CN106480207A

CN106480207A - 一种鉴别酸浆的核苷酸序列、特异性标记引物和方法

Info

Publication number: CN106480207A
Application number: CN201611006393.2A
Authority: CN
Inventors: 冯尚国; 焦凯丽; 姜梦莹; 卢江杰; 沈晨佳; 王慧中
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2017-03-08
Anticipated expiration: 2036-11-16
Also published as: CN106480207B

Abstract

本发明涉及一种鉴别酸浆的核苷酸序列、特异性标记引物和方法。本发明鉴别酸浆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于鉴别酸浆的特异性标记引物上游序列ST5SJF：如SEQ ID NO.2所示；下游序列ST5SJR：如SEQ ID NO.3所示。利用特异性标记引物ST5SJF/ST5SJR，通过常规PCR方法来鉴别酸浆。本发明ST5SJF/ST5SJR酸浆特异性标记引物，若为其他酸浆属植物样品，为阴性反应，能够实现酸浆样品的快速准确鉴别。该方法简便、准确，且耗时短，半日即可完成。

Description

一种鉴别酸浆的核苷酸序列、特异性标记引物和方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别酸浆Physalis alkekengi var.franchetii的核苷酸序列、特异性标记引物，以及一种利用该特异性引物对酸浆进行快速鉴别的方法。

背景技术

酸浆Physalis alkekengi var.franchetii是茄科(Solanaceae)酸浆属(Physalis)一年生草本植物，又名锦灯笼、挂金灯。其原产于我国，在我国南北地区均有分布，多生长于田边、路旁、林缘、荒地，等。酸浆果实含有丰富的β－胡萝卜素、维生素C、Ca等多种矿物质和人体所需的18种氨基酸，可以生吃，也可以加工成果汁、罐头等。酸浆是我国重要的传统中药材，最早记录于《神农本草经》，现被《中华人民共和国药典》(2015版)收录。酸浆宿萼含有甾体类、甾醇、黄酮及酸浆苦味素等重要化学成分，其具有清热解毒、利咽化痰、利尿通淋之功效，可以用于咽喉音哑、痰热咳嗽、小便不利、热淋涩痛、湿疹、天疱疮等治疗。酸浆与小酸浆P.minima、苦蘵P.angulata及毛酸浆Physalis pubescens的叶、花及果实形状相似度非常高，利用形态学鉴别方法很难将酸浆与其它三种酸浆属植物区分开。因而，经常会发生将小酸浆、苦蘵及毛酸浆错误鉴定为酸浆的情况，这为酸浆资源的安全使用和保护带来了很大困难。

对酸浆属植物的鉴别主要依据表观特征，但是酸浆属植物的表型特征十分相似，且形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，因此，仅靠细微表型差异难以准确鉴定酸浆属植物种类。DNA分子标记尤其是特异性分子标记技术弥补和克服了传统分类方法的一些缺陷和难题，可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。本专利首先运用SCoT标记方法，采用PCR技术获得酸浆属植物SCoT指纹图谱。经过大量筛选实验，获得酸浆特异性条带，通过切胶回收、TA克隆、测序等方法，开发获得酸浆特异性标记引物，对有效的鉴别和保护酸浆种质资源具有非常重要的意义。该方法具有快速、简便、成本低、准确度高的特点，迄今为止，尚未有特异性分子标记应用于酸浆鉴别的研究报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种鉴别酸浆的特征性核苷酸序列。

本发明采用PCR技术，利用SCoT标记，经过大量筛选实验，获得酸浆特异性DNA片段，通过切胶回收、TA克隆、测序，获得该DNA序列。具体序列为：

CAACAATGGCTACCACGAGACACAAAAGGGTGTGGGGCTTCTTTAGGGGATTAGTTTTTCCGCTCTATATGATAACCATACATTTGGTAGTAGCAGGACATACCCTCGAATAGATCTTTGGACAATTGGTAGCCTTTGAAGAGGCTTATCATGAAACTTATGGTATGGGTGGTCAGGGAGTTCACCAGACGACGAGGACTGGTAGTGATCCATCTCGGGGTCGGAAAGATGAGGATCCCACGAGTTGTTTCATATGTGGTAGGTTTGGACACAAGGCCATGGAATGTTCCCTCCATGGGACTTTTTTATTGCAGCGACTTGAGCTGAGTAGTCAAGATTCAGGACAGATTCATCCAATTTTGCCTTCGGGTTCTCAAAACCTTTCTAATGATATCCGATCAGTAAGTAGAGGATGTGATAGACAGACTTATCAACCGCTGAGATTTCAACATCACGATCGATTGGGTCAGTACAGAGGCCAGAGCAGCCAGGGTAGCCAACTTGTTAGGGGTGCATCTTCGGGTTCAAGAGGTCGTGGTAGCCATTGTTG，如SEQ ID NO.1所示；

本发明的第二个目的是提供基于上述酸浆特征性核苷酸序列设计的鉴别酸浆的特异性标记引物(ST5SJF/ST5SJR)，该引物序列如下：

ST5SJF:5’-AGGGTGTGGGGCTTCTTTA-3’，如SEQ ID NO.2所示；

ST5SJR:5’-GGCTGCTCTGGCCTCTGTA-3’，如SEQ ID NO.3所示；

上述特异性引物(ST5SJF/ST5SJR)，具有非常高的特异性，以该引物对酸浆属植物进行PCR扩增，只与酸浆样本DNA发生反应，获得463bp大小的特异性片段，而不与其他酸浆属植物样品反应。运用该特异性引物，通过常规PCR反应即可以快速鉴别出酸浆样品。

本发明的第三个目的是提供一种利用上述特异性标记引物对酸浆进行快速鉴别的方法。

本发明采用上述引物组合(ST5SJF/ST5SJR)作为特异性扩增引物，以待测酸浆属植物基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现463bp大小的特异性片段，则待测酸浆属植物样品为酸浆，反之则不是。

本发明有益效果主要体现为：ST5SJF/ST5SJR酸浆特异性标记引物，若为其他酸浆属植物样品，为阴性反应，能够实现酸浆样品的快速准确鉴别。该方法简便、准确，且耗时短，半日即可完成。

附图说明

图1是本发明所述的酸浆的特征性核苷酸序列及对酸浆特异性引物ST5SJF和ST5SJR的位置图，左侧为5’端，右侧为3’端，其中黑色部分为特异性引物ST5SJF/ST5SJR扩增的序列片段大小及位置；

图2是按照常规PCR方法，运用SCoT标记对酸浆属植物样品进行PCR扩增，经过大量筛选实验，获得的具有酸浆特征性条带的电泳图(箭头所指的条带是酸浆特有的条带，分子量为550bp)，其中M为DNA分子量标准marker DL2000；通道1～4：小酸浆P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸浆P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸浆P.pubescens。

图3是运用本发明设计的特异性标记引物ST5SJF/ST5SJR对酸浆属植物样品进行PCR扩增后的电泳图，其中M为DNA分子量标准marker DL2000；通道1～4：小酸浆P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸浆P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸浆P.pubescens。电泳图显示只有酸浆样品扩增出分子量为463bp的特异性DNA条带。

具体实施方式

本发明可以从分子水平上较为快速准确的鉴别酸浆植物，通过以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：酸浆特征性核苷酸序列的制备

1.基因组DNA的提取

剪取酸浆属植物样品(包括小酸浆4个样品、苦蘵9个样品、酸浆4个样品、以及毛酸浆3个样品)新鲜叶片100mg放入研钵，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(购于上海生工生物工程有限公司)提取基因组DNA，所得DNA用0.8％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μl。

2.SCoT–PCR扩增，电泳检测

运用SCoT标记对酸浆属植物进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，反应体系(总体积20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物(10μM)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，1μl模板DNA(50ng/μl)，12.7μl ddH₂O。

PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

经过大量筛选实验，获得具有酸浆特征性条带的指纹图谱(见图2)，箭头标记的条带(分子量为550bp，通道14～17)，是筛选出的酸浆特异性DNA条带。如图2(图中，通道M为DNA分子量标准marker DL2000；通道1～20为4种不同酸浆属植物样品，具体编号见附图说明)所示，只有酸浆(通道13～17)在分子量550bp位置有条带出现，而其他酸浆属植物在分子量550bp位置没有条带出现。因此，此条带为酸浆的特征性核苷酸序列。

3.序列测定

对上述筛选获得的酸浆特异性DNA片段(图2中箭头所指片段)进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒(上海生工)回收纯化所切DNA片段。然后将所纯化的DNA片段连接到PUCm-T载体(上海生工)上，转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后送生物公司测序(上海生工)，得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸组成和排列。

实施例2：酸浆特异性标记引物的制备，PCR扩增，电泳检测

在测序获得酸浆特异性DNA序列的基础上，设计获得ST5SJF/ST5SJR引物序列(分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。然后利用引物组合ST5SJF/ST5SJR对不同酸浆属植物样品(具体见附图说明)进行PCR扩增。

PCR反应体系(总体积20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物ST5SJF(10μM)，1μl引物ST5SJR(10μM)，1μl模板DNA(50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，11.7μl ddH₂O。

PCR反应程序：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性50s，61℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

利用1.5﹪琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，电泳图如图3所示(图中，通道M为DNA分子量标准marker DL2000；通道1～20为4种不同酸浆属植物的样品，具体见附图说明)，从图3可以看出，只有酸浆(通道14～17)能扩增出分子量为463bp大小的特异性片段，而其他酸浆属植物样品没有扩增出任何条带，这表明本发明的特异性引物具有极高的专一性，因此可以用于酸浆样品的快速鉴别。将酸浆的特异性片段送去测序，其序列如SEQ IDNO.1的27～489位碱基所示，其长度为463bp.具体序列信息见图1黑色标记部分。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州师范大学

<120> 一种鉴别酸浆的核苷酸序列、特异性标记引物和方法

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 550

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

caacaatggc taccacgaga cacaaaaggg tgtggggctt ctttagggga ttagtttttc 60

cgctctatat gataaccata catttggtag tagcaggaca taccctcgaa tagatctttg 120

gacaattggt agcctttgaa gaggcttatc atgaaactta tggtatgggt ggtcagggag 180

ttcaccagac gacgaggact ggtagtgatc catctcgggg tcggaaagat gaggatccca 240

cgagttgttt catatgtggt aggtttggac acaaggccat ggaatgttcc ctccatggga 300

cttttttatt gcagcgactt gagctgagta gtcaagattc aggacagatt catccaattt 360

tgccttcggg ttctcaaaac ctttctaatg atatccgatc agtaagtaga ggatgtgata 420

gacagactta tcaaccgctg agatttcaac atcacgatcg attgggtcag tacagaggcc 480

agagcagcca gggtagccaa cttgttaggg gtgcatcttc gggttcaaga ggtcgtggta 540

gccattgttg 550

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agggtgtggg gcttcttta 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggctgctctg gcctctgta 19

Claims

1.一种鉴别酸浆的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列为：

CAACAATGGCTACCACGAGACACAAAAGGGTGTGGGGCTTCTTTAGGGGATTAGTTTTTCCGCTCTATATGATAACCATACATTTGGTAGTAGCAGGACATACCCTCGAATAGATCTTTGGACAATTGGTAGCCTTTGAAGAGGCTTATCATGAAACTTATGGTATGGGTGGTCAGGGAGTTCACCAGACGACGAGGACTGGTAGTGATCCATCTCGGGGTCGGAAAGATGAGGATCCCACGAGTTGTTTCATATGTGGTAGGTTTGGACACAAGGCCATGGAATGTTCCCTCCATGGGACTTTTTTATTGCAGCGACTTGAGCTGAGTAGTCAAGATTCAGGACAGATTCATCCAATTTTGCCTTCGGGTTCTCAAAACCTTTCTAATGATATCCGATCAGTAAGTAGAGGATGTGATAGACAGACTTATCAACCGCTGAGATTTCAACATCACGATCGATTGGGTCAGTACAGAGGCCAGAGCAGCCAGGGTAGCCAACTTGTTAGGGGTGCATCTTCGGGTTCAAGAGGTCGTGGTAGCCATTGTTG，如SEQ ID NO.1所示。

2.基于如权利要求1所述的一种鉴别酸浆的核苷酸序列设计的特异性标记引物ST5SJF/ST5SJR，其特征在于该特异性引物序列如下：

上游引物ST5SJF：5’-AGGGTGTGGGGCTTCTTTA-3’，如SEQ ID NO.2所示；

下游引物ST5SJR：5’-GGCTGCTCTGGCCTCTGTA-3，如SEQ ID NO.3所示。

3.一种鉴别酸浆的方法，其特征在于采用权利要求2所述的引物ST5SJF/ST5SJR作为特异性扩增引物，以待测酸浆属植物基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现463bp大小的特异性片段，则待测酸浆属植物样品为酸浆。

4.如权利要求3所述的一种鉴别酸浆的方法，其特征在于PCR扩增反应体系(总体积20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物ST5SJF(10μM)，1μl引物ST5SJR(10μM)，1μl模板DNA(50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，11.7μl ddH₂O。

5.如权利要求3所述的一种鉴别酸浆的方法，其特征在于PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性50s，61℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。