CN115976255A - 一种在苗期鉴定不结球白菜抽薹时间的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在苗期鉴定不结球白菜抽薹时间的方法，属于分子生物学技术领域。该方法以不结球白菜的基因组DNA为模板，采用引物组6943bp‑insert‑2F/2R通过聚合酶链式反应扩增该片段，根据目标条带的大小，即可快速鉴定不结球白菜早抽薹材料和品种。本发明提供的鉴定方法，可以在不结球白菜发育早期检测早抽薹的材料和品种，提高检测效率的同时节省了大量人力物力，进一步加快了不结球白菜的育种进程。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种在苗期鉴定不结球白菜抽薹时间的方法。
背景技术
不结球白菜（
Brassica campestris（syn.
Brassica rapa）ssp
. chinensis）起源于我国，属于十字花科芸薹属种的亚种之一，主要种植于长江中下游地区，因其富含可溶性糖、有机酸及人体所需的微量元素，受到消费者的喜爱。不同的不结球白菜品种或者材料在抽薹时间上存在差异，所以其营养生长方面也存在差异，先期抽薹的不结球白菜在品质和产量方面均下降。因此不结球白菜抽薹的研究对于提高其经济价值和育种速度都具有重要的指导意义。
因此，设计一种专用于苗期鉴定不结球白菜先期抽薹的方法是极其关键的。
发明内容
本发明的目的是提供一种在苗期鉴定不结球白菜抽薹时间的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
引物组6943bp-insert-2F/2R在苗期鉴定不结球白菜早抽薹材料或品种中的应用；
所述引物组6943bp-insert-2F/2R的序列如下：
6943bp-insert-2F：5’-GGCTATGTGCTCCCACCTTC -3’(Seq_1)
6943bp-insert-2R：5’-CTAAATCGGTTAGTACTAGC -3’(Seq_2)。
一种在苗期鉴定不结球白菜早抽薹材料或品种的方法，包括以下步骤：
步骤1，取待鉴定材料或品种的组织并提取基因组DNA；
步骤2，以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用引物组6943bp-insert-2F/2R对其进行PCR扩增；
所述引物组6943bp-insert-2F/2R序列如下：
6943bp-insert-2F：5’-GGCTATGTGCTCCCACCTTC -3’
6943bp-insert-2R：5’-CTAAATCGGTTAGTACTAGC -3’；
步骤3，对步骤2的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得待鉴定材料或品种的带型，若片段大小为1687bp，则说明该材料或者品种呈早抽薹性状。
进一步地，步骤2中，PCR反应体系为：在10μL反应体系中，3μL去离子水、各0.5μL10μM 6943bp-insert-2F/2R引物、1μL 80ng/μL 基因组DNA 、5μL 2× PrimeSTAR MAX DNAPolymerase。
进一步地，步骤2中，PCR扩增反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，10℃保存。
有益效果：
1. 本发明通过使用标记引物6943bp-insert-2F/2R，可在幼苗期快速地筛选不结球白菜早抽薹品种和材料。
2. 本发明辅助选择方便，成本低，操作简单。不结球白菜抽薹性状的常规选育方法耗时耗力，通过本发明，可以在苗期进行选择，极大节约了后续筛选成本。
附图说明
图1、图2为标记引物6943bp-insert-2F/2R在多种不结球白菜样本中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图。其中：M为DL2000 Marker，图1中泳道1-32、35、40为早抽薹品种，泳道33、36-39为晚抽薹品种；图2中泳道1-34均为早抽薹品种。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的试剂等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的。可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明提供了一组在苗期鉴定不结球白菜早抽薹的分子标记引物，即6943bp-insert-2F/2R，以多个早、晚抽薹品种和材料的不结球白菜基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增目标片段。依据目的条带的大小，可筛选出早抽薹品种和材料。该方法提供了可以在幼苗期检测早抽薹不结球白菜的一对分子标记，可高效快速地检测早抽薹的材料和品种，节省选育时间和成本，从而加快育种进程，促进叶菜类蔬菜的蓬勃发展。
实施例1
本实施提供的一种在苗期鉴定不结球白菜早抽薹的方法，包括以下步骤：
步骤1，不结球白菜基因组DNA的提取
根据植物基因组DNA快速提取试剂盒（购自于北京天根生化科技有限公司）说明书提取DNA，简要如下：
1）取100mg不结球白菜材料或者品种的叶片，放入液氮中并充分研磨；
2）在实验开始前将装有700µL GP1的离心管在65℃水浴锅中预热，后加入巯基乙醇，使GP1的终浓度为0.1%。将上述GP1加入到淹没好的粉末中，迅速混匀，将其置于65℃水浴锅中20min；
3）在上述反应液中加入氯仿700µL并充分混匀，10,000rpm离心5min；
4）将上述离心所得的上清液转移至新的离心管中，加入GP2缓冲液700µL 并混合均匀；
5）将上述混匀的液体转移到吸附柱CB3中，10,000rpm离心30 s，弃废液；
6）加入500µL缓冲液GD于吸附柱CB3中，10,000rpm离心30s，弃废液；
7）再次向吸附柱CB3中 加入漂洗液PW600µL，10,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
8）重复步骤7；
9）将吸附柱CB3放回收集管中，10,000rpm离心2min，弃废液。将吸附柱CB3开盖于室温放置2min，彻底清除吸附材料中的漂洗液；
10）将吸附柱CB3放置于一个新的离心管中，向吸附柱CB3的中间部位滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min，10,000rpm离心2min，将基因组DNA收集到离心管中；
11）测定DNA的纯度及浓度，并将其稀释到80ng/μL，存放于-20℃冰箱中。
步骤2，标记引物6943bp-insert-2F/2R 在不结球白菜基因组DNA中扩增
在10μL反应体系中，1μL 80ng/μL DNA模板、各0.5μL 10μM标记引物6943bp-insert-2F/2R 、5μL 2× PrimeSTAR MAX DNA Polymerase、3μL去离子水。
6943bp-insert-2F/2R标记引物：
6943bp-insert-2F：5’-GGCTATGTGCTCCCACCTTC -3’，
6943bp-insert-2R：5’-CTAAATCGGTTAGTACTAGC -3’。
PCR扩增程序为：98℃预变性2min，98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min， 30个循环，10℃保存。
步骤3，琼脂糖凝胶电泳检测
PCR扩增结束后，采用1%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TAE Buffer，取PCR产物10μL上样，150V电泳15min后，在凝胶成像仪观察。
从电泳结果可知，图1泳道1-32、35、40的早抽薹品种均能扩增出1687bp的片段，泳道4、33、36（泳道4的片段较为暗淡，但能确定其中存在1687bp的片段），泳道33、36-39的晚抽薹品种均不能扩增出1687bp的片段；图2泳道1-34的早抽薹品种均能扩增出1687bp的片段。
由以上结果可知，采用分子标记引物6943bp-insert-2F/2R在不结球白菜基因组中扩增，若扩增出1687p的片段，则标志着该不结球白菜品种或者材料具有早抽薹性状。
Claims (4)
1.引物组6943bp-insert-2F/2R在苗期鉴定不结球白菜早抽薹材料或品种中的应用，
所述引物组6943bp-insert-2F/2R的序列如下：
6943bp-insert-2F：5’-GGCTATGTGCTCCCACCTTC -3’
6943bp-insert-2R：5’-CTAAATCGGTTAGTACTAGC -3’。
2.一种在苗期鉴定不结球白菜早抽薹材料或品种的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，取待鉴定材料或品种的组织并提取基因组DNA；
步骤2，以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用引物组6943bp-insert-2F/2R对其进行PCR扩增；
所述引物组6943bp-insert-2F/2R序列如下：
6943bp-insert-2F：5’-GGCTATGTGCTCCCACCTTC -3’
6943bp-insert-2R：5’-CTAAATCGGTTAGTACTAGC -3’；
步骤3，对步骤2的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得待鉴定材料或品种的带型，若片段大小为1687bp，则说明该材料或者品种呈早抽薹性状。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2中，PCR反应体系为：在10μL反应体系中，3μL去离子水、各0.5μL 10μM 6943bp-insert-2F/2R引物、1μL 80ng/μL 基因组DNA 、5μL 2× PrimeSTAR MAX DNA Polymerase。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2中，PCR扩增反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，10℃保存。
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