CN111518942A - 蔊菜属植物通用性ssr引物对及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明首次公开了蔊菜属植物通用性SSR引物对及其筛选方法和应用。本发明通过对印度蔊菜进行转录组测序，在转录组测序的基础上，对序列数据进行分析筛选，开发了大量的SSR引物，从中筛选到10对多态性引物。该10对多态性引物，具有条带清晰、多态性丰富、稳定性好等优点，可应用于蔊菜属植物种质资源遗传多样性评价、亲缘关系鉴定、遗传连锁图谱构建和分子标记辅助育种。

Description

蔊菜属植物通用性SSR引物对及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蔊菜属植物通用性SSR引物筛选及应用。

背景技术

蔊菜属植物为十字花科一年生或两年生直立草本，具有耐渍性、抗旱和抗盐碱等优异性状。蔊菜属植物营养丰富，不仅含有蛋白质、氨基酸、多种维生素，还含有蔊菜素、生物碱、黄酮化合物等药用保健成分。由于蔊菜属植物在我国山东、江苏、浙江、福建、台湾、湖南、江西、广东和四川等地均有分布，生态适应性广，而且种间(例如，无瓣蔊菜与印度蔊菜)存在很大的分类关系争议，形态学分类指标随环境变异大，通过传统分类学手段很难准确完成物种辨别和鉴定，更难以进一步开展蔊菜属近缘种的亲缘关系和系统进化研究工作。因此，很有必要开发蔊菜属通用分子标记，得到更准确快捷的蔊菜属植物鉴定方法。

随着现代生物技术的发展，分子标记已经广泛用于辅助育种和种质资源遗传多样性分析等工作。SSR标记是一类由1～6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。与其他分子标记相比，SSR标记具有多态性丰富、重复性好、可靠性强、成本低等特点，已广泛应用于遗传多样性、种质资源鉴定、遗传结构与遗传图谱分析。

目前，蔊菜属植物尚无全基因组信息及其可用的SSR引物。因此，关于如何基于转录组测序获得蔊菜属植物SSR引物对，以便更好地研究蔊菜属不同种之间的亲缘关系，应用于分子标记辅助育种，将其优良性状转移至经济作物中，获得大量优异种质资源，成为该技术领域急需解决的难题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，利用RNA-seq技术分别对印度蔊菜的根、茎和叶片材料进行转录组测序，检测其SSR位点并设计引物，通过引物筛选和多态性检测等方法，开发了10对SSR引物，为蔊菜属植物种质资源遗传多样性分析以及不同种之间的亲缘关系鉴定等研究工作提供技术支撑。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种基于转录组测序开发的蔊菜属植物通用性SSR引物对的筛选方法，包括以下步骤：

(1)取印度蔊菜的根、茎、叶片3种组织进行转录组测序；

(2)使用在线微卫星位点扫描工具SSRIT(或MISA软件)检验分析不同类型SSR重复单元的重复次数分布，筛选SSR位点，搜索设置为单碱基10次，二碱基6次，三、四、五和六碱基均为5次；

(3)利用Primer 3.0软件根据重复序列的两翼序列设计引物，引物设计的主要参数为：GC含量40-70％，退火温度55-60℃，上、下游引物的Tm值相差≦2℃，引物长度18-28bp，预期扩增产物无二级结构和二聚体；

(4)使用CTAB法提取表2中所示的蔊菜属植物基因组DNA；

(5)采用上述步骤(4)提取的基因组DNA为模板，用步骤(3)合成的引物进行PCR扩增反应；

(6)使用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出条带清晰、多态性丰富、稳定性好的蔊菜属植物通用性SSR引物对。

优选地，所述步骤(1)中所述转录组测序的具体步骤如下：采用植物RNA提取试剂盒分别提取印度蔊菜的根、茎以及叶片的总RNA，根据mRNA特有的ployA结构，用oligodT纯化分离得到总RNA中的mRNA，以mRNA为模板反转录合成双链cDNA，双链cDNA末端补平后连接接头Adaptor，根据接头序列进行PCR扩增，得到符合要求的文库，用Illumina HiSeq×10对扩增后的文库进行测序，最后用Trinity软件对测序结果进行拼接组装得到Unigene。

优选地，所述步骤(4)中所述CTAB法提取蔊菜属植物基因组DNA的步骤如下：

1)取蔊菜属植物新鲜叶片0.05g，放入2ml圆底离心管中，加入1ml 2％CTAB,再放入2粒钢珠(无油，直径6mm)，震荡破碎机震荡6min；

2)65℃水浴30min，每间隔10min震荡混合；

3)冷却至室温，倒出钢珠；

4)加入等体积的混合液(混合液由体积比为24:1的氯仿和异戊醇组成)，充分混匀后，静置10min，12000rpm离心10min；

5)取上清液约600μl至新的离心管中，加入2/3体积约400μl预冷的异丙醇，轻晃，置于-20℃，90min；

6)12000rpm离心10min；

7)吸取上清，待沉淀风干后，加入50μl无菌水溶解。

优选地，所述步骤(5)中所述的PCR扩增反应体系为：反应总体系为10μl，其中ddH₂O:3.4μl；2×Pcr Taq mix：5μl(康为世纪)，正向引物：0.3μl，10μmol/L；反向引物：0.3μl，10μmol/L；模板DNA：1μl，100-500ng/μl。反应程序为：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，60℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸45s，10个循环；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸45s，22个循环。

优选地，所述步骤(6)中的具体步骤如下：

1)配制6％变性聚丙烯酰胺凝胶:100ml丙烯酰胺凝胶混合液(1L丙烯酰胺凝胶混合液配制方法：尿素420g、丙烯酰胺57g、亚甲基双丙烯酰胺3g、10×TBE 100ml、加水定容至1L)，过硫酸铵400μl、TEMED 40μl等待凝胶时间40min；

2)凝胶完成后，取2μl扩增产物在电压900v、电流50mA、功率45W的程序下跑胶100min；

3)将跑好胶的玻璃板用蒸馏水洗10s，加入到2L的硝酸银染色液银染10min(2L硝酸银染色液：1.6g AgNO₃,4ml CH₃COOH)；

4)银染后，取出玻璃板用蒸馏水洗10s，加入2L的显影液等待5min～10min直到显示出清晰的条带为止(2L显影液：24g NaOH,0.8gNa₂CO₃,8ml甲醛溶液)。

本发明所述的基于转录组测序开发的10对蔊菜属植物通用性SSR引物序列，如下表1所示：

表1 10对多态性SSR引物对

所述引物c87330_g1、c74633_g1、c87201_g1、c76405_g1、c78097_g1、c84734_g2、c89663_g3的退火温度为63℃，所述引物c90394_g1、c84340_g3、c71640_g1的退火温度为58℃。

本发明还提供了上述基于转录组测序开发的蔊菜属植物通用性SSR引物对，或者上述方法筛选出的蔊菜属植物通用性SSR引物对的用途，包括：

a.在蔊菜属植物种质资源遗传多样性检测中的用途；

b.在蔊菜属植物种质资源亲缘关系鉴别中的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供的10对SSR引物具有条带清晰、多态性丰富、稳定性好等优点，可有效实现蔊菜属植物种质资源遗传多样性和种间亲缘关系分析，为蔊菜属植物遗传资源评价及亲缘关系鉴定等研究提供技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明中蔊菜属植物通用性SSR引物对的筛选方法的流程图。

图2是本发明中引物c89663_g3的电泳结果图。

图3是本发明中引物c78097_g1的电泳结果图。

图4是本发明中引物c87330_g1的电泳结果图。

图5是本发明中引物c90394_g1的电泳结果图。

图6是本发明中引物c84340_g3的电泳结果图。

图7是本发明中引物c87201_g1的电泳结果图。

图8是本发明中引物c71640_g1的电泳结果图。

图9是本发明中引物c76405_g1的电泳结果图。

图10是本发明中引物c74633_g1的电泳结果图。

图11是本发明中引物c84734_g2的电泳结果图。

图12是本发明实施例中52份蔊菜属植物种质资源材料的亲缘关系图。

具体实施方式

下面实施例中所用植物材料，如下表2所示：

表2 52份蔊菜属植物种质资源材料

实施例1

基于转录组测序开发的蔊菜属植物通用性SSR引物对的筛选方法，具体步骤如下：

(1)取印度蔊菜的根、茎、叶片材料进行转录组测序，具体过程为：采用

Reagent(Invitrogen)提取蔊菜根、茎以及叶片的总RNA，根据mRNA特有的ployA结构，利用oligo(dT)纯化分离得到总RNA中的mRNA，以mRNA为模板反转合成双链cDNA，双链cDNA末端补平后连接的接头Adaptor，根据接头的序列进行PCR扩增，得到符合要求的文库，用Illumina HiSeq×10对文库进行测序，最后用Trinity软件对测序结果进行拼接组装得到Unigene。

(2)使用在线微卫星位点扫描工具SSRIT检验分析Unigene中不同类型SSR重复单元的重复次数分布，筛选出SSR位点，筛选条件为：单碱基10次，二碱基6次，三、四、五和六碱基均为5次；

(3)利用Primer 3.0软件对上述步骤(2)中筛选出的SSR位点进行批量设计引物，引物长度设置为18-28bp，本实施例中，筛选出166对引物由上海生物工程有限公司进行合成；

(4)提取不同地区或不同种的蔊菜属植物基因组DNA，本实施例中采用52份蔊菜属植物种质资源材料，其物种名及采集地如表2所示；

本实施例中采用CTAB法提取蔊菜属植物的基因组DNA，具体步骤如下：

1)取蔊菜属植物新鲜叶片0.05g，放入2ml圆底离心管中，加入1ml 2％CTAB,再放入2粒钢珠(无油，直径6mm)，震荡破碎机震荡6min；

2)65℃水浴30min，每间隔10min震荡混合；

3)冷却至室温，倒出钢珠；

4)加入等体积的混合液(混合液由体积比为24:1的氯仿和异戊醇组成)，充分混匀后，静置10min，12000rpm离心10min；

5)取上清液约600μl至新的离心管中，加入2/3体积约400μl预冷的异丙醇，轻晃，置于-20℃，90min；

6)12000rpm离心10min；

7)吸取上清，待沉淀风干后，加入50μl无菌水溶解。

(5)随机选用几组上述步骤(4)提取的不同种蔊菜属植物基因组DNA作为模板，并采用步骤(3)合成的引物进行PCR扩增反应；PCR扩增反应的反应体系和反应程序如下：

反应体系：ddH₂O:3.4μl；2×Pcr Taq mix：5μl(康为世纪)，正向引物：0.3μl，10μmol/L；，反向引物：0.3μl，10μmol/L；模板DNA：1μl，100-500ng/μl。

反应程序为：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，60℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸45s，10个循环；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸45s，22个循环。

(6)使用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出条带清晰、多态性丰富、稳定性好的蔊菜属植物通用性SSR引物对。

本实施例中上述6％变性聚丙烯酰胺凝胶的配制及电泳过程为：

1)配制6％变性聚丙烯酰胺凝胶:100ml丙烯酰胺凝胶混合液、10％的过硫酸铵400μl、TEMED 40μl混合，等待凝胶，等待时间40min。其中，1L丙烯酰胺凝胶混合液配制方法：尿素420g、丙烯酰胺57g、亚甲基双丙烯酰胺3g、10×TBE 100ml、加水定容至1L。TEMED为四甲基乙二胺，10×TBE为Tris-硼酸电泳缓冲液。

2)凝胶完成后，取2μl步骤(5)获得的扩增产物在电压900v、电流50mA、功率45W的程序下跑胶100min；

3)将跑好胶的玻璃板用蒸馏水洗10s，加入到2L的硝酸银染色液银染10min(2L硝酸银染色液：1.6g AgNO₃,4ml CH₃COOH)；

4)银染后，取出玻璃板用蒸馏水洗10s，加入2L的显影液等待5min～10min直到显示出清晰的条带为止(2L显影液：24g NaOH,0.8gNa₂CO₃,8ml甲醛溶液)。

上述步骤中的oligo(dT)、Adaptor、Illumina HiSeq×10、Trinity软件、SSRIT、Primer 3.0等均为现有技术，本实施例中不再赘述。

根据电泳检测显影结果，分析其多态性，同种引物在不同地区或不同种蔊菜属植物材料之间能扩增出差异条带的，本发明认为其具有多态性。本发明从166对引物中筛选出如下表3中10对条带清晰、多态性丰富、稳定性好的蔊菜属植物通用性SSR引物对。

表3 10对多态性SSR引物对

采用上述方法筛选出的10对引物对上述表2所示的52份蔊菜属种质资源基因组DNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳图如图2-图11所示，将电泳结果输入现有软件NTSYS2.1进行分析，检测出上述52份蔊菜属种质资源材料的亲缘关系，亲缘关系图如图12所示。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种基于转录组测序开发的蔊菜属植物通用性SSR引物对，其特征在于，包括以下10对引物碱基序列：

2.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发的蔊菜属植物通用性SSR引物对，其特征在于，所述引物c87330_g1、c74633_g1、c87201_g1、c76405_g1、c78097_g1、c84734_g2、c89663_g3的退火温度为63℃，所述引物c90394_g1、c84340_g3、c71640_g1的退火温度为58℃。

3.一种基于转录组测序开发的蔊菜属植物通用性SSR引物对的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采集成熟时期蔊菜属植物材料不同组织进行转录组测序；

(2)对所得转录组测序数据检验分析不同类型SSR重复单元的重复次数分布，筛选SSR位点，筛选条件为：单碱基10次，二碱基6次，三、四、五和六碱基均为5次；

(3)根据重复序列的两翼序列设计引物，设置引物长度为18-28bp；

(4)提取不同地区或/和不同种的蔊菜属植物基因组DNA；

(5)采用上述步骤(4)提取的基因组DNA为模板，用步骤(3)合成的引物进行PCR扩增反应；

(6)使用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出条带清晰、多态性丰富、稳定性好的蔊菜属植物通用性SSR引物对。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的体系为：反应总体系10μl；其中，ddH₂O：3.4μl；2×Pcr Taq mix：5μl；正向引物：0.3μl，10μmol/L；反向引物：0.3μl，10μmol/L；模板DNA：1μl，100-500ng/μl。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，53～60℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸45s，22个循环。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述10个循环中的退火温度，每个循环降低0.5℃。

7.权利要求1或2所述的基于转录组测序开发的蔊菜属植物通用性SSR引物对，或者权利要求3-6任一所述的方法筛选出的蔊菜属植物通用性SSR引物对具有如下的用途：

a.在蔊菜属植物种质资源遗传多样性检测中的用途；

b.在蔊菜属植物种质资源亲缘关系鉴别中的用途。

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