CN104975108B - 华山新麦草Ns基因组特异分子标记引物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种华山新麦草Ns基因组特异分子标记引物及其使用方法，涉及生物基因工程领域，SCAR标记引物为Ph‑D15‑2，将SCAR标记引物进行PCR扩增。本发明的有益效果如下：获得更多的Ns基因组特异重复序列，将其转化为Ns基因组特异的SCAR标记，以补充现有Ns基因组特异标记的不完整性，以更有效准确地鉴定Ns基因组遗传物质。

Description

华山新麦草Ns基因组特异分子标记引物及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，特别涉及一种华山新麦草Ns基因组特异分子标记引物及其使用方法。

背景技术

华山新麦草(2n＝14，Ns)是小麦重要的近缘种属，携带多种抗性基因。有较多报道表明，已将华山新麦草遗传物质转移到小麦遗传背景中，为普通小麦提供必要的抗性资源。在华山新麦草遗传物质向小麦转移的过程中，华山新麦草遗传物质的准确鉴定与追踪是重要的而迫切的工作。目前，Du et al(2013)和Wang et al(2014)已利用RAPD技术克隆到Ns基因组的特异重复序列，并成功将其转化为更为稳定的SCAR标记，分别命名为RHS12及RHS141。经验证，这两条SCAR标记均可在华山新麦草亲本及小麦-华山新麦草1Ns-7Ns附加系中扩增出华山新麦草Ns基因组的特异片段，为华山新麦草优异性状向小麦遗传背景中的转移提供技术支持。

现有技术一的技术方案：

建立基因组特异分子标记是鉴定、追踪小麦近缘物种遗传物质的最为有效的方法。因此，建立华山新麦草Ns基因组特异分子标记的主要技术为：利用RAPD引物在华山新麦草、小麦及部分近缘物种中扩增获得华山新麦草Ns基因组特异条带，对该条带进行克隆测序，并在NCBI数据库中对该序列进行搜索、比对。根据比对结果，明确该序列与小麦及部分近缘物种相关序列的低同源区域，根据低同源区的碱基序列设计SCAR引物。通过将此SCAR引物在小麦、华山新麦草及部分小麦近缘物种或小麦-华山新麦草异源材料中的扩增，以验证该SCAR引物对华山新麦草遗传物质的特异性。

现有技术一的缺点：

由RADP随机引物扩增获得的条带多为重复序列，其中最为常见的为反转录转座子。反转录转座子根据其序列可分为多个家族。不同家族的反转录转座子，甚至是同一家族的反转录转座子在染色体上的拷贝数有高有低，且分布区域有一定的特异性，比如：仅分布于1Ns-7Ns染色体中的一条或几条染色体上，或仅分布于染色体臂近着丝粒区等。因此由一条RAPD扩增序列转化得到的稳定SCAR标记仅能鉴定、追踪到特异的华山新麦草Ns染色体(片段)，不能做到对每一条Ns染色体、一条Ns染色体的全部区域(近着丝粒区、染色体臂中部、染色体臂端部)进行鉴定和追踪。因此，需开发更多的SCAR标记以满足实践需要。

缩略语和关键术语定义

RAPD:随机扩增多态性DNA标记，利用10个碱基的随机引物，对供试材料进行扩增，获得多态性片段。

SCAR：特定序列扩增。通常是由RAPD、SRAP、SSR标记转化而来。SCAR标记是将特异标记片断从凝胶上回收并进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异引物(18-24碱基)，比RAPD标记更稳定。

发明内容

本发明是针对现有技术不能做到对每一条Ns染色体、一条Ns染色体的全部区域进行鉴定和追踪而提出的一种华山新麦草Ns基因组特异分子标记引物及其使用方法，本发明所提供的分子标记可作为现有技术的有益补充。

为补充完善以上问题，本发明采用的技术方案如下：一种华山新麦草Ns基因组特异分子的标记引物，SCAR标记引物为Ph-D15-2，其中所述的SCAR引物序列为：

F:5′-GGTAAAGGTGGTGGTTCGTAGT-3′

R:5′-TTTCTGGTGACATGGGTAGCA-3′。

为补充完善以上问题，本发明采用的另一个技术方案如下：一种华山新麦草Ns基因组特异分子的标记方法，将SCAR引物进行PCR扩增，具体方法如下：反应体系如下：

作为优选，PCR反应在PTC-200型PCR仪中进行。

本发明的有益效果:采用本发明公开的分子标记引物Ph-D15-2，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法，有效区分小麦及小麦育种中常见近缘种属(硬粒小麦、黑麦)与华山新麦草的遗传物质。本发明提供的分子标记可用于在分子标记辅助选择育种过程中，快速、有效地追踪华山新麦草的遗传物质，有利于加快华山新麦草优良性状向受体品种的转移与利用，加速育种进程，提高新品质选育的效率。

附图说明

图1为现有技术一的流程示意图；

图2为引物Ph-D15-2F和Ph-D15-2R对供试材料的扩增效果(箭头所指部分为特异的目标片段)；其中，1.华山新麦草；2.硬粒小麦J11；3.普通小麦中国春；4.黑麦。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举实施例，对本发明做进一步详细说明。

实施例：

(1)、采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA，此方法为现有技术，提取步骤如下：

1)取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0)15ml，混匀。

2)65℃水浴30-45min，其间轻摇混匀。冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10min。

3)取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA。

4)勾出DNA，用70％酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH 8.0的1×TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100μg/μl。

5)100V恒定电压下，1％琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测DNA浓度及质量。

(2)、PCR扩增：

反应体系如下：

PCR反应在PTC-200型PCR仪(MJ Research,U.S.A.)中进行。引物Ph-D15-2扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳40分钟后，EB染色检测。结果如图2所示。由图可知，华山新麦草中能扩增出特异片段，而在目前推广小麦品种遗传背景广泛包含的硬粒小麦、普通小麦及黑麦中则不能扩增出该片段。

华山新麦草Ns基因组特异分子SCAR标记引物为Ph-D15-2；

SCAR引物序列：F:5′-GGTAAAGGTGGTGGTTCGTAGT-3′(SEQ ID NO:1)

R:5′-TTTCTGGTGACATGGGTAGCA-3′(SEQ ID NO:2)。

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种华山新麦草Ns基因组特异分子标记引物，其特征在于，SCAR标记引物为Ph-D15-2，其中所述的SCAR引物序列为：

F:5′-GGTAAAGGTGGTGGTTCGTAGT-3′

R:5′-TTTCTGGTGACATGGGTAGCA-3′。

2.根据权利要求1所述的一种华山新麦草Ns基因组特异分子标记引物的使用方法，其特征在于，将SCAR引物进行PCR扩增，具体方法如下：

反应体系如下：

3.根据权利要求2所述的一种华山新麦草Ns基因组特异分子标记引物及其使用方法，其特征在于，PCR反应在PTC-200型PCR仪中进行。