KR100682130B1

KR100682130B1 - 배추 게놈의 염색체별로 유일발현하는 단일발현 유전자마커

Info

Publication number: KR100682130B1
Application number: KR1020050032626A
Authority: KR
Inventors: 김정선; 박범석; 진용문; 김호일
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2005-04-20
Filing date: 2005-04-20
Publication date: 2007-02-15
Also published as: KR20060110880A

Abstract

본 발명은 배추 게놈의 염색체별로 유일 발현하는 단일발현 유전자 마커에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 복잡하게 중복되어 존재하는 재조합 다배체형 게놈의 염색체를 갖는 배추에 있어서 연관군별로 위치하는 유일 발현 유전자 64종으로 이루어진 유전자 마커에 관한 것이다. 본 발명의 단일 발현 유전자 마커는 애기장대 발현유전자와 높은 상동성을 보이고, 다배체형 게놈을 갖는 배추속 작물의 염색체 특이적 구분 마커로 활용할 수 있으며, 유전자변형작물의 정량분석에 있어 표지마커로 활용할 수 있다.

배추, 게놈, 다배체, 마커

Description

배추 게놈의 염색체별로 유일발현하는 단일발현 유전자 마커{SINGLE EXPRESSED GENETIC MARKER EXPRESSED ACCORDING TO THE CHROMOSOMES OF BRASSICA RAPA}

도 1은 애기장대 게놈의 염색체내 및 염색체간 중복 영역에 대한 분포도이다.

도 2a, 2b, 2c 및 2d는 배추 단일발현 유전자들의 장원양친 게놈 DNA에 대한 서던혼성화(southern hybridization) 분석도이다.

도 3a, 3b, 3c 및 3d는 일반적인 배추 발현유전자(EST 클론)를 이용한 장원양친 게놈 DNA에 대한 서던혼성화 분석도이다.

도 4는 장원 분리집단(F3 pooled 134 계통)에 대해 단일발현 유전자를 이용하여 서던혼성화한 유전분리비 분석도이다.

도 5는 배추유전자 10개에 대하여 배추 연관군별 단일발현 유전자들의 유전 위치를 나타낸 분석도이다.

도 6은 배추유전자지도에 위치한 단일발현 유전자들의 염기서열 정보를 이용한 상동성 분석 결과이다.

도 7는 배추 단일발현 유전자, BAN235를 이용한 HindIII BAC 유전자 은행 탐색도이다.

도 8a는 배추 단일발현 유전자들로 검출된 BAC 클론들의 HindIII 핑거프린트(fingerprint) 전기영동의 결과를 나타낸 사진이다.

도 8b는 상기 도8a의 HindIII 핑거프린트 블롯에 대한 BAC 유전자들의 단일발현 영상 확인도이다.

도 9a 및 9b는 배추의 보편적 유전자들의 BAC 유전자 은행 선별과, HindIII 핑거프린트 및 게놈내 중복 유전자임을 확인하는 도면이다.

본 발명은 배추 게놈의 염색체별로 유일 발현하는 단일발현 유전자 64종으로 이루어진 단일 발현 유전자마커에 관한 것이다.

배추속 작물은 분류학적으로 애기장대와 같은 배추과 작물이다. 유지공급원, 채소와 양념 등 다양한 범위의 용도를 가지고 있는 작물들이 포함되어 있는 배추속 작물은 경제적으로도 그 가치가 높다. 배추속 작물중에서 B. napus, B. rapa(syn, B. campestris), B. juncea 및 B. carinata는 전세계 식용 채소 유지원의 12%를 차지하고(Labana and Gupta, 1993), B. oleracea 및 B. rapa 등 결구형 작물은 신선한 식용 채소원으로 사용되고 있다. 이들 배추속 작물들은 각각 극대화된 기관의 형태에 의해 분류된다. 대표적으로 꽃봉오리가 발달한 꽃양배추(B. oleracea ssp. botrytis)와 브로콜리(B. oleracea spp. italica), 줄기조직이 발달한 콜라비(B. oleracea ssp. gongylodes), 뿌리 기관이 발달된 순무(B. rapa ssp. rapifera), 구 불구불한 잎 조직이 발달한 박쵸이(B. rapa ssp. chinensis)와 배추(B. rapa ssp. pekinensis), 단일 정단 봉오리가 발달한 양배추(B. oleracea ssp. capitata) 및 다양한 측아조직이 발달된 방울다다기양배추(B. oleracea ssp. gemmifera) 등을 들 수 있다. 또한 겨자 양념으로 이용되는 B. nigra 도 배추속 작물에 속한다.

배추속 작물에 대한 유전연구는 U(1935)가 발표한 세포학적 연구와 종간 교배능에 의한 화합성을 토대로 한 연구를 기본으로하여, 배추(B. rapa, 2n=20), 양배추(B. oleracea, 2n=18) 및 겨자(B. nigra, 2n=16) 등 이배체 3종과, 이들 이배체 3종의 자연교잡능에 의해 유래된 것으로 추정되는 유채(B. napus, 2n=38), 겨자 (B. juncea, 2n=36) 및 양겨자(B. carinata, 2n=34) 등 복이배체 3종으로 분류된다. 현재까지 배추속 작물에 대한 분자생물학적 연구에 의해 작성된 분자유전자지도는 최소한 15개가 넘는데, 주로 중요 채소원 또는 유지원으로 사용되는 유지배추, 양배추, 유채에 대한 연구였다(Lan and Patersnon 2001 inpress; Lan et al., 2000a, 2000b; Truco et al., 1996; Lagercrantz and Lydiate 1996; Uzunova et al., 1995; Teutonico and Osborn 1994; Ferriera et al., 1994; Figdore et al., 1993; Kianian and Quiros 1992; Chyi et al., 1992; Song et al., 1991; Landry et al., 1991, 1992; Slocum et al., 1990).

배추속 작물에 대한 RFLP 분석을 통하여, 현재 분포하는 배추속 6종의 진화관계를 구명한 Song 등(1988)에 의한 보고에 따르면, 배추속 작물은 종간, 아종간, 아종내 다형성이 매우 높다. 이들은 상기 보고에서 배추속 6종 중 B. rapa 19종 및 B. oleracea 18종, B. nigra 2종, B. juncea 6종, B. napus 5종 및 B. carinata 2 종 등 다양한 배추속 작물에 대한 RFLP 결과를 분석하여 배추 6종간 유연관계도를 작성하였다. 그 결과 B. rapa는 박쵸이와 순무, 결구배추와 같은 동양권에서 재배되는 아종 chinesis, pekinensis 등의 그룹과 유럽에서 주로 재배되고 있는 tunip rape, sarson 및 spring broccoli가 속한 아종 rapifera, olifera 등 두 개의 그룹으로 구분됨을 보고하였다. 또한 배추속 작물의 진화를 추정하였는데, B. nigra는 개별적으로 원시종인 Sinapsis arvensis 또는 이와 유사한 게놈으로부터 진화되었고, B. rapa 와 B. oleracea는 공통된 원시게놈을 가졌으나 이후 다른 진화과정을 밟은 것으로 보고하였다. 또한, B. rapa 아종중 Turnip, Turnip rape, Sarson 등으로부터 양배추 게놈과 유사한 spring broccoli가 유래되었고, 이와 원시 양배추종과의 자연교잡에 의해 B. napus (n=19)가 만들어진 것으로 추정하였다. 동양권에서 주로 재배되며, 주요 채소원인 pekinensis 아종은 순무로부터 진화되었고, B. nigra와 교잡하여 B. juncea(n=18) 복이배체 게놈을 생성한 것으로 추정하였다. B. rapa 와 B. oleracea 원시 공통 조상은 9개의 염색체를 가진 것으로 연구되고 있으며, 10개의 염색체를 가지고 있는 배추종은 염색체 재변환에 의한 것으로 추정하였다.

1988년 Figdore 등은 B. rapa 16종, B. oleracea 16종, B. napus 1종을 대상으로 RFLP 분석하여 배추속 작물의 다형성이 매우 높으며, 종간은 95%, 아종간은 79%, 아종내에도 70% 이상 다형성을 보임을 보고하였다. 1988년, 1989년 Song 등은 B. rapa 10종, B. oleracea 9종 및 야생형 B. oleracea 등 38점을 이용한 RFLP 분석을 통하여, B. rapa의 경우 박쵸이, 결구배추 등 아시아 재배권에 속하는 그룹과 Turnip rape, Sarson 등의 유럽형 재배종이 유전적으로 매우 다르다는 것을 확인 보고하였고, B. oleracea는 케비지, 브로콜리 및 케일 등의 3가지 그룹으로 구분됨을 보고하였다.

식물 게놈내에 가장 빈번하면서 빠른 염색체 대단위 변화를 초래하는 현상을 다배체화(polyploidy)라 할 수 있다. 현재 존재하는 피자식물 중 80%가 넘는 식물종이 1회 또는 여러회 염색체의 배가가 이루어진 다배체화 게놈 형태인 것으로 알려져 있다(Masterson 1994; Stebbinson 1996). 애기장대도 분류학적으로 같은 배추과 작물에 속하는 것으로, 역시 전 게놈 분석 결과(AGI 2000) 도1에 도시한 바와 같이 65% 이상의 유전자가 염색체간, 염색체내 중복되어 있는 다배체 게놈인 것으로 분류되었다. 다배체화는 광범위한 염색체 재구성 (Ahn and Tanksley, 1993; Reinsch et al., 1994; Song et al., 1995a, 1995b; Lagercrantz and Lydiate, 1996; Bubaker et al., 1999) 및 레트로-트란스포존(retro-transposon) 증폭을 가능하게 할뿐 아니라(Matzke and Matske, 1998; Zhao et al., 1998), 염색체간 유사한 영역을 공통으로 갖고 있어 세대를 거듭하고 진화함에 따라 상동성 있는 영역간 재조합을 일으키게 하고, 부가적인 유전자 중복을 가져오게 하여 더 복잡한 염색체 재구성의 기본 요인이 된다.

식물에서 가장 공통적인 다배체화 현상이 어떤 이유에 의해서 일어났든간에 이는 게놈 전체 중복 현상을 가져왔다. 이에 원시 단순 게놈이 중복된 게놈은 어떤 특성을 가질 것인가에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다. 이러한 다배체화 게놈 특징의 구조적 이해에 대한 설명의 가장 좋은 예는 애기장대이다. 전체적인 게놈 염기서열 분석 결과, 상기한 바와 같이 애기장대 게놈의 65%가 염색체간, 염색체내에서 중복되어 있다고 보고되었다.

브라시카속 작물 양배추, 배추, 겨자 등 이배체 3종과 유채, 겨자, 양겨자 등 복이배체 3종은 그 공통 조상인 원시 단순 게놈의 삼중복과 삼중복체의 이형 염색체 배가에 의해, 현재의 게놈으로 분화되어 6종 게놈간 유사성이 높다. 이들 게놈간 유용 유전자 정보를 연계하기 위해서도 브라시카속 통합 유전자지도 작성이 필수적이나, 현재까지 단일발현 유전자의 위치를 게놈내에서 밝혀낸 예가 없어, 브라시카속 통합유전자 지도 작성이 어려운 실정이다. 이를 극복하고자 일부 SSR 마커가 개발되어 브라시카 작물 중 유채를 중심으로, R-group을 명명하고, 배추와 양배추 게놈 염색체와의 상동성에 준하여 브라시카속 작물의 통합유전자 지도를 작성하는 방법이 있으나, SSR 마커는 다형성 검출 빈도가 낮아, 각 게놈간 공통마커의 공유가 어렵다는 문제가 있었다.

배추의 핵형은 두 개의 비교적 큰 염색체와 두 개의 비교적 작은 염색체와 중간형의 여섯 개 염색체로 이루어져 있다. 일반적으로 배추의 핵형 구분과 관련된 연구에 발현 빈도가 높은 라이보좀 DNA를 활용해 왔으나, 복잡하게 중복되어 존재하는 배추의 염색체들 각각의 크기가 비슷하여 염색체 구분이 어렵고, 이때문에 배추의 염색체들과 각 연관군들을 연계하여 유전자 지도(genetic map)와 염색체와의 상관관계를 확립하는 작업이 현재까지 이루어지지 못하고 있는 실정이었다.

또한, 배추 내에서 단일 발현하는 유전자 대조구가 없어 형질전환배추의 정량 분석에 있어, 재조합 유전자의 배추게놈내 발현을 분석하기가 곤란하다는 문제 가 있었다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 배추 염색체 구별 마커로 활용할 수 있도록 배추 염색체별로 단일하게 위치하는 배추 염색체별 특이 마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 배추속 작물인 유채, 양배추, 배추 유전자 변형 작물의 양적 유전분석의 단일발현 유전자 대조구로 활용할 수 있는 단일발현 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 배추 국제 통합 유전자지도를 작성함으로써 국제배추게놈연구(Multinational Brassica Genome Project; MBGP)의 표준 유전자지도로 활용할 수 있고, 배추 핵형분석과 통합유전자지도 작성에 활용할 수 있는 단일발현 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 유전자 마커는 도6에 도시한 바와 같이 배추 연관군별로 위치된 유일 발현 유전자 총 64종으로서, 서열번호 1~64에 기재되어 있는 유전자들을 포함하는 것이다. 상기 유전자들은, 바람직하게는 이를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열을 포함할 수 있다.

상기에서 "변형서열"은 실질적으로 RFLP 분리비의 연관분석에 의하여 결정된 연관군 내에서의 위치가 유지되는 범위내에서 일부 염기의 결실, 삽입, 부가 및 치환된 서열을 의미하는 것이다. 여기에서, 변이의 위치는 단일발현 유전자의 연관군별 위치에 영향을 주지 않는 한 특별히 한정되지는 않는다.

본 발명의 유전자 마커는 핵형을 분석하거나 염색체를 구분하는 등의 요구되는 유전분석에 있어서 필요에 따라서 전체 64종의 유일 발현 유전자 중에서 2개 이상의 유전자를 조합하여 사용할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 배추 발현유전자(EST)를 활용한 배추 분리집단 양친 유전 분석

배추 유전자지도 작성을 위해 활용한, 장원배추 분리집단 양친의 게놈 DNA를 분리하고, 한 분석 시료 당 10㎍이 되도록 정량한 후, 7가지 제한효소(BamHI, DraI, EcoRI, HindIII, EcoRV, XbaI, ScaI)로 밤새 처리한 후, 0.8% 아가로스겔에 40V, 20시간 전기영동하여 절단한 게놈DNA를 전개한 후, 나일론막(hybond N⁺)에 전이하였다. 배추 발현유전자(EST)들을 ³²P-dCTP로 탐침한 후, 혼성화(hybridization) 반응에 의해 검출되는 밴드 수를 확인하여, 단일발현 유전자들을 선별하였다(도 2). 배추미숙꽃(BIF) 발현 유전자은행, 배추미숙꽃밥(BAN) 발현 유전자은행 및 배추암발아(A) 발현 유전자은행 등 3종의 유전자은행별로 383개 EST 클론들에 대하여 서던분석하여, 그 결과를 표1에 기재하였다. 표1에 기재된 바와 같이 배추 단일발현 유전자의 분포는 배추 유전자은행 종류에 따라 그 빈도수가 달랐고, 3종의 유전자 은행을 분석한 결과, 배추 게놈내에 존재하는 단일발현 유전자의 분포는 약 16%였다. 이는 애기장대의 35%, 벼의 65%보다 훨씬 적은 빈도로서 배추 게놈이 복잡하게 중복되어 있는 다배체게놈으로서, 배추게놈에 존재하는 보편적인 유전자들의 서던 혼성화 결과 두 세 카피 이상 존재하기 때문에, 단일발현 유전자 검출이 어렵다는 것을 확인할 수 있다.

[표1:배추 유전자지도 작성에 활용한 3종 유전자 은행별로 383개 EST 클론들에 대하여 서던분석하여 얻은 단일발현 유전자 검출 빈도표]

라이브러리	단일발현 혼성체	총 분석 클론	SC 퍼센트(%)
배추미숙꽃(BIF)	10	127	7
배추미숙꽃밥(BAN)	39	206	18
배추암발아(A)	16	50	32
종합	65	383	16

실시예 2: 배추 단일발현 유전자(single copy EST)의 배추 게놈내 위치 결정

배추 유전자지도 작성에 활용한 장원분리집단(134 F3 pooled population)의 게놈DNA를 선발한 단일발현 유전자를 다형성을 보이는 제한효소로 밤새 처리한 후, 실시예 1과 동일한 방법으로 서던분석하여 유전분리비를 확보하였다(도 4). 이들 유전분리비들에 대한 연관분석을 통하여 배추 게놈내 위치를 결정하였다(도 5). 이들 단일발현 유전자들을 10개 연관군별로 위치와 염기서열 정보에 의해 분석된 유 전정보를 정리하였다(도 6). 이들 단일발현 유전자들의 유전자 염기서열 정보를 이용하여 NCBI 유전자은행내 뉴클레오티드 수준에서의 상동성 분석한 결과(BLASTNsearch), 애기장대에서 그 발현빈도가 낮아, 아직 기능이 구명되지 않은 발현단백질(hypothetical protein 또는 expressed protein)로 분류된 유전자들과 높은 상동성을 나타내는 것을 확인하였다. 단일발현 유전자들의 배추 게놈내 위치 분석 결과를 하기 표2에 기재하였다. 하기 표2에 기재된 바와 같이 가장 큰 1번 연관군에서 단일발현 유전자가 16개 결정되었고, 9번 연관군의 경우 가장 적었으나, 전 연관군에 모두 분포되어, 배추 핵형 분석에 활용 가능함을 확인하였다.

[표2:단일발현 유전자 64종들의 배추 연관군별 분포도]

연관군(Linkage Group)	단일발현 유전자(Single Copy Clones)
LG1	15
LG2	6
LG3	7
LG4	5
LG5	10
LG6	3
LG7	5
LG8	7
LG9	1
LG10	5
총합	64

실시예 3: 배추 단일발현 유전자가 포함된 BAC 클론 선발

배추 핵형 분석에 활용할 수 있는 탐침자는 대략 30Kb 이상의 단편을 필요로한다. 배추 연관군별 단일발현 유전자를 ³²P-dCTP로 탐침하여, 배추 게놈연구에 활용하고 있는 HindIII BAC 유전자은행(10X, 52,000 clones)에 대한 콜로니 혼성화(colony hybridization)를 통하여 배추 단일발현 유전자가 포함된 BAC을 선발하였 다(도 7). 이들 BAC 유전자들을 알칼리분해(alkaline lysis) 변형 방법에 의해 BAC DNA를 분리한 후, HindIII 제한효소에 의해 2시간동안 절단하였다. 절단된 HindIII-BAC 핑거프린트를 0.8% 아가로스겔에 30V, 20시간 전기영동한 후, 나일론막(hybond N⁺)에 전이하였다. 이 블롯(blot)들을 각각 본 발명의 단일발현 유전자로 혼성화(hybridization)한 후, 단일패턴의 밴드가 검출됨을 확인하였다(도 8).

실시예 4: 3배체 게놈(triplicated genome)으로 분석되는 배추 유전자들의 유전분석 양상

3배체인 배추의 유전자를 활용하여, 실시예 3과 같이 HindIII BAC 유전자 은행을 탐색하여 도 9에 나타내었다. 도 9로부터 배추에서 다중발현 유전자들이 포함된 BAC을 선발한 경우의 HindIII 핑거프린트와 그 블롯의 혼성화 결과는 각기 다른 사이즈의 밴드가 검출되는 양상을 확인할 수 있었다.

본 발명에 의한 배추속 작물의 단일발현 유전자들의 게놈내 분포 위치를 분석함으로써, 배추속 작물의 단일발현 유전자를 개발하고, 배추 국제 통합 유전자지도를 작성함으로써 국제배추게놈연구(Multinational Brassica Genome Project; MBGP)의 표준 유전자지도로 활용할 수 있다.

또, 배추 염색체별 특이 마커를 통하여 배추 염색체 구별 마커로 활용할 수 있고, 배추속 작물인 유채, 양배추, 배추 유전자 변형 작물의 양적 유전분석의 단 일 발현 유전자 대조구로도 활용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

각각 서열번호 1~64로 기재되는 염기서열로 이루어지는, 배추 연관군별로 위치된 64종의 단일발현 유전자들로 구성되는 배추 단일발현 유전자 마커.
각각 서열번호 1~64로 기재되는 염기서열로 이루어지는 64종의 유전자들 중에서 2개 이상을 선택하여 유전자 마커로서 조합한 것을 특징으로 하는 배추 단일발현 유전자 마커.