CN1737151A - 一个与小麦抗白粉病基因Pm21连锁的共显性PCR标记及其用法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与小麦抗白粉病基因Pm21连锁的标记，可用于小麦白粉病抗病育种分子标记辅助选择，同时可用来鉴别普通小麦种子纯度。根据通过杨麦5号和易位系抑制性扣除杂交得到的抗病基因类似物Ta－LRR2序列设计引物NAU/ XiBao16F和NAU/ XiBao16R，经过一系列材料的验证，标记NAU/XiBao16与易位系6VS/6AL抗白粉病基因Pm21连锁，并且在一次PCR实验中可以同时扩增出来自普通小麦6AS和簇毛麦6VS染色体的两条专化带。标记NAU/XiBao16可以用于小麦白粉病抗病育种分子标记辅助选择，也可用来鉴别普通小麦种子纯度，尤其可用来鉴别细胞工程和染色体工程创造的涉及普通小麦第六同源群染色体6AS发生变异的材料。

Description

一个与小麦抗白粉病基因Pm21连锁的共显性PCR标记及其用法

一、技术领域

本发明公开了与小麦抗白粉病基因Pm21连锁的标记，可用于小麦白粉病抗病育种分子标记辅助选择；此标记同时可用来鉴别普通小麦种子纯度，尤其用来鉴别细胞工程和染色体工程创造的涉及普通小麦第六同源群染色体6AS发生变异的材料。

二、技术背景

小麦(T.aestivum L)作为世界性的重要的粮食作物，在农业生产中具有举足轻重的地位，但是其生产却受到很多生物胁迫和非生物胁迫的影响。由专性寄生真菌小麦白粉病菌(Erysiphegraminis DC)引起的小麦白粉病(Ergsiphe greminis f.sp.tritici)是中国和世界上许多国家小麦生产中危害日趋严重的病害之一，并且随着肥水条件的改善，近年有不断加重的趋势。

普通小麦(T.aestivum L)有21对染色体，每对包含两条一样的染色体，这21条染色体通常表示为1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D、7A、7B、7D，普通小麦通常直接用AABBDD来表示(图8)。簇毛麦(Haynaldia villosa L)有7对染色体，每对包含两条一样的染色体，这7条染色体分别为1V、2V、3V、4V、5V、6V、7V，簇毛麦通常用VV来表示(图9)。普通小麦和簇毛麦的每条染色体又包含长臂和短臂，分别用L和S表示，比如簇毛麦6V染色体包括长臂6VL和短臂6VS。

我国原有的小麦品种大部分都含有Pm8抗源，但是随着白粉菌小种的不断变化，Pm8已经逐渐失去了抗性，寻找和利用新的抗白粉病病基因对于我国小麦生产的安全性有重要意义。南京农业大学细胞遗传所从上世纪80年代初起就致力于把簇毛麦(Haynaldia villosa L)中的优异基因通过染色体工程技术转入普通小麦，得到了高抗白粉病的涉及簇毛麦6V染色体易位系和添加缺失系(见参考文献：1、Chen PD，Qi LL Zhou B，et al.Development and molecular cytogenetic analysis ofwheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew.TheorAppl Genet，1995，91：1125-1128.2、L.L.Qi，S.L.Wang，PD.Chen，D.J.Liu，B.S.Gill 1998Identification and physical mapping ofthree Haynaldia villosa chromosome-6V deletion lines TAG97：1042-1046)。其中小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL就是把普通小麦6A染色体短臂6AS代换成簇毛麦6V染色体短臂6VS，形成一条易位染色体，这条染色体由6AL和6VS组成，用6VS/6AL表示这条易位染色体。纯合的小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL与普通小麦相比，两条6A染色体变成了两条6VS/66VS/6AL染色体(图11)；杂合的小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL与普通小麦相比，只有一条6A染色体变成了6VS/6AL染色体，还保存一条6A(6AS/6AL)染色体(图12)。经分子细胞遗传学的进一步研究，簇毛麦中的抗白粉病基因Pm21被定位于簇毛麦染色体短臂6VSFL0.58区段内(见参考文献：L.L.Qi，S.L.Wang，PD.Chen，D.J.Liu，B.S.Gill 1998 Identification and physical mapping ofthree Haynaldia villosa chromosome-6V deletion lines TAG 97：1042-1046)。由于6VS染色体与普通小麦染色体亲源关系比较远，与普通小麦染色体发生交换比较难，目前还未发现与普通小麦染色体发生交换的现象。所以目前携带Pm21基因的材料都携带6VS染色体。Pm21是目前为止对白粉病抗性最强、抗谱最广的基因，能抗中国现有的所有白粉病菌的菌系或小种及120个欧洲生理小种，为了在小麦育种中更好地利用这一抗病基因资源，将其通过基因聚合或者转基因的方式导入不同农艺性状的优良品种是当务之急。但是要在同一个群体中同时检测到多个聚合的基因，传统的常规育种方法很难胜任，因此找到与目标基因紧密连锁的分子标记就变得非常重要了，并且分子标记对于这一基因的克隆和转化来说也是必不可少的。

小麦中已经找到了一些与抗白粉病Pm21基因相关的分子标记：RAPD以及SCAR(见参考文献：QiLL，Cao MS，Chen PD，Li WL，Liu DJ(1996).Identification，mapping，and appli-cation ofpolymorphic DNA associated with resistance gene Pm21of wheat.Genome 39，191-197Liu ZY，Sun QX，Ni ZF et al(1999).Development of SCAR markers linked with Pm21gene conferringresistance to the powdery mildew in common wheat.Plant Breeding 118，215-219)。在这些标记中RAPD标记方便但很不稳定，SCAR标记虽然方便而且稳定但是却是一个显性标记，不能区分出6AS/6VS这条染色体处于纯合或杂合状态。

利用Pm21基因来进行抗白粉病育种的时候，育种单位用的亲本大多是南京农业大学细胞遗传所发放的小麦-簇毛麦易位系(6VS/6AL)，已经有几个品种经过了品种审定，还有很多品系处于审定过程中。由于6VS染色体与6AS染色体不交换，所以种子中携带Pm21基因的植株都携带6VS/6AL染色体。无论在品种选育过程中或是品种在生产使用过程中，6VS/6AL这条染色体处于纯合状态都很重要，否则后代白粉病抗性就会发生分离，而这恰恰是利用这个材料作为亲本进行育种的目标。另外，品种在生产上使用时其纯度要得到保证，对于利用小麦-簇毛麦易位系(6VS/6AL)作为亲本选育出来的高抗白粉病小麦品种，可以利用6VS/6AL染色体处于纯合状态的种子占的比例作为种子纯度的一个重要指标。但是，利用SCAR₁₄₀₀和SCAR₁₂₆₅进行分子标记辅助选择或鉴定种子纯度时，只能明确材料中是否含有6VS/6AL染色体，而这条染色体是处于纯合或杂合状态却无法得知。所以，寻找一种不仅对6VS专化而且还能够区分其纯合或杂合状态的标记，从而确定Pm21基因纯合或杂合状态，不仅可以提高分子标记辅助选择效率，而且在检测种子纯度时也可以发挥很大的作用。

本实验室在克隆Pm21基因的过程中试图寻找基于PCR的能同时在一次PCR反应中鉴别第六群染色体6AS和6VS的标记，用于可鉴别普通小麦种子纯度。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于提供基于PCR的与Pm21连锁的分子标记，并且用该引物在一次PCR反应中通过扩增出的带型能同时专化性地鉴别普通小麦第六同源群染色体6AS，从而确定Pm21基因的纯合或杂合状态，该引物还能够用来鉴定普通小麦种子纯度。此标记不仅可以用来提高分子标记辅助选择效率，而且在检测种子纯度和鉴定涉及第六同源群染色体6AS发生变异的材料时也可以发挥很大的作用。

技术方案

本发明与Pm21连锁并可鉴别普通小麦种子纯度的标记，其特征在于，该引物是以抗病基因类似物Ta-LRR2序列为模板设计而得到的。其序列为：NAU/XiBao16F：5′-GTAGACAGTGCCGCTATTTC-3′和NAU/XiBao16R：5′-CAACTCATGTGTCCAGTTCA-3′。该标记从簇毛麦中扩增出的1586bp的片段位于6VS染色体距着丝粒FL0.58区段内，从普通小麦扩增出的1882bp特异带位于6AS上距着丝粒FL0.34的远端区段。

上述标记的使用方法：

(1)以待鉴定材料DNA作为模板，用NAU/XiBao16F和NAU/XiBao16R作为引物进行PCR，

PCR试剂组成为：DNA模板2μL，2.5μL10×PCR buffer，1.8μLMgCl₂，2μLdNTP，左右引物各0.5μL，0.25μL Taq DNA polymerase，16μL d.d H₂O；

PCR程序为：94℃预变性3；94℃变性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分钟，32个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存，PCR产物在非变性的聚丙烯酰胺39∶1胶上电泳分离，用银染法进行染色。

(2)标记鉴定Pm21基因的结果为：能扩增出1586bp片段特异带的单株携带Pm21基因，其Pm21基因位于簇毛麦6VS染色体上；不能扩增出902bp片段特异带的则不携带Pm21基因。

(3)标记鉴定单株的抗病染色体6VS/6AL纯合或杂合状态的结果为：

能扩增出1507bp、1886bp和1586bp三条带的植株，其抗病染色体6VS/6AL处于杂合状态：1507bp带来自于普通小麦BBDD染色体组，并且这些染色体都是成对存在；1886bp的条带来自染色体6AS，1586bp的条带来自6VS，表明该单株中同时存在染色体6AS/6AL和抗病染色体6VS/6AL，抗病染色体6VS/6AL不能成对存在，处于杂合状态。

能扩增出1507bp和1586bp两条带的植株的抗病染色体6VS/6AL处于纯合状态：来自6AS染色体的1886bp的带扩增不出来，6AS染色体就不存在，所以6VS/6AL染色体成对存在，处于纯合状态。

该标记检测携带Pm21基因种子纯度的方法：首先从待检测种子中随机挑选单粒种子，利用标记鉴定单粒种子的6VS/6AL染色体纯合或杂合状态，再统计6VS/6AL染色体处于纯合状态的种子在检测种子总量中所占比例，即为种子纯度指标。本发明与已有技术相比较的优点及有益效果：

1、本发明分子标记NAU/XiBao16与Pm21基因的连锁更紧密。由于引物NAU/XiBao16F和NAU/XiBao16R在簇毛麦中扩增出来的带和Pm21基因同时位于6VS染色体距着丝粒FL0.58区段内，而且6VS与普通小麦染色体不发生交换，所以NAU/XiBao16可以作为白粉病抗性基因Pm21的分子标记来使用，并且分析此引物扩增出来的序列发现其推倒的氨基酸中含有抗病基因保守结构域亮氨酸重复(LRRs)，而抗病基因一般都是以基因家族的形式存在于染色体上(见参考文献：Baker Barbara，Zambryski Patricia，Staskawicz Brian，Dinesh-Kumar SP(1997).Sig-naling inPlant-Microbe Interactions.Science 276，726-733.Geffroy V，Sicard D，De Oliveira JC et al.(1999).Identification of an ancestral resistance gene cluster involved in the coevolution process betweenPhaseolus vulgaris and its fungal pathogen Colletotrichum lindemuthianum.Mol Plant-Microbe Interact12，774-784.)，因此NAU/XiBao16扩增出来的基因片段可能就是Pm21基因家族的一部分，所以该标记与Pm21基因连锁程度比标记SCAR₁₄₀₀和SCAR₁₂₆₅与Pm21基因连锁程度更高。

2、本发明分子标记NAU/XiBao16在鉴定普通小麦6AS与簇毛麦6VS染色体时更高效。分子标记NAU/XiBao16能在6AS和6VS上扩增出大小不同的两条带，这两条带可以特异性追踪这两条染色体。在以往的研究中，往往需要用几个标记来确定材料中含有这两条染色体中的哪一条，而用分子标记NAU/XiBao16在一次PCR反应中就可以达到鉴别这两条染色体的目的。在用小麦-簇毛麦易位系(6VS/6AL)作为亲本进行抗白粉病育种时，用NAU/XiBao16来进行分子标记辅助选择，不仅可以鉴定材料中是否含有6VS/6AL，还可以鉴定6VS/6AL染色体是否处于纯合状态，这样可以大大提高育种的选择效率。

3、本发明分子标记NAU/XiBao16在鉴定抗病染色体6VS/6AL纯合或杂合状态时更方便快捷、经济。使用SCAR₁₄₀₀和SCAR₁₂₆₅这两个分子标记时，只要材料中含有6VS染色体就能扩增出相应的特异带，不能区分6VS/6AL处于纯合或杂合状态。以往鉴定材料中6VS/6AL染色体是否处于纯合状态，往往是采用根尖有丝分裂中期染色体C-分带技术或者原位杂交技术来进行，这两种技术不但实验技术烦琐，而且花费很高，所以在大量鉴定材料时使用具有局限性。如果使用NAU/XiBao16进行分子标记辅助选择，可以很方便快捷地鉴定以小麦-簇毛麦易位系(6VS/6AL)和普通小麦为亲本的后代材料中6VS/6AL染色体是否为纯合状态。

4、在用细胞工程或染色体工程创建育种材料时，可以用NAU/XiBao16标记来鉴别普通小麦第六同源群染色体6AS发生变异的材料。

四、附图说明

图1：用扬麦5号、易位系(6VS/6AL)、簇毛麦DNA作为模板，用本发明中的引物NAU/XiBao16进行PCR扩增，含有簇毛麦和易位系都能扩增出一条共同分子量1586bp的带，而普通小麦扬麦5号缺乏这条带，因此推测这条1586bp条带位于6VS上。

图2：用普通小麦中国春分别添加簇毛麦1V、2V、3V、4V、5V、6V、7V染色体的7个材料DNA以及簇毛麦6V染色体代换了普通小麦6A染色体的代换系DNA为模板，用本发明中的引物NAU/XiBao16进行PCR扩增，结果显示只有6V染色体存在的材料能扩增出与簇毛麦一样的1586bp的带，说明这条1586bp的带位于簇毛麦6V上。

图3：用普通小麦6V添加缺失系de16V#2S-1DNA作为模板，用本发明中的引物NAU/XiBao16进行PCR扩增，结果表明6V上的1586bp带仍然存在，6VS上的带位于着丝粒与FL0.58区段之间。图4：用普通小麦中国春的一套缺体四体(N1A/T1D，N1A/T1B，N1B/T1A，N1B/T1D，N1D/T1A，N1D/T1B，N2A/T2B，N2A/T2D，N2B/T2A，N2B/T2D，N3A/T3B，N3A/T3D，N3B/T3A，N3B/T3D，N4A/T4B，N4A/T4B，N4B/T4A，N4B/T4D，N4D/T4A，N4D/T4B，N5A/T5B，N5A/T5D，N5B/T5A，N5B/T5D，N5D/T5A，N5D/T5B，N6A/T6B，N6A/T6D，N6B/T6A，N6B/T6D，N6D/T6A，N6D/T6B，N7A/T7B，N7A/T7D，N7B/T7A，N7B/T7D，N7D/T7A，N7D/T7B)的DNA为模板进行PCR，用本发明中的引物NAU/XiBao16进行PCR扩增，结果表明缺6A的材料少了一条1886bp的带，根据结果可以推测1886bp的带位于6A染色体上。

图5：用扬麦5号、簇毛麦、硬簇麦(AABBVV)(硬簇麦由硬粒小麦AABB和簇毛麦VV人工合成)、一粒小麦、拟斯卑尔托山羊草、节节麦、提莫非维小麦、圆锥小麦以及6VS/6AL易位系和6VS/6DL易位系DNA未模板，用本发明中的引物NAU/XiBao16进行PCR扩增，结果表明扬麦5号、6DL/6VS易位系、硬粒小麦-簇毛麦双二倍体、一粒小麦、提莫非维小麦以及圆锥小麦中都存在1886bp这条带，但是在6VS/6AL易位系以及其它不含有AA基因组的麦类作物：簇毛麦、拟斯卑尔托山羊草和节节麦中却不存在，这进一步说明1886bp的带位于6AS染色体上。

图6：用中国春缺失系DNA作为模板，以本发明中的引物NAU/XiBao16进行PCR扩增，缺失系6AS-1扩增出的带少了一条1886bp的带，1886bp带位于FL0.35染色体远端。

图7：用扬麦5号×小麦-簇毛麦易位系(6VS/6AL)F2群体单株DNA为模板，用本发明中的引物NAU/XiBao16进行PCR扩增的结果。含有1586bp带的材料田间鉴定全部抗白粉病，不含1586bp带的材料全部感病。同时具有1886bp带和1586bp带的易位系是杂合易位；只有1586bp带而不具有1886bp带的材料为纯合易位系。

图8：普通小麦染色体示图

图9：簇毛麦染色体示图

图10：小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL其染色体6VS/6AL为纯合时的示图

图11：小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL其染色体6VS/6AL为杂合时的示图

图12：以易位系第一链cDNA为模板进行RT-PCR扩增得到的全长Ta-LRR2基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。红色部分的表示起始子和终止子。

图13：Ta-LRR2基因推导的氨基酸序列与水稻、拟南芥以及玉米LRR基因氨基酸序列比较结果。上划线表示LRR单元所在位置，黑体子部分表示抗病基因保守结构域LRR单元的氨基酸残基，数字表示LRR单元的个数。LRR单元常见结构为：axxaxaxx，其中a表示任何脂肪类氨基酸残基如I，F L，M，A或V；X表示任意残基。星号和黑点分别表示四个物种LRR基因氨基酸序列比较后相同和相似的氨基酸。。

五、具体实施方式

1、筛选位于6VS染色体上的抗病基因类似物

抗白粉病6VS/6AL易位系与扬麦5号回交7代，得到背景与扬麦5号接近的易位系，将此易位系和亲本扬麦5号在盆钵中栽培，并用透明胶片制成的罩子隔离，以防外界杂菌污染。植株长到二叶期时，用白粉病混合菌种对易位系进行抖落法接种，分别诱导6h和12h，而扬麦5号不经白粉病菌诱导。然后取诱导后的易位系叶片与没诱导的扬麦5号叶片提取RNA，分别构建以易位系叶片RNA为Tester，扬麦5号RNA为Driver的正向抑制性扣除杂交(SSH)文库以及扬麦5号RNA为Tester，易位系叶片RNA为Driver的反向SSH文库，以反向文库cDNA为探针筛选正向SSH文库，得到杂交信号、有表达量差异的阳性克隆，序列分析结果表明其中一个为抗病基因类似物(图13)，该基因片段作为Pm21的侯选基因，可能位于6VS染色体上。

2、根据筛选的抗病基因类似物开发基于PCR的分子标记

以上述得到的序列片段作探针搜索小麦表达序列标签(EST)数据库(http:∥www.graingenes.org)，得到三个与之高度同源的ESTs序列，通过电子拼接后形成全长序列，并根据此拼接的序列用Primer3软件(http:∥www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)设计引物NAU/XiBao16F：5′-GTAGACAGTGCCGCTATTTC-3′和NAU/XiBao16R：5′-CAACTCATGTGTCCAGTTCA-3′，以易位系cDNA为模板进行扩增得到了全长基因(图12)，并将此基因命名为Ta-LRR2，根据此序列推导的氨基酸序列具有抗病基因保守结构域(图13)。

以普通小麦扬麦5号(AABBDD)(公知公用，引自扬州里下河农科所)、小麦-簇毛麦易位系(6VS/6AL)(公知公用，南京农业大学细胞遗传实验室对外提供)、簇毛麦(VV)的DNA为模板，以NAU/XiBao16F和NAU/XiBao16R为引物进行PCR扩增。PCR试剂组成：DNA模板2μL(50-100ng)，2.5μL10×PCR buffer，1.8μLMgCl₂，2μLdNTP(2.5mmoL/L)，各0.5μL左右引物(10mmol/L)，0.25μL Taq DNA polymerase(5u/μL)，16μL d.d H₂O。PCR程序为：94℃预变性3；94℃变性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分钟，33个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。PCR产物经8％的聚丙希酰胺(39∶1)凝胶电泳银染后表明易位系(6VS/6AL)和簇毛麦有一条共同的分子量为1586bp的带，而扬麦5号缺乏这条带(图1)。以普通小麦中国春中分别添加簇毛麦1V-7V染色体的添加系以及代换系(公知公用，见Sears，E.R.1953.Addition of the genome ofHaynaldia villosa to Triticum aestivum.Am.J.Bot.40：168-174.)DNA为模板，进行相同条件的PCR和电泳，结果表明6V染色体存在的材料能扩增出了分子量为1586bp特异带，说明1586bp这条带是从6VS上扩增得到的(图2)。进一步以小麦一簇毛麦6V添加缺失系de16V#2S-1(见参考文献：Lili Qi，Mingshu Cao，Peidu Chen，Wanlong Li and Dajun Liu.Identification，mapping，andapplication of polymorphic DNA associated with resistance gene Pm21 of wheat.Genome39：191-197，1998)的DNA作为模板进行PCR，仍然可以扩增出这条带(图3)，结合小麦-簇毛麦6V添加缺失系的缺失断点研究结果表明6VS上的这条1586bp产物位于6VS距着丝粒FL 0.58的区段，由于del6V#2S-1田间鉴定仍然抗病，所以Pm21和1586bp条带位于染色体6VS的同一个区域。

以中国春的42个缺体四体系(公知公用，见参考文献：KM Devos，ME Sorrells，JA Anderson，TE Miller，SM Reader，AJ Lukaszewski，J Dubcovsky，PJ Sharp，J Faris，MD Gale.1999.Chromosomeaberrations in wheat nullisomic-tetrasomic and ditelosomic lines.Cereal Research Communications27：231-239)的DNA为模板，进行相同条件的PCR和电泳，缺6A的材料中扩增出的带少了一条1886bp的带(图4)。结果表明从普通小麦扩增出来的1886bp的带为6A染色体上的。用扬麦5号、簇毛麦、硬簇麦(AABBVV)(硬簇麦由硬粒小麦AABB和簇毛麦VV人工合成)、一粒小麦、拟斯卑尔托山羊草、节节麦、提莫非维小麦、圆锥小麦以及6VS/6AL易位系和6VS/6DL易位系DNA为模板，用本发明中的引物NAU/XiBao16进行PCR扩增，结果表明扬麦5号、6DL/6VS易位系、硬粒小麦-簇毛麦双二倍体、一粒小麦、提莫非维小麦以及圆锥小麦中都存在1886bp这条带，但是在6VS/6AL易位系以及其它不含有AA基因组的麦类作物：簇毛麦、拟斯卑尔托山羊草和节节麦中却不存在，这进一步说明1886bp的带位于6AS染色体上。

以中国春6A染色体的部分缺失系(即染色体缺失了靠染色体端部的一部分，公知公用，见参考文献Endo TR，Gill BS.The deletion stocks ofcommon wheat.Heredity 87：295-307，1996)DNA为模板，进行相同的PCR，产物在8％的聚丙希酰胺(39∶1)凝胶上电泳。结果表明以中国春缺失体6AS-1为模板扩增到的PCR产物少了1886bp的带。根据缺失系的图谱，1886bp这条带位于6AS上距着丝粒FL0.34的染色体远端(图5)。

3、用标记NAU/XiBao16检测扬麦5号(公知公用品种)×小麦-簇毛麦易位系F2群体

以NAU/XiBao16F和NAU/XiBao16R为引物，扬麦5号×小麦-簇毛麦易位系的F2代33个单株DNA为模板进行PCR，结果表明田间鉴定抗病的单株9-33都能扩增出6VS上的特异带，田间鉴定感病单株1-8都不能扩增出6VS上的特异带(图7)，并且抗感病比例接近3∶1。说明能否扩增出6VS上的特异带与抗感病直接相关，并且该引物能作为Pm21基因紧密连锁的分子标记使用。

抗病单株的扩增带型又可以分成两种类型，一类能扩增出三条带，如单株19-33，这三条带从大到小分别是6AS(1886bp)、6VS(1586bp)以及BBDD染色体(1509bp)上的，扩增出这种带型的单株只携带一条6VS/6AL易位染色体；另一类只能扩增出两条带，如9-18，这两条带从大到小分别是6VS(1586bp)以及BBDD染色体(1509bp)上的，6AS上的带没有扩增出，能扩增出这种带型的单株携带两条6VS/6AL易位染色体。这个结果表明NAU/XiBao16标记不但可以鉴定扬麦5号×小麦-簇毛麦易位系的F2代各单株是否携带6VS/6AL易位染色体，而且还能鉴定该染色体的纯合或杂合状态。

Claims (6)

1、与小麦抗白粉病基因Pm21连锁的标记，其特征在于，该引物是以抗病基因类似物Ta-LRR基因序列为模板设计而得到的。

2、根据权利要求1所述与小麦抗白粉病基因Pm21连锁的标记，其序列为：

NAU/XiBao 16F：5′-GTAGACAGTGCCGCTATTTC-3′和

NAU/XiBao 16R：5′-CAACTCATGTGTCCAGTTCA-3′

3、根据权利要求1或2所述与Pm21连锁并可鉴别普通小麦种子纯度的标记，其特征在于：该引物从簇毛麦中扩增出的1586bp的片段位于6VS染色体距着丝粒FL0.58区段内，从普通小麦扩增出的1886bp的带可以专化地追踪6AS，并位于6AS染色体臂上距着丝粒FL0.34远端。

4、权利要求1～3之一所述与小麦抗白粉病基因Pm21连锁的标记的用法：1)待鉴定材料DNA作为模板，用NAU/XiBao16F和NAU/XiBao16R作为引物进行PCR，

PCR试剂组成为：DNA模板2μL，2.5μL10xPCR buffer，1.85μLMgCl₂，2μLdNTP，左右引物各0.5μL，0.25μL Taq DNA polymerase，16μL d.d H₂O；

PCR程序为：94℃预变性3；94℃变性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分钟，33个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存，PCR产物在非变性的聚丙烯酰氨39∶1胶上电泳分离，在用银染法进行染色；

2)标记鉴定Pm21基因的结果为：能扩增出1586bp片段特异带的单株携带Pm21基因，其Pm21基因位于簇毛麦6VS染色体上；不能扩增出1586bp片段特异带的则不携带Pm21基因。

5、根据权利要求4所述与小麦抗白粉病基因Pm21连锁的标记的用法，其特征在于，

能扩增出1886bp、1509bp和1586bp三条带的植株的抗病染色体6VS/6AL处于杂合状态：1509bp带是普通小麦BBDD染色体组扩增出来的；1886bp的条带来自染色体6AS；1586bp的条带来自抗病染色体6VS；表明该单株中同时存在染色体6AS/6AL和抗病染色体6VS/6AL，抗病染色体6VS/6AL不成对存在，处于杂合状态；

能扩增出1586p和1509bp两条带的植株的抗病染色体6VS/6AL处于纯合状态：来自6AS染色体的1886bp的带扩增不出来，6AS染色体就不存在，所以6VS/6AL染色体成对存在，处于纯合状态；用以鉴定单株的抗病染色体6VS/6AL纯合或杂合状态。

6、根据权利要求4或5所述与小麦抗白粉病基因Pm21连锁标记的用法，其特征在于，

用该标记检测携带Pm21基因种子纯度的方法：首先从待检测种子中随机挑选单粒种子，利用标记鉴定单粒种子的6VS/6AL染色体纯合或杂合状态，再统计6VS/6AL染色体处于纯合状态的种子在检测种子总量中所占比例，即为种子纯度的指标。

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