CN113832218A

CN113832218A - 一种预测玉米植株氮素状态的方法及引物组

Info

Publication number: CN113832218A
Application number: CN202111145637.6A
Authority: CN
Inventors: 宁丽华; 石习; 赵涵
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2021-12-24

Abstract

本发明涉及预测玉米植株氮素状态的方法及引物组，其预测步骤如下：1)提取对照和测试样品玉米叶片中总RNA并进行反转录；2)实时定量PCR扩增基因Zm00001d024281，Zm00001d039049和Zm00001d037680并获知其相对表达量，将三个基因在对照与测试样品相对表达量比值分别带入线性模型，预测待测玉米品种的氮素状况；本申请在玉米生长过程中利用该标记物指示玉米植株氮素状态，依据该指示结果对玉米进行精确施肥，降低氮肥浪费，提高肥料利用效率，在实际现农业生产中具有广阔的应用前景。

Description

一种预测玉米植株氮素状态的方法及引物组

技术领域

本发明涉及玉米栽培和分子生物学技术领域，具体涉及一种预测玉米植株氮素状态的方法及其引物。

背景技术

玉米是我国重要的粮饲作物，其生长过程中对氮肥需求量极大。为获得较高产量，通常施用过量的化肥。另外，实践中通常采用‘一炮轰’式施肥方式，即一次性投入大量施肥，不再追肥的方式；这种施肥方式并未遵循玉米对氮肥需求的阶段性规律，因而大量氮肥被浪费。研究表明近年来我国化肥投入和产出极不相称，氮肥投入已远超过当前产量水平的氮肥需求量(孙志梅,武志杰,陈利军,刘永刚.农业生产中的氮肥施用现状及其环境效应研究进展[J].土壤通报,2006(04):782-786.)。过量施用氮肥并不能保证产量的持续增加，反而导致玉米品质下降(付钰.玉米籽粒品质与氮素供给关系的研究[D].沈阳农业大学,2020.)。农民生产成本增加等问题，另外过量施用氮肥还会造成农田土壤大面积酸化、水体富营养化等环境问题(武良,张卫峰,陈新平,崔振岭,范明生,陈清,张福锁.中国农田氮肥投入和生产效率[J].中国土壤与肥料,2016(04):76-83.)。

因此如何合理施用氮肥、充分发挥玉米生产潜力，促进光合产物向籽粒转移成为研究人员重点关注的问题。在保障粮食安全的前提下，精准施肥和提高肥料利用率是解决上述问题的有效手段。开展作物养分精准监测以及变量施肥决策的理论研究对于提高化肥利用率，减少农田环境污染，以及促进农业增产增效具有重要现实意义。

精准施肥的管理决策取决于对作物氮素营养状况和土壤养分丰缺的精确评价。早期农业工作者通过观察作物外观如叶色、植株生长形态去判断，该方法虽然方法简单但是具有滞后性，当观察到明显的低氮现象时，作物产量和品质已经受到严重影响(Elliott DE,Reuter D J,Growden B,et al.Improved strategies for diagnosing andcorrecting nitrogen deficiency in spring wheat[J].Journal of plant nutrition,1987,10(9):1761-1770.)。植株含氮量能够直接反映作物氮素营养状况，并且与作物产量有着较好的相关性。目前，多数作物采用测定植株氮含量作为指示作物营养状态的指标。但是对氮素含量的测定需要专业性较强的人员操作，并操作过程繁琐耗时长，测试成本高，很难实时做出氮素营养状况的诊断结论，这不能满足大范围内对作物养分状况实时诊断的需求。

氮素与植物叶绿素含量相关，低氮会影响叶绿素形成，所以，利用叶绿素仪测定SPAD(Specialty products agricultural division)值可以反应出作物氮素营养状况。但是SPAD测定结果准确性受到测定环境限制，如果植株同时缺乏两种或两种以上营养元素时，或者出现由病虫害、药害、生理病害等非营养元素引起的与低氮时类似外观症状时，容易造成误判。因此，如何准确并且高通量的探测作物氮素状况，对于指导作物养分诊断研究和精准变量施肥具有重要意义。

目前关于植物在转录水平上响应低氮胁迫的分子机制有广泛报道。玉米基因组中大约有五万个编码基因(MaizeGDB)，研究发现低氮处理会导致大约7％的玉米基因在转录水平上发生改变(Xiaofeng S.Yang,Jingrui Wu,Todd E.Ziegler,et al.GeneExpression Biomarkers Provide Sensitive Indicators of in Planta NitrogenStatus in Maize.2011,157(4):1841-1852.)，而这些变化会将缺氮信号快速地传递到结构蛋白和蛋白酶水平导致植物的生长发育等过程发生变化。然而，具体是哪些基因的转录水平变化表达只与低氮胁迫相关，而与其他响应无关，尚不明确。

发明内容

针对现有玉米植株氮素含量预测技术的缺陷和不足，本申请通过生物信息分析、实时定量PCR，生物统计学分析等技术筛选鉴定氮素响应基因，进而提供一组结构简单、设计合理、使用方便，易高通量操作、简便、准确、快速检测玉米氮素状况的方法。

具体而言，上述发明目的是通过以下技术方案实现的：

首先，本申请提供了一种预测玉米植株氮素状态的方法，其具体步骤如下：

3)分别提取郑58以及测试玉米样品的叶穗RNA，反转录获得郑58以及样品cDNA；所述郑58是指充足氮环境生长的郑58玉米植株。

4)分别以郑58以及玉米样品cDNA为模板，进行实时定量PCR检测，分别检测充足氮郑58和测试玉米样品中基因Zm00001d039049、基因Zm00001d037680、基因Zm00001d024281的表达量；再以郑58中基因Zm00001d039049、基因Zm00001d037680、基因Zm00001d024281的表达量，分别与测试玉米样品材料对应基因的表达量进行比较(Fold Difference＝郑58/样品材料)，即获取实时定量PCR反应的CT值，利用2^-ΔΔCT分别计算样品中基因Zm00001d039049、基因Zm00001d037680、基因Zm00001d024281相对表达量，并分别计为x4、x3、x2；

5)将x4、x3、x2带入函数Y＝1.143+0.017*x2+0.017*x3-0.302*x4，即获知测试玉米样品氮含量预测值Y；若Y＞1.30，则认为玉米生长达到正常状态，不需要补充氮肥；若Y＜1.22，则认为玉米生长未达到正常状态，需要补充氮肥。

本申请以充足氮郑58为对照，与其他测试玉米材料的生物标记物基因表达量进行比较(Fold Difference＝郑58/样品材料)，利用线性模型进行预测所获得在足氮环境下的不同样品的氮含量预测值范围为0.72-1.22；在缺氮环境下的不同样品的氮含量预测值范围为1.30-1.67。所以在以充足氮郑58作为对照时，当氮含量预测值Y大于1.30时表明玉米生长达到正常状态，不需要补充氮肥；当氮含量预测值Y小于1.22时表明玉米生长未达到正常状态，需要补充氮肥。

本申请中，术语“充足氮”是指施用足氮为250kgka^-1(参见文献“Chengsong Liao,Yunfeng Peng,Wei Ma,Renyi Liu,Chunjian Li,and Xuexian Li.(2012).Proteomicanalysis revealed nitrogen-mediated metabolic,developmental,and hormonalregulation of maize(zea mays L.)ear growth.Journal of Experimental Botany,63(14),5275-5288.”)。

进一步而言，上述预测玉米植株氮素状态的方法中，进行实时定量PCR反应是指：以郑58或玉米样品cDNA为模板，核苷酸序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6为引物进行荧光定量PCR反应；

PCR反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，10微升；Primer 1(10μM)，0.4微升；Primer 2(10μM)，0.4微升；cDNA(100ng/微升)，1微升；ddH₂O，8.2微升。

PCR反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒，40个循环。

其次，本申请还提供了一组用于预测玉米植株氮素状态的引物，包括：

4)用于检测Zm00001d039049基因的上游引物和下游引物，他们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

5)用于检测Zm00001d037680基因的上游引物和下游引物，他们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

6)用于检测Zm00001d024281基因的上游引物和下游引物，他们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本申请利用生物信息学分析的方法鉴定出的能够在不同氮素处理下准确评估植株氮状况的生物标记物候选基因，再通过实时定量PCR的方法筛选出三个稳定表达且反应灵敏的生物标记物基因，从而建立的一种生物标记物指示玉米植株含氮量诊断方法。该生物标记物能广泛适用于多种玉米自交系和杂交种材料，另外这种方法比直接利用消煮法测定植物全氮含量操作上简便,通量更高。本申请提供的三个生物标记物基因可以作为有效的农艺工具实时监测田间条件下玉米植株的氮状态，精确指示植物对氮素需求情况，依据植物需求而施入氮肥，达到氮肥分施，精确施氮的目的，在提高玉米产量的同时，降低生产成本，尽量减少施用氮肥带来的潜在环境污染。

附图说明

图1为生物标记物候选基因在B73材料中表达情况示意图。

图2为两种氮素处理下不同玉米材料的穗位叶总氮含量示意图。

图3为4个候选基因表达差异倍数与植株总氮差异倍数相关性分析示意图。

图4为构建广义线性模型(A)两基因模型(B)三基因模型(C)四基因模型示意图。

具体实施方式

实施例涉及到生物试剂及引物合成与测序：

Trizol试剂购于Invitregen公司；

PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购于TaKaRa公司；ChamQTM

qPCR Master Mix试剂盒购于诺维赞生物科技有限公司；

实时定量PCR仪为AB17900 HT TagMan machine；

浓硫酸和30％H₂O₂购于国药集团化学试剂有限公司；

实施例所涉及的引物均交由上海生工有限公司合成。

下述实施例中所使用的试验方法无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.芯片数据的获得

从NCBI网站上下载获到不同氮素处理下玉米材料RNA芯片数据(http://www.nbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE32361)。实施例所使用的不同氮素处理下玉米材料DNA的微阵列数据从NCBI网站上下载获得(http://www.nbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE32361)(参见文献：Xiaofeng S.Yang,Jingrui Wu,ToddE.Ziegler,et al.Gene Expression Biomarkers Provide Sensitive Indicators of inPlanta Nitrogen Status in Maize.2011,157(4):1841-1852.)，随后通过多个处理步骤进行数据过滤。数据过滤后获得的探针组比对到B73基因组上，获得基因ID；通过MAIZE GDB网站获得候选基因在玉米植株各部位表达情况，筛选出在叶片中表达的候选基因；同时利用葛敏等(参见文献：葛敏,吕远大,张体付,周玲,林峰,赵涵.玉米氮素敏感性差异自交系的表达谱分析[J].作物学报,2016,42(10):1487-1494.)在高氮和低氮处理下B73材料基因表达RNA-Seq数据、Stelpflug(参见文献：Stelpflug S C,Sekhon R S,Vaillancourt B,etal.An Expanded Maize Gene Expression Atlas based on RNA Sequencing and itsUse to Explore Root Development[J].The Plant Genome,2016,9(1).)等在不同组织、不同发育时期B73材料基因表达RNA-Seq数据对候选基因进行筛选。

2.涉及玉米品种和种植方式

供试玉米(Zea maysL.)品种及来源如表1所示，所用部分供试材料的氮素利用效率存在显著差异(葛敏,吕远大,张体付,周玲,林峰,赵涵.玉米氮素敏感性差异自交系的表达谱分析[J].作物学报,2016,42(10):1487-1494.)。试验材料于2020年5月-7月在江苏省农业科学院进行盆栽(45cm×30cm×50cm)种植。实验所用土壤为五年未施氮肥的大田土(全氮含量0.7g/kg)，pH为6.1-6.8，偏酸性。

实验采用穴盘播种育苗，V3阶段移植盆栽，播种时各施0.4g/kg的氮肥(尿素)、0.12g/kg的磷肥(P₂O₅)和0.08g/kg钾肥(K₂O)作为基肥。在玉米植株生长至V12阶段进行不同氮素处理追肥，试验共设置2个处理：低氮试验组不追加氮肥(N0)，高氮处理试验组追加0.6g/kg尿素(N1)。

表1供试玉米品种

3.样品处理

在玉米生长至V12阶段收集1/2片穗位叶，液氮研磨至粉末状，取1/4叶片粉末立刻冻存于－80℃备用，后续用于穗位叶RNA提取实验；其他3/4叶片粉末于105℃烘箱杀青30min，再于65℃烘至恒重，过60目细筛，获得粉末干样，备用，后续用于消煮法叶片总氮含量测定实验。

4.消煮法叶片总氮含量测定

前期穗位叶样品处理后，称取步骤3获得的0.05g粉末干样于定氮管，1mL ddH₂O润湿样品，加入5mL浓硫酸，盖上盖弯管漏斗静置过夜；将消煮炉温度加热至250℃消煮20min，加入10滴催化剂(30％过氧化氢)，250℃消煮20min，再添加一次催化剂，混匀后280℃继续消煮1小时。消煮完全的样品置于凯氏定氮仪中蒸馏，每个样品约5min，利用硼酸指示剂进行滴定，记录滴定体积，利用以下公式计算植株总氮含量。

全氮量(mg/g)＝(V-V0)×c(1/2HCl)×14.0×10-3/m

V—滴定试液时所用酸标准溶液的体积(L)；V0—滴定空白时所用酸标准溶液的体积(L)；

c—0.01mol/L(1/2HCl)标准溶液浓度；m—烘干叶片粉末的质量(g)。

3.Trizol法提取RNA

将保存于－80℃的叶片样品用液氮快速研磨成粉末，立即加入Trizol试剂(TaKaRa公司)充分匀浆，室温放置5min，4°低温离心机12000rpm离心10min；转移上清至RNase-Free离心管中，按照Trizol：氯仿＝1：5比例加入氯仿，轻柔混匀，室温放置15min，离心；小心转移上层水相，按照Trizol：异丙醇＝1：2比例加入异丙醇，轻柔混匀，室温静置10min，离心；此时RNA呈白色团状沉淀在试管底部，用75％冰乙醇充分洗涤沉淀，在RNase-Free通风橱中开盖放置5min，除尽乙醇，避免乙醇影响后续实验；最后用RNase-Free ddH2O(于75°预热)溶解RNA样品5min，获得RNA溶液。测定RNA浓度及纯度，A260/A280在1.8-2.0之间RNA提取质量较好，若＜1.8存在DNA污染，转移水相时存在中间相污染。若＞2.2存在氯仿污染。注意RNA提取过程规范实验操作，避免RNA酶的降解反应。

5.实时定量PCR实验

试验样品为步骤3-80℃保存备用的叶片粉末。

使用InvitrogenTRIzol试剂(ThermoFisher公司)提取叶片RNA。使用PrimeScript^TMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa公司)进行反转录反应获得cDNA。按照诺维赞生物科技有限公司的ChamQ

qPCR Master Mix说明配制实时定量PCR反应混合液：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，10微升；上游引物(10μM)，0.4微升；下游引物(10μM)，0.4微升；Template cDNA(100ng/微升)，1微升；ddH₂O，8.2微升。使用AB17900 HT TagMan machine仪器进行实时定量PCR反应。

PCR首选95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒，40个循环；溶解曲线程序设置为95℃，

实施例1

1、利用生物信息学分析过滤筛选候选基因

本实施例使用的不同氮素处理下玉米材料DNA的微阵列数据从NCBI网站上下载获得(GSE32361)。随后通过多个处理步骤进行数据过滤，以Log2强度值≥9.0为标准，筛选得到基因表达强度较高的探针集；t检验，以P值≤0.01作为显著差异标准，筛选得到高氮处理与低氮处理基因表达量差异显著的探针；以高、低氮处理下基因表达差异倍数≥10为标准，进一步筛选得到高氮处理与低氮处理基因表达量差异显著的探针(表2)。

表2氮响应生物标记物候选基因的生物信息学分析和筛选

数据过滤后获得的探针组比对到B73基因组上，获得基因ID；通过MAIZEGDB网站获得候选基因在玉米植株各部位表达情况，筛选出在叶片中表达的候选基因；同时利用葛敏等(葛敏,吕远大,张体付,周玲,林峰,赵涵.玉米氮素敏感性差异自交系的表达谱分析[J].作物学报,2016,42(10):1487-1494.)在不同氮水平处理下B73材料基因表达RNA-Seq数据、GSE32361微阵列数据对候选基因进行筛选，取在两组数据中基因表达水平都较高且高氮、低氮处理下基因表达差异显著的基因，作为氮响应生物标记物候选基因进行实时定量PCR实验验证。

2、实时定量PCR鉴定玉米氮素状况生物标记物候选基因

表3生物标记物候选基因实时定量PCR实验引物

为进一步鉴定生物标记物候选基因(见表3)在氮素处理下变化情况，利用Trizol法提取不同氮素处理下B73植株的穗位叶RNA，通过实时定量PCR方法对10个生物标记物候选基因做进一步筛选(即：反转录B73植株的穗位叶RNA获得样品cDNA后，以该cDNA为模板，以表1所示引物为引物，按照诺维赞生物科技有限公司的ChamQ

qPCR Master Mix说明书配制实时定量PCR反应混合液进行实时定量PCR反应，以同时检测表3中10种基因的表达量)。

检测结果显示，编号为1、5的两个基因在两种氮素(高氮N1、低氮N0)处理下，基因表达变化不显著；其他基因均在两种氮素处理下表达差异显著，并且多个生物学重复B73材料中可以稳定表达(见图1)。

以上检测发现，第2、3、7、8、9号基因在低氮(N0)处理后基因表达量下调，4、6、10基因在低氮(N0)处理后基因表达量上调。以上实验初步筛选出8个在高氮(N1)、低氮(N0)处理下基因表达差异显著，并且可以稳定表达的生物标记物候选基因。

3.生物标记物基因表达模式与叶片总氮含量相关性

为了解上述8个候选基因在不同基因型材料中表达模式，进一步选取遗传多样性丰富、生态区域广泛的26种自交系材料和4种杂交种材料进行实时定量PCR实验(表1)，结果显示在高、低氮处理下，这8个基因在不同材料之间对氮素的响应呈现不同模式，其中有4个基因(Zm00001d022630、Zm00001d024281、Zm00001d037680、Zm00001d039049)在25种以上材料中均表现出充足氮、低氮处理后基因表达存在显著差异情况，与在B73材料中结果一致。其他4个基因在30种供试材料中出现多种材料表达模式不一致，不能稳定表达。

为了验证Zm00001d022630、Zm00001d024281、Zm00001d039049和Zm00001d037680这4个候选基因表达变化是否准确反映供试材料植株氮含量，利用凯氏定氮法测定植株穗位叶氮含量。最后发现22-27号玉米材料氮含量没有表现出差异，而其他供试材料穗位叶总氮含量在充足氮环境下培育的玉米植株氮含量显著高于低氮环境下生长的材料(如图2所示)。这与四个基因在不同氮处理下材料的表达差异变化变化趋势一致。

进一步分析了两种氮素处理下4个基因表达丰度差异倍数与穗位叶总氮含量差异倍数进行相关性，结果四个基因丰度差异倍数均与穗位叶总氮含量差异倍数均呈现显著相关性(R²均大于0.6)，如图3所示。图3中，(A)-(D)依次为Zm00001d022630、Zm00001d024281、Zm00001d039049和Zm00001d037680相关性检测结果示意图。

其中，Zm00001d022630、Zm00001d024281、Zm00001d037680这3个基因表达变化与氮含量变化呈正相关，Zm00001d039049基因呈负相关。根据以上结果，认为这4个基因可以有效反映玉米植株体内氮含量，可以作为生物标记物基因，用于指示玉米氮素营养状况。

4.模型建立

为了方便上述生物标记物基因在实践中的应用，利用实时定量PCR实验数据，本实施例以同批次种植的氮处理充足的郑58材料作为对照材料，与大棚中栽培的两种氮处理下其它所用材料进行比较(Fold Difference＝其它材料/其他所用材料)，以对照材料与其它所用材料的基因表达差异比值为X值，Zm00001d0226309(x1)、Zm00001d024281(x2)、Zm00001d037680(x3)、Zm00001d039049(x4)，以对照材料与其它所用材料的穗位叶氮含量比值为Y值，利用SPSS2.0软件线性回归分析方法进行模型构建，分别获得两基因、三基因、四基因广义线性模型，用于预测玉米植株氮含量，如图4所示。图4中，(A)为Zm00001d037680(x3)、Zm00001d039049(x4)基因构建的两基因模型，(B)为Zm00001d024281(x2)、Zm00001d037680(x3)和Zm00001d039049(x4)三个基因构建的三基因模型，(C)为Zm00001d0226309(x1)、Zm00001d024281(x2)、Zm00001d037680(x3)、Zm00001d039049(x4)构建的四基因模型，其中y轴表示预测差异倍数，x轴表示实际差异倍数。

表5模型函数关系

表5中Y值表示预测玉米植株氮含量差异倍数，x值表示对照材料郑58/试验材料基因表达差异倍数，Zm00001d0226309(x1)、Zm00001d024281(x2)、Zm00001d037680(x3)、Zm00001d039049(x4)。

在两基因模型中，由Zm00001d037680(x3)、Zm00001d039049(x4)基因构建模型相关性(R²＝0.51)相关性最高；在三基因模型中，由Zm00001d024281(x2)、Zm00001d037680(x3)和Zm00001d039049(x4)三个基因构建的线性模型的相关性(R²＝0.53)相关性最高，如图4(B)所示；四基因模型与三基因模型相关性基本一致，均高于两基因模型(见表5)。

基于预测功效与测试成本考虑，最终确定由Zm00001d024281、Zm00001d037680和Zm00001d039049这三个生物标记物构建的三基因模型以快速有效指示玉米氮素营养状况。

在具体生产实践中，可以利用表5所示的线性模型的函数关系，预测氮含量差异倍数Y值。其具体方法为：分别取样品以及充足氮郑58植株的穗位叶叶尖3-4cm叶片，通过实时定量PCR方法得到Zm00001d024281、Zm00001d037680和Zm00001d039049三基因相对表达量，再根据表5所示函数关系，得到预测氮含量差异倍数Y值。

实施例2

将商业杂交种郑单958和先玉335种植在穴盘播种育秧，V3阶段移植盆栽，播种时各施0.4g/kg的氮肥(尿素)、0.12g/kg的磷肥(P₂O₅)和0.08g/kg钾肥(K₂O)作为基肥。在玉米植株生长至V12阶段进行不同氮素处理追肥，试验共设置2个处理，低氮试验组不追加氮肥(N₀)，充足氮处理试验组追加0.6g/kg尿素(N₁)在玉米生长至V12阶段分别收集两种氮处理下的穗位叶，液氮研磨至粉末状，取一部分冻存于－80℃用于RNA提取；另外一部分粉末烘干，用于凯氏定氮法叶片总氮含量测定。

首先使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa公司)进行反转录反应。以反转录获得cDNA为模板进行实时定量PCR反应。生物标记物引物参照表3，以ActinII作为内参基因，引物F的和核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

按照试剂盒说明书进行RT-PCR反应混合液，使用AB17900 HT TagMan machine仪器按照两步法进行60℃退火温度和40个PCR循环的实时定量PCR反应。然后进行数据分析。

以从充足氮下种植的郑58为对照，与其他测试玉米材料的生物标记物基因表达量进行比较(Fold Difference＝郑58/其他材料)，利用三基因模型Y＝1.143+0.017*x2+0.017*x3-0.302*x4，对测试材料氮素差异倍数进行预测，结果显示充足氮处理下郑单958的预测氮含量比值为1.09；低氮处理下郑单958的预测氮含量比值为1.52；充足氮处理下先玉335的预测氮含量比值为1.17；低氮处理下先玉335的预测氮含量比值为1.32。

为了验证以上预测的玉米氮素营养状态是否准确，进一步测定郑58和测试材料玉米穗位叶总氮含量，同样以从充足氮下种植的郑58为对照材料，结果显示郑58与充足氮处理下郑单958的实测氮含量比值为1.11；郑58与低氮处理下郑单958的实测氮含量比值为1.43；郑58与充足氮处理下先玉335的实测氮含量比值为1.02；郑58与低氮处理下先玉335的实测氮含量比值为1.31。由此可见，本实施例三基因模型预测的作物氮素营养状况与实际测定氮素营养状况吻合，这说明这三个生物标记物可以准确预测植物氮素营养状况。

以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种预测玉米植株氮素状态的方法及引物组

<141> 2021-09-21

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctacggcgag ggcacatcc 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacagacaga cagaggtcca tcc 23

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcaccgagg accagagg 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagcgcacct cctcagcag 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggtccgaca ggttctacaa gg 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtgctcgct ggtgtgctc 19

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcttgactg agcgtggtta ttcc 24

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctggtcctg gctgtctcc 19

Claims

1.一种预测玉米植株氮素状态的方法，其特征在于，具体步骤如下：

分别以郑58或玉米样品cDNA为模板，进行实时定量PCR检测；再以郑58中基因Zm00001d039049、基因Zm00001d037680、基因Zm00001d024281的表达量，与样品对应基因表达量进行比较，获得样品中基因Zm00001d039049、基因Zm00001d037680、基因Zm00001d024281的相对表达量，分别计为x4、x3、x2；

将x4、x3、x2带入函数Y=1.143+0.017*x2+0.017*x3-0.302*x4，即获知样品氮含量预测值Y；

若Y＞1.30，则认为玉米生长达到正常状态，不需要补充氮肥；若Y＜1.22，则认为玉米生长未达到正常状态，需要补充氮肥。

2.如权利要求1所述预测玉米植株氮素状态的方法，其特征在于，步骤2）所述实时定量PCR检测是指，以郑58或玉米样品cDNA为模板，分别以基因Zm00001d039049、或基因Zm00001d037680、或基因Zm00001d024281的上游引物为引物I，以基因Zm00001d039049、或基因Zm00001d037680、或基因Zm00001d024281的下游引物为引物II，进行实时定量PCR检测。

3.根据权利要求2所述预测玉米植株氮素状态的方法，其特征在于，步骤2）所述实时定量PCR检测是指，

PCR反应体系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10微升；10 µM的引物I0.4微升；10 µM的引物II 0.4微升；浓度为100ng/微升的cDNA， 1微升；ddH₂O，8.2微升；

PCR反应程序：95°C预变性3分钟；95℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒，40个循环。

4.根据权利要求2所述预测玉米植株氮素状态的方法，其特征在于，步骤2）中基因Zm00001d039049上游引物、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

基因Zm00001d037680上游引物、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示；

基因Zm00001d024281上游引物、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。

5.一组用于预测玉米植株氮素状态的引物，包括：

用于检测Zm00001d039049基因的上游引物和下游引物，他们的核苷酸序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

用于检测Zm00001d037680基因的上游引物和下游引物，他们的核苷酸序列分别如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

用于检测Zm00001d024281基因的上游引物和下游引物，他们的核苷酸序列分别如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示。