按照BPPCT 002、BPPCT 038、BPPCT 039、BPPCT040、UDP98-409和UDAp-471顺序串联各个标记的编码构成37份种质的12位分子身份证，利用Excel软件对分子身份证进行排序和比较。结果表明，‘立园’、‘玉华’和‘夏华’3个新品种的12位数分子身份证分别是23588857df6e、4625bcla4b6h和16eg26aa4aah，既互不相同，也与其它种质的分子身份证不同。这些结果为利用分子鉴定进行杏新品种的品种权保护提供了依据。(2)创立SSR标记扩增产物谱带复杂时用最小和最大的两个特征条带编码代表该标记的方法。实施例，UDAp-471标记的扩增产物谱带复杂，以最小和最大特征谱带的两条特征条带编码代表该标记。(3)首次提出可以利用某些SSR标记的附加特征条带，并创立附加特征条带的编码方法，编码方法是：在12位分子身份证后增加第13位编码，BPPCT 002、BPPCT038、BPPCT 039、BPPCT 040和UDP98-409这5个标记扩增产物谱带有附加特征条带时其第13位代码分别是1、2、3、4和5，无附加特征条带时第13位代码是0或略去。实施例，BPPCT 038、BPPCT 039、BPPCT 040和UDP98-409四个标记在一些种质上的扩增产物除正常编码的谱带外，出现第三个附加谱带，以附加谱带的特征条带编码作为这些种质分子身份证的第13位编码。当种质不能用上述方法区分时，比较种质的UDAp-471标记扩增产物谱带，发现一份种质有特异条带时，将一个特异条带编码作为该种质分子身份证的第13位编码以区别种质，数字6、7、8、9和除了O、L以外的字母可以用作UDAp-471标记的编码构成分子身份证第13位编码。
本发明有益效果是：(1)通过实验找出特征条带数相对少的BPPCT 002标记作为分子身份证第一个标记，有助于比较和区别种质；(2)UDAp-471标记的扩增产物谱带复杂，实际上是至少两个基因的两对等位基因扩增产物，图谱中间的扩增产物谱带很难区分是哪个基因的，但图谱两端的扩增产物谱带肯定是来自两个基因的两个等位基因，以最小和最大特征谱带的两条特征条带编码代表该标记，是利用了来自两个基因的等位基因信息；(3)发现并利用某些SSR标记的附加特征条带构成分子身份证第13位编码，增加了实验结果信息的利用；(4)从UDAp-471标记扩增产物图谱中间的产物谱带发现特异条带编码利用，构成分子身份证第13位编码，增加了实验结果信息的利用；(5)本发明方法利用实验结果信息充分，编码空间大，在相同实验成本时区分种质多。
附图说明
图1是本发明方法出现第三个附加谱带的图谱。附图标记126.88实测条带大小，126仪器识别条带大小，156.35实测条带大小，156仪器识别条带大小，本发明实验数据统一采用四舍五入法校正数据。
图2是2018年UDAp-471标记引物在一个杏品种‘大白杏’上扩增出的产物谱带。附图标记119.17实测条带大小，120仪器识别条带大小，125.76实测条带大小，126仪器识别条带大小，本发明实验数据统一采用四舍五入法校正数据。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1利用6个荧光SSR标记构建37份杏种质的分子身份证
步骤1，试材：取37份杏树种质(包括3个新品种)的枝芽或叶为试材，采自泰安万吉山基地；其中‘金太阳1’和‘凯特2’采自万吉山基地2号地，‘凯特1’采自万吉山基地4号地东南角，‘金太阳2’、‘金太阳3’、‘金太阳X’和‘金太阳BS’最初作为‘金太阳’种质，分别自泰安市枣行村、泰安市麻塔村、泰安市麻塔村和莒县北部沙沟村收集；‘大白杏’自烟台福山区收集。
步骤2，DNA提取及PCR扩增实验：用CTAB法提取各样品材料的总DNA。具体方法：取50mg材料，液氮研磨，将粉术装到2ml离心管中。加入800μl 2×CTAB提取缓冲液，加入60μl巯基乙醇，混匀，60℃水浴30min，其间混匀二至三次。待样品冷却到室温，加入800μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，振荡混匀，12000rpm离心15min。取上清到一个新2ml离心管，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，振荡混匀，12000rpm离心15min。取上清到一个新2ml离心管，加入1.5倍体积1×CTAB沉淀液，放置20～30min，12000rpm离心15min。将沉淀晾干，加200μl TE-buffer溶解。加入400μl 95％乙醇，20μl 3M NaAC，-20℃沉淀1小时。4℃离心，12000rpm离心15min。500μl 75％乙醇洗涤，12000rpm离心10min。加入30～50μl TE-buffer，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
试验6对分布在不同连锁群上的引物，其中新试验标记UDP98-409、UDAp-471引物从文献中选用，利用GDR基因组数据库中近缘物种扁桃、桃和樱桃的基因组数据找出其引物序列和分布的连锁群(表1)；其它4对引物是从国外文献中选出、经过试验筛选的。每个标记引物的正向引物上分别加注荧光染料6-FAM荧光基团，各个引物12，000g离心1min，用灭菌双蒸水溶解引物至终浓度10μM，棕色1.5mlEP管避光保存。
SSR-PCR反应体系包括2×Taq PCR mix 12.5μl，10μM正向和反向引物各0.5μl，DNA模版1μl，水10.5μl。PCR循环条件是：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。PCR反应在Gene Amp PCR System 9600(Perkin Elmer，USA)上进行。
表1 6个SSR标记的引物
步骤3，毛细管电泳检测PCR扩增产物：利用ABI公司的3730XL测序仪进行检测SSR荧光标记PCR扩增产物，获得供试种质的分子图谱和特征条带数据。
步骤4，杏树SSR分子身份证构建方法：用个位阿拉伯数字1，2，3，……，9作为不同特征条带的代码，特征条带数大于9时，分别用小写字母a，b，c代表第10，11，12个特征条带，依次类推，但为避免与数字混淆，排除用字母o和l表示特征条带，位点无扩增产物时用数字0表示。然后，以两位代码对某个标记的图谱带型进行编码，杂合带型以两位不同代码编码，纯合带型以两位相同代码编码。再按照一定的顺序，将某一供试种质各个标记的编码串联，得到每个样品的分子身份证。为保持与前期研究的连续性和可比性，继续沿用前期研究确定的4个SSR标记BPPCT 038、BPPCT 039、BPPCT 002和BPPCT 040及其编码和特征条带代码(苑克俊等，2018)。
步骤5，22份种质PCR实验和毛细管电泳检测结果
从表2和表3可看出，6个SSR标记的位点杂合度皆较高；利用前期选出的4个标记共检测到48个编码用特征条带，每个SSR标记检测到特征条带数7～17个，平均12个，位点杂合度0.7727～0.9091，扩增的片段长度100～212bp，共检测到59个带型，每个标记检测到带型数11～18个，平均14.75个带型；利用2个新标记共检测到33个编码用特征条带，每个SSR标记检测到特征条带数15～18个，平均16.5个，位点杂合度0.8636～0.9545，扩增的片段长度96～160bp，共检测到32个带型，每个标记检测到带型数14～18个，平均16个带型。这表明，利用每个新试验标记检测到的平均特征条带数和平均带型数皆高于利用前期选出的每个标记检测到的平均特征条带数和平均带型数。
表2利用6个SSR荧光标记引物获得的22份杏树种质特征条带数据和扩增产物带型
表3 6个SSR标记引物对22份杏树种质扩增产物的分析
*UDAp-471标记的两条编码用特征条带不是等位基因，根据纯合等位基因的种质数确定位点杂合度
如表3所示，编码用特征条带数由多到少的标记依次是UDAp-471、BPPCT 038、UDP98-409、BPPCT 039、BPPCT 040和BPPCT 002，特征条带数依次为18、17、15、14、10和7；扩增产物带型数由多到少的标记依次是UDP98-409、BPPCT 038、BPPCT 039、BPPCT 040、UDAp-471和BPPCT 002，带型数依次为18、18、16、14、14和11。这说明，利用UDP98-409、BPPCT 038其中一个标记就可以从22份种质中鉴定出18个带型和有关种质。从表3可看出，利用BPPCT038、BPPCT 039和BPPCT 040这三个标记或者UDP98-409、BPPCT 038和BPPCT 040这三个标记就可以完全区别22份种质。
步骤6，37份种质分子身份证构建
考虑到本研究区别鉴定37个份种质、未来扩充区别更多种质以及鉴定同名异物等工作的需要，本研究采用6个标记构建种质的分子身份证。考虑到与前期研究(苑克俊等，2018)的连续性和可比性，前期确定的4个标记编码继续沿用，但是按照BPPCT 002、BPPCT038、BPPCT 039和BPPCT 040的顺序串联各个标记编码，利用这4个标记和2个新标记分析37份种质的特征条带代码见表4。
表4 6个SSR荧光标记等位基因的代码
将每份种质用BPPCT 002、BPPCT 038、BPPCT 039、BPPCT 040、UDP98-409和UDAp-471这6个标记得到的带型编码按顺序串联，得到37份种质的12位编码分子身份证，利用Excel软件对分子身份证进行排序和比较结果见表5。从表5可看出，表4中特征条带数少的BPPCT 002标记保留，并调整为分子身份证第一个标记，有助于比较和区别种质，如5份‘金太阳’类种质被归到一起比较。
从表5可看出，37份种质的分子身份证各不相同，‘立园’、‘玉华’和‘夏华’3个新品种的分子身份证分别是23588857df6e、4625bcla4b6h和16eg26aa4aah，既互不相同，也与其它种质的分子身份证不同。还可看出，来源于万吉山基地的‘金太阳’、泰安市麻塔村的‘金太阳3’及‘金太阳X’、泰安市枣行村的‘金太阳2’和莒县北部沙沟村的‘金太阳BS’这5种种质的分子身份证是不同的。
表5 37份杏种质的分子身份证
*13位编码的种质分子身份证
SSR标记扩增产物复杂谱带的特征条带和编码：一般SSR标记扩增出的产物谱带主要有两个，有些SSR标记扩增出三个产物谱带(图1)，这些标记在编码时比较易于确定标记的特征条带。如图2所示，本研究试验的UDAp-471标记在‘大白杏’种质上扩增出多达6个产物谱带，每个产物谱带的识别特征是产物条带自左向右变高，变低后识别为另一个产物谱带，以每个产物谱带中最高的条带作为谱带的特征条带；显然，有6个特征条带109bp、117bp、119bp、126bp、128bp和138bp(图2)。对于这种SSR标记扩增产物的复杂谱带，以最小和最大特征谱带的两个特征条带109bp和138bp代表该标记。分析结果表明，方法该能够从22份种质中区分出14种种质带型，方法简单易行，基本上已充分利用了实验结果信息，故在构建分子身份证时采用该方法，例如‘大白杏’以最小109bp和最大138bp两个特征条带的2位代码代表该标记(表2)。
附加特征条带及其编码：如图1和表2所示，‘金太阳2’、‘车头杏’、158号、J42、87号和S120这6份种质分别有2条、1条、4条、2条、1条和1条附加的第三特征条带。另外，PS75种质的BPPCT038标记有1条附加特征条带104bp，S119种质的BPPCT038和UDP98-409标记分别有附加特征条带115bp和146bp。
完成一个实验花费大量人力、物力和财力，实验结果信息应充分利用。从这方面考虑，进行分子身份证编码时应该利用某些种质的附加特征条带，方法是：在12位分子身份证后增加第13位编码，BPPCT 002、BPPCT 038、BPPCT 039、BPPCT 040和UDP98-409这5个标记有附加特征条带时其第13位代码分别是1、2、3、4和5，无附加特征条带时第13位代码是0或略去。编码方法：首先编码只有1个标记有附加特征条带的种质，然后编码2个标记有附加特征条带的种质，从2个标记中尽量选用尚未使用、易于区别其它种质的标记和附加特征条带进行编码，如只有1个标记有附加特征条带的87号、‘车头杏’和S120编码为2的情况下，J42选用尚未使用的标记UDP98-409和152bp条带编码为5，‘金太阳2’选用易于区别的标记BPPCT 038和114bp条带编码为2；最后编码多个标记有附加特征条带的种质时，从多个标记中尽可能选用尚未使用的附加特征条带进行编码，如158号选用标记BPPCT 040和146bp条带编码为4。按照上述方法编码，‘金太阳2’、87号、158号、‘车头杏’、J42、S120、PS75和S119这8份种质的13位分子身份证编码见表5。
UDAp-471标记的谱带复杂，一般情况下不考虑其附加特征条带。当种质不能用上述方法区分时，比较种质的UDAp-471标记扩增产物谱带；当发现一份种质有特异条带时，将一个特异条带编码作为该种质分子身份证的第13位编码，数字6、7、8、9和除了0、L以外的字母可以用作UDAp-471标记的编码构成分子身份证第13位编码。
本研究采用上述图谱带型双代码编码构建分子身份证，带型编码为两位代码，统一由一套代码编码，代表的是基因的两条特征谱带(两个等位基因)。该方法优点突出，信息量大，编码编码空间大(苑克俊等，2014)，有助于比较和区别种质。
图谱带型双代码编码方法由于采用9个个位数和24个小写字母作为等位基因代码，每个标记用2位代码编码，理论上每个标记最多可以编码33×33＝1089种带型(苑克俊等，2018)。即使按照表4中已经获得的等位基因数编码，6个标记也分别可以编码21×21、21×21、7×7、15×15、22×22和23×23种带型，外加33种附加特征条带编码，图谱带型双代码编码方法的编码空间显著高于已报道的单个等位基因编码方法和图谱带型单个代码法(徐雷锋等，2014；苑克俊等，2018)，后两种方法如果采用6个标记构建分子身份证，理论上6个标记仅分别可以编码33、33、33、33、33和33种带型。
参考文献见背景技术部分。
Claims (4)
1.构建杏种质分子身份证的一种改进方法，杏种质分子身份证由BPPCT 002、BPPCT038、BPPCT 039、BPPCT 040、UDP98-409和UDAp-471六个标记的编码构成，其改进特征是通过实验确定UDP98-409和UDAp-471标记作为构成杏种质分子身份证的标记；BPPCT 002标记的特征条带数相对其它标记少，作为分子身份证第一个标记。
2.上述权利1构建杏种质分子身份证的一种改进方法，其改进特征是：UDAp-471标记的扩增产物谱带复杂，以最小和最大特征谱带的两条特征条带编码代表该标记。
3.上述权利1构建杏种质分子身份证的一种改进方法，其改进特征是：BPPCT 038、BPPCT 039、BPPCT 040和UDP98-409四个标记在一些种质上的扩增产物除两个正常编码谱带外，出现第三个附加谱带；对于出现第三个附加谱带的标记，以附加谱带的特征条带编码构成种质分子身份证的第13位编码，数字1、2、3、4、5分别用作BPPCT 002标记和上述四个标记的附加特征条带编码。
4.上述权利1构建杏种质分子身份证的一种改进方法，其改进特征是：当种质不能用12位分子身份证和上述权利3方法区分时，比较种质的UDAp-471标记扩增产物谱带；当发现一份种质有特异条带时，将一个特异条带编码作为该种质分子身份证的第13位编码，数字6、7、8、9和除了O、L以外的字母用作UDAp-471标记的编码构成分子身份证第13位编码。
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