CN115992290A - 小麦株高相关snp位点及其在辅助筛选不同株高小麦中的应用 - Google Patents

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鲍菁培
赵伟双
白蛟腾
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Abstract

本发明公开了小麦株高相关SNP位点及其在辅助筛选不同株高小麦中的应用,所述SNP位点位于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第7186位碱基;所述SNP位点的碱基为C或T,基因型CC相对于基因型TT具有或潜在具有更高的株高。降低小麦株高可以增加其抗倒伏能力,进而有效增加小麦的产量,因此株高性状对于实现小麦的高产、稳产十分重要。本发明开发的小麦株高相关SNP位点在小麦分子标记辅助育种等诸多领域均具有重要的科研和实用价值。

Description

小麦株高相关SNP位点及其在辅助筛选不同株高小麦中的 应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,涉及TaNUP85-3B基因中的C7186T SNP位点在辅助筛选不同株高小麦中的应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是我国最主要的粮食作物之一。提升小麦单产是满足粮食需求不断提高的重要方式,同时也是保证粮食安全的战略目标。降低小麦株高可以增加抗倒伏能力,进而小麦产量增加。因此株高性状对于实现小麦的高产、稳产极其重要。
目前,研究者已经定位了大量调控株高的QTL:Gao等利用周842B×中国春的重组自交系群体鉴定到位于染色体2A、4A、4B、4D和5A的5个株高QTL;Zhang等在染色体1D、2B、3A、3D、4A、4B、5A和6B鉴定到8个与株高相关QTL;Guo等基于芯片标记技术对215个小麦品种进行关联分析,关联到11个与株高相关的QTL位点,分别被定位3A、3B、5B、6A、6B和7B染色体上;Yu等利用包含有110株系ITMI的RIL群体为材料,对小麦株高进行定位,共检测到10个控制株高的QTL位点,分别被定位3B、5A、5B、6A和7D染色体上;Bai等利用双单倍体材料(Avalon x Cadenza),对小麦株高性状进行定位,共5个QTLs被检测到,分别被定位在2D、4D、3A、3B和6A。尽管已经定位了大量的与小麦株高相关的QTL,但由于绝大多数QTL的表型贡献率较小,且在不同年际及环境间重复性差,所以这些QTL难以应用于小麦株高的遗传改良。
CAPS标记又称为PCR-RFLP(限制性片段长度多态性聚合酶链反应),是一类以PCR为基础的共显性分子标记,揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异信息,其基本原理是用PCR扩增目的DNA,扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段,直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同,产生不同长度的DNA片段条带。优点是避免了RFLP分析中繁琐的转移、杂交步骤,又能保持RFLP分析的精确度。然而,SNP恰好位于限制性酶切位点的情况比较少,因此,提出了dCAPS标记,即在CAPS标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基,结合SNP位点引入新的限制性内切酶作用位点,产生和CAPS标记类似的多态性。
可见,对于小麦株高相关SNP位点的开发和应用具有重要的科研和实用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种与小麦株高性状相关的SNP位点及其应用。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案如下。
用于检测与小麦株高相关的SNP位点的试剂盒,所述SNP位点位于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第7186位碱基;所述SNP位点的碱基为C或T,基因型CC相对于基因型TT具有或潜在具有更高的株高。
作为本发明的一种优选技术方案,所述试剂盒包含由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3组成的引物对F1、R1,以及由SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5组成的引物对F2、R2。
作为本发明的一种优选技术方案,所述试剂盒中还包含至少一种限制性内切酶;所述限制性内切酶为PvuII。
上述试剂盒的用途,在小麦分子标记辅助育种中用于在分子育种早期区分和/或筛选待测小麦的株高表型。
鉴定或辅助鉴定小麦株高的方法,包括如下步骤:
A、以待测小麦的基因组DNA为模板,采用由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3组成的引物对F1、R1进行PCR扩增,得到PCR扩增产物P1;然后以所得PCR扩增产物P1为模板,采用由SEQID NO.4、SEQ ID NO.5组成的引物对F2、R2再次进行PCR扩增,得到PCR扩增产物P2;
B、将上步所得PCR扩增产物P2用限制性内切酶PvuII进行酶切得到酶切产物;
C、基于所得酶切产物鉴定或辅助鉴定小麦的株高:如果所得酶切产物为一条DNA片段,则待测小麦为基因型II;如果所得酶切产物为两条DNA片段,则待测小麦为基因型I;基因型I的小麦的株高>基因型II的小麦的株高。
作为本发明的一种优选技术方案,步骤C中,按照如下标准基于所得酶切产物鉴定或辅助鉴定小麦的株高:如果所得酶切产物中只具有128bp的DNA片段,则待测小麦为基因型II;如果所得酶切产物中具有105bp的DNA片段和23bp的DNA片段,则待测小麦为基因型I;基因型I的小麦的株高>基因型II的小麦的株高。
一种用于检测小麦株高的引物组合,包括由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3组成的引物对F1、R1,以及由SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5组成的引物对F2、R2。
上述引物组合的用途,用于鉴定或辅助鉴定小麦的株高,以及在分子育种早期区分和/或筛选待测小麦的株高表型。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于:
本发明公开了一种与小麦株高相关的SNP位点及其应用;降低小麦株高可以增加其抗倒伏能力,进而有效增加小麦的产量,因此株高性状对于实现小麦的高产、稳产十分重要。
经过试验验证,采用本发明所提供的方法检测待测小麦基于TaNUP85-3B基因的基因型,可以筛选或辅助筛选小麦株高性状。当分子标记中的C7186T SNP位点的基因型为CC纯合型,则判定为基因型I的小麦;当分子标记中的C7186T SNP位点的基因型为TT纯合型,则判定为基因型II的小麦;所述C7186T SNP位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起的第7186位核苷酸;基因型I的小麦的株高>基因型II的小麦的株高。
综上所述,本发明开发的小麦株高相关SNP位点在小麦分子标记辅助育种等诸多领域均具有重要的科研和实用价值。
附图说明
图1为利用F1、R1对自然群体中16个品种小麦TaNUP85-3B基因进行扩增得到的电泳图;图中展示的是对照和16个品种小麦的检测结果,1-16的品种依次为rysdale、冀麦30、冀麦32、冀麦38、冀麦41、冀麦6号、冀麦9号、冀麦一号、冀审5099、鉴26、金光、晋2148-7、晋麦13、晋麦17、晋麦33、晋麦39。
图2为自然群体中部分小麦TaNUP85-3B基因的基因型检测电泳图;图中展示的是对照和16个品种小麦的检测结果,1-16的品种依次为Drysdale、冀麦30、冀麦32、冀麦38、冀麦41、冀麦6号、冀麦9号、冀麦一号、冀审5099、鉴26、金光、晋2148-7、晋麦13、晋麦17、晋麦33、晋麦39。
图3为296个小麦品种分别种植于九个环境下两种基因型的小麦的株高的统计结果示意图;图中,“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品,均能够通过市场购买直接获得。在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此,在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例,而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”,除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”,除非是以其他方式另外特别强调。
下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库,材料信息见中国作物种质信息网。由于小麦材料均为栽培种,因此通常被默认为是高度纯合的植物材料,基因型均为纯合型。
实施例1、小麦TaNUP85-3B基因及C7186T SNP
基于大量的理论分析和试验研究,在小麦TaNUP85-3B基因上发现了一个SNP位点,命名为C7186T SNP。C7186T SNP位于SEQ ID NO:1自5’末端起的第7186位,基因型为CC纯合型和TT纯合型。由于基因组DNA是由反向互补的两条单链DNA分子组成双链DNA分子,因此一般将编码蛋白质的DNA分子命名为正义DNA分子;将与正义DNA分子的反向互补的DNA分子命名为反义DNA分子。C7186T SNP的基因型均为正义DNA的基因型。
根据小麦TaNUP85-3B基因的不同将小麦分为两种基因型:TaNUP85-3B-C(以下简称基因型I)和TaNUP85-3B-T(以下简称基因型II)。
实施例2、用于扩增包括C7186T SNP的靶序列的引物对
设计并合成用于扩增包括C7186T SNP的靶序列的引物对甲和引物对乙。引物对甲由引物F1和引物R1组成。引物对乙由引物F2和引物R2组成。各个引物的核苷酸序列具体如下:
引物F1:5′-CATCCGTCTTGGTCAAGAGGCTGT-3′(SEQ ID NO:2)
引物R1:5′-CAGACGTCCGGTCTGAATTCCGA-3′(SEQ ID NO:3)
引物F2:5′-GAAGCCAGCTGTGTAACTCTT-3′(SEQ ID NO:4)
引物R2:5′-TTATTGTTTCCAGTAAGGAGCA-3′(SEQ ID NO:5)
引物对甲扩增的靶序列如SEQ ID NO:1自5’末端起第6918-7513位所示。
实施例3、基于TaNUP85-3B基因的小麦基因型分型方法
1、提取待测小麦的基因组DNA。
2、以步骤1的待测小麦的基因组DNA为模板,采用引物F1和引物R1组成的引物对甲进行PCR扩增,得到PCR扩增产物P1。反应体系为10μL,由3.6μL ddH2O、5μL 2×Taq酶Mix、0.2μL引物F1水溶液(浓度为10μmol/L)、0.2μL引物R1水溶液(浓度为10μmol/L)和1μL待测小麦的基因组DNA(浓度为20ng/μL)组成。2×Taq酶Mix为南京诺唯赞公司的产品,产品目录号为P131。反应条件为:95℃3min;95℃15s,65℃15s,72℃15s,32次循环;72℃10min;16℃保存。
3、完成步骤2后,以PCR扩增产物P1的稀释液(1体积份PCR扩增产物P1和9体积份水混合而成)为模板,采用引物F2和引物R2组成的引物对乙进行PCR扩增,得到PCR扩增产物P2。反应体系为10μL,由3.6μL ddH2O、5μL 2×Taq酶Mix、0.2μL引物F2水溶液(浓度为10μmol/L)、0.2μL引物R2水溶液(浓度为10μmol/L)和1μL PCR扩增产物P1的稀释液组成。反应条件为:95℃3min;95℃15s,60℃15s,72℃10s,32次循环;72℃10min;16℃保存。
4、将步骤3得到的PCR扩增产物P2用限制性内切酶PvuII进行酶切消化,得到酶切产物;将酶切产物进行4%琼脂糖凝胶电泳检测,进行如下判断:如果酶切产物为带型A(显示两条带,分别为105bp和23bp),则待测小麦C7186T SNP为CC纯合型,即待测小麦基于TaNUP85-3B基因的基因型为基因型I;如果酶切产物为带型B(显示一条带,为128bp),则待测小麦C7186T SNP为TT纯合型,即待测小麦基于TaNUP85-3B基因的基因型为基因型II。
实施例4、小麦TaNUP85-3B基因的基因型与小麦株高的关联分析及验证
①自然群体中各个小麦TaNUP85-3B基因的基因分型
采用实施例1中步骤三的方法对自然群体中的各个小麦品种进行基因分型。自然群体由296个小麦品种(均为六倍体)组成。小麦品种名称详见表1。
部分检测结果见图1(M为DNA Marker,其它泳道为不同小麦品种;其中T为基因型II的小麦品种,C为基因型I的小麦品种)。
296个小麦品种基于TaNUP85-3B基因的基因型见表1:48个小麦品种基于TaNUP85-3B基因的基因型为基因型I,248个小麦品种基于TaNUP85-3B基因的基因型为基因型II。
表1
Figure BDA0004001879040000051
Figure BDA0004001879040000061
Figure BDA0004001879040000071
Figure BDA0004001879040000081
注:I为基因型I,II为基因型II。
②株高性状检测
将296个小麦品种分别种植于九个环境,分别统计不同种植条件下两种基因型的小麦的平均株高。统计结果见表2。
表2
Figure BDA0004001879040000082
Figure BDA0004001879040000091
注:P value为关联分析的显著性水平,“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01。
3、关联分析
利用Tassel2.1软件将自然群体中小麦TaNUP85-3B基因的基因型与株高进行关联分析,结果见表2。结果表明,296个小麦品种组成的自然群体中,“基因型I的小麦”的株高>“基因型II的小麦”的株高;所述“>”为在统计学上的>。对自然群体的研究表明,基因型II是降低小麦株高的优异基因型。上述结果表明,通过检测待测小麦基于TaNUP85-3B基因的基因型可以筛选或辅助筛选小麦株高性状,在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。
在上述实施例中,对各个实施例的描述都各有侧重,某个实施例中没有详述或记载的部分,可以参见其它实施例的相关描述。
以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.用于检测与小麦株高相关的SNP位点的试剂盒,所述SNP位点位于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第7186位碱基;所述SNP位点的碱基为C或T,基因型CC相对于基因型TT具有或潜在具有更高的株高。
2.根据权利要求1所述的用于检测与小麦株高相关的SNP位点的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包含由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3组成的引物对F1、R1,以及由SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5组成的引物对F2、R2。
3.根据权利要求1所述的用于检测与小麦株高相关的SNP位点的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中还包含至少一种限制性内切酶;所述限制性内切酶为PvuII。
4.权利要求1或2或3所述的试剂盒的用途,在小麦分子标记辅助育种中用于在分子育种早期区分和/或筛选待测小麦的株高表型。
5.鉴定或辅助鉴定小麦株高的方法,其特征在于:该方法包括如下步骤:
A、以待测小麦的基因组DNA为模板,采用由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3组成的引物对F1、R1进行PCR扩增,得到PCR扩增产物P1;然后以所得PCR扩增产物P1为模板,采用由SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5组成的引物对F2、R2再次进行PCR扩增,得到PCR扩增产物P2;
B、将上步所得PCR扩增产物P2用限制性内切酶PvuII进行酶切得到酶切产物;
C、基于所得酶切产物鉴定或辅助鉴定小麦的株高:如果所得酶切产物为一条DNA片段,则待测小麦为基因型II;如果所得酶切产物为两条DNA片段,则待测小麦为基因型I;基因型I的小麦的株高>基因型II的小麦的株高。
6.根据权利要求5所述的鉴定或辅助鉴定小麦株高的方法,其特征在于:步骤C中,按照如下标准基于所得酶切产物鉴定或辅助鉴定小麦的株高:如果所得酶切产物中只具有128bp的DNA片段,则待测小麦为基因型II;如果所得酶切产物中具有105bp的DNA片段和23bp的DNA片段,则待测小麦为基因型I;基因型I的小麦的株高>基因型II的小麦的株高。
7.一种用于检测小麦株高的引物组合,包括由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3组成的引物对F1、R1,以及由SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5组成的引物对F2、R2。
8.权利要求7所述的引物组合的用途,用于鉴定或辅助鉴定小麦的株高,以及在分子育种早期区分和/或筛选待测小麦的株高表型。
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