CN105950617B - 与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记、获得方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记，同时还提供了获得与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的方法。本发明提供的分子标记具有很强的特异性，能够快速完成番茄枯萎病生理小种3的抗性鉴定，提高番茄枯萎病生理小种3抗性育种的效率，且本发明提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记制备简单、生产成本低。本发明提供的分子标记能够用于鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性、筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄和/或鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。本发明提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记能够用于制备试剂盒，该试剂盒具有与本发明提供的分子标记相同的应用。

Description

与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记、获得方法及应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记、获得方法及应用。
背景技术
番茄枯萎病(Fusarium oxysporumf.sp.Lycopersici Snyder et Hansen)又称萎蔫病，是一种能够使番茄植株整株枯萎直至死亡的病种。番茄枯萎病生理小种3(Fusariumoxysporumf.sp.Physiological races 3)是番茄枯萎病中一种对番茄毒性极强的生理小种，番茄枯萎病生理小种3能够使番茄的叶部发生病理性萎蔫，情况严重的甚至会造成番茄绝收，因此，抗番茄枯萎病生理小种3的番茄选育是控制番茄枯萎病最直接、有效的方法。
番茄枯萎病生理小种3的抗原来源于番茄野生种品系潘那利番茄(Lycopersiconpennellii)LA716，潘那利番茄LA716的抗性为单基因显性遗传，其抗性基因被命名为I3。目前，通常利用与抗性基因紧密连锁的分子标记进行番茄抗性鉴定，进而间接筛选抗性基因I3。分子标记的实用性取决于分子标记与目的基因的连锁强度以及分子标记的利用成本。分子标记与目的基因的连锁强度越高，遗传距离越近，则选择出番茄枯萎病生理小种3的抗性基因I3的准确率也就越高。但是，缩短遗传距离会导致可用的分子标记数量减少，而剩余可用的分子标记大多数是成本较高的分子标记，如SNP(Single NucleotidePolymorphisms，即单核苷酸的多态性)、CAPs(Cleaved Amplified PolymorphismSequences，即酶切扩增多态性序列)等，这会降低分子标记的实用性，因此，在筛选分子标记时，一般选取分子标记与目的基因的遗传距离在5cM(centi-morgan，即厘摩尔根)范围内的分子标记。SCAR(Sequence—characterized Amplified Region，即序列特异性扩增区)标记为分子标记中的一种特异引物PCR(Polymerase Chain Reaction，即聚合酶链式反应)标记，该标记方便、快捷、可靠，能够快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高，因此，SCAR标记为分子标记在育种实践中应用的首选标记。
目前，选择抗性基因I3常用的SCAR标记为P7-43DF3/R1，P7-43DF3/R1标记与I3的遗传距离小于1cM，能够用于I3的分子辅助育种选择。但是，相关文献以及实际实验结果显示，P7-43DF3/R1标记只能鉴定纯合基因型I3/I3，不能区分杂合体I3/i3与纯合体i3/i3，且P7-43DF3/R1具有较差的特异性，进而影响番茄抗枯萎病生理小种3的抗性选择，同时也降低了SCAR标记的利用效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记、获得方法及应用，解决选择抗性基因I3的分子标记P7-43DF3/R1特异性差的问题。
本发明提供了一种与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记，所述分子标记的特异性引物对为：
上游引物：5'-TTGTCAACCTTACCTTGCGTAC-3'；
下游引物：5'-AGGAACTTTATCACCATTGACA-3'。
本发明提供了一种与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的获得方法，所述获得方法包括：
获得P7-43DF3/R1标记的引物序列；
通过blast工具分别获得所述P7-43DF3/R1标记在加工番茄M82和潘那利番茄中的扩增序列；
对比所述加工番茄M82和所述潘那利番茄扩增序列中的同源序列，在多态序列两侧设计引物；
筛选有效引物，得到与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记。
优选地，所述P7-43DF3/R1标记的引物序列为：
上游序列：5'-CACGGGATATGTTATTGATAAGCATGT-3'；
下游序列：5'-GTCTTTACCACAGGAACTTTATCACC-3'。
优选地，所述P7-43DF3/R1标记在加工番茄M82和潘那利番茄中的扩增序列分别为序列表中的序列1和序列2。
本发明提供了一种与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的应用，所述分子标记应用于鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性、筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄和/或鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记，所述试剂盒应用于鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性、筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄和/或鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。
本发明提供了一种鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性的方法，所述方法包括：
提取待测番茄的DNA；
以与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记为引物PCR扩增所述番茄DNA得到扩增产物；
将所述扩增产物进行电泳测试，观察PCR扩增产物的条带大小；
若得到896bp条带的PCR扩增产物，则所述待测番茄具有枯萎病生理小种3抗性；
若得到687bp条带的PCR扩增产物，则所述待测番茄不具有枯萎病生理小种3抗性。
本发明提供了一种筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄的方法，所述方法包括：
将感病番茄与抗病番茄进行杂交，得到F1代，所述F1代自交后得到F2代单株番茄；
提取所述F2代单株番茄的DNA；
以与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记为引物PCR扩增所述F2代单株番茄DNA得到扩增产物；
将所述扩增产物进行电泳测试，观察PCR扩增产物的条带大小；
若得到896bp条带的PCR扩增产物，则所述F2代单株番茄为纯合抗枯萎病生理小种3单株；
若得到896bp+687bp条带的PCR扩增产物，则所述F2代单株番茄为杂合抗枯萎病生理小种3单株；
若得到687bp条带的PCR扩增产物，则所述F2代单株番茄为纯合感枯萎病生理小种3单株。
本发明提供了一种鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度的方法，所述方法包括：
将感病番茄母本与抗病番茄父本进行杂交，得到F1代番茄种子；
提取所述F1代番茄种子的DNA；
以与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记为引物PCR扩增所述F1代番茄种子DNA得到扩增产物；
将所述扩增产物进行电泳测试，观察PCR扩增产物的条带大小；
若得到双带PCR扩增产物，则所述F1代番茄种子为杂交种；
若得到单带PCR扩增产物，则所述F1代番茄种子为自交种；
分别统计所述杂交种和所述自交种的数量，计算所述杂交种和所述自交种的比例，得到抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。
优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，33个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
本发明的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
本发明提供了一种与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记，所述分子标记的特异性引物对为：上游引物：5'-TTGTCAACCTTACCTTGCGTAC-3'；下游引物：5'-AGGAACTTTATCACCATTGACA-3'。本发明提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记是在原有选择抗性基因I3的分子标记P7-43DF3/R1的基础上设计的引物对，以本发明提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记为引物扩增从待测番茄中提取的DNA，所提取的DNA经过PCR扩增后进行电泳测试，番茄枯萎病生理小种3抗性鉴定、抗番茄枯萎病生理小种3单株番茄的筛选和番茄抗枯萎病生理小种3与番茄感枯萎病生理小种3配制产生的杂交种种子纯度鉴定均通过判断扩增产物的带条数进行。本发明提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记具有很强的特异性，能够快速完成番茄枯萎病生理小种3的抗性鉴定，提高番茄枯萎病生理小种3育种的效率，且本发明提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记制备简单、生产成本低。本发明提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记同时还能够用于制备试剂盒，该试剂盒能够用于鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性、筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄和/或鉴定番茄抗枯萎病生理小种3与番茄感枯萎病生理小种3配制产生的杂交种种子纯度。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记获得方法流程图；
图2为本发明实施例提供的P7-43DF3/R1标记在加工番茄M82和潘那利番茄中的扩增序列的对比图；
图3为本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记为引物扩增番茄亲本材料的电泳结果图；
图4为本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记为引物扩增由抗/感枯萎病生理小种3番茄亲本配制的F2单株的电泳结果图；
图5为本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记为引物扩增由感枯萎病生理小种3番茄母本与抗枯萎病生理小种3番茄父本配制的F1单株的电泳结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药品材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
实施例1：与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的获得
本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记是在原有选择抗性基因I3常用的SCAR标记P7-43DF3/R1的基础上设计的具有多态性的、特异性强的引物对，且本发明实施例提供的分子标记被命名为TJ-1。
请参考附图1，附图1示出了本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记获得方法流程图。
本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的获得具体包括以下内容：
S01：获得P7-43DF3/R1标记的引物序列，P7-43DF3/R1标记为目前常用标记，因此P7-43DF3/R1标记的引物序列是共知的，即P7-43DF3/R1标记的引物序列为：
上游引物：5'-CACGGGATATGTTATTGATAAGCATGT-3'；
下游序列：5'-GTCTTTACCACAGGAACTTTATCACC-3'。
S02：在NCBI(National Center of Biotechnology Information，即美国国家生物技术信息中心)网站上，通过blast(Basic Local Alignment Search Tool)工具分别获得P7-43DF3/R1标记在加工番茄M82和潘那利番茄中的扩增序列，具体的，P7-43DF3/R1标记在加工番茄M82和潘那利番茄中的扩增序列分别为序列表中的序列1和序列2；
S03：通过序列分析软件DNAMAN6.0对比加工番茄M82中的cTOF-21-J12序列以及与其对应的潘那利番茄扩增序列中的同源序列Solanum pennellii chromosome ch07，在多态序列两侧设计引物；
S04：对设计得到的引物进行筛选，选取能够进行PCR扩增的有效引物，进而得到本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记TJ-1，TJ-1的引物序列为：
上游引物：5'-TTGTCAACCTTACCTTGCGTAC-3'；
下游引物：5'-AGGAACTTTATCACCATTGACA-3'。
请参考附图2，附图2示出了本发明实施例提供的P7-43DF3/R1标记在加工番茄M82和潘那利番茄中的扩增序列的对比图，其中，A为P7-43DF3/R1标记在加工番茄M82中的扩增序列；B为P7-43DF3/R1标记在潘那利番茄中的扩增序列。
实施例2
为验证本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记TJ-1具有较强的特异性，即发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记TJ-1能够用于鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性，本发明实施例还提供了三种不同种质资源的感番茄抗枯萎病生理小种3的番茄植株以及三种不同种质资源的抗番茄抗枯萎病生理小种3的番茄植株，其中，1、3、5为感番茄抗枯萎病生理小种3的番茄植株；2、4、6为抗番茄抗枯萎病生理小种3的番茄植株。
本发明实施例提供的鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性的方法具体包括：
分别提取上述六种番茄植株的DNA；
以分子标记TJ-1为引物PCR扩增上述六种DNA，得到六种PCR扩增产物；
将PCR扩增产物置于1％琼脂糖凝胶上，在120V的电压条件下恒压电泳20min，经EB(Ethidium bromide，即溴化乙锭)染色后置于凝胶成像系统中成像，观察电泳结果图上扩增条带的大小；
若得到896bp(Base Pair，即碱基对)条带的PCR扩增产物，则所述待测番茄具有枯萎病生理小种3抗性；
若得到687bp条带的PCR扩增产物，则所述待测番茄不具有枯萎病生理小种3抗性。
进一步，在进行番茄植株DNA提取时，取10mg番茄幼嫩叶片，将叶片剪碎后置于1.5mL离心管中，向离心管中加入浓度为0.25mol/L、体积为100mL的NaOH溶液，将上述装置置于沸水中30s，然后加入浓度为0.25mol/L、体积为100mL的HCl溶液进行中和，中和反应结束后，加入浓度为0.5mol/L、体积为100μL的Tris-HCl溶液，于沸水浴中加热2min，将离心管中的浸出液取出，该浸出液包含有番茄植株DNA。当然，番茄植株DNA提取也可以使用已公知的提取手段进行提取，本发明实施例不对DNA的提取方法进行限定。
在使用分子标记TJ-1为引物进行PCR扩增时，PCR扩增的反应体系为：10μL的2×taq mix，各0.4μL的TJ-1上、下游引物，2μL的DNA浸出液，7.2μL的水。PCR扩增的反应条件为：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，共33个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
具体结果请参考附图3，附图3示出了本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记为引物扩增番茄亲本材料的电泳结果图。
从附图3中能够看出，经过与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记TJ-1为引物进行PCR扩增番茄DNA后，番茄植株1、3、5的PCR扩增条带大小为698bp，番茄植株2、4、6的PCR扩增条带大小为896bp，这与预期的条带大小相符合，由此表明，本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记TJ-1与田间鉴定相吻合，进而能够说明本发明实施例提供分子标记TJ-1具有很好的特异性，能够很好的鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性。
实施例3
本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记不仅能够用于鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性而且还能够用于筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄。
本发明实施例还提供了一种筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄的方法，该方法具体包括：
将感病番茄A与抗病番茄B进行杂交，得到F1代，F1代进行自交后得到24个F2代单株番茄；
提取F2代单株番茄的DNA；
以分子标记TJ-1为引物PCR扩增F2代单株番茄DNA得到扩增产物；
将PCR扩增产物置于1％琼脂糖凝胶上，在120V的电压条件下恒压电泳20min，经EB染色后置于凝胶成像系统中成像，观察电泳结果图上扩增条带的大小；
若得到896bp条带的PCR扩增产物，则所述F2代单株番茄为纯合抗枯萎病生理小种3单株；
若得到896bp+687bp条带的PCR扩增产物，则所述F2代单株番茄为杂合抗枯萎病生理小种3单株；
若得到687bp条带的PCR扩增产物，则所述F2代单株番茄为纯合感枯萎病生理小种3单株。
在本发明提供实施例中，番茄植株DNA提取方法、PCR扩增的反应体系及PCR扩增的反应条件均与实施例2中的一致。
请参考附图4，附图4示出了本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记为引物扩增由抗/感枯萎病生理小种3番茄亲本配制的F2单株的电泳结果图。从附图4中能够看出，编号为3、17、18、20、22、23的单株番茄PCR扩增后的条带大小仅为687bp，编号为6、9、13、14、24的单株番茄PCR扩增后的条带大小仅为896bp，编号为1、2、4、5、7、8、10、11、12、13、16、19、21的单株番茄PCR扩增后出现条带为896bp和687bp的两条条带，由此得知，除编号为3、17、18、20、22、23的单株番茄是感病植株外，其余编号的番茄均为抗病植株。将24个F2单株分别进行自交，自交后得到F3植株，将F3植株分别进行接种试验，试验发现编号为3、17、18、20、22、23的单株番茄自交后的F3植株全部感染番茄枯萎病；编号为6、9、13、14、24的单株番茄自交后的F3植株全部抗番茄枯萎病；编号为1、2、4、5、7、8、10、11、12、13、16、19、21的单株番茄自交后的F3植株内部出现抗性分离，即出现抗病番茄和感病番茄，且抗病番茄和感病番茄的分布比例为3:1。由附图4所示出的内容可知，编号为3、17、18、20、22、23的F2单株番茄均为纯合感病单株，编号为6、9、13、14、24的F2单株番茄均为纯合抗病单株，编号为1、2、4、5、7、8、10、11、12、13、16、19、21的F2单株番茄为杂合抗病单株。由上述内容可知，本发明实施例提供的分子标记TJ-1能够筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄。
实施例4
本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记还能够用于鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。本发明实施例提供了鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度的方法，该方法具体包括：
将感病番茄母本C与抗病番茄父本D进行杂交，得到24颗F1代番茄种子；
提取F1代番茄种子的DNA；
以分子标记TJ-1为引物PCR扩增F1代番茄种子DNA得到扩增产物；
将PCR扩增产物置于1％琼脂糖凝胶上，在120V的电压条件下恒压电泳20min，经EB染色后置于凝胶成像系统中成像，观察电泳结果图上扩增条带的大小；
若得到双带PCR扩增产物，则所述F1代番茄种子为杂交种；
若得到单带PCR扩增产物，则所述F1代番茄种子为自交种；
分别统计杂交种和自交种的数量，计算杂交种和自交种的比例，得到抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。
其中，在进行F1代番茄种子DNA的提取时，采用已知的SDS(sodium dodecylsulfate,sodium salt，即十二烷基硫酸钠)法提取DNA。
请参考附图5，附图5示出了本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记为引物扩增由感枯萎病生理小种3番茄母本与抗枯萎病生理小种3番茄父本配制的F1单株的电泳结果图。从附图5中能够看出，编号为3、21的番茄种子进行PCR扩增后的条带大小仅为687bp，其余编号的番茄种子进行PCR扩增后出现的条带为896bp和687bp两条条带，由此可知，编号为3、21的番茄种子为纯合感病种子，其余22颗番茄种子为杂合抗病种子，由感病番茄母本C与抗病番茄父本D进行杂交得到的种子中抗病种子所占比例为22/24，即该批次种子的纯度为22/24，进而表明，本发明实施例提供的分子标记TJ-1能够快速鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。
由实施例2-4可知，本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记TJ-1能够用于快速鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性、筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄、鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度，从而提高番茄枯萎病生理小种3育种的效率。同时本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记TJ-1制备简单、生产成本低，适用于大范围的推广与应用，具有较大的应用前景。
本发明实施例提供的与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记TJ-1还能够用于制备鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性的试剂盒，所制备的试剂盒还可以包含酶混合液、PCR反应液等。本发明实施例提供的试剂盒能够用于鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性、筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄和/或鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (10)

1.一种扩增与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的特异性引物对，其特征在于，所述引物对为：
上游引物：5'-TTGTCAACCTTACCTTGCGTAC-3'；
下游引物：5'-AGGAACTTTATCACCATTGACA-3'。
2.一种如权利要求1所述的扩增与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的特异性引物对的获得方法，其特征在于，所述获得方法包括：
获得P7-43DF3/R1标记的引物序列；
通过blast工具分别获得所述P7-43DF3/R1标记在加工番茄M82和潘那利番茄中的扩增序列；
对比所述加工番茄M82和所述潘那利番茄扩增序列中的同源序列，在多态序列两侧设计引物；
筛选有效引物，得到扩增与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的特异性引物对。
3.根据权利要求2所述的扩增与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的特异性引物对的获得方法，其特征在于，所述P7-43DF3/R1标记的引物序列为：
上游序列：5'-CACGGGATATGTTATTGATAAGCATGT-3'；
下游序列：5'-GTCTTTACCACAGGAACTTTATCACC-3'。
4.根据权利要求2所述的扩增与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的特异性引物对的获得方法，其特征在于，所述P7-43DF3/R1标记在加工番茄M82和潘那利番茄中的扩增序列分别为序列表中的序列1和序列2。
5.一种如权利要求1所述的扩增与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的特异性引物对的应用，其特征在于，所述分子标记应用于鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性、筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄和/或鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的扩增与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的特异性引物对，所述试剂盒应用于鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性、筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄和/或鉴定抗枯萎病生理小种番茄3与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。
7.一种鉴定番茄枯萎病生理小种3抗性的方法，其特征在于，所述方法包括：
提取待测番茄的DNA；
以权利要求1所述的扩增与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的特异性引物对为引物PCR扩增所述番茄DNA得到扩增产物；
将所述扩增产物进行电泳测试，观察PCR扩增产物的条带大小；
若得到896bp条带的PCR扩增产物，则所述待测番茄具有枯萎病生理小种3抗性；
若得到687bp条带的PCR扩增产物，则所述待测番茄不具有枯萎病生理小种3抗性。
8.一种筛选抗番茄枯萎病生理小种3的单株番茄的方法，其特征在于，所述方法包括：
将感病番茄与抗病番茄进行杂交，得到F1代，所述F1代自交后得到F2代单株番茄；
提取所述F2代单株番茄的DNA；
以权利要求1所述的扩增与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的特异性引物对为引物PCR扩增所述F2代单株番茄DNA得到扩增产物；
将所述扩增产物进行电泳测试，观察PCR扩增产物的条带大小；
若得到896bp条带的PCR扩增产物，则所述F2代单株番茄为纯合抗枯萎病生理小种3单株；
若得到896bp+687bp条带的PCR扩增产物，则所述F2代单株番茄为杂合抗枯萎病生理小种3单株；
若得到687bp条带的PCR扩增产物，则所述F2代单株番茄为纯合感枯萎病生理小种3单株。
9.一种鉴定抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度的方法，其特征在于，所述方法包括：
将感病番茄母本与抗病番茄父本进行杂交，得到F1代番茄种子；
提取所述F1代番茄种子的DNA；
以权利要求1所述的扩增与番茄枯萎病抗性基因连锁的分子标记的特异性引物对为引物PCR扩增所述F1代番茄种子的DNA得到扩增产物；
将所述扩增产物进行电泳测试，观察PCR扩增产物的条带大小；
若得到双带PCR扩增产物，则所述F1代番茄种子为杂交种；
若得到单带PCR扩增产物，则所述F1代番茄种子为自交种；
分别统计所述杂交种和所述自交种的数量，计算所述杂交种和所述自交种的比例，得到抗枯萎病生理小种3番茄与感枯萎病生理小种3番茄配制产生的杂交种种子纯度。
10.根据权利要求7-9中任意一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，33个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
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