CN110195100A

CN110195100A - F型三系杂交小麦雄性不育基因相关分子标记开发及应用

Info

Publication number: CN110195100A
Application number: CN201810161480.8A
Authority: CN
Inventors: 吴坤; 杨雅生; 冯树英
Original assignee: Biocentury Seed Industry Co Ltd
Current assignee: Biocentury Seed Industry Co Ltd
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2019-09-03

Abstract

本发明公开了一种F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点的特异PCR标记开发方法，包括：(1)将小麦通过多代姊妹交，将获得的自交系分成自交结实率高的保持系和自交结实率中等的保持系，以及自交结实率低于5％的稳定不育系，三者除育性差异，其他生物学特征完全一致；(2)对上述三个样品进行建库测序；(3)检索三个样品线粒体及细胞核基因组间存在的SNP变异；(4)针对上述不育系与不同自交结实率的保持系株系间鉴定获得的线粒体及细胞核基因组SNP位点，检测、设计和开发限制性内切酶扩增多态性序列(CAPS)标记或竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记。本发明还公开了相关SNP位点分子标记及其检测方法。

Description

F型三系杂交小麦雄性不育基因相关分子标记开发及应用

技术领域

本发明属于小麦分子育种领域，具体地说，涉及普通小麦不育系及两种保持系线粒体基因组和细胞核基因组重测序分析，同时涉及F型雄性不育基因相关分子标记开发，以及相关分子标记在F型三系杂交小麦不育系改良育种中的应用，以提高F型杂交小麦分子育种改良的效率。

背景技术

小麦是世界第一、我国第二大粮食作物，小麦生产是关系我国国计民生和社会稳定的重要农业产业。与水稻、玉米、油菜等作物相比，小麦是迄今为止仍未大面积应用于生产的作物之一。杂交小麦作为世界性难题，一直受到世界各国政府与跨国种业集团的高度重视和巨额投资，至今杂交小麦研究已经有60余年的历史，前期以跟踪学习国外的三系法(CMS)和化杀法(CHA)为主要技术方法，因未攻克技术难题而未实现大面积应用。2000年后我国原创的二系法杂交小麦应用技术体系得到了快速发展，奠定了我国在国际杂交小麦研究领域的领先地位，目前我国关于BS系列、ES系列和C49S系列的小麦光温敏二系不育系遗传、基因定位及相关基因克隆的研究报道较多。小麦F型雄性不育系是山西运城市蓝红杂交小麦研究中心冯树英研究员历经20多年，先后选用4个普通小麦品种进行3轮杂交、2轮回交、8代姊妹交和6代测交育成的新型小麦不育系，其不育系(FA)与保持系(FB)的选育方法获得国家发明专利(CN200810135045)，FA不育系获得国内植物新品种权授权(CNA20090410.1)。F型三系不育材料的发现补充了我国小麦杂种优势利用的途径。FA是我国新发现的不育源，具有无外源细胞质毒性及恢复源广等优点，但是目前关于该不育系相关基础研究基本空白，挖掘和利用该新型不育资源，创新小麦杂种优势利用技术方法非常必要。因此，本领域中需要改善F型三系杂交小麦的分子育种改良实践。

发明内容

本发明通过细胞核及线粒体基因组二代高通量重测序技术开发了F型三系杂交小麦不育基因相关的分子标记，并应用于不育系的分子育种改良实践。

在本发明的第一方面提供了一种F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点的特异PCR标记开发方法，所述方法包括：

(1)将小麦通过多代，例如8代以上，姊妹交，将获得的自交系分成自交结实率高的保持系和自交结实率中等的保持系，以及自交结实率低于5％的稳定不育系，三者除育性差异，其他生物学特征完全一致；

(2)对上述三个样品进行建库测序：提取上述三个样品的基因组DNA，建库后进行测序；

(3)基因组序列比较分析：比对小麦参考基因组数据库中线粒体及细胞核参考基因组序列，检索三个样品线粒体及细胞核基因组间存在的SNP变异；

(4)F型雄性不育基因相关SNP位点特异PCR标记开发：针对上述不育系与不同自交结实率的保持系株系间鉴定获得的线粒体及细胞核基因组SNP位点，检测、设计和开发限制性内切酶扩增多态性序列(CAPS)标记或竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记。

在本发明第一方面的第一实施方案中，通过Hiseq2000进行测序。

在本发明第一方面的第二实施方案中，运用BWA软件与小麦参考基因组序列进行比对，并利用GATK软件包进行SNP信息的检测和注释。

在本发明第一方面的第三实施方案中，利用Annovar程序结合参考基因组的gff注释信息对得到的纯合SNP进行注释，并通过Goatools进行富集分析，利用KOBAS进行KEGGpathway富集分析。

在本发明第一方面的第四实施方案中，通过DNAMAN和Primer Premier5.0检测、设计和开发限制性内切酶扩增多态性序列标记或竞争性等位基因特异性PCR标记。

在本发明的第二方面提供了F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点分子标记，所述SNP位点包括3个SNP位点，第1个SNP位于358137bp为PsaA/PsaB基因内同义突变C变成T，第2和3个SNP分别位于419226bp和419241bp为NdhB基因内非同义突变T变成C。

本发明第二方面的F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点分子标记通过本发明第一方面的方法获得。

在本发明的第三方面提供了一种F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点特异的限制性内切酶扩增多态性序列标记的检测方法，所述方法包括：

用以下引物进行PCR扩增：

正向引物：5’GCATAACGGCCCTATTGTTCC3’

反向引物：5’CGAACGAACCACACTCCTTC3’；

用限制性内切酶对PCR产物酶切，所用限制性内切酶为Bsp1407I。

在本发明第三方面的第一实施方案中，PCR扩增退火温度Tm＝59℃，延伸时间40S。

本发明第二方面的F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点分子标记通过本发明第三方面的方法进行检测。

本发明利用筛选鉴定得到的SNP差异开发的CAPS标记是一种普通PCR扩增加限制性内切酶酶切的三代分子标记，相对于SSR及SNP等其他类型分子标记，其特点是特异性强、稳定性和重复性好、方法简单易行、可操作性强，可避免随机引物非特异性扩增及SNP引物假阳性扩增。

附图说明

图1为CAPS标记在不同FA不育系及FB保持系中的扩增酶切检测结果；

注：1～10泳道为10个不同自交结实率的保持系FB单株，11～20泳道为10个不同自交结实率的不育系FA株系，M为pUC19DNA/MspI Marker，箭头所指为扩增酶切目的片段。

图2为三个送检样品FA-mix与FB-4和FB-5在线粒体基因组上存在的序列差异位点及其对应的基因预测分析；注：基因序列结构预测方法为FGENESH(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)

图3为三个送检样品FA-mix与FB-4和FB-5细胞核基因组SNP(参考小麦基因组)在小麦染色体上的分布；

注：从内向外依次为，第1圈为GC分布，第2圈FB-5纯合SNP分布，第3圈FB-4纯合SNP分布，第4圈FA-mix纯合SNP分布。

具体实施方式

在国家科技支撑计划项目“F型三系杂交小麦研究与应用”(2013BAD04B00)的支持和推动下，通过北京农林科学院、中国农业大学、西北农林大学、河南农业大学、山西省农业科学院等国内一流科研院所联合攻关和协同创新，发现F型不育系存在一定的光温或环境诱导效应，短日低温育性降低，与二系光温敏不育系趋势类似，育性和对环境的反应程度间于二系光温敏核不育系和CMS三系不育系之间，花粉败育以圆败和染败为主；F型雄性不育的育性受多基因控制，较符合两对主效基因的群体分布规律。同时，通过选择较高密度覆盖小麦染色体组的1013对小麦SSR引物，以FA不育系和代表性恢复系进行了多态性筛选，结果发现24.8％的引物表现出了多态性，筛选出不育系和恢复系多态性引物251对。最后获得的5对稳定多态性引物，尚需进一步验证。因此，本发明通过细胞核及线粒体基因组二代高通量重测序技术开发了F型三系杂交小麦不育基因相关的分子标记，并应用于不育系的分子育种改良实践。

在本发明的一个实施方案中，F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点的特异PCR标记开发的方法包括：

(1)材料创制：通过8代以上的姊妹交，获得了自交结实率高的保持系FB-4和自交结实率中等的保持系FB-5，以及自交结实率低于5％的稳定不育系FA-mix，三者除育性差异，其他生物学特征完全一致；

在本发明中选择生物学特征一致的自交系，将自交结实率低于5％的稳定不育系作为FA-mix；将其他自交结实率大于5％的稳定保持系分成自交结实率高的保持系和自交结实率中等的保持系两部分，两部分数量大致相当，例如相差不多于10％。

(2)建库测序：CTAB法提取FA-mix,FB-4和FB-5三个样品的基因组DNA，建库后通过Hiseq2000进行测序分析，运用BWA软件与小麦参考基因组序列进行比对，并利用GATK软件包进行SNP信息的检测和注释；

(3)基因组序列比较分析：比对小麦参考基因组数据库中线粒体及细胞核参考基因组序列，检索三个样品线粒体及细胞核基因组间存在的SNP变异。利用annovar程序结合参考基因组的gff注释信息对得到的纯合SNP进行注释，并通过Goatools进行富集分析，利用KOBAS进行KEGG pathway富集分析；

(4)F型雄性不育基因相关SNP位点特异PCR标记开发：针对上述不育系FA与不同自交结实率的保持系FB株系间鉴定获得的线粒体及细胞核基因组SNP位点，通过DNAMAN(http://www.lynnon.com/dnaman.html)和Primer Premier5.0(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)等软件检测、设计和开发限制性内切酶扩增多态性序列(CAPS)标记或竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记。

本发明首次公开了F型三系杂交小麦雄性不育系FA与保持系FB在线粒体基因组上存在的SNP差异；并且针对性地开发了特异的CAPS标记，该分子标记的核苷酸序列及检测条件如下：

正向引物：5’GCATAACGGCCCTATTGTTCC3’

反向引物：5’CGAACGAACCACACTCCTTC3’；

PCR扩增退火温度Tm＝59℃，延伸时间40s；PCR产物酶切所用限制性内切酶为Bsp1407I，酶切温度37℃。

SEQ ID NO.1为第2和3个SNP所在线粒体基因组部分序列，用来设计和开发本专利涉及的CAPS标记(即为PCR引物人工序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)。

采用本方法对F型三系杂交小麦线粒体基因组DNA进行PCR扩增和限制性内切酶酶切，根据PCR产物酶切后条带大小差异，可以在苗期有效鉴定小麦的育性，更好的应用于F型三系杂交小麦不育系FA的选育，可免去田间大量自交和无效测交工作。该方法简单易行，可操作性强，且引物检测特异性强，扩增重复性好。通过该不育基因相关分子标记与恢复基因相关分子标记相结合，将为F型三系杂交小麦的新品种高效选育和商业化应用奠定坚实基础。

通过第二代重测序技术发掘小麦不育系及不同自交结实率的保持系间线粒体及细胞核基因组序列SNP差异，并开发了相应的PCR检测标记。研究结果表明：这种方法可以快速有效得到雄性不育相关基因及关联的SNP位点，利用SNP位点开发的CAPS标记可以快速有效的鉴定F型雄性不育。

本发明公开的F型三系杂交小麦雄性不育相关CAPS标记与现有技术相比所具有的优点和效果在于：

(1)本发明利用多代姊妹交创制了细胞核遗传背景近乎完全相同的不育系FA-mix和自交结实率不同的保持系FB-4及FB-5，利用二代基因组重测序手段在小麦线粒体基因组中快速鉴定并获得了F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP，可为其他三系杂交作物不育基因鉴定和分离提供重要的成功案例。

(2)本发明鉴定和获得的F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP点位于线粒体功能基因NDHB基因(NADH基因)内部，由此开发的PCR标记也属于功能分子标记，与目标基因共分离，可以通过功能分子标记直接选择基因，MAS选择(标记辅助选择)效率大大提高。

通过结合说明书附图和以下实施例，进一步阐述本发明的具体实施方式。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照标准流程所述的条件进行。其中F型雄性不育系“FA-mix”(一个高代姊妹交不育系)、F型雄性保持系“FB-4”和“FB-5”(两个高代自交保持系)均来自山西运城市蓝红杂交小麦研究中心(不育系FA的植物新品种权授权编号CNA20090410.1)。

在本发明中，参考基因组版本号：IWGSC RefSeq v1.0，可以从https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Assemblies获得。

实施例1

F型三系杂交小麦雄性不育相关SNP的获得及分子标记开发，包括以下步骤：

(1)通过4个普通小麦品种进行3轮杂交、2轮回交、8代姊妹交和6代测交，选育出一批稳定纯合的新型不育系FA及保持系FB株系(选育方法参见国家发明专利CN200810135045)，其中FA-mix的自交结实率(国际法)为2.9％，FB-4的自交结实率(国际法)为137.5％，FB-5的自交结实率(国际法)为66.7％。

(2)通过CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium AmmoniumBromide))提取上述三个样品的基因组DNA并随机打断，琼脂糖电泳后回收所需DNA片段后加接头并进行Cluster制备，然后在Hiseq2000上机测序。运用BWA软件将测序得到的读段与小麦参考基因组序列进行比对，然后利用Picard-tools去除PCR-duplication产生的测序读段。接着根据比对结果，计算出相对于参考基因组的测序深度和覆盖度(要求每个样品的测序深度为普通小麦基因组大小的10×以上，即为100Gbp以上)，并利用GATK软件包进行SNP信息的检测和注释。

(3)通过分别比对小麦基因组数据库中线粒体及细胞核参考基因组序列(http://www.wheatgenome.org/)，检索和比较上述三个样品线粒体及细胞核基因组间存在的SNP变异，发现三个样品间细胞核基因组存在较多的SNP(图3)，而线粒体基因组仅存在3个SNP(图2)。利用Annovar程序结合参考基因组的gff注释信息对得到的纯合SNP进行注释，对于在CDS区域的SNP位点，将会对突变位点对于蛋白质翻译的影响进行注释(图2)。并通过Goatools(https://github.com/tanghaibao/GOatools)进行富集分析，利用KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)进行KEGG pathway富集分析，使用方法均为Fisher精确检验。

(4)针对上述不育系FA与不同自交结实率的保持系FB株系间鉴定获得的线粒体及细胞核基因组SNP位点，发现两个FB株系线粒体基因组序列完全相同，但与FA线粒体基因组间存在3个SNP位点，第1个SNP位于358137bp为PsaA/PsaB基因内同义突变(FA为T，FB为C)，第2和3个SNP分别位于419226bp和419241bp为NdhB基因内非同义突变(FA为C，FB为T)。通过DNAMAN(http://www.lynnon.com/dnaman.html)进行序列比对及限制性内切酶酶切位点分析，发现FA和FB序列存在一个6碱基内切酶Bsp1407I酶切位点差异(419226bp，FA的C碱基突变为FB的T碱基，导致FB中该酶切位点缺失)。随后利用Primer Premier5.0(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)设计和开发限制性内切酶扩增多态性序列(CAPS)标记。设计时要求引物长度为17～25bp，复性温度50～62℃，GC含量为40～60％，PCR产物大小为300～800bp，酶切后产物大小为100～500bp。

实施例2

F型三系杂交小麦雄性不育相关分子标记的应用

(1)利用上述多代杂交、回交和姊妹交得到的FA及FB株系，挑选其中10个高度不育的稳定纯合FA株系(FA-1～FA-10)，以及其中10个自交结实率不同的稳定纯合FB株系(FB-1～FB-10，自交结实率分别为90.0％、73.3％、113.3％、137.5％、66.7％、90.0％、96.7％、121.9％、103.3％和81.3％)，验证上述开发分子标记的有效性。

(2)参照成熟的小麦CTAB法提取10个不育系FA及10个保持系FB的基因组DNA，每个FA或FB株系取12个单株鲜嫩幼苗叶片等量混合，液氮研磨后转移至2ml离心管中，加入CTAB裂解缓冲液1ml，充分混匀，65℃水浴30min，期间每隔5min轻缓混匀一次，冷却至室温加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提(上下颠倒充分混匀至不分层)，12000rpm离心10min，取上清至2ml离心管中，重复氯仿:异戊醇抽提一次，12000rpm离心20min，取上清至1.5ml离心管中，后加入等体积的冰冻无水乙醇轻缓颠倒混匀至絮状DNA析出，-20℃静置10min，用枪头挑取DNA并倒弃管内剩余液体(或3000rpm离心取沉淀)，用75％乙醇浸泡冲洗2～3次(每次10min)，倒掉乙醇后倒置管壁晾干后，加入TE(Tris-EDTA缓冲液)溶解DNA后，加入2μl浓度为10mg/ml的RNAase，并在37℃培养箱处理30min以去除RNA，通过分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行DNA浓度和纯度测定后，定量稀释工作液DNA浓度至25ng/μl，剩余DNA原液-20℃长期保存备用。

(3)PCR扩增反应体系为：10×Buffer 1.0μl，Mg²⁺0.6μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.1μl(5U)，正反向引物各1μl(10μm/l)，ddH₂O 5.1μl，模板DNA 1μl(25ng/μl)。PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃40s，72℃50s，共37个循环，72℃延伸10min，10℃保存。

(4)PCR产物酶切体系为：PCR产物10μl(～0.1-0.5μg DNA)，nuclease-free水18μl，10X Buffer Tango 2μl，Bsp1407I酶1～2μL。轻轻混匀后，置于37℃培养箱酶切反应过夜(1～16h)。

(5)酶切后PCR产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(40％PAGE 4ml，5×TBE 4ml，ddH₂O 12ml，AP 134μl，TEMED 16μl)电泳分离，160V恒压电泳3h，1g/L AgNO₃溶液染色，30g/L NaOH溶液(加入15ml甲醛混匀)显影，在凝胶成像仪上拍照和读带分析。结果如图1所示。10个保持系FB株系PCR产物由于Bsp1407I酶切位点缺失，电泳检测酶切产物大小均为原始PCR产物大小(即580bp)；而10个不育系FA株系均一致被酶切为430bp和150bp两条条带，表明该CAPS标记能够非常有效的鉴定F型三系杂交小麦不育系及保持系中的线粒体不育基因。

以上所述本发明主要内容，仅为F型三系杂交小麦分子机理中雄性不育基因及相关分子标记，作为不同于国内其他细胞核不育、温光敏两系不育等的新型三系小麦，遗传机制比较特殊复杂，其恢复基因及相关分子标记开发和应用等研究工作正在全力开展攻关，相关技术发明专利将单独申报，与本专利相互补充验证。

序列表

SEQ ID NO.1

DNA

小麦

TAAGAATAAG AAAGAAGAAT CTTATGGAAA TAGCATGGAA TAAGGTTTGA TCCTATTCAT60GGGGATTCCG TAAATATCCC ATTTCTAAAA TCGAAACAAT CGGGACTTTT CGGAGATTGG120ATGCAGTTAC TAATTCATGA TCTGGCATGT ACAGAATGAA AACTTCATTC TCGATTCTAC180GAGAATTTTT ATGAAAGCGT TTCATTTGCT TCTCTTCAAT GGAAGTTTCA TTTTCCCAGA240ATGTATCCTA ATTTTTGGCC TAATTCTTCT TCTTCTGATC GATTCAACCT CTGATCAAAA300AGATAGACCT TGGTTCTATT TCATCTCTGC AACAAGTTTA GTAATAAGCATAACGGCCCT360ATTGTTCCGA TGGAGAGAAG AACCTATAAT TAGCTTTTCG GGAAATTTCC AAACGAACAA420TTTCAACGAA ATCTTTCCAT TTCTCATTTT ATTATGTTCA ACTTTATGTA TTCCTCTATC480CGTAGAGTAC ATTGAATGTA CAGAAATGGC TATAACAGAG TTTCTGTTAT TCGTATTAAC540AGCTACTCTA GGGGGAATGT TTTTATGTGG TGCTAACGAT TTAATAACTA TCTTTGTAGC600TCCAGAATGT TTCAGTTTAT GTTCCTACCT ATTGTCTGGA TATACCAAGA GAGATCTACG660GTCTAATGAG GCTACTATGA AATATTTACT CATGGGTGGG GCAAGCTCTT CTATTCTGGT720TCATGGTTTC TCTTGGCTAT ATGGTTCATC TGGGGGGGAG ATCGAGCTTC AAGAAATTGT780GAACGGTCTT ATCAATACAC AAATGTATAA CTCCCCAGGA ATTTCCATTG CGCTTATATC840CATCACTGTAGGACTTGGGT TTAAGCTTTC CCCAGCCCCT TTTCATCAAT GGACTCCTGA900CGTCTACGAA GGAGTGTGGT TCGTTCGACA AATTCCTACC TCTATATCTATCTCTGAGGT960GTTTGGGTTT TGCAAAACTC CATAGACATG CAGAAGAGAA ATGCTATCCC CACTCC 1016

SEQ ID NO.2

DNA

人工序列(正向引物)

GCATAACGGCCCTATTGTTCC

SEQ ID NO.3

DNA

人工序列(反向引物)

CGAACGAACCACACTCCTTC

SEQ ID NO.4

DNA

人工序列

ATGGCTATAACAGAGTTTCTGTTATTCGTATTAACAGCTACTCTAGGGGGAATGTTTTTATGTGGTGCTAACGATTTAATAACTATCTTTGTAGCTCCAGAATGTTTCAGTTTATGTTCCTACCTATTGTCTGGATATACCAAGAGAGATCTACGGTCTAATGAGGCTACTATGAAATATTTACTCATGGGTGGGGCAAGCTCTTCTATTCTGGTTCATGGTTTCTCTTGGCTATATGGTTCATCTGGGGGGGAGATCGAGCTTCAAGAAATTGTGAACGGTCTTATCAATACACAAATGTATAACTCCCCAGGAATTTCCATTGCGCTTATATCCATCACTGTAGGACTTGGGTTTAAGCTTTCCCCAGCCCCTTTTCATCAATGGACTCCTGACGTCTACGAAGGAGTGTGGTTCGTTCGACAAATTCCTACCTCTATATCTATCTCTGAGGTGTTTGGGTTTTGCAAAACTCCATAG

SEQ ID NO.5

蛋白质

人工序列

MAITEFLLFVLTATLGGMFLCGANDLITIFVAPECFSLCSYLLSGYTKRDLRSNEATMKYLLMGGASSSILVHGFSWLYGSSGGEIELQEIVNGLINTQMYNSPGISIALISITVGLGFKLSPAPFHQWTPDVYEGVWFVRQIPTSISISEVFGFCKTP

序列表

<110> 创世纪种业有限公司

<120> F型三系杂交小麦雄性不育基因相关分子标记开发及应用

<130> CP2018

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1016

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 1

taagaataag aaagaagaat cttatggaaa tagcatggaa taaggtttga tcctattcat 60

ggggattccg taaatatccc atttctaaaa tcgaaacaat cgggactttt cggagattgg 120

atgcagttac taattcatga tctggcatgt acagaatgaa aacttcattc tcgattctac 180

gagaattttt atgaaagcgt ttcatttgct tctcttcaat ggaagtttca ttttcccaga 240

atgtatccta atttttggcc taattcttct tcttctgatc gattcaacct ctgatcaaaa 300

agatagacct tggttctatt tcatctctgc aacaagttta gtaataagca taacggccct 360

attgttccga tggagagaag aacctataat tagcttttcg ggaaatttcc aaacgaacaa 420

tttcaacgaa atctttccat ttctcatttt attatgttca actttatgta ttcctctatc 480

cgtagagtac attgaatgta cagaaatggc tataacagag tttctgttat tcgtattaac 540

agctactcta gggggaatgt ttttatgtgg tgctaacgat ttaataacta tctttgtagc 600

tccagaatgt ttcagtttat gttcctacct attgtctgga tataccaaga gagatctacg 660

gtctaatgag gctactatga aatatttact catgggtggg gcaagctctt ctattctggt 720

tcatggtttc tcttggctat atggttcatc tgggggggag atcgagcttc aagaaattgt 780

gaacggtctt atcaatacac aaatgtataa ctccccagga atttccattg cgcttatatc 840

catcactgta ggacttgggt ttaagctttc cccagcccct tttcatcaat ggactcctga 900

cgtctacgaa ggagtgtggt tcgttcgaca aattcctacc tctatatcta tctctgaggt 960

gtttgggttt tgcaaaactc catagacatg cagaagagaa atgctatccc cactcc 1016

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

gcataacggc cctattgttc c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 3

cgaacgaacc acactccttc 20

<210> 4

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 4

atggctataa cagagtttct gttattcgta ttaacagcta ctctaggggg aatgttttta 60

tgtggtgcta acgatttaat aactatcttt gtagctccag aatgtttcag tttatgttcc 120

tacctattgt ctggatatac caagagagat ctacggtcta atgaggctac tatgaaatat 180

ttactcatgg gtggggcaag ctcttctatt ctggttcatg gtttctcttg gctatatggt 240

tcatctgggg gggagatcga gcttcaagaa attgtgaacg gtcttatcaa tacacaaatg 300

tataactccc caggaatttc cattgcgctt atatccatca ctgtaggact tgggtttaag 360

ctttccccag ccccttttca tcaatggact cctgacgtct acgaaggagt gtggttcgtt 420

cgacaaattc ctacctctat atctatctct gaggtgtttg ggttttgcaa aactccatag 480

<210> 5

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 5

Met Ala Ile Thr Glu Phe Leu Leu Phe Val Leu Thr Ala Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gly Met Phe Leu Cys Gly Ala Asn Asp Leu Ile Thr Ile Phe Val Ala

20 25 30

Pro Glu Cys Phe Ser Leu Cys Ser Tyr Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Lys

35 40 45

Arg Asp Leu Arg Ser Asn Glu Ala Thr Met Lys Tyr Leu Leu Met Gly

50 55 60

Gly Ala Ser Ser Ser Ile Leu Val His Gly Phe Ser Trp Leu Tyr Gly

65 70 75 80

Ser Ser Gly Gly Glu Ile Glu Leu Gln Glu Ile Val Asn Gly Leu Ile

85 90 95

Asn Thr Gln Met Tyr Asn Ser Pro Gly Ile Ser Ile Ala Leu Ile Ser

100 105 110

Ile Thr Val Gly Leu Gly Phe Lys Leu Ser Pro Ala Pro Phe His Gln

115 120 125

Trp Thr Pro Asp Val Tyr Glu Gly Val Trp Phe Val Arg Gln Ile Pro

130 135 140

Thr Ser Ile Ser Ile Ser Glu Val Phe Gly Phe Cys Lys Thr Pro

145 150 155

Claims

1.一种F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点的特异PCR标记开发方法，所述方法包括：

(1)将小麦通过多代姊妹交，将获得的自交系分成自交结实率高的保持系和自交结实率中等的保持系，以及自交结实率低于5％的稳定不育系，三者除育性差异，其他生物学特征完全一致；

2.根据权利要求1所述的方法，所述多代是指8代以上。

3.根据权利要求1或2所述的方法，通过Hiseq2000进行测序。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，运用BWA软件与小麦参考基因组序列进行比对，并利用GATK软件包进行SNP信息的检测和注释。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，利用Annovar程序结合参考基因组的gff注释信息对得到的纯合SNP进行注释，并通过Goatools进行富集分析，利用KOBAS进行KEGGpathway富集分析。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，通过DNAMAN和Primer Premier5.0检测、设计和开发限制性内切酶扩增多态性序列标记或竞争性等位基因特异性PCR标记。

7.根据权利要求1-6任一项的方法获得的F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点分子标记，所述SNP位点包括3个SNP位点，第1个SNP位于358137bp为PsaA/PsaB基因内同义突变C变成T，第2和3个SNP分别位于419226bp和419241bp为NdhB基因内非同义突变T变成C。

8.根据权利要求7的F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点分子标记的检测方法，所述方法包括：

用以下引物进行PCR扩增：正向引物：5’GCATAACGGCCCTATTGTTCC3’；反向引物：5’CGAACGAACCACACTCCTTC3’；

9.根据权利要求8所述的方法，PCR扩增退火温度Tm＝59℃，延伸时间40S。

10.根据权利要求8或9所述的方法，酶切在37℃下进行。