CN106148334A - 一种簇毛麦3v染色体的分子标记引物及其用途和pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了簇毛麦3V染色体的特异性分子标记引物，即TaGS5‑C‑1引物对，以及该引物对用于检测簇毛麦3V染色体的用途。此外，本发明还提供了基于该引物的检测簇毛麦3V染色体的PCR方法。

Description

一种簇毛麦3V染色体的分子标记引物及其用途和PCR方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及鉴定簇毛麦3V染色体的分子标记引物及其PCR方法。
背景技术
一年生二倍体簇毛麦(2n＝14,VV)是小麦重要的近缘种属，其1V-7V染色体上都携带多种抗性基因(De Pace C 2011)。其中，3V染色体上具有抗小麦全蚀病及眼斑病基因(DePace C 2011)。普通小麦中国春(CS)-一年生二倍体簇毛麦3V附加系具有优异的小麦条锈病抗性。为将簇毛麦3V染色体转移到小麦遗传背景中，并进一步在小麦遗传改良中利用簇毛麦3V染色体的优异抗性，簇毛麦3V染色体的准确鉴定与追踪成为重要工作。目前，一年生簇毛麦V基因组的特异标记已见大量报道(Liu et al,2003；Zhang et al,2013)，而簇毛麦3V染色体的特异分子标记还未见报道。簇毛麦V组特异只能检测簇毛麦遗传物质，并不能识别这些遗传物质来源于哪条染色体。因此，迫切需要开发簇毛麦3V特异标记，以使3V染色体上的优良性状能应用于小麦育种中。
建立分子标记是鉴定、追踪小麦近缘物种遗传物质的最为有效的方法。因此，建立簇毛麦3V染色体特异分子标记的主要技术为：根据麦类植物基因组共线性原理，查找前人报道的已定位于小麦第三同源群的基因及克隆该基因的引物，使用这些引物在簇毛麦中进行扩增，对在簇毛麦中扩增的片段进行克隆测序，并与小麦中的该基因相应区域进行比对。根据比对结果，明确该序列与小麦序列的低同源区域，根据低同源区的碱基序列设计SCAR引物。通过将此SCAR引物在小麦、簇毛麦、小麦-簇毛麦附加系及部分小麦近缘物种中进行扩增，以验证该SCAR引物对簇毛麦3V染色体的特异性。
由于基因在染色体上一般为单拷贝，因此，基于基因序列设计的引物只能检测染色体上该基因所在的特定区域，并不能检测染色体的全部区域。
SCAR，指特定序列扩增。SCAR标记是将特异标记片断从凝胶上回收并进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异引物(18-24碱基)，可特异扩增目标区域。
参考文献：
De Pace C,Vaccino P,Cionini P G,Pasquini M,Bizzarri M,Qualset CO.Dasypyrum.Kole C(eds)Wild crop relatives:genomic and breeding resources[C].Springer-Verlag,Berlin,German.2011,pp:185-291
Liu SB,Tang ZH,You MS,Li BY,Song JM,Liu GT.Development andapplication of a genome-specific PCR marker for Haynaldia villosa.ActaGenet.Sin.2003,30,350–356.
Zhang J,Long H,Pan Zhifen,Liang JJ,Yu SY,Deng GB,YuMQ.Characterization of a genome-specific Gypsy-like retrotransposon sequenceand development of a molecular marker specific for Dasypyrum villosum(L.).Journal of Genetics.92(2):103-108
发明内容
本发明目的包括：
提供一种特异性的分子标记引物；
提供一对针对簇毛麦3V染色体的分子标记引物，即特异SCAR标记引物；
提供该SCAR引物的用途，如鉴定小麦-簇毛麦异源材料中是否含有3V染色体的用途。
提供一种基于上述SCAR引物的PCR方法；以及该方法用于鉴定簇毛麦3V染色体的用途；
提供一种使用上述SCAR引物，鉴定簇毛麦3V染色体的PCR方法等。
本发明提供的簇毛麦3V染色体的分子标记引物，又称簇毛麦3V染色体的特异性分子标记引物或SCAR引物；该SCAR引物由引物1和引物2组成，其中引物1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，引物2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；序列表所示的核苷酸序列均从5‘端向3’端延伸。
本发明还提供了上述SCAR引物用于检测一年生二倍体簇毛麦3v染色体的用途；如鉴定小麦-簇毛麦异源材料中是否含有3V染色体的用途。
本发明SCAR引物的一种应用是，基于该SCAR引物的检测簇毛麦3V染色体的PCR方法，其反应体系包括：待检样品DNA、dNTPs、权利要求1所述的引物1和引物2、Taq plus聚合酶、10×PCR缓冲液、镁离子和双蒸水；
扩增程序包括：
步骤(1)94℃保持4分钟；
步骤(2)94℃保持1秒；
步骤(3)58℃保持30秒；
步骤(4)72℃保持30秒；
步骤(5)重复步骤(2)至步骤(4)35个循环；
步骤(6)72℃保持10分钟。
优选的，所述反应体系为：待检样品DNA 100-150ng、dNTPs 100μM、权利要求1所述的引物1 5pmol、权利要求1所述的引物2 5pmol、Taq plus聚合酶1U、10×PCR缓冲液2.5μL、镁离子1.5mM，加双蒸水加至终体积25μL。
有益效果
采用本发明公开的分子标记引物，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法，有效区分普通小麦、黑麦、簇毛麦1-2V、4-7V与簇毛麦的3V染色体。本发明提供的分子标记可用于在分子标记辅助选择育种过程中，快速、有效地追踪簇毛麦的3V染色体，有利于加快簇毛麦3V染色体上所携带的优良性状向受体品种的转移与利用，加速育种进程，提高新品质选育的效率。
附图说明
图1.基于簇毛麦3V染色体特异SCAR标记引物TaGS5-C-1的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
图中，箭头所指部分为特异的目标片段；
M.marker(Trans2k)；
1.簇毛麦；
2中国春-簇毛麦1V附加系；
3.中国春-簇毛麦2V附加系
4.中国春-簇毛麦3V附加系
5.中国春-簇毛麦4V附加系
6.中国春-簇毛麦5V附加系
7.中国春-簇毛麦6V附加系
8.中国春-簇毛麦7V附加系
9.中国春；
10.小麦品种川麦49；
11.小麦品种川麦50；
12.小麦品种川麦60；
13.荆州黑麦
具体实施方式
实施例一、簇毛麦3V染色体特异SCAR标记引物的合成
簇毛麦3V染色体特异SCAR标记引物TaGS5-C-1，由以下两条引物组成：F:5′-AGTTCCGAATCAAAACATAGTC-3′，即引物1,，如序列表SEQ ID NO.1的核苷酸序列所示；
R:5′-AAATCACAATCCTTCTTTATGC-3′，即引物2，如序列表SEQ ID NO.2的核苷酸序列所示。
可按照本领域常规方法合成，或由引物合成公司合成。
实施例二、检测簇毛麦3V染色体的PCR方法
检测簇毛麦3V染色体的方法包括如下步骤：
(1)、采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA，提取步骤如下：
1)取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0)15ml，混匀。
2)65℃水浴30-45min，其间轻摇混匀。冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10min。
3)取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA。
4)勾出DNA，用70％酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH 8.0的1×TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100μg/μl。
5)100V恒定电压下，1％琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测DNA浓度及质量。
(2)、PCR扩增：
反应体系如下：
PCR反应在PTC-200型PCR仪(MJ Research,U.S.A.)中进行。引物TaGS5-C-1扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳40分钟后，EB染色检测。结果如图1所示。由图可知，簇毛麦和小麦-簇毛麦3V附加系中能扩增出750bp的特异片段，而在普通小麦、小麦-簇毛麦1V、2V、4V-7V附加系及黑麦中则不能扩增出该片段。

Claims (5)

1.簇毛麦3V染色体的分子标记引物，由引物1和引物2组成；其中引物1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，引物2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的分子标记引物用于检测一年生二倍体簇毛麦3V染色体的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用途为鉴定小麦-簇毛麦异源材料中是否含有3V染色体的用途。
4.一种检测簇毛麦3V染色体的PCR方法，其反应体系包括：待检样品DNA、dNTPs、权利要求1所述的引物1和引物2、Taq plus聚合酶、10×PCR缓冲液、镁离子和双蒸水；
扩增程序包括：
步骤(1)94℃保持4分钟；
步骤(2)94℃保持1秒；
步骤(3)58℃保持30秒；
步骤(4)72℃保持30秒；
步骤(5)重复步骤(2)至步骤(4)35个循环；
步骤(6)72℃保持10分钟。
5.根据权利要求3所述的PCR方法，其特征在于，所述反应体系为：待检样品DNA 100-150纳克、dNTPs 100微摩、权利要求1所述的引物1 5皮摩、权利要求1所述的引物2 5皮摩、Taq plus聚合酶1个酶活单位、10×PCR缓冲液2.5微升、镁离子1.5微摩，加双蒸水加至终体积25微升。
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