CN112410451A - 二倍体簇毛麦3v染色体特异kasp标记检测用引物、检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二倍体簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物、检测方法及应用，所述簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物的核苷酸序列为：F1:5’‑GAAGGTGACCAAG TTCATGCTGAGCAGGCTGTCGAAGCTA‑3’；F2:5’‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCAGGCTGTCGAAGCTC‑3’；R:5’‑TGGAGCACGAGGGTGTGA‑3’。利用本发明的标记可高效在普通小麦CS背景中检测到簇毛麦3V染色体，为将3V染色体上的优良性状应用于小麦育种中提供了基础。

Description

二倍体簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物、检测方法 及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种二倍体簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物、检测方法及应用。

背景技术

SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)是指基因组DNA序列上单个碱基的变异所引起的DNA序列多态性，这种变异主要是由单个碱基的转换、颠换所致，数量极多、多态性丰富、具二态性、易于检测和统计、可实现高通量自动化操作检测。随着二代测序(NGS,next generation sequencing)技术的成熟，SNP的开发和检测变得越来越容易，也因此SNP分子标记已快速应用到各个生物研究领域，被视为最重要、最有应用前景的一种标记。竞争性等位基因特异性PCR(KASP,kompetitive allele specific PCR)技术是由英国LGC公司开发的新一代高通量自动化SNP检测技术，现已成为国际上SNP分型以及插入缺失变异(InDel,Insertion or Deletion)检测的主要方法之一。相较于传统的基于PCR的分子标记检测技术以及其他SNP分子标记检测技术，KASP技术只需合成两个带有不同颜色的荧光基团和双链通用的探针，不需要针对每个SNP位点分别设计荧光探针，具有高通量、准确、省时、便捷、低成本的特点，实现了更加灵活的检测。目前，已成功用于包含小麦、水稻、玉米等大宗粮食作物在内的，超过100多个物种的基因分型、遗传多样性分析、指纹图谱构建等方面。

一年生二倍体簇毛麦(2n＝14,VV)是小麦重要的近缘种属，其1V-7V染色体上都携带多种抗性基因。其中，3V染色体上具有抗小麦全蚀病及眼斑病基因。同时，申请者发现，本实验室保存的普通小麦中国春(CS)-一年生二倍体簇毛麦3V附加系具有优异的小麦条锈病抗性。为将簇毛麦3V染色体转移到小麦遗传背景中，并进一步在小麦遗传改良中利用簇毛麦3V染色体的优异抗性，簇毛麦3V染色体的高通量鉴定与追踪成为重要工作。

现有技术中利用RNA-seq测序结果，与小麦基因组数据库进行比对，获得检测簇毛麦3V染色体特异的标记。但这些标记基于目标片段多态性设计而来，主要通过PCR和电泳进行检测，耗时耗力。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种二倍体簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物、检测方法及应用，为进一步在小麦遗传改良中利用簇毛麦3V染色体的优异抗性提供了基础。

本发明采用的技术方案如下：

一种二倍体簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物，引物的核苷酸序列如下：

上游引物F1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCAGGCTGTCGAAGCTA-3’；

上游引物F2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCAGGCTGTCGAAGCTC-3’；

下游引物R:5’-TGGAGCACGAGGGTGTGA-3’。

采用上述引物检测二倍体簇毛麦3V染色体的方法，包括步骤如下：

S1.提取待测植株的DNA；

S2.以待测植株的DNA为模板，利用权利要求1所述引物对其进行PCR扩增反应；

S3.KASP法检测PCR扩增产物并分析。

进一步地，PCR扩增反应体系如下：

进一步地，，PCR反应程序如下：

(1)94℃ 保持15分钟；

(2)94℃ 保持20秒；

(3)57℃ 保持60秒；

重复(2)至(3)10个循环，其中(3)每个循环降低0.6℃；

(4)94℃ 保持20秒；

(5)55℃ 保持60秒；

重复(4)至(5)26个循环。

进一步地，在26个循环后再进行如下程序：

(6)94℃ 保持20秒；

(7)57℃ 保持60秒；

重复(6)至(7)5个循环。

上述的二倍体簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物在簇毛麦3V染色体的高通量鉴定与追踪中的应用。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明的方法在选择育种过程中，能够快速有效地对簇毛麦的3V染色体进行高通量鉴定与追踪，有利于加快簇毛麦3V染色体上所携带的优良性状向受体品种的转移与利用，并进一步在小麦遗传改良中利用簇毛麦3V染色体的优异抗性，加速育种进程，提高新品质选育的效率；

2、本发明的检测方法普通小麦中国春(CS)的荧光信号，簇毛麦亲本ZC6的荧光信号，小麦-簇毛麦3V(3D)附加系的信号，三个材料分型明显，荧光信号存在多态性；该KASP标记可有效检测小麦背景中的簇毛麦3V染色体，且该标记能在小麦-簇毛麦3V(3D)附加系上呈共显性表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为簇毛麦3V染色体特异KASP标记对CS、CS-簇毛麦3V附加系及簇毛麦ZC6的检测结果图；

图中，(左上)红色信号(X轴方向)为CS信号分布，(中间)绿色信号为CS-簇毛麦3V附加系信号分布，(右下)蓝色信号为簇毛麦ZC6信号分布，(左下)黑色为空白对照。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明较佳实施例提供的一种二倍体簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物，所述引物的核苷酸序列如下：

上游引物F1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCAGGCTGTCGAAGCTA-3’；

上游引物F2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCAGGCTGTCGAAGCTC-3’；

下游引物R:5’-TGGAGCACGAGGGTGTGA-3’。

实施例2

本发明基于上述实施例1提供的采用上述引物检测二倍体簇毛麦3V染色体的方法，包括如下步骤：

1、采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA，提取步骤如下：

1)取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0)15ml，混匀。

2)65℃水浴30-45min，其间轻摇混匀。冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10min。

3)取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA。

4)勾出DNA，用70％酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH 8.0的1×TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100ng/μl。

2、PCR扩增：

反应体系如下：

PCR反应程序：

(1)变性94℃ 保持15分钟；

富集含有SNP位点的模板DNA：

(2)94℃ 保持20秒；

(3)57℃ 保持60秒；

重复(2)至(3)10个循环，其中(3)每个循环降低0.6℃；

荧光信号放大：

(4)94℃ 保持20秒；

(5)55℃ 保持60秒；

重复(4)至(5)26个循环；

如果分型不明显，增加：

(6)94℃ 保持20秒；

(7)57℃ 保持60秒；

重复(6)至(7)5个循环。

3、荧光信号的读取。

待KASP检测PCR反应程序结束后，将384孔板放置到Omega荧光信号阅读仪上将荧光信号转变为可分析的数值，然后用LGC公司提供的分析软件KrakenTM进行基因型分析。

结果如图1所示。由图可知，普通小麦中国春(CS)的荧光信号(红色)在Y轴分型，簇毛麦亲本ZC6的荧光信号(蓝色)在X轴分型，小麦-簇毛麦3V附加系的信号在X轴和Y轴之间分型(绿色信号)，三个材料分型明显，即：若等位型为a/a(蓝色)，则为簇毛麦亲本ZC6；若等位型为c/c(红色)，则为普通小麦CS；若等位型为a/c(绿色)，则为其后代CS-簇毛麦附加系。表明该KASP标记可有效检测小麦背景中的簇毛麦3V染色体，且该标记能在小麦-簇毛麦3V附加系上呈共显性表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

四川省农业科学院生物技术核技术研究所

中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司

<120> 二倍体簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物、检测方法及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tgagcaggct gtcgaagcta 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tgagcaggct gtcgaagctc 40

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggagcacga gggtgtga 18

Claims (6)

1.一种二倍体簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：

上游引物F1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCAGGCTGTCGAAGCTA-3’；

上游引物F2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCAGGCTGTCGAAGCTC-3’；

下游引物R:5’-TGGAGCACGAGGGTGTGA-3’。

2.采用权利要求1所述引物检测二倍体簇毛麦3V染色体的方法，其特征在于，包括步骤如下：

S1.提取待测植株的DNA；

S2.以待测植株的DNA为模板，利用权利要求1所述引物对其进行PCR扩增反应；

S3.KASP法检测PCR扩增产物并分析。

3.根据权利要求2所述的二倍体簇毛麦3V染色体检测方法，其特征在于，PCR扩增反应体系如下：

4.根据权利要求3所述的二倍体簇毛麦3V染色体检测方法，其特征在于，PCR反应程序如下：

(1)94℃ 保持15分钟；

(2)94℃ 保持20秒；

(3)57℃ 保持60秒；

重复(2)至(3)10个循环，其中(3)每个循环降低0.6℃；

(4)94℃ 保持20秒；

(5)55℃ 保持60秒；

重复(4)至(5)26个循环。

5.根据权利要求4所述的二倍体簇毛麦3V染色体检测方法，其特征在于，在26个循环后再进行如下程序：

(6)94℃ 保持20秒；

(7)57℃ 保持60秒；

重复(6)至(7)5个循环。

6.权利要求1所述的二倍体簇毛麦3V染色体特异KASP标记检测用引物在簇毛麦3V染色体的高通量鉴定与追踪中的应用。

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