CN104878018A - 一种控制玉米行粒数和穗粒数的多效性基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制玉米行粒数和穗粒数的多效性基因及其应用，本发明的ZmSTKR基因来源于玉米QTLqKNPR6，位于玉米第6染色体上。其序列为SEQIDNO.1所示，对应的CDS为SEQIDNO.3所示，该基因控制玉米雌穗行粒数和穗粒数重要产量性状。通过在水稻中超表达该基因，可明显增加水稻的穗粒数和行粒数，达到增产的目的，针对掖478和SL57-6ZmSTKR基因序列差异，设计基因标记，通过分子标记辅助选择方法，能够准确快捷的区分控制行粒数等位基因型的优劣，选择具有SL57-6ZmSTKR相同的等位基因型的自交系作为优异的等位变异用于玉米的遗传改良。

Description

一种控制玉米行粒数和穗粒数的多效性基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种控制玉米行粒数和穗粒数的多效性基因及其应用，本发明的基因来源于玉米QTL qKNPR6，位于玉米第6染色体上。该基因控制玉米雌穗行粒数和穗粒数重要产量性状。本发明公开了一个控制qKNPR6的基因ZmSTKR的分离克隆、功能证实及其应用价值，本发明还涉及基于该基因的分子标记开发与应用。 

背景技术

玉米(Zea may L.)是当今世界最重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物，在保障世界粮食安全、经济发展及缓解能源危机等方面作用巨大。与1990年相比，我国2010年玉米总产量增加了1.83倍，但总产的增加主要依赖于种植面积的增加，单产提高对总产增加的贡献约35%～40%。由于土地供给的刚性制约，为满足我国国民经济持续发展对玉米的需求，提高玉米单位面积产量是遗传育种学科的重大课题。 

在特定种植密度下，玉米单位面积产量由单穗籽粒产量与穗数决定；而单穗籽粒产量又由每穗粒数(Kernel Number per Ear:KNE)和百粒重所决定。可见，KNE是一个重要的产量因子，分离并利用控制玉米穗粒数的关键基因，不仅有助于阐明KNE形成的遗传基础，也可为玉米育种提供基因资源和理论支撑。 

鉴于此，本发明利用图位克隆技术，分离了一个位于玉米第6染色体上，可控制玉米行粒数和穗粒数的QTL qKNPR6，该基因为ZmSTKR,编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类受体(ser/thr protein kinase receptor)蛋白。基于连锁分析、自然群体中等位基因的效应分析、水稻遗传转化分析和相关分子生物学分析，证实了该基因在控制穗长、行粒数和穗粒数等性状上的生物学功能及其作用机理。 

发明内容

本发明的目的在于提供了一种控制玉米行粒数和穗粒数的多效性基因ZmSTKR，其序列为SEQ ID NO.1所示。该基因具有提高玉米行粒数和穗粒数的功能，其对应cDNA序列为SEQ ID NO.2所示，CDS序列为SEQ ID NO.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。 

本发明的另一个目的在于提供了一种控制玉米行粒数和穗粒数的多效性基因的制备方法，该方法易行，操作简便。 

本发明的另一个目的在于提供了一种基于基因ZmSTKR分子标记的引物，针对掖478和SL57-6ZmSTKR基因序列差异，设计基因标记，通过分子标记辅助选择方法，能够准确快捷的区分控制行粒数等位基因型的优劣，即选择具有与SL57-6ZmSTKR相同的等位基因型的自交系作为优异的等位变异用于玉米的遗传改良。 

本发明还提供了一种基于基因ZmSTKR分子标记的引物在玉米高产育种分子标记辅助选择中的应用。 

本发明的最后一个目的在于提供了一种控制玉米行粒数和穗粒数的多效性基因在农作物增产中的应用，通过增加农作物穗粒数和行粒数，达到增产的目的。 

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施： 

本发明的设计思路如下： 

本发明是利用图位克隆技术分离位于玉米第6染色体的行粒数和穗粒数性状的QTLqKNPR6，并对候选基因进行生物学功能验证，将获得的该基因命名为ZmSTKR（在以下描述中，当出现QTL qKNPR6时，即为ZmSTKR基因）。 

一种控制玉米行粒数和穗粒数的多效性基因，通过以下步骤制备得到： 

提取SL57-6植株叶片总DNA，根据玉米B73基因组参考序列设计引物，ZmSTKR基因PCR扩增重测序，获得了ZmSTKR基因完整的核苷酸序列（SEQ ID NO.1所示），引物表1所示（扩增SL57-6所用引物ID:10，11，12，13）。PCR扩增程序：94℃预变性5min，然后以94℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸90s,进行35个循环，最后72℃延伸5min。 

扩增体系： 

Compoent	Volume(uL)
		10×Buffer	2
MgCl2	1.5
		DNTP(10mM)	0.4
Taq(5U/uL)	0.2
		Forward primer(5uM)	1
Reverse primer(5uM)	1
		DNA(10ng/uL)	2

 

ddH2O	11.9
		Total	20

提取SL57-6约5-10mm雌穗的总RNA，反转录合成cDNA。其对应的CDS序列为SEQ ID NO.3所示，引物引物表1所示，ID:3。其表达的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。SL57-6中ZmSTKR基因CDS序列PCR扩增程序：94℃预变性5min，然后以94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min,进行35个循环，最后72℃延伸10min。 

CDS序列PCR扩增体系： 

Compoent	Volume(uL)
		LA Taq(5U/uL)	0.2
2×GC Buffer I	10
		DNTP(10mM)	0.8
CDS-F(5uM)	1.6
		CDS-R(5uM)	1.6
CDNA(10ng/uL)	5.8
		Total	20

以上述cDNA为模板，使用FirstChoice RLM-RACE(Ambion公司)试剂盒（货号：AM1700）对SL57-6中ZmSTKR基因进行5'和3'末端扩增，实验步骤严格按照说明书执行，5'RACE和3'RACE所用的巢式引物有试剂盒提供和自主设计引物表1所示，ID:1，2两部分组成，最后一步扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶回收，连接至pGEM-TEasy载体（Promega公司），4℃连接过夜后转化，筛选约10个阳性克隆送至Invitrogen公司进行测序，结合其对应的CDS序列拼接后获得了SL57-6中ZmSTKR基因1872bp的全长cDNA（SEQ ID NO.2所示） 

一种分离的基因ZmSTKR在水稻增产中的应用，其应用过程如下： 

利用SL57-6中ZmSTKR全长CDS序列（SEQ ID NO.3所示）作为应用基因，在引物上分别添加了KpnI和SalI的酶切接头（表1所示，引物ID：3），因此扩增得到的片段可以用限制性核酸内切酶KpnI和SalI进行酶切，连接在载体PCAMBIA1301S-XBZ（图10，是华中农业大学水稻组在载体PCAMBIA1301基础上改造所得，参见：抗旱候选基因和启动子的水稻遗传转化分析和田间抗旱性鉴定，肖本泽博士论文。PCAMBIA1301参见 http://www.cambia.org.其他本领域常规的表达载体也能完成本发明），该载体具备CaMV35S启动子、多克隆位点和polyA终止子的序列且包含GUS的报告基因和潮霉素的筛选基因，得到一种ZmSTKR基因超表达的载体，然后再用（表1所示，引物ID：3）所示的引物对得到的克隆进行测序，确定基因连接到载体上。 

将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种中花11中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻（粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法（参见：Efficienttransformation of rice,Oryza sativaL.,mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA,1994,Plant Journal6:271-282)。 

获得了12个过表达ZmSTKR的转基因水稻家系。T1表型分析发现，阳性转基因家系的单株总穗粒数平均1072粒，显著高于阴性对照881粒，提高了21.6%，且过表达植株家系的分蘖数、二次枝梗数、主穗粒数显著高于中花11阴性家系（图5），其中过表达植株家系分蘖数平均为10，阴性对照分蘖数平均为7，平均每株增加了3个分蘖；过表达植株家系二级枝梗数平均为22，阴性对照二级枝梗数平均为16。证实了ZmSTKR的过表达可通过提高水稻花穗的二次枝梗数，单株分蘖数进而提高每穗籽粒数，在生产应用中预计将提高水稻产量15%左右。 

一种基于基因ZmSTKR分子标记的引物在作为玉米高产育种分子标记辅助选择中的应用，其应用过程如下： 

ZmSTKR基因的5′-非编码内含子（ATG上游-1391bp处）插入了1个长5046bp的、失活的CACTA转座子（以下简称：TE）是引起自然群体中行粒数、穗长、雄穗长度、雄穗分枝数等变异的重要功能位点，因此根据该位点设计分子标记引物。 

在玉米分子标记辅助选择中，利用基因特异引物(GSP3：GTCCCGACTTCCGATAAA)和转座子引物（TEP：TGCTGCGTCAAGAAACAA）组合检测TE插入的存在（扩增出的片段长度1435bp），以GSP1：CCTTTTCTTTTCTTTCCTTTT和GSP2：ACATCTGACTGCTTTCCTAAC引物对检测无转座子插入（扩增出的片段长度733bp），以无转座子插入的等位基因作为优异的等位变异，它是控制玉米行粒数，穗长的功能位点之一，予以选择保留。 

与现有技术相比，本发明具有以下优点： 

（1）本发明在玉米中克隆并证实了一个控制行粒数和穗粒数QTL的基因ZmSTKR，证实了行粒数和穗粒数的多少与ZmSTKR的表达水平的关系。 

（2）本发明为玉米产量改良提供了新的基因，也为禾本科作物如水稻的穗粒数改良，提供了新基因。 

（3）本发明为玉米高产育种提供了功能标记。 

（4）ZmSTKR是一个控制玉米穗粒数的重要基因，具有多效性，通过其表达水平正调控玉米穗粒数、行粒数、雄穗分枝等。掖478和SL57-6间的穗粒数的差异，是由于1个En/spm插入到掖478的ZmSTKR的5′-UTR，提高了5′-UTR区DNA甲基化水平，进而降低了该基因的表达水平所致。自然群体中该En/spm插入位点也是功能位点。在作用机理上，认为该基因产物与Tb1,Bd1和Lg2互作并导致其磷酸化，进而调节下游基因的表达，最终调控花序分生组织（IM）中分枝分生组织（branch meristem）的分化活性，即穗粒数、行粒数和雄穗分枝数等。 

附图说明

图1为玉米行粒数QTL qKNPR6的精细定位示意图。 

（a）基于NILs间杂交（掖478×SL57-6）所发展的F2，F2:3群体的连锁分析。（b）:QTL区段内纯合交换家系的基因型。（c）:纯合交换家系的行粒数表现型，括号内的数值为所考察的穗数。 

图2为qKNPR6的图位克隆示意图。 

（a）交换家系的基因型、行粒数表型，箭头所指的为标记所在物理位置。（b）两个NILs中候选基因的结构，转座子在掖478中的插入位置。（c）5′-RACE和3′-RACE电泳图。 

图3为ZmSTKR中转座子插入片段与行粒数的关系示意图。 

（a）QTL区段内各交换家系及亲本的表型。(b)ZmSTKR基因特异性引物与TE特异引物的组合的扩增片段。（c）ZmSTKR基因特异性引物对的扩增片段。1-13分别表示玉米自交系掖478、SL57-6、619-2、613-2、R72-5、638-1、602-3、588-11、R96-9、603-4、R55-11、604-6和509-2。 

图4为玉米自然群体中ZmSTKR的等位变异及其表型变异示意图。 

(a)等位基因的表达水平，SL57-6-like等位基因高于掖478-like等位基因。(b-d):穗部性状平均表型。具有SL57-6-like等位基因的系其每行籽粒数(b)、穗长(c)和雄穗长度(d)、雄穗分支 数（e）显著高于具有具有掖478-like等位基因的系。 

图5为转ZmSTKR水稻的表型示意图。 

(a):过表达ZmSTKR水稻的穗(ZH11-OE)和阴性转基因个体(ZH11-neg)的表型。(b-c):分别表示转ZmSTKR水稻的一次枝梗数、穗长与阴性转基因个体无显著差异。(d-f):分别表示ZmSTKR水稻的穗粒数、二次枝梗数和分孽数显著高于阴性转基因个体。ZH11-OE：过表达ZmSTKR的中花11转基因株系；ZH11-neg:中花11阴性转基因株系。 

图6为ZmSTKR基因的表达与甲基化示意图。 

(a):ZmSTKR在不同组织器官中的表达，（b）:玉米雌穗发育不同时期ZmSTKR在掖478和SL57-6中的表达，(c):被检测的甲基化区段示意图，(d):掖478和SL57-6中3个DNA片段的甲基化情况，红色实心圆圈表示被甲基化的CG，蓝色实心圆圈表达被甲基化的CHG，绿色实心圆圈表达被甲基化的CHH。 

图7为酵母双杂交所使用的pGBKT7载体结构和多克隆位点示意图。 

图8为酵母双杂交所使用的pGABT7载体结构和多克隆位点示意图。 

图9为ZmSTKR互作蛋白研究示意图。 

(a):DDO：SD/-Trp-Leu平板；(b):QDO:SD/-Trp-Leu-His平板(c)：QDO/X/A:SD/-Trp-Leu-His/x-α-gal/AbA平板。LG2、TB1、BIF2、BD1、BA1、TE1、FEA2、PIN1a、ZIF1和KN1为玉米花序发育所需的重要蛋白。 

图10为水稻遗传转化所用超表达载体PCAMBIA1301S-XBZ结构和多克隆位点。 

具体实施方式

以下实施实例进一步定义本发明，并描述了qKNPR6的精细定位、克隆、功能验证、作用机理及分子标记开发的方法。根据以下的描述和实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出适当的完善和修改，以使其适用各种用途和条件。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规分子生物学技术。 

实施例1：ZmSTKR克隆 

利用玉米第6染色体bnlg1433-umc1857区段的两个近等基因系：掖478或Ye478（国 家农作物种质中心）和SL57-6（Liu et al.,PLoSONE,2012,journal.pone.0049836），这两个近等基因系间杂交构建分离群体，开发分子标记，寻找交换单株，自交发展纯合交换家系；基于交换家系间的基因型和表现型的比较分析，发现在约79Kb的染色体区段仅有一个编码ser/thr protein kinase receptor的功能基因，命名为ZmSTKR(图2a)。 

分别提取掖478和SL57-6约5-10mm雌穗的总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用表1中引物和快速扩增cDNA末端（RACE）技术，分别获得了掖478和SL57-6中ZmSTKR基因1880bp和1872bp的全长cDNA（SEQ ID NO.2所示，引物表1所示，ID:1，2，3），同时PCR扩增获得了该基因完整的编码区(图2，引物表1所示，ID:3)。这两个自交系ZmSTKR均包含6个外显子，5个内含子，开放读码框为1146bp，编码381个氨基酸（其序列为SEQ ID NO.4所示），其中，第1-146个氨基酸为信号结合区，第147-168个氨基酸为跨膜区，第169-245个氨基酸为激酶结构域，其中第169-180个氨基酸为丝氨酸/苏氨酸激酶活性位点。5′-非编码区（5′-UTR）存在一个内含子和一个5′-非编码外显子。 

分别提取掖478和SL57-6植株叶片总DNA,根据玉米B73基因组参考序列设计引物，在两材料间对ZmSTKR基因PCR扩增重测序，获得了该基因完整的核苷酸序列（SEQ ID NO.1所示，引物表1所示，扩增掖478基因组所用引物ID:4，5，6，7，8，9，10，11；扩增SL57-6所用引物ID:10，11，12，13。)在掖478中，该基因的5′-非编码内含子（ATG上游-1391bp处）插入了1个长5046bp的、失活的CACTA转座子（简称：TE，下同）(图2b)；而在SL57-6中，则缺少该插入片段。 

表1.试验所使用的引物及其序列 

实施例3： 

ZmSTKR的生物学功能验证 

为探明TE插入的遗传效应，以TE序列和TE两侧的ZmSTKR基因序列设计引物（表1），利用基因特异引物(GSP3)和转座子引物（TEP）组合检测TE插入的存在（扩增出的片段长度1435bp），以GSP1和GSP2引物对检测无转座子插入（扩增出的片段长度733bp）。对2012年所选择的11个重组家系分别PCR扩增发现，行粒数与掖478相似的重组系均有TE插入，而行粒数显著高于掖478、与SL57-6表型相似的重组系，均无TE插入(图3)，表明TE插入导致行粒数的下降。 

为明确玉米自然群体中ZmSTKR的等位变异与行粒数表型的关系，对145份玉米自交系中的ZmSTKR重测序发现：25份自交系含TE插入，具有掖478等位基因；120份自交系无TE插入，具有SL57-6等位基因。表达分析发现，SL57-6等位基因的表达水平显著高于掖478等位基因（图4a），且含SL57-6等位基因的自交系的平均行粒数、穗长、雄穗分枝数和雄穗长度也显著高于含有掖478等位基因的自交系(图4b-d)。因此，证实ZmSTKR的表达与玉米行粒数、穗长、雄穗长度和雄穗分枝数相关，且该基因5′-UTR中TE插入是引起自然群体中行粒数、穗长、雄穗长度、雄穗分枝数等变异的重要功能位点。 

实施例4：ZmSTKR的表达与甲基化 

提取SL57-6不同发育时期的组织：幼苗根系、幼苗叶片、节间、成熟叶片、～1cm长的未成熟雌穗、～4cm长的未成熟雌穗、未成熟的雄穗，采用TRIZOL试剂提取总RNA，反转 录合成cDNA。以cDNA为模板，使用基因特异性引物对（GSP4和GSP5）进行定量PCR分析。发现ZmSTKR在玉米生殖发育的各组织器官和幼苗的根系中的表达水平高，在叶片和节间等组织表达相对较低(图6a)。在花序发育不同时期，ZmSTKR在SL57-6中表达量显著高于其在掖478中的表达(图6b)。为探索SL57-6和掖478中ZmSTKR表达量差异的原因，采用BS-seq方法(Fraga et al.2002)，对这2份材料中ZmSTKR基因的5′-UTR区的甲基化水平进行了分析。分别提取了相同发育进程的SL57-6和掖478的雌穗DNA,按照EpiTect Bisulfite试剂盒操作说明，对DNA进行亚硫酸盐处理。然后，针对图5c所指示的区段，使用特异性引物（如表1）进行PCR扩增。扩增产物连接到T-easy载体上。选取阳性克隆进行序列分析，每条片段至少测序15个克隆。结果发现，在掖478中，ZmSTKR基因5′-UTR区TE插入序列两侧的DNA序列，其CG和CHG的甲基化水平高，相反，SL57-6中由于其5′-UTR无TE插入，甲基化水平低。也就是说，TE插入导致掖478中ZmSTKR5′-UTR的甲基化水平提高（图6d）。 

实施例5：ZmSTKR的互作蛋白 

采用表3中的序列引物，以B73的cDNA为模板，分别扩增玉米Bd1、Tb1、Lg2、Ba1、Bif2、Fea2、ZIF1、TE1、PIN1a、KN1共10个基因的全长cDNA，扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（Aidlab,中国）回收后，连接PGEM-T Easy载体。随后将连接产物转化大肠杆菌Trans5a感受态细胞，在氨苄抗性LB平板上培养过夜后，经菌落PCR鉴定，阳性克隆测序验证。序列正确的菌落摇菌，高纯度质粒小量快速提取试剂盒(TIANGEN，中国)提取质粒。用相应限制性内切酶（表3）双酶切含目的基因的质粒，然后将ZmSTKR基因连接到pGBKT7（图7）载体上，转化Y2H酵母菌株；将表3中的其他基因分别连接到pGADT7载体（图8）并转化Y187酵母菌株。将Y187(pGADT7-目的基因)与Y2H(pGBKT7-ZmSTKR)进行接合培养后涂于DDO(SD-Trp-Leu)上，利用菌落PCR挑取阳性单克隆，摇菌，稀释不同倍数后涂于DDO、QDO(SD-Trp-Leu-Ade-His)和QDO/X/A(QDO+X-a-Gal+AbA)，结果如图9所示。 

表3酵母双杂载体构建所使用的引物 

发现ZmSTKR蛋白能与Tb1、Lg2和Bif2互作，与TE1、PIN1a、ZIF1、Fea2以及KN1不互作(图9)。已知，Tb1编码一个TCP类转录因子，为次生分枝和腋生分生组织发育的抑制子(Doebley et al.1997)。Lg2编码一个bZIP蛋白的转录因子，参与玉米叶鞘与叶面边界的建立(Walsh et al.1997)，也调控玉米花穗的分枝分生组织的活性（Walsh&Freeling,1999）。ZmBIF2编码一个ser/thr protein kinase(McSteen et al.2007)，且与BA1和ZmPIN1互作，使BA1和ZmPIN1磷酸化，进而调控细胞内的生长素的浓度，影响玉米雄穗和雌穗的小穗分生组织和小花分生组织的数目（Skirpan et al.2008,2009）。可见，ZmSTKR可能参与到腋生分生组织和次生分枝分生组织的发育调控。 

实施例6： 

基因ZmSTKR在增加水稻穗粒数中的应用，其应用过程如下： 

本发明利用SL57-6中ZmSTKR全长CDS序列作为应用基因，在引物上分别添加了KpnI和SalI的酶切接头（表1所示，引物ID：3），因此扩增得到的片段可以用限制性核酸内切酶KpnI和SalI进行酶切，体系如下： 

电泳回收酶切片段后连接在载体PCAMBIA1301S-XBZ（图10，载体来自华中农业大学生科院水稻课题组，参见：抗旱候选基因和启动子的水稻遗传转化分析和田间抗旱性鉴定，肖本泽博士论文。）上，该载体具备一段包含CaMV35S启动子、多克隆位点和polyA终止子的序列且包含GUS的报告基因和潮霉素的筛选基因，是一种可以运用基因超表达的载体，然后再用（表1所示，引物ID：3）所示的引物对得到的克隆进行测序，确定基因连接到载体上。将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌（EHA105由华中农业大学生科院水稻邢永忠课题组提供）介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种中花11中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻（粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法（参见：Efficienttransformation of rice,Oryza sativaL.,mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA,1994,Plant Journal6:271-282)。 

获得了12个过表达ZmSTKR的转基因水稻家系。T1表型分析发现，阳性转基因家系的单株总穗粒数平均1072粒，显著高于阴性对照881粒，提高了21.6%，且过表达植株家系的分蘖数、二次枝梗数、主穗粒数显著高于中花11阴性家系（图5），其中过表达植株家系分蘖数平均为10，阴性对照分蘖数平均为7，平均每株增加了3个分蘖；过表达植株家系二级枝梗数平均为22，阴性对照二级枝梗数平均为16。证实了ZmSTKR的过表达可通过提高水稻花穗的二次枝梗数，单株分蘖数进而提高每穗籽粒数，在生产应用中预计将提高水稻产量15%左右。 

实施例7： 

ZmSTKR分子标记的引物在作为玉米高产育种分子标记辅助选择中的应用，其应用过程如下： 

ZmSTKR基因的5′-非编码内含子（ATG上游-1391bp处）插入了1个长5046bp的、失活的CACTA转座子（以下简称：TE）是引起自然群体中行粒数、穗长、雄穗长度、雄穗分枝数等变异的重要功能位点，因此根据该位点设计分子标记引物。本发明涉及到无转座子插 入重组家系的平均行粒数为33.8粒，显著高于有转座子插入家系平均行粒数27.33粒，平均每行粒数增加5-6粒，每穗粒数增加60-100粒。 

在玉米分子标记辅助选择中，利用基因特异引物(GSP3：GTCCCGACTTCCGATAAA)和转座子引物（TEP：TGCTGCGTCAAGAAACAA）组合检测TE插入的存在（扩增出的片段长度1435bp），以GSP1：CCTTTTCTTTTCTTTCCTTTT和GSP2：ACATCTGACTGCTTTCCTAAC引物对检测无转座子插入（扩增出的片段长度733bp），以无转座子插入的等位基因作为优异的等位变异，它是控制玉米行粒数，穗长的功能位点之一，予以选择保留（图3）。 

ZmSTKR是控制玉米雌穗行粒数、穗粒数和穗长性状的QTL qKNPR6的基因，自然群体中其表达水平与行粒数、穗粒数和穗长正相关，过表达该基因也提高水稻的二次枝梗数和每穗籽粒数。在近等基因系掖478和SL57-6中，由于TE插入导致ZmSTKR5′-UTR的甲基化水平提高，ZmSTKR表达量下降。由于中ZmSTKR与Tb1、BIF2和Lg2互作，ZmSTKR表达量的下降则导致Tb1、BIF2和Lg2磷酸化水平低、蛋白活性低，因而Tb1和Lg2所调控的下游基因表达水平也较低，最终导致花序分生组织（IM）中短的分枝分生组织（short-branch meristem）活性的下降，即行粒数、穗粒数和穗长的下降。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学

 

<120>  一种控制玉米行粒数和穗粒数的多效性基因及其应用

 

<130>  一种控制玉米行粒数和穗粒数的多效性基因及其应用

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  4417

<212>  DNA

<213>  玉米

 

<400>  1

aaaccggagc attccgcggt accccgcggt gacgcgtccc ggccccggcg gccggcgggt     60

ctgctaccgg taccggcccc gctcgctcgc cgagtcaacg gcttgactgc gcccgcccgc    120

cacgttcgta gtactatacg agtacatgcc tttgccttcc ctttcctctc ctctcctcct    180

ctcccacagt cccacccgtt tcgcagtgca gaagccggcg aaacttccaa gcccaaggaa    240

ggaaaaaaaa aactgtcacc tttaactcga tcccctcttc cccgcccgag tcagagcggc    300

ggcgccggag ccggagccga cagcttccgg caagcggggg ctacttggtg cggcgggcta    360

tttccgcggt tttgtgccac agcgggactg gactgcccgc ccaggctgcc ctatcagggt    420

caccaagatt gaacaagact gaactgccgc gcttcagcct tcaggtgagt ctcgccgtct    480

cgttgagttt cgtagggaaa gatcctctcg ccttttcttt tctttccttt ttttttgttt    540

tgcttcttgc tgttgcgtga ttgcgcaaat ccttgcttct gtgtctggtc tggcatggcg    600

ttcccttgtt gggcacgccg cacgcgagta gtaggctatt caaacactgc ttttgtgtct    660

tcgatcgatc aacgccgcct ggcctgactc aggaccagtc gctagattgc ctaatagtct    720

ctggatagaa cgcctagtaa aagagatttt agttctgaat ttctgatccg atgtcggtaa    780

cacatagtac ataattgtcg ggtcccgact tccgataaat cgtcacgtca tgccgggatt    840

ctacgcacag tactacaaat gtgcagattg aagccaatca tgcattaatt gctcaacaat    900

caattggatt ggatgccagc gcatctgcac agtactacta gtatttctat tcgtcactat    960

tctgtaccat tgggccgtaa tccgttgctg tgctactgca cggagattat ttatggtaat   1020

tcacatttca gaaccatcag ttattagata agcaatgacg tacaggctgc acacatgaac   1080

atgacgcgta cgccttttgt ctactgatga agcatttctt tggtgggttg tcttcttcgt   1140

agcttcgttg tttatcgaaa ctcgaaagaa gtctacggag taattttctt cccccctttt   1200

tctccaaagt gtgtttggtt gtgttaggaa agcagtcaga tgttgatgtc tatccaataa   1260

ttataggaga tattttgaac tagactaagg ctgtagtggg cctagcctac cgtgtttgat   1320

cgtattatca atggtcatca attaggtggg atgatgtagc ctgtgctgcg gtgctggttt   1380

gtttttgtga atgaacatag gaataggata cgggtgatga aaccactgct ttgtgcgtca   1440

gtggttttct gctcctgctc tgttcacact tgaagtgcat ttgaattatg tggtcaactc   1500

cttgcaaaaa aaaggatatt tggattattg agacctgatt ggtactatct aatctaatga   1560

taggatacga gtgatggaac cactgcattg aattattatc acttgaattg gtagttacaa   1620

gtggaatacc aacatatcca atcaatggtc atcgataagg ttcagtgatc tagccattgc   1680

tgatgtgtga gttccttttg tgaagcaata ctaggatgcg tgtaatgaaa ccactgcttt   1740

gtgtatcagt ggttttcctg cccctgttac ttcgaataat gtagactcct tggtcaaaaa   1800

aaacctatgg ggtcaatgga acttgtgaat ctagtaggtg ggtttataat atttgtatgc   1860

ataggaaaaa cagtaggcgt ggacataatt tatgcaaccg catggaactc aagggatttt   1920

atttttgcaa cagcatcttt gtggctcttg ggttgcattc attctgagaa ctataatcct   1980

gttattggac aggttacaat tatgcccccc ccccacccac ccacccaaat atgtttttta   2040

attaagtttt tttattacaa acatacaata tactgtttac ataggtatcc tttcctgcta   2100

ctgcaattgt agggaagtaa ttttttgcct atatacattt tctgacttct gtatgttttt   2160

tgagaaggat atacactttc tagtgattag tggcattcag tttctggctt tttccttagg   2220

tttccatttt tgctaagcac aagtttttcc cattttttat tgatgcaagt tgattagtat   2280

tgtgtatact gctacttctt tcataagcag agcctctatt catgttttca tgtttcagga   2340

tactgaactg ccatctcagt taaatgatac actgcacaac agtgggcagc gatagtttga   2400

gacacattag caatgagttg tttttctcac tttttcaaga gaaaaagggg gccacaacaa   2460

caagacgatc catctgacaa ttgtaagatc ccttatgcct acagttatgt aaaaagacca   2520

ctatttcaaa agtcatatgc ttcttttcaa ctttcaatga atcaatctgc cttccttgat   2580

acaaacactt atttctgcag atttcactgg ttctgagaat ataacaagat tcagctacag   2640

ggaactggtt agagccacat caaattttga ccaaggcaat aagattggtg agggcggcta   2700

tggacctgtc tacaaggtag tagcacagcc attttcaatt tgatgaagga ccagaatgca   2760

ctagtggtgt ttgaaacctt tctaacttac aacttcaggg aacactcaag gatgggacag   2820

ttattgccgt aaaggttctg tctttacatt ctagacaagg ggcaaaggag tttcttaatg   2880

agcttcttgc aatctctgat gtaacacatg agaatcttgt caaactctat ggctgctgtg   2940

tagaaggaaa ccacaggatc cttgtctaca attatcttga aaataatagt cttgcacata   3000

cccttctagg ttgttctctt tgctgaattc tcaatattgt tttctggagt actatccttt   3060

tagcaaggta tttacatcct gtaacattct tgtccatgct atagattcgc gacacagcaa   3120

catccagttc aactggagaa ctcgggtaaa tatctgcatc ggtgttgccc aaggattagc   3180

tttcctccat ggcagtgtca gccctcacat tgttcaccgt gacatcaagg cgagcaatat   3240

acttcttgat aaggatatga cgccaaaaat atctgatttt ggtctggcaa agcttctacc   3300

tccggatgta tcacatgtta gcacaagagt cgcagggacc ctgtaagtgg aagttattat   3360

tattgttaca tctactgtga tgtatgtttt ttactgcttg ttgtggtcct tcaaacttag   3420

ttgtgagagg cattggcagc tacaattgcc cagtgatagt tacttgaaga ggttcttttg   3480

acctaaatat ctaaccaggg agtgcaatgg aaagaatgaa accaagctag tatttgatca   3540

ttcagacatg gtttgcgtgg tacctcactc acactgtagt tttgcctgca gaggttactt   3600

ggctcctgaa tatgcaattc gaggacatgt tacacggaag gcagatgtct acagctatgg   3660

cgttctgctt atcgaaattg tgagcggaag atgcaacact gatacgaaat tgccctatga   3720

tgaccagatt ctccttgaga aggtatatac gggattctac taagtactag ttcagacaag   3780

acagaaaaca cttgccatga aagtggttgc ttgctaattc aaactgcatt tctgaacaaa   3840

ggcatctcta cacactttgc atacatggag atactatggt cgcgggaatc tggagaagat   3900

catagacagc tcccttggcg acgacctgga cgttgacgaa gcctgcaggt ttctgaagat   3960

cgggctcctc tgcacccaag acggcacgaa acgccggccg ggcatgtctg cggtggtggc   4020

catgctgaga ggcgaggcgg acgtggacac ggagacgatc agcaagcccg acgtgatcag   4080

ggatttcgga gacctgaagc tgcggagcag ggccacgtcg tccacgctgc tgacctcgat   4140

catggcgcgg tcgtccccgc tgtcgtctga ggagacgacg cgcacctcca tcaccttcac   4200

cgagatatcg gagcgcgact gactgacgat cgccgttaat tcgccgacaa gaagtgggct   4260

gtgagcctgt gaccgtgtag ctggaggagc ggaaagtgta cgtagcatag gccggggaga   4320

attctttttg ctggttttat gtgatctgtg tgcgtatttc tatattacaa tcgcggtaga   4380

aaacggcgct tcaaagacta tccacgtcag cttctaa                            4417

 

<210>  2

<211>  1872

<212>  DNA

<213>  玉米

 

<400>  2

aaaccggagc attccgcggt accccgcggt gacgcgtccc ggccccggcg gccggcgggt     60

ctgctaccgg taccggcccc gctcgctcgc cgagtcaacg gcttgactgc gcccgcccgc    120

cacgttcgta gtactatacg agtacatgcc tttgccttcc ctttcctctc ctctcctcct    180

ctcccacagt cccacccgtt tcgcagtgca gaagccggcg aaacttccaa gcccaaggaa    240

ggaaaaaaaa aactgtcacc tttaactcga tcccctcttc cccgcccgag tcagagcggc    300

ggcgccggag ccggagccga cagcttccgg caagcggggg ctacttggtg cggcgggcta    360

tttccgcggt tttgtgccac agcgggactg gactgcccgc ccaggctgcc ctatcagggt    420

caccaagatt gaacaagact gaactgccgc gcttcaggat actgaactgc catctcagtt    480

aaatgatata ctgcacaaca gtgggcagcg atagtttgag acacattagc aatgagttgt    540

ttttctcacc ttttcaagag aaaaaggggg ccacaacaac aagacgatcc atctgacaat    600

tatttcactg gttctgagaa tataacaaga ttcagctaca gggaactggt tagagccaca    660

tcaaattttg accaaggcaa taagattggt gagggcggct atggacctgt ctacaaggga    720

acactcaagg atgggacagt tattgccgta aaggttctgt ctttacattc tagacaaggg    780

gcaaaggagt ttcttaatga gcttcttgca atctctgatg taacacatga gaatcttgtc    840

aaactctatg gctgctgtgt agaaggaaac cacaggatcc ttgtctacaa ttatcttgaa    900

aataatagtc ttgcacatac ccttctagat tcgcgacaca gcaacatcca gttcaactgg    960

agaactcggg taaatatctg catcggtgtt gcccaaggat tagctttcct ccatggcagt   1020

gtcagccctc acattgttca ccgtgacatc aaggcgagca atatacttct tgataaggat   1080

atgacgccaa aaatatctga ttttggtctg gcaaagcttc tacctccgga tgtatcacat   1140

gttagcacaa gagtcgcagg gaccctaggt tacttggctc ctgaatatgc aattcgagga   1200

catgttacac ggaaggcaga tgtctacagc tatggcgttc tgcttatcga aattgtgagc   1260

ggaagatgca acactgatac gaaattgccc tatgatgacc agattctcct tgagaagaca   1320

tggagatact atggtcgcgg gaatctggag aagatcatag acagctccct tggcgacgac   1380

ctggacgttg acgaagcctg caggtttctg aagatcgggc tcctctgcac ccaagacggc   1440

acgaaacgcc ggccgggcat gtctgcggtg gtggccatgc tgagaggcga ggcggacgtg   1500

gacacggaga cgatcagcaa gcccgacgtg atcagggatt tcggagacct gaagctgcgg   1560

agcagggcca cgtcgtccac gctgctgacc tcgatcatgg cgcggtcgtc cccgctgtcg   1620

tctgaggaga cgacgcgcac ctccatcacc ttcaccgaga tatcggagcg cgactgactg   1680

acgatcgccg ttaattcgcc gacaagaagt gggctgtgag cctgtgaccg tgtagctgga   1740

ggagcggaaa gtgtacgtag cataggccgg ggagaattct ttttgctggt tttatgtgat   1800

ctgtgtgcgt atttctatat tacaatcgcg gtagaaaacg gcgcttcaaa gactatccac   1860

gtcagcttct aa                                                       1872

 

 

<210>  3

<211>  1146

<212>  DNA

<213>  玉米

 

<400>  3

atgagttgtt tttctcacct tttcaagaga aaaagggggc cacaacaaca agacgatcca     60

tctgacaatt atttcactgg ttctgagaat ataacaagat tcagctacag ggaactggtt    120

agagccacat caaattttga ccaaggcaat aagattggtg agggcggcta tggacctgtc    180

tacaagggaa cactcaagga tgggacagtt attgccgtaa aggttctgtc tttacattct    240

agacaagggg caaaggagtt tcttaatgag cttcttgcaa tctctgatgt aacacatgag    300

aatcttgtca aactctatgg ctgctgtgta gaaggaaacc acaggatcct tgtctacaat    360

tatcttgaaa ataatagtct tgcacatacc cttctagatt cgcgacacag caacatccag    420

ttcaactgga gaactcgggt aaatatctgc atcggtgttg cccaaggatt agctttcctc    480

catggcagtg tcagccctca cattgttcac cgtgacatca aggcgagcaa tatacttctt    540

gataaggata tgacgccaaa aatatctgat tttggtctgg caaagcttct acctccggat    600

gtatcacatg ttagcacaag agtcgcaggg accctaggtt acttggctcc tgaatatgca    660

attcgaggac atgttacacg gaaggcagat gtctacagct atggcgttct gcttatcgaa    720

attgtgagcg gaagatgcaa cactgatacg aaattgccct atgatgacca gattctcctt    780

gagaagacat ggagatacta tggtcgcggg aatctggaga agatcataga cagctccctt    840

ggcgacgacc tggacgttga cgaagcctgc aggtttctga agatcgggct cctctgcacc    900

caagacggca cgaaacgccg gccgggcatg tctgcggtgg tggccatgct gagaggcgag    960

gcggacgtgg acacggagac gatcagcaag cccgacgtga tcagggattt cggagacctg   1020

aagctgcgga gcagggccac gtcgtccacg ctgctgacct cgatcatggc gcggtcgtcc   1080

ccgctgtcgt ctgaggagac gacgcgcacc tccatcacct tcaccgagat atcggagcgc   1140

gactga                                                              1146

<210>  4

<211>  381

<212>  PRT

<213>  玉米

<400>  4

Met Ser Cys Phe Ser His Leu Phe Lys Arg Lys Arg Gly Pro Gln Gln

1               5                   10                  15     

Gln Asp Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Phe Thr Gly Ser Glu Asn Ile Thr

            20                  25                  30        

Arg Phe Ser Tyr Arg Glu Leu Val Arg Ala Thr Ser Asn Phe Asp Gln

        35                  40                  45             

Gly Asn Lys Ile Gly Glu Gly Gly Tyr Gly Pro Val Tyr Lys Gly Thr

    50                  55                  60                 

Leu Lys Asp Gly Thr Val Ile Ala Val Lys Val Leu Ser Leu His Ser

65                  70                  75                  80 

Arg Gln Gly Ala Lys Glu Phe Leu Asn Glu Leu Leu Ala Ile Ser Asp

                85                  90                  95     

Val Thr His Glu Asn Leu Val Lys Leu Tyr Gly Cys Cys Val Glu Gly

            100                 105                 110        

Asn His Arg Ile Leu Val Tyr Asn Tyr Leu Glu Asn Asn Ser Leu Ala

        115                 120                 125            

His Thr Leu Leu Asp Ser Arg His Ser Asn Ile Gln Phe Asn Trp Arg

    130                 135                 140                

Thr Arg Val Asn Ile Cys Ile Gly Val Ala Gln Gly Leu Ala Phe Leu

145                 150                 155                 160

His Gly Ser Val Ser Pro His Ile Val His Arg Asp Ile Lys Ala Ser

                165                 170                 175    

Asn Ile Leu Leu Asp Lys Asp Met Thr Pro Lys Ile Ser Asp Phe Gly

            180                 185                 190         

Leu Ala Lys Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser His Val Ser Thr Arg Val

        195                 200                 205            

Ala Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Ile Arg Gly His

    210                 215                 220                 

Val Thr Arg Lys Ala Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Val Leu Leu Ile Glu

225                 230                 235                 240

Ile Val Ser Gly Arg Cys Asn Thr Asp Thr Lys Leu Pro Tyr Asp Asp

                245                 250                 255    

Gln Ile Leu Leu Glu Lys Thr Trp Arg Tyr Tyr Gly Arg Gly Asn Leu

            260                 265                 270        

Glu Lys Ile Ile Asp Ser Ser Leu Gly Asp Asp Leu Asp Val Asp Glu

        275                 280                 285            

Ala Cys Arg Phe Leu Lys Ile Gly Leu Leu Cys Thr Gln Asp Gly Thr

    290                 295                 300                

Lys Arg Arg Pro Gly Met Ser Ala Val Val Ala Met Leu Arg Gly Glu

305                 310                 315                 320

Ala Asp Val Asp Thr Glu Thr Ile Ser Lys Pro Asp Val Ile Arg Asp

                325                 330                 335    

Phe Gly Asp Leu Lys Leu Arg Ser Arg Ala Thr Ser Ser Thr Leu Leu

            340                 345                 350        

Thr Ser Ile Met Ala Arg Ser Ser Pro Leu Ser Ser Glu Glu Thr Thr

        355                 360                 365            

Arg Thr Ser Ile Thr Phe Thr Glu Ile Ser Glu Arg Asp

    370                 375                 380    

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

gtcccgactt ccgataaa                                                   18

<210>  6

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

tgctgcgtca agaaacaa                                                   18

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

ccttttcttt tctttccttt t                                               21

<210>  8

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

acatctgact gctttcctaa c                                               21

Claims (8)

1.一种分离的基因ZmSTKR，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述基因的CDS，其序列为SEQ ID NO.3所示。

3.权利要求1或2所述基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.4所示。

4.权利要求1所述基因ZmSTKR分子标记的引物，具体如下：

GSP3：GTCCCGACTTCCGATAAA；

TEP：TGCTGCGTCAAGAAACAA；

GSP1：CCTTTTCTTTTCTTTCCTTTT；

GSP2：ACATCTGACTGCTTTCCTAAC。

5.权利要求1或2所述基因在提高农作物产量中的应用。

6.权利要求1或2所述基因在提高玉米产量中的应用。

7.权利要求1或2所述基因在提高水稻产量中的应用。

8.权利要求4所述引物在玉米高产育种分子标记辅助选择中的应用。