CN101230389A - 中药白术聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药鉴定技术领域，是一种用于鉴定中药白术的引物及其鉴定方法。本发明设计的白术聚合酶链反应的鉴定引物DNA序列为：引物cc1：5’－accaaattccattctccc－3’；引物cc2：5’－tatgtccataatacacaa－3’。鉴定方法为：提取药材的总DNA；用本发明的一对鉴定引物进行PCR扩增，电泳检查扩增结果，若用鉴定引物得到阳性扩增，则供试品为白术，若无阳性扩增则供试品不为白术。本发明能够实现白术的快速、准确地鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及中药鉴定的技术领域，尤其涉及一种用于鉴定中药白术的引物及其鉴定方法。
技术背景
白术(Atractylodes macrocephala Koidz)是著名中药材“浙八味”之一，有补脾益气，燥湿利水，固表止汗等功效，是目前中草药市场上使用较多的一种(8-10)
随着中药现代化步伐的加快，中药的标准化已成为中药产业发展和打入国际市场的瓶颈。药用植物的发展离不开标准化生产，即目前大力推行的GAP(Goodagriculturing Practice，中药材生产质量管理规范)工作的核心。而物种的鉴定方法是质量标准控制和管理的前提。随着分子生物学、分子遗传学和现代化学分析技术的快速发展，使药材的科学鉴定成为可能(1-7)。
然而，利用形态及理化方法对药材进行鉴定需要丰富的经验，且结果不够可靠，尤其是破碎或粉末状态的药材则更难鉴别，而基于植物DNA序列的分子遗传标记技术适合于物种的鉴别，因此可以建立一种分子遗传标记技术对白术进行鉴定。
目前，分子遗传标记在动植物品种鉴定方面已得到广泛应用。在药材鉴定方面，已建立了鉴别性聚合酶链反应(PCR)技术，并已成功地用于龟甲、鹿类等中药的鉴别。但这种方法不是对所有的中药都有统一的方法和引物，对不同的中药材，其鉴定方法、引物都有不同。
参考文献
1)Cao H.Liu Y.P.1998.Applications of molecular markers in thedetection of herbal medicine.Chin.Pharm.J.33(5)：269-273.
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9)陈仲良.1989，中药白术的化学成分II.白术三醇的α-甲基丁酰衍生物.化学学报，47：1022
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11)林强等.1997，白术挥发油成分的分析.华西药学杂志，12(2)：119
发明内容
本发明的目的是提供一种对白术药材能准确鉴别其真伪的中药白术鉴别性聚合酶链反应鉴定引物及其鉴定方法。
用于鉴定中药白术的引物：鉴定引物DNA序列为：引物cc1：5’-accaaattccattctccc-3’；引物cc2：5’-tatgtccataatacacaa-3’，用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即得到鉴定引物的白色粉末结晶。
中药白术的鉴定方法包括如下步骤：
1)药材DNA提取：采用改良CTAB法提取药材DNA；
2)鉴别性PCR：将鉴定引物的白色粉末结晶用无离子水溶解并稀释至5umol/L，得到引物cc1和引物cc2溶液，按照下面表格将各反应物品加入PCR反应管中，得到反应混合液；
组 分 终浓度
10×Buffer(Mg2+free) 2.5ul
MgCl2 2.0～2.5ul
dNTPs 0.5ul
引物cc1、引物cc2各 1.0ul
Taq酶(5U/μl) 0.25ul
共试品DNA模板(20ng/μl) 2.0～2.5ul
双蒸水 加至25ul
3)PCR循环：将反应混合液放入PCR仪中，按下述程序进行PCR反应：
4)电泳观察：取出PCR反应液5ul，加入加样缓冲液1ul，用含有0.5％溴化乙锭的1.5％琼脂凝胶电泳，检测扩增结果，若有阳性扩增，则供试品为白术；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为白术。
所述的改良CTAB法提取药材DNA的步骤为：
1)取约0.05～0.1克的硅胶干燥叶片，置入磨样管中，用磨样机研磨，磨样速度为4.0～5.0rpm，磨样时间为20～40s，然后在磨样管中迅速加入65℃预热的含2％β-巯基乙醇的2×CTAB提取缓冲液800～1000ul，摇均匀后转入5ml离心管中，再用800～1000ul 2×CTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中，65℃水浴30～35分钟；
2)冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，缓慢颠倒15～30分钟，混合均匀，离心10～15分钟，离心速度为8000～10000rpm；
3)离心后，吸取上层水相，加入1/10体积的10×CTAB，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，缓慢颠倒15～30分钟，混合均匀，离心10～15分钟，离心速度为8000～10000rpm；
4)离心后吸取上层水相，加入0.5体积的5M NaCl混匀，再加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于-20℃放置2～12小时；
5)离心10～15min，离心速度为10000～12000rpm，弃水相；
6)加75％乙醇浸洗2～3次，用无水乙醇清洗1～2次，去乙醇，风干，用100～200ul 0.1×TE溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。
本发明解决了中药白术的鉴定问题。我们在对白术的鉴别中，设计了鉴别白术的一对高特异性引物，该鉴定引物在给定的PCR条件下，能将白术鉴定出来。当供试样品用本鉴定引物进行PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳观察有无扩增条带的出现，即可鉴定白术。用此对引物可以制造用于白术鉴别的反应试剂盒。本发明对于中药生产、销售部门快速、准确地鉴定白术，搞好药材的质量控制，是十分必要的，对各地市药检部门打击假冒伪劣，净化药材市场具有十分重要的价值。
附图说明
附图是采用引物cc1和引物cc2进行PCR扩增检测的电泳图(如图所示，白术在分子量为700bp位置有清晰条带出现，而苍术在分子量为700bp位置没有条带出现)；图中：K：空白对照，M：分子量。
具体实施方式
首先从白术及其近缘种、混淆种的原植物中提取总DNA，用PCR方法扩增多个基因片段并分别纯化，对各纯化片段进行DNA序列分析，建立白术及其近缘种、混淆种的DNA序列数据库，在比较数据库的基础上，选择合适的DNA片段，针对白术特有的片段，设计一对用于鉴定中药白术的引物：鉴定引物DNA序列为：引物cc1：5’-accaaattccattctccc-3’；引物cc2：5’-tatgtccataatacacaa-3’，用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即得到鉴定引物的白色粉末结晶。
采用上述引物对中药白术进行鉴别，鉴定方法包括如下步骤：
1)药材DNA提取：采用改良CTAB法提取药材DNA；
2)鉴别性PCR：将鉴定引物的白色粉末结晶用无离子水溶解并稀释至5umol/L，得到引物cc1和引物cc2溶液，按照下面表格将各反应物品加入PCR反应管中，得到反应混合液；
组分 终浓度
10×Buffer(Mg2+free) 2.5ul
MgCl2 2.0～2.5ul
dNTPs 0.5ul
引物cc1、引物cc2各 1.0ul
Taq酶(5U/μl) 0.25ul
供试品DNA模板(20ng/μl) 2.0～2.5ul
双蒸水 加至25ul
3)PCR循环：将反应混合液放入PCR仪中，按下述程序进行PCR反应：
4)电泳观察：取出PCR反应液5ul，加入加样缓冲液1ul，用含有0.5％溴化乙锭的1.5％琼脂凝胶电泳，检测扩增结果，若有阳性扩增，则供试品为白术；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为白术。
所述的改良CTAB法提取药材DNA的步骤为：
1)取约0.05～0.1克的硅胶干燥叶片，置入磨样管中，用型号为BIO101的磨样机研磨，磨样速度为4.0～5.0rpm，磨样时间为20～40s，然后在磨样管中迅速加入65℃预热的含2％β-巯基乙醇的2×CTAB提取缓冲液800～1000ul，摇均匀后转入5ml离心管中，再用800～1000ul 2×CTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中，65℃水浴30～35分钟；
2)冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，缓慢颠倒15～30分钟，混合均匀，离心10～15分钟，离心速度为8000～10000rpm；
3)离心后，吸取上层水相，加入1/10体积的10×CTAB，轻轻混匀，再加入加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，缓慢颠倒15～30分钟，混合均匀，离心10～15分钟，离心速度为8000～10000rpm；
4)离心后吸取上层水相，加入0.5体积的5M NaCl混匀，再加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于-20℃放置2～12小时；
5)离心10～15min，离心速度为10000～12000rpm，弃水相；
6)加75％乙醇浸洗2～3次，用无水乙醇清洗1～2次，去乙醇，风干，用100～200ul 0.1×TE溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。
实施例1
1)药材DNA提取：采用改良CTAB法提取药材DNA。
(1)取约0.05克的硅胶干燥叶片，置入磨样管中，用型号为BIO101的磨样机研磨，磨样速度为4.0rpm，磨样时间为20s，然后在磨样管中迅速加入65℃预热的含2％β-巯基乙醇的2×CTAB提取缓冲液800ul，摇均匀后转入5ml离心管中，再用800ul 2×CTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中，65℃水浴30分钟；
(2)冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，缓慢颠倒15分钟，混合均匀，离心10分钟，离心速度为8000rpm；
(3)离心后，吸取上层水相，加入1/10体积的10×CTAB，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，缓慢颠倒15分钟，混合均匀，离心10分钟，离心速度为8000rpm；
(4)离心后吸取上层水相，加入0.5体积的5M NaCl混匀，再加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于-20℃放置2小时；
(5)离心10min，离心速度为10000rpm，弃水相；
(6)加75％乙醇浸洗2次，用无水乙醇清洗1次，去乙醇，风干，用100ul0.1×TE溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。
2)鉴别性PCR：将鉴定引物的白色粉末结晶用无离子水溶解并稀释至5umol/L，得到引物cc1和引物cc2溶液，然后在PCR反应管中依次加入双蒸水15.25ul、10×Buffer(Mg2+free)2.5ul、MgCl2 2.0ul、dNTPs 0.5ul、引物cc1和引物cc2各1.0ul、供试品DNA模板(20ng/μl)2.5ul和Taq酶(5U/μl)0.25ul(所用的10×Buffer(Mg2+free)、MgCl2、dNTPs 0.5ul、和Taq酶(5U/μl)均购买自上海申能博彩生物科技有限公司)，得到反应混合液。
3)PCR循环：将反应混合液放入PCR仪中，94℃预变性4min，然后按下列参数进入30个循环：94℃变性30sec，61.5℃复性30sec，72℃延伸1min。循环结束后在72℃保持7min。
4)电泳观察：取出PCR反应液5ul，加入加样缓冲液1ul，用含有0.5％溴化乙锭的1.5％琼脂凝胶电泳，检测扩增结果，若有阳性扩增，则供试品为白术；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为白术。
实施例2
1)药材DNA提取：采用改良CTAB法提取药材DNA。
(1)取约0.1克的硅胶干燥叶片，置入BIO101磨样管中，用型号为BI0101的磨样机研磨，磨样速度为5.0rpm，磨样时间为40s，然后在磨样管中迅速加入65℃预热的含2％β-巯基乙醇的2×CTAB提取缓冲液1000ul，摇均匀后转入5ml离心管中，再用1000ul 2×CTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中，65℃水浴35分钟；
(2)冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，缓慢颠倒30分钟，混合均匀，离心15分钟，离心速度为10000rpm；
(3)离心后，吸取上层水相，加入1/10体积的10×CTAB，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，缓慢颠倒15～30分钟，混合均匀，离心15分钟，离心速度为10000rpm；
(4)离心后吸取上层水相，加入0.5体积的5M NaCl混匀，再加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于-20℃放置12小时；
(5)离心15min，离心速度为12000rpm，弃水相；
(6)加75％乙醇浸洗3次，用无水乙醇清洗2次，去乙醇，风干，用200ul0.1×TE溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。
2)鉴别性PCR：将鉴定引物的白色粉末结晶用无离子水溶解并稀释至5umol/L，得到引物cc1和引物cc2溶液，然后在PCR反应管中依次加入双蒸水15.25ul、10×Buffer(Mg2+free)2.5ul、MgCl22.5ul、dNTPs 0.5ul、引物cc1和引物cc2各1.0ul、供试品DNA模板(20ng/μl)2.0ul和Taq酶(5U/μl)0.25ul(所用的10×Buffer(Mg2+free)、MgCl2、dNTPs0.5ul、和Taq酶(5U/μl)均购买自上海申能博彩生物科技有限公司)，得到反应混合液。
3)PCR循环：将反应混合液放入PCR仪中，94℃预变性5min，然后按下列参数进入40个循环：94℃变性45sec，61.5℃复性45sec，72℃延伸1.5min。循环结束后在72℃保持10min。
4)电泳观察：取出PCR反应液5ul，加入加样缓冲液1ul，用含有0.5％溴化乙锭的1.5％琼脂凝胶电泳，检测扩增结果，若有阳性扩增，则供试品为白术；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为白术。
Claims (3)
1.一种中药白术聚合酶链反应鉴定引物，其特征在于：鉴定引物DNA序列为：引物cc1：5’-accaaattccattctccc-3’；引物cc2：5’-tatgtccataatacacaa-3’，用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即得到鉴定引物的白色粉末结晶。
2.一种使用如权利要求1所述引物的中药白术的鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：
1)药材DNA提取：采用改良CTAB法提取药材DNA；
2)鉴别性PCR：将鉴定引物的白色粉末结晶用无离子水溶解并稀释至5umol/L，得到引物cc1和引物cc2溶液，按照下面表格将各反应物品加入PCR反应管中，得到反应混合液；
组分 终浓度
10×Buffer(Mg2+free) 2.5ul
MgCl2 2.0～2.5ul
dNTPs 0.5ul
引物cc1、引物cc2各 1.0ul
Taq酶(5U/μl) 0.25ul
供试品DNA模板(20ng/μl) 2.0～2.5ul
双蒸水 加至25ul
3)PCR循环：将反应混合液放入PCR仪中，按下述程序进行PCR反应：
4)电泳观察：取出PCR反应液5ul，加入加样缓冲液1ul，用含有0.5％溴化乙锭的1.5％琼脂凝胶电泳，检测扩增结果，若有阳性扩增，则供试品为白术；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为白术。
3.根据权利要求1所述的一种中药白术的鉴定方法，其特征在于所述的改良CTAB法提取药材DNA的步骤为：
1)取约0.05～0.1克的硅胶干燥叶片，置入磨样管中，用磨样机研磨，磨样速度为4.0～5.0rpm，磨样时间为20～40s，然后在磨样管中迅速加入65℃预热的含2％β-巯基乙醇的2×CTAB提取缓冲液800～1000ul， 摇均匀后转入5ml离心管中，再用800～1000ul 2×CTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中，65℃水浴30～35分钟；
2)冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，缓慢颠倒15～30分钟，混合均匀，离心10～15分钟，离心速度为8000～10000rpm；
3)离心后吸取上层水相，加入1/10体积的10×CTAB，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，缓慢颠倒15～30分钟，混合均匀，离心10～15分钟，离心速度为8000～10000rpm；
4)离心后吸取上层水相，加入0.5体积的5M NaCl混匀，再加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于-20℃放置2～12小时；
5)离心10～15min，离心速度为10000～12000rpm，弃水相；
6)加75％乙醇浸洗2～3次，用无水乙醇清洗1～2次，去乙醇，风干，用100～200ul 0.1×TE溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN103993009A (zh) * | 2013-02-17 | 2014-08-20 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 一组pcr引物对及以其鉴别天南星的方法 |
| CN104774948A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-07-15 | 浙江工业大学 | 河北白术pcr鉴定试剂盒及鉴定方法 |
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2007
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|---|---|---|---|---|
| CN103993009A (zh) * | 2013-02-17 | 2014-08-20 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 一组pcr引物对及以其鉴别天南星的方法 |
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