CN114480718A - 一种基于kasp技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用，属于分子生物学及作物遗传育种技术领域。基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组包括扩增OsTT1的引物组、扩增SLG1的引物组和扩增SUS3的引物组。本发明对OsTT1、SLG1和SUS3中SNP位点设计引物，通过筛选，去除了引物组合出现的错配、发夹结构、引物二聚体等情况，获得的3组引物组可有效区分等位变异位点，可用于增强水稻耐高温能力。采用所述引物组对16份水稻材料进行3个耐高温基因有利等位变异分析，结果能够明显区分不同水稻种质3个耐高温基因的基因型的检测，为耐高温水稻辅助育种提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及作物遗传育种技术领域，具体涉及一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是我国的主要粮食作物，在国家粮食安全战略中占有主导地位。随着温室效应和极端异常天气的频繁出现，高温热害已经成为影响水稻生产最重要因素之一，而长江中下游，如江西的大部、湖南的东部、浙江的西南部、四川的东部和广东的东北部等地，作为主要的水稻产区也成为高温热害的重灾区(郑建初等,2005)。高温是严重影响水稻的产量和品质，不仅会导致花粉发育异常，活力下降，还会抑制颖花开放和花药开裂程度，阻碍传粉和受精，造成结实率下降(MATSUI et al.,2002,2005；TAO et al.,2007；Zhang et al.,2007；RANG et al.,2011)。特别是我国长江中下游稻区每年规律性的7月中旬至8月下旬38℃以上极端高温，而这段时间正好是双季早稻的灌浆期，水稻灌浆期是产量和米质形成的关键时期，结果造成“籽粒高温逼熟”，导致秕粒率增加、籽粒充实度下降、产量降低、米质变劣，给水稻生产造成严重损失。因此，开展水稻耐高温种质资源的筛选和水稻品种的耐高温性精准鉴定，以推动水稻耐高温性育种进程，保障国家粮食安全已成为当前水稻研究的一个重要课题。
水稻耐高温性是受多种遗传因素和环境共同调控的数量性状。目前已克隆且存在功能变异的水稻耐热性基因主要有OsTT1(LOC_Os03g26970)、SLG1(LOC_Os12g39840)和SUS3(LOC_Os07g42490)。如OsTT1编码区存在3个单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)位点，其中SNP2位点1个G/A的变化导致其编码的蛋白第99个氨基酸由精氨酸(Arg99)变为组氨酸(His99)，而His99的替换可提高泛素化蛋白的降解效率，从而提高水稻的耐高温能力。依据该单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)可将核心种质材料OsTT1分作两种单倍型，二者存在极显著的耐高温性差异。SLG1编码区存在7个SNP位点，其中第865位T/C和第1839位G/T的变化，分别导致缬氨酸(Val)到丙氨酸(Ala)和缬氨酸(Val)到苯丙氨酸(Phe)的变化，并引起耐高温性差异。这两个SNP在水稻核心种质材料中紧密连锁，利用这个两个SNP中的任意一个都可以将水稻核心种质分成两类，且二者在耐高温表型上存在极显著的差异。利用导致基因功能变异的碱基位点开发标记，筛选野生稻中的有利等位变异，为培育水稻耐高温品种具有重要意义。然而，传统的连锁标记主要是基于与基因连锁的分子标记进行基因型鉴定，不能用来准确鉴定材料目标性状有利基因单倍型组合以及进行定向的改良育种，并且操作复杂、通量小、劳动力消耗量大。因此，开发水稻重要耐高温基因标记，利用基因标记辅助选择耐高温性较好的目标单株，可以大大提高选择效率，加快育种进程。
分子标记技术能够有效的辅助优异基因的选育，但是现有的分子标记技术仍存在许多不便利的因素。常规的分子标记无法摆脱在完成聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)之后，进行酶切、电泳、染色和显带检测等系列冗长的步骤，增加了操作和劳动成本，操作也不方便，难于用于大规模的育种应用中。
KASP基因分型技术是一项独特的竞争型等位基因特异性PCR，可对各种基因组核酸样品进行SNPs和Indels(insertion deletion)高精度双等位基因分型。KASP标记在PCR扩增反应完成后，无需经过电泳分析，无需染色或添加荧光标记，只需要借助荧光定量PCR仪运行扫描程序1min，即可完成基因型的分析工作。同时，基因分型结果可以方便地导出，既省去了人工读取基因型的时间，也避免了人为误读所带来的偏差。总的来说，KASP技术操作简单，分析稳定、准确，并且成本较低。水稻基因组大小约400Mb，经探索发现20～50ngDNA为最适宜的模板用量，利用上述3个基因功能位点开发的分子标记，对野生稻资源及水稻种质进行有利等位基因的鉴别及不同基因有利单倍型组合筛选，进行特定有利基因的转移和聚合，提水稻耐高温性，可以极大地节省成本，增加选择的准确性和效率，提高育种效率。然而目前尚未有用于检测水稻耐热基因分型的试剂，制约了耐热水稻育种的研究进程。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用，应用于野生稻和水稻种质的筛选、鉴定以及应用于基因型辅助选择改良水稻耐热性。
本发明提供了一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组，包括扩增OsTT1的引物组、扩增SLG1的引物组和扩增SUS3的引物组；
所述扩增OsTT1的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物；
所述扩增SLG1的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；
所述扩增SUS3的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的反向引物；
第一正向引物和第二正向引物采用不同标记物修饰。
优选的，所述标记物包括荧光基团或标签序列。
优选的，3条第一正向引物分别采用FAM标签序列修饰，3条第二正向引物分别采用HEX标签序列修饰；
所述FAM标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
所述HEX标签序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明提供了一种用于水稻耐高温基因分型的检测试剂盒，包括所述引物组。
优选的，所述检测试剂盒还包括2×KASP Master Mix。
本发明提供了所述引物组或所述检测试剂盒在水稻耐高温基因分型中的应用。
本发明提供了所述引物组或所述检测试剂盒在耐高温水稻辅助育种中的应用。
本发明提供了一种水稻资源的耐高温基因型的分型方法，包括以下步骤：
1)提取待检测水稻资源的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)将步骤2)中所述PCR扩增产物进行标记物检测，获得3个片段对应的基因型。
优选的，所述PCR扩增的反应体系为5μl：模板DNA 2.43μl，引物混合液0.07μl，2×ASP Master Mix 2.5μl，每条第一正向引物或每条第二正向引物的终浓度为12μM，每条反向引物的终浓度为25μM。
优选的，所述PCR扩增的反应程序为：94℃15min；94℃20s，61℃～55℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，32个循环。
本发明提供了一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示的扩增OsTT1的引物组、核苷酸序列如SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:6所示的扩增SLG1的引物组和核苷酸序列如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:9所示的扩增SUS3的引物组；其中第一正向引物和第二正向引物采用不同标记物修饰。本发明对OsTT1(LOC_Os03g26970)、SLG1(LOC_Os12g39840)和SUS3(LOC_Os07g42490)中SNP位点设计引物，通过筛选，去除了引物组合出现的错配、发夹结构、引物二聚体等情况，获得的3组引物组可有效区分等位变异位点，可用于增强水稻耐高温能力。本发明实施例中，采用所述引物组对16份水稻材料进行3个耐高温基因有利等位变异分析，结果能够明显区分不同水稻种质3个耐高温基因的基因型的检测，为耐高温水稻辅助育种提供了新思路。
附图说明
图1为本发明实施例中基因功能位点标记TT1_KASP在16份水稻材料间的基因型簇图；
图2为本发明实施例中基因功能位点标记SLG1_KASP在16份水稻材料间的基因型簇图；
图3为本发明实施例中基因功能位点标记SUS3_KASP在16份水稻材料间的基因型簇图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组，包括扩增OsTT1的引物组、扩增SLG1的引物组和扩增SUS3的引物组。本发明所述水稻耐热基因包括OsTT1(LOC_Os03g26970)、SLG1(LOC_Os12g39840)和SUS3(LOC_Os07g42490)，它们的功能性分子标记分别对应于表1中M1～M3。
表1耐高温基因SNP位点信息
引物组的具体序列如表2所示。
表2扩增OsTT1、SLG1、SUS3的引物组
其中，第一正向引物和第二正向引物采用不同标记物修饰，以便后续基于标记物的差异判断基因型情况。所述标记物优选包括荧光基团或标签序列。在本发明实施例中，以标签序列为标记物来修饰引物。在本发明实施例中，3条第一正向引物分别采用FAM标签序列修饰，所述FAM标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:10(gaaggtgaccaagttcatgc)所示。3条第二正向引物分别采用HEX标签序列修饰；所述HEX标签序列如SEQ ID NO:11(gaaggtcggagtcaacggatt)所示。本发明对所述引物组的各引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物来源即可。在本发明实施例中，所述引物组委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明提供了一种用于水稻耐高温基因分型的检测试剂盒，包括所述引物组。所述检测试剂盒优选还包括2×KASP Master Mix。所述2×KASP Master Mix优选购自videgene(FLU-ARMs 2×PCR Mix V4)公司。
本发明提供了所述引物组或所述检测试剂盒在水稻耐高温基因分型中的应用。
本发明提供了一种水稻资源的耐高温基因型的分型方法，包括以下步骤：
1)提取待检测水稻资源的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)将步骤2)中所述PCR扩增产物进行标记物检测，获得3个片段对应的基因型。
本发明提取待检测水稻资源的基因组DNA。
本发明对提取水稻基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取方法即可，例如试剂盒法提取或CTAB法。在本发明实施例中，所述提取方法采用植物基因组试剂盒完成。
提取后，本发明以提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选为5μl：模板DNA 2.43μl，引物混合液0.07μl，2×ASP Master Mix 2.5μl，每条第一正向引物或每条第二正向引物的终浓度为12μM，每条反向引物的终浓度为25μM。所述PCR扩增的反应程序优选为：94℃15min；94℃20s，61℃～55℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，32个循环。
得到PCR扩增产物后，本发明将所述PCR扩增产物进行标记物检测，获得3个片段对应的基因型。
在本发明中，根据标记物的种类选择检测方法。当标记物为荧光基团时，检测激发光的颜色。当标记物为荧光标签序列时，进行进行荧光数据读取，荧光扫描的结果得到基因型分型结果。在本发明实施例中，第一正向引物用Fam序列标签修饰，对应的TT1基因型为AA，SLG1基因型为GG，对应的SUS3基因型为AA，第二正向引物用Hex序列标签修饰，对应的TT1基因型为GG，SLG1基因型为TT，对应的SUS3基因型为GG。
鉴于本发明提供的引物组能够准确获得三个耐高温基因的基因型，因此本发明提供了所述引物组或所述检测试剂盒在耐高温水稻辅助育种中的应用。所述耐高温水稻辅助育种的方法，优选包括采用所述引物组对水稻材料进行筛选，获得携带有利等温基因的水稻材料进行后续杂交或转基因受体材料；或者利用所述引物组扩增目标基因，为后续水稻改良或构建转基因水稻提供材料。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
水稻重要耐高温基因功能标记的开发
1、根据文献Li X,Chao D,et al.Natural alleles of a proteasome α2subunit gene contribute to thermotolerance and adaptation of African rice[J].Nature genetics,2015,47:827-836的报道。TT1对应于MSU基因编号：LOC_Os03g26970，该基因编码区第2261位SNP：G/A变异直接导致基因功能差异。在ricevarmap2(RiceVarMap2.ncpgr.cn)网站上分析基因LOC_Os03g26970在4000多份水稻种质的变异，发该基因在功能变异位点上游82bp和109bp处存在两个SNP，而在其下游200bp内没有变异位点，因此在MSU网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载LOC_Os03g26970的基因序列，同时发现截取该基因功能SNP位点上游50bp、下游150bp的序列设计KASP引物。根据KASP引物设计的规则，首先固定F引物(即功能变异位点上游20bp)，并在F引物上分别添加FAM和HEX标签，得到引物TT1-Fam-F(引物1)和TT1-Hex-F(引物2)，其中引物1对应有利等位基因可提高水稻的耐高温能力，R引物则在功能变异位点下游设计，考虑到整个引物组合出现错配、发夹结构和引物二聚体等情况，设计了4条R引物TT1-R、TT1-R1、TT1-R2、TT1-R3(引物3至引物6)分别和F引物组配，具体见表3。
表3开发的TT1引物组合
结果见图1。引物TT1-R(引物3，功能变异位点下游2-23bp)为最优的组配引物，可以有效的TT1两种等位变异分开(图1)。
2、根据文献Xu Y,Zhang L,et al.Natural variations of SLG1 confer high-temperature tolerance in indica rice[J].Nature communication,2020,11:5441-5453的报道。SLG1对应于MSU基因编号：LOC_Os12g39840，其中第865位T/C和第1839位G/T的变化直接导致基因功能差异。在ricevarmap2网站上分析该基因在4000多份水稻种质中的变异，发现第865位T/C功能变异位点上游11bp和26bp均存在SNP，而第1839位功能SNP上游25bp和下游200bp内均无变异。因此，优先利用SLG1的第1839位SNP开发该基因的功能标记。根据KASP标记设计规则，将F引物设定在第1839位SNP上游25bp，并在F引物上分别添加FAM和HEX标签，得到引物SLG1-Fam-F(引物7)和SLG1-Hex-F(引物8)，其中引物7对应有利等位基因可增强水稻耐高温能力，R引物则在功能变异位点下游设计，考虑到整个引物组合出现错配、发夹结构和引物二聚体等情况，设计了2条R引物SLG1-R(引物9)和SLG1-R1(引物10)分别和F引物组配。具体见表4。
表4开发的SLG1引物组合
结果见图2。引物SLG1-R(引物9)与相应的F引物组合效果最优，可以有效的SLG1两种等位变异分开(图2)。同时在SLG1基因第865位SNP处也开发了一对KASP标记，F引物为第865位SNP上游22bp，并在F引物上分别添加FAM和HEX标签，得到引物SLG1-Fam-F2(引物11)和SLG1-Hex-F2(引物12)，其中引物11对应有利等位基因可增强水稻耐高温能力，考虑整个引物组合出现错配、发夹结构和引物二聚体等情况SLG1-R2(引物13)为下游27bp至52bp，利用PCR技术检测发现该引物组合不如SLG1-Fam-F、SLG1-Hex-F与SLG1-R引物组合的效果。
3、根据文献Takehara K,Murata K,et al.Thermo-responsive allele ofsucrose synthase 3(SUS3)provides high-temperature tolerance during theripening stage in rice(Oryza sativa L.)[J].Breeding Science,2018,68:336-342的报道。SUS3对应于MSU基因编号：LOC_Os07g42490，该基因编码区存在6个影响氨基酸变异的SNP(基因编码区第948、3264、4076、4107、4442和4451位碱基，依次命名为SNP1到SNP6)。在ricevarmap2网站上分析基因LOC_Os07g42490在4000多份水稻种质中的变异，发现SNP1上游112bp至下游42bp，SNP2上游215bp至下游37bp，SNP3上游444bp至下游30bp，SNP4上游30bp至下游23bp，SNP5上游310bp至下游8bp，SNP6上游8bp至下游85bp无碱基变异，根据KASP引物设计的原则与DNA序列的GC含量及形成特殊结构的特性，选择SNP3开发基因SUS3的功能标记。根据以往的设计思路，将F引物设定在功能变异位点上游(即功能变异位点上游20bp)，并在F引物上分别添加FAM和HEX标签，得到引物SUS3-Fam-F1(引物14)和SUS3-Hex-F1(引物15)，其中引物15对应有利等位基因可提高水稻的耐高温能力，R引物则在功能变异位点下游设计。具体见表5。
表5开发的SUS3引物序列
所述标签FAM的核苷酸序列为gaaggtgaccaagttcatgct；所述标签HEX的核苷酸序列为gaaggtcggagtcaacggatt。SUS3-Fam-F1、SUS3-R2是根据正义链(SEQ ID NO:29)来设计的，SUS3-Fam-F、SUS3-R、SUS3-R1是根据反义链(SEQ ID NO:30)来设计的。
考虑到整个引物组合出现错配、发夹结构和引物二聚体等情况，在SNP3下游31bp至56bp设计R引物SUS3-R2(引物16)，利用PCR技术检测发现引物组合(引物14、15和16)并不能有效区分SUS3的两种等位基因。原因可能是在SUS3-R2引物上存在SNP变异，导致分型结果不理想。因此避开SNP3下游31bp处变异的干扰，我们利用该段序列的反向互补序列来开发引物，同样将F引物固定在SNP3上游1-22bp，并在F引物上分别添加FAM和HEX标签，得到引物SUS3-Fam-F(引物17)和SUS3-Hex-F(引物18)，其中引物17对应有利等位基因可以有效提高水稻耐高温能力；在功能变异位点下游，结合整个引物组合出现错配、发夹结构和引物二聚体等情况设计了SUS3-R(引物19)和SUS3-R1(引物20)两条R引物，经PCR检测发现引物SUS3-R(引物19)与相应的F引物组合效果最优，可以有效的SUS3两种等位变异分开(图3)。
实施例2
一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的检测试剂盒
包括引物组和检测试剂
其中，引物组具体序列见表6。所述检测试剂为2×KASP Master Mix。
表6试剂盒中各引物序列信息
实施例3
水稻重要耐高温基因功能标记的多态性筛选
针对3个水稻重要耐高温基因的功能位点分子标记，采用实施例2所述试剂盒对包括7份野生稻(包含福建、广东、广西、海南、湖南、云南、江西地方野生稻)和9份栽培稻(KOSHIHIKARI、密阳46、Milyang23、广陆矮4号、IR64、日本晴、珍汕97B、N22、非洲栽培稻ACC9)在内的16份水稻材料进行KASP反应，测试标记分型情况。
PCR扩增反应使用的体系为5μl：模板DNA 2.43μl，引物混合液0.07μl，2×ASPMaster Mix 2.5μl，引物Fam-F、引物Hex-F终浓度均为12μM，引物R终浓度为25μM。
PCR扩增反应的条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，32个循环。
PCR反应结束后，利用ABI-StepOnePlus荧光定量PCR仪对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果导出成列表格式，即得到表7中基因分型结果。
3个耐高温基因功能位点标记在16份材料间基因型簇图分别见图1～图3。针对野生稻及水稻种质进行3个耐高温基因有利等位变异分析，发现野生稻含有的有利耐高温等位基因并不多，说明在野生稻资源中还有其他重要的耐高温基因。
表7测试种质材料分型结果
注：表4中TT1_KASP对应的Allele 1、2分别为G、A，SLG1_KASP对应的Allele 1、2分别为T、G，SUS3_KASP对应的Allele 1、2分别为C、T。Heterozygote表示杂合型。
由于水稻耐高温特性是数量性状由多基因控制，且受遗传背景影响，针对目前已克隆的3个耐高温基因开发了相应的基因功能标记，在遗传背景相似的情况下，三个基因都可以增强水稻耐高温特性，同时三个基因也具有累加效应。本发明实施例检测的水稻种质是代表不同生态型不同地区的种质，能够说明所述引物组具有广适性。不同遗传背景的水稻材料，包含单个或少数几个耐高温基因很难体现出耐高温能力的差异。但在相似的遗传背景下，包含单个或少数几个耐高温基因就可以明显体现出的耐高温特性的差异。开发这些基因标记的目的是针对耐高温能力定向改良某些特定水稻品系，辅助育种
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江西省农业科学院水稻研究所
中国科学院东北地理与农业生态研究所
<120> 一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaagcacaa cagtattatc a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaagcacaa cagtattatc g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaccatcaaa taccttgtac ag 22
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcgactacg tccaaaattc cagaagg 27
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgactacgt ccaaaattcc agaagt 26
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaaaagtgg actcatcgct atc 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taggtgagcc tcttctgtga ttt 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggtgagcct cttctgtgat tc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggtgctgac atgtccatct ac 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaaggtgacc aagttcatgc tgcaagcaca acagtattat ca 42
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggtcgga gtcaacggat tgcaagcaca acagtattat cg 42
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggataggata gcactgtaaa actgc 25
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tacgtctacg acatattttt tta 23
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gactattcct acgtctacga c 21
<210> 17
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggtgacc aagttcatgc tgcgactacg tccaaaattc cagaagg 47
<210> 18
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaaggtcgga gtcaacggat tgcgactacg tccaaaattc cagaagt 47
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccacacatca gacagagaat ctca 24
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaggtgacc aagttcatgc tggcgttaaa gcgatgcaca ttgt 44
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaaggtcgga gtcaacggat tggcgttaaa gcgatgcaca ttgc 44
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aacctgcgtt ccccatcctc cgatt 25
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaaggtgacc aagttcatgc tccatctact tcccattcac cg 42
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaaggtcgga gtcaacggat tccatctact tcccattcac ca 42
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gagtagctcc tctatctcta 20
<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaaggtgacc aagttcatgc taggtgagcc tcttctgtga ttt 43
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaaggtcgga gtcaacggat taggtgagcc tcttctgtga ttc 43
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtccatggta tcgatgtctt tgacc 25
<210> 29
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> n=g or a
<400> 29
caacatcgtc tctcctggtg ctgacatgtc catctacttc ccattcaccn aatcacagaa 60
gaggctcacc tctctccatt tagagataga ggagctactc ttcagtgatg ttgaaaacac 120
tgagcacaag tgagtattgt ataatctttt accagtttga gttgtaactc aacatatgca 180
tatcatgcct gttatcttac tggactacct ctgtaggttt gttctgaagg acaagaagaa 240
gccaatcatc ttctcgatgg ctaggctaga ccatgtcaag aatttgactg gtctggttga 300
<210> 30
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n=c or t
<400> 30
aatggagaga ggtgagcctc ttctgtgatt nggtgaatgg gaagtagatg gacatgtcag 60
caccaggaga gacgatgttg aacttggggt caaagacatc gataccatgg acaacacgat 120
aaaggccagg cattgtgaat gccatgtgag actcatactg ccccacagtt tccttgctga 180
aaattggatg atgatgtaag atcagcttat gccatttaca aatatccaga aagtttgtaa 240
aaggaaaatc ttactttcca gcaatctcct ggaaggtact tgtgatgatg aagtcagcat 300
ggttcattgc aatcaggtca gctgtgaact ggcaggagaa gtgatagtga 350
Claims (10)
1.一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组，其特征在于，包括扩增OsTT1的引物组、扩增SLG1的引物组和扩增SUS3的引物组；
所述扩增OsTT1的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物；
所述扩增SLG1的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；
所述扩增SUS3的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的反向引物；
第一正向引物和第二正向引物采用不同标记物修饰。
2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述标记物包括荧光基团或标签序列。
3.根据权利要求2所述引物组，其特征在于，3条第一正向引物分别采用FAM标签序列修饰，3条第二正向引物分别采用HEX标签序列修饰；
所述FAM标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
所述HEX标签序列如SEQ ID NO:11所示。
4.一种用于水稻耐高温基因分型的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3一项所述引物组。
5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括2×KASPMasterMix。
6.权利要求1～3任意一项所述引物组或权利要求4或5所述检测试剂盒在水稻耐高温基因分型中的应用。
7.权利要求1～3任意一项所述引物组或权利要求4或5所述检测试剂盒在耐高温水稻辅助育种中的应用。
8.一种水稻资源的耐高温基因型的分型方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待检测水稻资源的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1～3任意一项所述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)将步骤2)中所述PCR扩增产物进行标记物检测，获得3个片段对应的基因型。
9.根据权利要求8所述分型方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为5μl：模板DNA2.43μl，引物混合液0.07μl，2×ASP MasterMix 2.5μl，每条第一正向引物或每条第二正向引物的终浓度为12μM，每条反向引物的终浓度为25μM。
10.根据权利要求8或9所述分型方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃15min；94℃20s，61℃～55℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，32个循环。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117701755A (zh) * | 2023-12-21 | 2024-03-15 | 辽宁省水稻研究所 | 一种水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记及引物组和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106854658A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-06-16 | 华中农业大学 | 利用蔗糖合酶提高水稻稻瘟病抗性的方法 |
| CN111471787A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-07-31 | 上海市农业科学院 | 一种鉴定水稻耐高温tt1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 |
| CN113388013A (zh) * | 2020-02-26 | 2021-09-14 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 耐热相关蛋白slg1及其编码基因在调控水稻耐热性中的应用 |
| CN113930539A (zh) * | 2021-11-09 | 2022-01-14 | 连云港市农业科学院 | 水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发及其应用 |
| CN113930532A (zh) * | 2021-08-25 | 2022-01-14 | 上海市农业科学院 | 检测水稻耐高温基因tt1的kasp分子标记及方法 |
-
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- 2022-03-08 CN CN202210218922.4A patent/CN114480718B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106854658A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-06-16 | 华中农业大学 | 利用蔗糖合酶提高水稻稻瘟病抗性的方法 |
| CN113388013A (zh) * | 2020-02-26 | 2021-09-14 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 耐热相关蛋白slg1及其编码基因在调控水稻耐热性中的应用 |
| CN111471787A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-07-31 | 上海市农业科学院 | 一种鉴定水稻耐高温tt1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 |
| CN113930532A (zh) * | 2021-08-25 | 2022-01-14 | 上海市农业科学院 | 检测水稻耐高温基因tt1的kasp分子标记及方法 |
| CN113930539A (zh) * | 2021-11-09 | 2022-01-14 | 连云港市农业科学院 | 水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| KANA TAKEHARA, ET AL.: "Thermo-responsive allele of sucrose synthase 3 (Sus3) provides high-temperature tolerance during the ripening stage in rice (Oryza sativa L.)", BREEDING SCIENCE, vol. 68, pages 336 - 342 * |
| XIN-MIN LI， ET AL.: "Natural alleles of a proteasome α2 subunit gene contribute to thermotolerance and adaptation of African rice", NATURE GENETICS, vol. 47, no. 7, pages 827 - 836 * |
| YUFANG XU, ET AL.: "The impact of high-temperature stress on rice: Challenges and solutions", THE CROP JOURNAL, pages 963 - 976 * |
| 姚瑶等: "基于KASP 技术开发检测水稻耐高温TT1 基因型的分子标记", 分子植物育种, pages 1 - 6 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117701755A (zh) * | 2023-12-21 | 2024-03-15 | 辽宁省水稻研究所 | 一种水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记及引物组和应用 |
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|---|---|
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