CN103451200A

CN103451200A - 一种控制玉米株高的分子标记及应用

Info

Publication number: CN103451200A
Application number: CN2012101717807A
Authority: CN
Inventors: 张祖新; 腾峰; 翟立红; 郑用琏
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2013-12-18

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，与分子标记制备和应用领域相关。本发明的分子标记来源于ZmGA3ox21基因片段，位于玉米第3染色体，控制玉米株高性状。分离克隆ZmGA3ox2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。获得一个作为玉米株高的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6-9所示。利用图位克隆的策略证实该基因的自然变异可以影响玉米株高的数量变异，其自然变异可以引起玉米节间细胞长度的变化，表达量的变化及体内活性GA含量的变化。该基因的自然变异不影响产量及花期相关性状。对矮秆突变体d1-6016的遗传分析证实该基因的大片段缺失可以导致玉米植株矮化。

Description

一种控制玉米株高的分子标记及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种分子标记的制备及应用，本发明的分子标记来源于QTLqPH3.1基因片段，其位于玉米第3染色体上，控制玉米株高性状。本发明公开了QTLqPH3.1基因的分离克隆及作为控制玉米株高的分子标记，本发明还涉及该分子标记的开发及应用。

背景技术

玉米是重要的粮食、饲料、工业原料和生物质能作物。生物学产量和籽粒产量都是玉米遗传育种的目标性状。株高与玉米籽粒产量和生物学产量密切相关，是一个重要的产量相关性状。因此，株高是玉米遗传和育种发明中重要的目标性状，对株高基因的鉴定与克隆具有重要的指导意义。

矮秆基因的应用在水稻和小麦中掀起了第一次绿色革命。当前，利用矮秆突变体已经克隆出大量的株高基因，这些基因大都涉及到赤霉素（GA）的生物合成及信号传导，著名的水稻和小麦的绿色革命基因就属于此类(Monna et al.,2002;Peng et al.,1999;Sasaki et al.,2002;Spielmeyer et al.,2002)，表明内源激素GA的含量与植物株高紧密相关，精确调控活性GA的生物合成与降解对茎秆的正常延伸非常重要。因此，通过对内源生物活性GA水平的遗传操纵从而产生矮秆植株是一个可行的策略。植物内源活性GA的量是由活性GA的合成速率与其转化为非活性GA的速率两方面共同决定的。在整个GA生物合成途径中，GA2氧化酶（GA 2-oxidase，GA2ox）负责将活性GA分解代谢为非活性GA。因此，通过抑制生物活性GA的合成或促进其分解代谢都可以用来减少内源GA的含量。基于这两条减少内源GA含量的途径，不同的发明小组提出了很多想法，并在水稻中做了一些尝试，其中利用GA生物合成基因OsGA3ox2（D18）的启动子来驱动GA2ox基因的异位表达，从而达到减少植株体内活性GA水平的方法，在水稻中取得了很好的突破(Sakamoto et al.,2003)，说明利用生物技术的手段也可以创造出矮秆品种。在玉米中，大量的玉米矮秆突变体也已经被鉴定(Sheridan,1988)，但是这些突变体往往伴随着植株的严重矮化，对产量和其他农艺性状也有很大的影响，不适合在实际育种中应用。因此，鉴定和克隆表现为数量变异的株高基因非常有必要。

鉴于此，本发明利用图位克隆的策略，克隆了一个位于玉米第3染色体的株高QTLqPH3.1，并最终鉴定到了一个住噶基因ZmGA3ox2。基于连锁分析、关联分析和突变体分析三种途径，均检测到ZmGA3ox2对株高有显著效应。另外，来自于表达、细胞学及生理学等分析也从逻辑上支持候选基因的正确性。

发明内容

本发明是利用图位克隆策略分离位于玉米第3染色体的株高性状的QTL qPH3.1，并对最终的候选基因进行功能验证，将获得的该基因命名为QTL qPH3.1（在下面的描述中以QTL qPH3.1代替QTL qPH3.1基因，二者的含义相同），以该基因的片段作为控制玉米株高的分子标记及应用。

本发明利用玉米第3染色体ND1-ND75区段近等基因系（NIL）综3（国家农作物种质中心）和SL15（或称HB522，国家农作物种质中心）杂交构建的分离群体，对qPH3.1进行精细定位。在2007年，申请人构建了一个含有161个单株的NIL-F₂群体，利用该群体申请人对株高及产量相关性状包括百粒重、行粒数、穗行数、穗粗、穗长进行QTL鉴定。结果表明，在ND1-ND75区段确实存在一个株高QTL，可以解释32.3%的表型变异。而未检测到任何产量相关性状的QTL，说明qPH3.1仅影响株高，而不影响产量相关性状。申请人在2008年和2009年构建了2个更大的NIL-F₂分离群体，分别含有617和2153个单株，对qPH3.1进行精细定位。在2008年分离群体中，申请人评估了qPH3.1对产量相关性状及两个花期性状（抽雄期和吐丝期）的影响。结果表明：qPH3.1对产量及花期性状均无影响。利用8个含有不同重组的目标区段的跨叠系（sub-NIL）将qPH3.1定位至ND87—ND88区间，两个标记间距离为12.6kb，在该12.6kb的区间内仅存在一个开放阅读框（ORF），申请人将其作为候选基因。使用快速扩增cDNA末端（RACE）技术获得了该基因的1892bp全长cDNA，同时PCR扩增该基因的完整的编码区DNA片段及其启动子。序列分析显示，该基因包含3个外显子，2个内含子，cDNA序列含有1个1149bp的ORF，其编码382个氨基酸，5′-非编码区（5′-UTR）和3′-非编码区（3′-UTR）的长度分别为238bp和505bp。因该基因与水稻的OsGA3ox2表现出80%的氨基酸一致性，申请人将其命名为ZmGA3ox2。申请人分析了玉米矮秆突变体dwarf-1（d1）的其中一个等位突变体d1-6016(美国玉米种质中心，Stock center USA）发现其ZmGA3ox2基因存在2304bp的片段缺失，包括734bp的起始密码子上游序列和1570bp的编码区。申请人同时构建了d1-6016的分离群体，ZmGA3ox2基因内的标记ND88和表型表现出完美的共分离。d1-6016中ZmGA3ox2基因的大片段缺失及ND88与表型的共分离表明ZmGA3ox2就是负责d1的基因，ZmGA3ox2具有控制玉米株高的功能。细胞学观察发现SL15的节间细胞显著长于综3（p<0.01），表明SL15相对于综3节间的延长是由于细胞长度的纵向增加，而非细胞数目的增加。生物信息学及表达分析表明ZmGA3ox2是玉米营养器官中唯一起作用的GA3氧化酶，在茎秆延伸中起着决定性作用。申请人利用quantitative RT-PCR分析了ZmGA3ox2在4个不同时期的综3和SL15的茎尖组织中的表达，结果表明在茎尖中，ZmGA3ox2在SL15中的表达水平显著高于综3，意味着SL15相对于综3将拥有更多的活性GA，进而导致SL15的株高高于综3。外源赤霉素（GA）喷施处理可以消除综3和SL15的株高差异。候选基因关联分析表明ZmGA3ox2启动子区的自然变异影响玉米植株高度。

本发明的优点在于：

（1）本发明在玉米中克隆并证实了一个控制株高的QTL，再一次证实了株高与GA生物合成的关系。

（2）本发明为玉米株高的遗传改良提供了新的基因和可供用于分子标记辅助选择改良玉米株高的分子标记。该基因可以改变株高大约20cm，而不影响产量及其相关性状。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的与玉米株高基因ZmGA3ox2的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的与玉米株高基因ZmGA3ox2的全长cDNA。

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的与玉米株高基因ZmGA3ox2编码的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：4是本发明克隆的矮秆突变体d1-6016中的ZmGA3ox2的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：5是本发明用于候选基因关联分析所测序列。

序列表SEQ ID NO：6-9是本发明开发的分子标记ND78和ND88的引物序列。

图1：是综3和SL15（HB522）的株高、节间长度比较。注：(a)和(b)：成熟期的综3和SL15的株高。白色箭头标注玉米的节（比例尺：50cm）。（c）：综3和SL15的雄穗和各节间长度的比较。*和***分别代表0.05和0.001的显著水平。误差线代表SD，n_综3=48,n_SL15=63。t-test检验差异的显著性。穗上节间用1、2、3、4、5、6标注，穗下节间用-1、-2、-3、-4、-5、-6和-7标注，雄穗用T标注。

图2：是qPH3.1的图位克隆。注：（a）基于2008年所构建的分离群体定位的qPH3.1位置。（b）SL15（HB522）、综3及8个跨叠系的基因型和表型。#670，#348和#427是由2008年分离群体中的交换单株发展而来，其余5个跨叠系来自于2009年分离群体。表型数据代表均值±标准差。n，每个跨叠系评估表型的单株数目。**，表示跨叠系的均值与综3的均值在0.01水平显著。NS，在0.01水平不显著。

图3：是ZmGA3ox2的基因结构及综3与SL15（HB522）间的多态性。注：灰盒和白盒分别代表外显子和UTR区域。垂直线代表SNP，其中3个SNP位于启动子区（位于-999bp,-885bp,-626bp处），1个位于5′UTR区（-7bp处），1个位于第一外显子（181bp处）。三角形代表插入缺失（InDel），上三角形表示综3相对于SL15的缺失，下三角形表示SL15相对于综3的缺失。数字表示缺失碱基的数目。

图4：是d1-6016等位基因的突变。注：（a）+/d1-6016和d1-6016/d1-6016分别表示杂合和纯合突变体。（b）利用引物4046F和7762R扩增B73和d1-6016纯合子中的ZmGA3ox2。（c）ZmGA3ox2的基因结构，灰盒和白盒分别表示外显子和UTR区域，d1-6016等位基因缺失的区域用虚线表示。箭头标明引物4046F和7762R的位置。三角形标注ND88的位置。（d）ND88和表型共分离。

图5：是ZmGA3ox2在不同的器官和组织中的表达。注：RNA自以下组织提取：冠根（CR），胚根（PR），再生根（SR），侧根（LR），中胚轴（CM），幼苗地上部分（SH），茎（ST），未成熟叶片（IL），幼雌穗（IE），幼雄穗（IT），纯合d1-6016突变体的幼雄穗（IT-d1）。

图6：是综3和SL15（HB522）四个不同时期的ZmGA3ox2的表达分析。注：拔节后对综3和SL15（HB522）的茎尖部位进行取材，共4个时期，每个时期间隔7天。Actin（NM_001155179作为内参）。每个时期的综3的表达量作为1，每个样品3次生物学重复，数据代表均值±标准差。t-test用来计算P值。

图7：是成熟期玉米节间的徒手纵切片。综3与SL15（HB522）节间细胞长度比较，误差线代表标准差（n>600）。t-test用来比较细胞长度差异的显著性。

图8：外源GA₃处理对综3和SL15（HB522）株高的效应。注：所有植株种植于温室，从萌芽后第2周开始测量株高。每组测量13至17株。各个时间点的综3(-)与SL15(-)比较，综3(+)与SL15(+)比较，误差线不重叠的表明在P<0.01水平，均值显著差异。综3(-)，SL15(-)，综3(+)，SL15(+)分别代表对照综3，对照SL15，处理的综3和处理的SL15。

具体实施方式

以下实施实例进一步定义本发明，并描述了qPH3.1的定位、克隆、功能验证及分子标记开发的方法。根据以下的描述和实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出适当的完善和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：qPH3.1的精细定位

(1)SL15（HB522）的遗传构成及其与综3的表型差异

SL15（HB522，来自国家农作物种质中心）和综3（来自国家农作物种质中心）是本试验用于QTL定位群体制备的亲本材料。SL15是一个染色体片段代换系，其主要遗传背景来自于综3，而在第3染色体的umc2369标记附近的染色体区段与综3存在差异，其导入片段来源于HB522（国家农作物种质保存中心种质库）。申请人使用了均匀分布于全基因组的245个SSR标记，对SL15和综3间的遗传差异进行评价。结果表明，SL15中导入片段的两侧可初步界定于bnlg1647~bnlg1447之间。为更准确界定导入片段的两端位置，基于B73参考基因组bnlg1647~bnlg1447区段两侧序列，申请人新开发了2个SSR标记ND1（位于bnlg1647上游）和ND75（位于bnlg1447下游），并最终作为导入片段的界限。本发明所开发的标记见表 1。以上几个标记在染色体上的顺序为ND1-bnlg1647-umc2369-bnlg1447-ND75，ND1与ND75所界定的导入片段的物理距离为2.6Mb。该导入片段跨越玉米第3染色体的3.02bin~3.03bin。另外，全基因组SSR扫描发现，仅在第3染色体上3.06bin存在一个与综3具有差异的分子标记dupssr23，说明在SL15中dupssr23附近的染色体片段来自于供体亲本，与综3具有等位差异。SSR分析表明，SL15与综3基因组的相似性为97.96%，两个自交系间的遗传差异很小，仅为2.04%。SL15和综3就是本发明用于qPH3.1定位的亲本材料。

比较SL15与综3的株高、节间数目和节间长度，申请人发现SL15的株高为203.9±10.8cm，显著高于综3的株高179.7±10.5cm（见图1a，图1b）；SL15与综3间的节间数目相同，均为穗上6个节间，穗下7个节间，表明两个材料间株高的差异是由于节间长度的差异所引起的，而不是节间数目的变化。为了展示节间长度的差异，申请人定义穗下的节间为-1到-7，穗上的节间为1到6，雄穗为T（图1a）。比较综3与SL15间相对应的节间长度和雄穗长度，结果表明SL15的所有节间都显著长于综3相对应的节间，但二者间雄穗的长度无显著差异（图1c）。

表1本发明开发的用于qPH3.1精细定位的SSR和InDel标记

说明：表1中ND78和ND88分子标记的引物已经录入说明书序列表SEQ ID NO：6-9。

表2不同大小群体对qPH3.1的鉴定

^a数据表示均值±标准差。n：群体大小；A：加性效应；D：显性效应。ZZ：综3纯合子；SS：SL15纯合子；ZS：杂合子。3种基因型基于最显著的标记进行划分。R²表示QTL解释的表型变异。

(2)株高QTLqPH3.1的初步定位

为鉴定控制SL15与综3株高差异的遗传因子，申请人以综3和SL15为亲本杂交，构建了一个含有161个单株的F2群体。使用ND1和ND75所锚定的染色体区段内的8个SSR标记（包括2个公共标记和6个新开发的标记）检测F2单株的基因型。QTL定位结果表明，ND1和ND75所锚定的染色体区段内存在一个株高QTL，该QTL位于ND51-ND35染色体区间，遗传距离4.0cM，可以解释32.3%的表型变异，SL15等位基因的加性和显性效应分别是9.6cm和4.5cm（表2），申请人定义该QTL为qPH3.1。为了鉴定SL15背景基因组中所残留的位于dupssr23标记处的供体染色体片段对株高的影响，申请人基于该标记，将分离群体分为3种基因型，方差分析表明，3种基因型间株高表型不存在显著差异，说明dupssr23所在的染色体片段与株高不相关。同时，申请人还考察了该分离群体的5个产量相关性状，包括百粒重、穗行数、行粒数、穗粗和穗长，检测qPH3.1区段是否与这5个产量性状相关。结果表明，F₂分离群体中这5个产量相关性状的变异不大，且qPH3.1区段及dupssr23所在的染色体片段均未定位到这5个性状的QTL，并且5个产量相关性状由qPH3.1所定义的3种基因型间，表型差异不显著（表3）。这些结果表明qPH3.1仅控制玉米株高，不影响产量相关性状。

表3分离群体中不同基因型的产量相关性状

基于QTL区域的标记划分3种基因型。ZZ,综3纯合子；SS，SL15纯合子；ZS，杂合子。数据表示均值±标准差。n.s.，在P<0.05水平不显著。NA，表示性状没有测量。

(3)株高QTLqPH3.1的精细定位

以SL15和综3为亲本杂交，在2008年和2009年，构建了分别含有617个和2153个单株的F₂分离群体。目标QTL区段内的所有标记都用来检测两个群体的基因型，并进行株高QTL的检测。在2008年所构建的分离群体中，申请人同样评估了qPH3.1对穗长、穗粗、穗行数和行粒数4个产量相关性状的效应。与2007年所鉴定的结果相似，qPH3.1不影响穗长、穗粗、穗行数和行粒数的表型（表3）。另外，申请人还评估了qPH3.1对抽雄期和吐丝期两个性状表型的影响，结果表明qPH3.1对2个花期性状均无影响（表3）。在2008年所构建的群体中，qPH3.1被定位于ND51-ND35间，遗传距离3.3cM（图2），SL15等位基因的加性和显性效应分别是10.8cm和4.4cm，QTL所解释的表型变异为36.6%（表2）。利用2009年所构建的群体，qPH3.1被缩短到umc2369-ND37区间，大约2.1cM，解释30.0%的表型变异。SL15等位基因的加性和显性效应分别是10.0cm和3.7cm（表2），qPH3.1的作用方式为部分显性。

在ND51和ND35所界定的qPH3.1区间，共开发了6个新的标记用以鉴定重组基因型，进而发展QTL 区段内的纯合跨叠系（sub-NIL）。经过连续自交，发展了8个sub-NILs，分别代表QTL区间内不同的重组交换类型（图2），其中，3个来自2008年的分离群体，5个来自2009年的分离群体。2009年于中国海南，2010年于中国武汉和中国河北保定共3个环境，分别鉴定和比较这8个sub-NILs、综3和SL15的表型。基于#670、#348、#427、#48-6、#26-6和#20-5这6个sub-NILs的表型和基因型，申请人可将qPH3.1定位至ND72-ND37区间（图2）。而#6-2和#44-3是两个最为有效的sub-NILs，二者的重组位点均位于ND87和ND88之间，且这2个系的株高均显著高于综3（P<0.01）（图2），表明ND87-ND88区间可能包含控制qPH3.1的基因，且来自SL15的等位基因可以增加株高，来自综3的等位基因则降低株高。这些新标记均是基于B73基因组序列（一个美国玉米公共DNA数据库，http://www.maizesequence.org）所开发，它们在B73基因组上的物理位置都是已知的，因而有助于申请人鉴定候选基因。在B73基因组上，ND87和ND88位于同一个BAC（c0160G03）上，二者间的距离大约为12.6kb（图2）。

生物信息学分析表明该12.6kb的区间仅包含一个ORF（GRMZM2G036340）。在MaizeGDB网站（http://www.maizesGDB.org）对该ORF进行BLAST比对，结果显示该ORF有大量的EST（DR816439、DR802279、DR824762、DR802280、DR824763、DY533225、DT941311、FL254381和DR963083）支持，表明该ORF是一个可以表达的真实基因。该ORF编码的蛋白与水稻的OsGA3ox2高度同源，一致性达到80%，因而，申请人将该基因命名为ZmGA3ox2。

实施例2：候选基因的扩增及序列分析

利用引物4046F和6276R（见表4）从综3和SL15中扩增候选基因（ZmGA3ox2）的完整编码区序列，包括基因组DNA和cDNA。cDNA的扩增采用拔节时期的茎尖RNA的反转录产物作为模板。PCR扩增使用高保真的LA Taq酶和GC Buffer Ⅱ（购自宝生物工程大连有限公司）。使用引物6107F和7762R扩增ZmGA3ox2起始密码子（ATG）的上游约1.6kb的序列。PCR扩增采用Fermentas公司的Taq酶（货号：EP0621）。以自交系B73（(美国玉米种质中心，Stock center USA）的茎尖RNA为模板，采用RACE（Rapid-Amplification of cDNA Ends）技术扩增候选基因转录本的5′和3′末端。RACE扩增所选用的试剂盒为FirstChoice RLM-RACE试剂盒（购自Ambion公司,USA），具体操作方法参见试剂盒说明。候选基因扩增所用引物见表4。

测序分析发现ZmGA3ox2含有3个外显子，2个内含子，ORF长度为1149bp，预测编码382个氨基酸的蛋白质。ZmGA3ox2基因的转录本包含238bp 5′-UTR和505bp 3′-UTR（其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：1-3所述）。

比较综3与SL15的候选基因序列，申请人发现两个自交系间在ZmGA3ox2内存在5个SNPs，其中，4个位于启动子和5′-UTR区，分别在-999bp、-885bp、-626bp和-7bp处，1个位于第一外显子的+181bp处。位于第一外显子内的SNP为G/C变异，该变异导致第61位氨基酸由丙氨酸（综3）转变为脯氨酸（SL15）。另外，在启动子区和5′-UTR区检测5个插入缺失变异（InDel），其中4个为综3相对于SL15的缺失位点，1个为SL15相对于综3的缺失位点；在内含子区和3′-UTR区也存在3处插入缺失变异（图3）。

实施例3：dwarf-1基因编码ZmGA3ox2

d1-6016纯合子植株在苗期即表现出极端矮化表型（图4a）。首先，申请人用引物4046F和7762R（见表4）对d1-6016纯合子的ZmGA3ox2全长基因进行扩增，扩增范围包含基因上游约1.6kb的启动子区和整个编码区，扩增的PCR产物预期大小在野生型玉米植株中约为3.7kb（图4b），引物在ZmGA3ox2基因上的位置见图4c。PCR扩增发现，在d1-6016纯合子中仅得到一条不到2kb的条带（图4b），推测该基因可能存在一个大的片段缺失。回收扩增条带并进行测序分析发现，与B73基因组序列比较，d1-6016的 ZmGA3ox2基因中存在2304bp的片段缺失，包括734bp的起始密码子上游序列和1570bp的编码区，丢失掉了核心启动子区域和几乎整个编码区，仅剩下第三外显子末端的64bp残留（见图4c，d1-6016的ZmGA3ox2基因序列见序列表SEQ ID NO：4）。

表4基因扩增、表达及RACE所用引物

实施例4：ZmGA3ox2的表达分析

（1）ZmGA3ox1和ZmGA3ox2的时空表达

为明确玉米基因组中除ZmGA3ox2之外，是否还存在其他的GA3ox基因，申请人利用ZmGA3ox2的编码区序列BLAST搜索玉米B73的基因组序列，结果表明，除3.03bin的ZmGA3ox2之外，在第6染色体6.05bin上还存在另外一个GA3ox基因（GRMZM2G044358），位于BAC c0451A18上，其编码的氨基酸序列与水稻的OsGA3ox1高度相似，因而申请人将其命名为ZmGA3ox1。选取玉米自交系B73的不同发育时期冠根、胚根、再生根、侧根、中胚轴、幼苗地上部分、茎、未成熟叶片、幼雌穗和幼雄穗等共10个组织，采用半定量RT-PCR方法，分析玉米中两个GA3ox基因（ZmGA3ox1和ZmGA3ox2）在不同组织中的表达水平。使用引物374F/784R扩增ZmGA3ox1的转录本，扩增片段大小为411bp；引物4046F/4221R扩增ZmGA3ox2的转录本，扩增片段大小为176bp。Actin（NM_001155179）作为内参基因。用于半定量RT-PCR分析的引物见表4。RT-PCR发明结果发现，ZmGA3ox1仅在幼嫩的雄花序中表达，而在根、幼苗、叶、茎和雌穗等器官中不表达（图5），表明ZmGA3ox1为组织特异性表达基因，而ZmGA3ox2则在所有被检测的10个组织（包括营养器官的根、茎、叶及生殖器官的雌穗、雄穗等）中均表达（图5），表明ZmGA3ox2为组成型表达基因。同时也说明ZmGA3ox1仅为玉米雄穗的发育所需要，而ZmGA3ox2则为玉米所有组织器官和各个发育阶段（包括营养生长和生殖生长）所需要。申请人检测了这2个基因在d1-6016纯合子的幼嫩雄花序中的表达情况，选择雄花序是因为在野生型植株中，这2个基因均在该组织中表达。在d1-6016中，ZmGA3ox1和ZmGA3ox2的转录本均能被检测到（图5）。尽管ZmGA3ox1基因正常表达，但是也不能改变d1-6016的矮化表型，表明ZmGA3ox1基因的功能不能补偿ZmGA3ox2的缺失，ZmGA3ox1和ZmGA3ox2的功能是不可替代的，说明ZmGA3ox2在玉米植株茎秆的生长中起着决定性作用。

（2）候选基因在茎尖组织中的表达分析

通过对玉米中2个GA3ox酶基因的表达模式分析，表明在玉米营养器官中，ZmGA3ox2是唯一起作用的GA3ox基因。因此，在营养生长阶段，ZmGA3ox2的表达量对活性GA的量起着决定性的作用。玉米中ZmGA3ox2的mRNA表达量与其内源GA₁的量正相关，而GA₁的量与株高正相关。GA主要存在于生长和延伸活跃的组织中，而茎尖就是其中生长延伸最活跃的组织之一。因此，本发明选择茎尖组织来做表达分析。采用quantitative RT-PCR的方法、以看家基因Actin（NM_001155179）为内参、3次生物重复和3次技术重复检测ZmGA3ox2在各样本中的表达。用于quantitative RT-PCR分析的内参基因及ZmGA3ox2基因的扩增引物序列见表4。申请人分析了拔节后4个不同时期的茎尖组织的表达，qRT-PCR结果表明茎尖中ZmGA3ox2，在SL15中的表达显著高于在综3中的表达，意味着SL15会合成更多的GA₁（图6）。而表型是SL15的株高高于综3，因此，表达分析的结果和表型具有很好的一致性，表达分析的结果支持候选基因的正确性。同时表达的差异也表明影响qPH3.1的功能位点可能位于启动子区。

实施例5：节间的细胞学观察

申请人选择综3与SL15两个材料之间长度变异最大的第4节间，取样后徒手切片，发明节间细胞数目和大小。细胞学观察发现，两个自交系间，节间细胞数目变化不显著，但SL15的节间细胞显著长于综3（p<0.01）（图7），表明SL15的节间长于综3主要是由于SL15的节间细胞长度的纵向增加所致。ZmGA3ox2是通过对GA水平的调控来实现对株高的调控。因此，本发明所观察到的细胞长度的变化支持ZmGA3ox2作为候选基因的正确性，也说明ZmGA3ox2可能通过调控节间细胞长度而影响植株节间长度，进而影响植株高度。

实施例6：外源GA喷施处理

如果ZmGA3ox2是qPH3.1的候选基因，那么qPH3.1引起株高变异应该是由于该QTL引起内源GA的差异所致。那么，对SL15和综3喷施外源GA，理论预期可人为消除SL15和综3间的株高差异。在本发明中，申请人使用100μL浓度为100μg/ml GA₃溶液连续处理综3和SL15。结果发现未处理的综3和SL15从萌芽后第7周开始表现出显著差异，随着发育进程的进行，两自交系间的株高差异更加明显（图8）；外源GA₃处理的综3和SL15，均表现出对GA₃的响应，其株高均显著高于相应的对照，直至外源GA₃处理8周后（抽雄期），综3和SL15的株高表现基本相似，无显著差异，说明外源GA₃处理消除SL15和综3间GA水平的差异，因而消除两者间株高表型的差异。综3和SL15间的株高差异可以被外源GA处理所消除，强烈表明GA水平的差异确实是引起株高差异的原因。GA水平的差异归根到底是由基因水平的差异所引起，暗示qPH3.1的候选基因的等位变异涉及GA的生物合成途径。因此，本实验从生理学的角度支持候选基因的正确性。

实施例7：候选基因关联分析

关联分析所使用的材料为选自于Yang et al.(2011)所构建的、代表全球玉米种质的关联分析群体中的244个自交系。采用PCR扩增结合PCR产物测序分析244份自交系中ZmGA3ox2的基因型。使用3对引物扩增ZmGA3ox2基因的编码区、启动子区和3′-UTR区。具体如下：1）扩增片段一使用引物7575F和 8823R，扩增ZmGA3ox2起始密码子ATG上游约-1.48kb至-2.73kb处，扩增长度约1.2kb，引物序列见表4；2）扩增片段二使用引物6107F和7762R扩增ATG上游约-20bp至-1.6kb的区域，扩增区段含5′-UTR和启动子，长度约1.6kb；3）扩增片段三使用引物4046F和6276R扩增整个编码区及3′-UTR区，扩增片段长约2.2kb。扩增片段一与扩增片段二有约187bp的重叠，扩增片段二与扩增片段三有约169bp的重叠。3个扩增片段总长4778bp（参考B73基因组），关联分析所测序列见序列表SEQ ID NO：5。PCR产物割胶纯化后，直接测序。使用MUSCLE(Edgar,2004)和MEGA version 5(Tamura et al.,2011)对所测序列进行比对及人工校正，采用TASSEL 3.0(Bradbury et al.,2007)抽提SNP和InDel，选取等位基因频率大于0.05的位点用作后续的关联分析。关联分析群体的表型鉴定于2009年和2010年分别在海南省三亚市和湖北省武汉市进行，244份玉米自交系按随机区组设计田间种植，两次重复。行长3.0m，株距0.3m，行距0.6m。在玉米成株期，每小区选取7-8株考察玉米株高。使用244份自交系的ZmGA3ox2基因型，结合2次试验的自交系株高表型，采用TASSEL 3.0中的MLM Q+K模型，开展候选基因关联分析。

候选基因ZmGA3ox2测序范围包括2736bp的ATG上游序列、1634bp的完整编码区序列及408bp的3′-UTR区序列（参考B73基因组序列）。多序列比对分析发现该基因存在123个最小等位基因频率（MAF）大于0.05的多态性位点，包含80个SNP和43个InDel，平均每38.8bp存在一个多态性位点。关联作图采用混合线性模型，同时控制群体结构（Q）和亲缘关系（K），结果表明有7个多态性位点与株高变异相关（P<0.05）。这7个位点中，5个位于启动子区，2个位于编码区。7个相关的位点中，有6个是在2个环境中均检测到和株高变异显著相关。值得注意的是，有3个显著相关的位点（S-574，S-565和S181）在综3和SL15间表现出多态性，特别是S-574和S-565两个位点，在关联群体中表现出株高高的等位基因来自于SL15（表5）。

表5ZmGA3ox2的多态性与株高的相关性

^a阿拉伯数字表示缺失碱基的数目，字母表示多态性核苷酸。加粗的数字和字母表示携带高的株高的等位基因。^b测序质量好的自交系的数目。R²，解释表型变异的百分率。n.s.,在P<0.05水平不显著。

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Claims

1.一种分离克隆的ZmGA3ox2基因在控制玉米株高中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述基因的应用，其特征在于作为玉米株高的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：6-9所示。