CN117701755A - 一种水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记及引物组和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记及引物组和应用，通过对本发明的水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记，应用PARMS技术对水稻材料进行Ptr基因检测，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测水稻稻瘟病抗性基因Ptr。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少PCR产物气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于Ptr基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。
Description
技术领域
本发明涉及水稻育种领域，特别是一种水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记及引物组和应用。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，稻瘟病在水稻的整个生长过程都可能发生，严重时导致颗粒无收，威胁着粮食安全，利用水稻自身的抗病基因是防治稻瘟病是最经济有效的方式，且对环境友好。水稻抗稻瘟病基因Ptr对我国不同稻区的稻瘟病菌表现广谱抗性，在水稻育种中具有较高的利用价值。
稻抗病育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。利用分子标记辅助选择育种简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期，亦可进行有目的的多基因聚合，提高育种效率，带来巨大的社会经济效益。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记及引物组和应用。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记，所述SNP分子标记为Ptr-W1，所述Ptr-W1的多态性位点位于水稻12号染色体的Ptr基因第10833386-10833387位碱基，第10833386-10833387位碱基为TG或AA。
本发明的第二个目的是要提供一种用于检测水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记的引物组，所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Primer Seq Ptr-W1Ra和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Primer Seq Ptr-W1Rt；所述通用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PrimerPtr-W1F。
优选地，所述Primer Seq Ptr-W1的5’端连接FAM或HEX荧光序列，PrimerSeqAllele Y的5’端连接HEX或FAM荧光序列。
本发明的第三个目的是要提供一种水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记在鉴定水稻Ptr基因型中的应用。
本发明的第四个目的是要提供一种用于检测水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记的引物组在鉴定水稻Ptr基因型中的应用，包括如下步骤：
S1、从水稻叶片中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用用于检测水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记的引物组，用PARMS技术对Ptr-W1分子标记进行检测；若Ptr-W1的SNP位点的碱基为TG，判定测试的水稻样品为纯合的抗病Ptr基因型；若Ptr-W1的SNP位点的碱基为AA，判定测试的水稻样品为纯合的感病的Ptr基因型；若Ptr-W1的SNP位点同时检测到TG、AA，判断待测水稻为杂合的抗病Ptr基因型。
与现有技术相比，通过对本发明的水稻稻瘟病抗性基因Ptr进行SNP分子标记，应用PARMS技术反应对水稻材料进行Ptr基因检测，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测水稻稻瘟病抗性基因Ptr。本发明利用PARMS技术对所开发的SNP标记进行基因分型，相比于目前最常用的基于PCR+电泳的SSR技术，PARMS SNP检测技术免去了耗时费力的电泳技术，采用荧光扫描的方式直接读取等位基因的基因型信号，配合数据分析软件，可快速完成基因型分析工作，工作效率具有数量级的提升。PARMS技术非常适用于检测自动化，配合GeneMatrix高通量基因分型系统，可以做到每天十万个数据点的超高通量的Ptr基因鉴定和稻瘟病抗性资源筛选。PARMS完美兼容LGC KASP SNP检测硬件体系以及引物，可做到无缝转换。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少PCR产物气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择，减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于Ptr基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。
附图说明
图1为本发明实施例的分子标记位置。
图2为PARMS SNP检测技术流程图。
图3为本发明实施例中不同品种分子标记Ptr-W1的分型图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
以下实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例公开了水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记，所述SNP分子标记为Ptr-W1，所述Ptr-W1的多态性位点位于水稻12号染色体的Ptr基因第10833386-10833387位碱基，10833386-10833387位碱基为TG或AA，SNP标记Ptr-W1在水稻染色体上的位置如图1所示。具体设计过程如图2所示，通过已克隆目标基因Ptr确定物理位置，提取SNP位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：
1)引物设计
根据文献的定位标记信息，确定Ptr(GenBank：MG385185.1)物理位置是日本晴(MSU7.0)的12号染色体10822534-10833768区间，提该区间的SNP位点和侧翼序列，并利用在线引物设计网站http://www.snpway.com/对其进行引物设计。Ptr-W1的引物设计如表1所示，每组标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列，引物委托武汉市景肽生物科技有限公司合成。
表1
2)样品检测
DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。
PARMS反应测试：10ul PCR反应体系。在PCR反应板中加入20ng DNA样品，烘干后加入PARMS MasterMix反应混合液(由武汉市景肽生物科技有限公司生产)，反应体系见表2。
表2
| 体积 | 终浓度 | |
| 10μMPrimerPtr-W1F | 0.4μL | 400nM |
| 10μMPrimerPtr-W1Ra | 0.15μL | 150nM |
| 10μMPrimerPtr-W1Rt | 0.15μL | 150nM |
| 2xPARMSMasterMix | 5μL | 1x |
| 超纯水 | 补至10μL |
PCR扩增在ABI 7500荧光定量PCR系统中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，32个循环。PCR反应完成后进行荧光数据读取，荧光数据的结果转化成图形。
3)自然群体验证
根据上述检测方法，用标记Ptr-W1对含有Ptr基因的58个水稻品种进行PARMS初筛反应验证，结果如表3所示，分型图如图3所示。
表3
由表3可以看出，携带Ptr基因品种在Ptr-W1测试位点检测出碱基TG为抗病Ptr型,如辽粳168、辽盐2号；不携带Ptr基因的对照全部为不抗病Ptr的碱基AA或阴性对照，Ptr基因未在检测的粳稻品种中广泛应用，后续可以导入Ptr基因定向改良稻瘟病抗性，Ptr-W1可用于水稻Ptr基因的高效检测。
结果表明利用SNP标记Ptr-W1对Ptr基因的检测准确，并能同时能够检测出携带的基因是否纯合。在利用SNP标记Ptr-W1进行分子标记辅助育种时能够有效快速筛选到携带纯合抗病基因Ptr的水稻株系。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记为Ptr-W1，所述Ptr-W1的多态性位点位于水稻12号染色体的Ptr基因第10833386-10833387位碱基，第10833386-10833387位碱基为TG或AA。
2.一种用于检测权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记的引物组，其特征在于：所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Primer Seq Ptr-W1Ra和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的PrimerSeq Ptr-W1Rt；所述通用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PrimerPtr-W1F。
3.根据权利要求2所述的用于检测水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记的引物组，其特征在于：所述Primer Seq Ptr-W1的5’端连接FAM或HEX荧光序列，Primer SeqAlleleY的5’端连接HEX或FAM荧光序列。
4.一种如权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记在鉴定水稻Ptr基因型中的应用。
5.一种如权利要求2或3所述的用于检测水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记的引物组在鉴定水稻Ptr基因型中的应用。
6.根据权利要求5所述的用于检测水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记的引物组在鉴定水稻Ptr基因型中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从水稻叶片中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用用于检测水稻稻瘟病抗性基因Ptr的SNP分子标记的引物组，用PARMS技术对Ptr-W1分子标记进行检测；若Ptr-W1的SNP位点的碱基为TG，判定测试的水稻样品为纯合的抗病Ptr基因型；若Ptr-W1的SNP位点的碱基为AA，判定测试的水稻样品为纯合的感病的Ptr基因型；若Ptr-W1的SNP位点同时检测到TG、AA，判断待测水稻为杂合的抗病Ptr基因型。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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