CN105671041A - 三系杂交小麦种子纯度分子标记及其引物对和应用 - Google Patents

三系杂交小麦种子纯度分子标记及其引物对和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三系杂交小麦种子纯度分子标记及其引物对和应用，其中的分子标记为SSR分子标记，所述分子标记为位于2A染色体上的Wmc474或位于1B染色体上的Barc8。本发明可准确鉴定AL型三系杂交小麦种子纯度。

Description

三系杂交小麦种子纯度分子标记及其引物对和应用
技术领域
本发明涉及育种技术领域，特别涉及一种三系杂交小麦种子纯度分子标记及其引物对和应用。
背景技术
利用小麦杂种优势是提高小麦单产的有效途径。目前，小麦利用杂种优势的主要途径有：“三系法”、“两系法”和“化学杀雄法”。
三系法是指将不育系、保持系和恢复系进行三系配套，不育系为母本，保持系为父本，相间种植，不育系所结种子下代仍为雄性不育，不育系循环繁殖或用以配制杂交种；以不育系为母本，恢复系为父本，相间种植，通过恢复系授给不育系花粉，不育系植株上生产的种子即为杂交种。
两系法主要是利用光温敏雄性不育系和相应恢复系实现二系配套。光温敏雄性不育受隐性主基因控制，其育性的表达受外界温光条件的影响。在敏感期，当环境温度在不育临界温度范围时，表现为完全不育，这时不育系可用来与恢复系制种；当环境温度在可育临界温度范围时，不育系又恢复正常可育，自交结实繁殖。在杂交制种中，将温光敏不育系种子和恢复系相间种植，来生产小麦杂交种。
化学杀雄法是指将强优势组合的亲本相间种植，在小麦抽穗—散粉关键时期，对母本喷施化学药剂，杀死母本的花粉，导致母本不育，通过父本授给母本花粉，使母本异交结实，生产小麦杂交种。
在上述三种小麦杂交种生产过程中，杂交种的纯度至关重要。因为种子的纯度将决定生产出的杂交种子能否在生产上应用，同时种子纯度还影响杂交种的田间长势长相和杂种优势表现。三系杂交小麦不育系亲本种子繁殖或杂交种种子生产，采用不育系母本与保持系父本或不育系母本与恢复系父本按不同行比种植。收获时，父、母本必须分别收获，即先割除父本，后收获不育系或杂交种，尽可能地降低种子的机械混杂。由于小麦是自花授粉作物，父本保持系或恢复系可以自我繁殖，加上播种质量、栽培措施、收获环节复杂等影响，在收获过程中，会造成少量父本割除不及时或不完全，难免会有保持系或恢复系种子混入，从种子形态上很难鉴别出混杂的种子，导致杂交种子的机械混杂，会降低杂交种的纯度。
目前我国采用的小麦种子纯度检测方法分为组织化学鉴定法、幼苗鉴定法、田间鉴定法和籽粒醇溶蛋白鉴定法(王立新等，2009)。但是这些方法都有一定的缺陷或局限性。组织化学法是凭借苯酚和氢氧化钠与种子各组织发生的颜色反应,根据种子间颖果和种皮着色差异区别杂株的种子,而小麦品种之间种子组织对染料的反应差异不大,很难依此鉴定种子纯度。幼苗鉴定法是根据幼苗叶鞘颜色辨别杂株,而幼苗叶鞘颜色只有紫色和绿色，如果杂株与测试品种幼苗叶鞘颜色一致,则无法辨别杂株。田间鉴定法是根据国标《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南普通小麦6(GB/T19557.2-2004)》,对测试品种全生育期25～56个重要表型和农艺性状进行一致性测试,需要一定面积的田间试验,试验周期较长。这样势必费时费力，增加成本。又因有些农艺性状为数量性状,株间差异往往为连续数据，而且容易受环境因素影响,降低了测试结果的准确性。籽粒醇溶蛋白鉴种子定法是依靠凝胶电泳技术展现品种间的醇溶蛋白亚基带型的差异而判断种子纯度。但因醇溶蛋白的所有组分在一块凝胶中电泳分离,没有足够的空间展示所有组分,使该技术灵敏度大打折扣。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供一种三系杂交小麦种子纯度分子标记及其引物对和应用，主要目的是准确鉴定三系杂交小麦种子纯度。
为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种三系杂交小麦种子纯度分子标记，所述分子标记为SSR分子标记，所述分子标记为位于2A染色体上的Wmc474或位于1B染色体上的Barc8。
另一方面，本发明实施例提供了一种三系杂交小麦种子纯度分子标记的引物对，其中
位于2A染色体上的Wmc474的引物对的序列如下：
Xwmc474L：ATGCTATTAAACTAGCATGTGTCG，
Xwmc474R：AGTGGAAACATCATTCCTGGTA；
位于1B染色体上的Barc8的引物对的序列如下：
Xbarc8L：GCGGGAATCATGCATAGGAAAACAGAA，
Xbarc8R：GCGGGGGCGAAACATACACATAAAAACA。
另一方面，本发明实施例提供了一种三系杂交小麦种子纯度分子标记在AL型三系杂交小麦种子纯度检测中的应用。
作为优选，所述应用包括如下步骤：
将三系杂交小麦种子与非杂交种子按不同的设计比例混合形成多个试验组，待发苗后提取DNA；
用所述SSR分子标记对应的引物对其幼苗DAN进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳染色检测，分别统计各试验组的杂交种和非杂交种子的检测数量；
将统计出的检测值与设计的理论值作相关性分析和回归分析得到小麦杂交种纯度计算值与检测值的方程；
将待测三系杂交小麦种子抽样发苗、提取叶片DNA，然后利用所述SSR分子标记对应的引物进行检测，将检测值代入上述方程，计算得到待测小麦杂交种纯度。
作为优选，所述三系杂交小麦种子分别与恢复系种子和保持系种子按不同的设计比例混合形成多个试验组。
作为优选，所述三系杂交小麦种子与恢复系种子混合时，
以位于2A染色体上的Wmc474的引物对其幼苗DNA进行扩增，建立的混入恢复系种子的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下：y＝4.4-10+0.7875x，其中x为混入的恢复系种子的检测值，y为混入的恢复系种子的计算值；
以位于1B染色体上的Barc8的引物对其幼苗DNA进行扩增，建立的混入恢复系种子的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下：y＝-0.1452+0.9314x，其中x为混入的恢复系种子的检测值，y为混入的恢复系种子的计算值；
所述三系杂交小麦种与保持系混合时，
以位于2A染色体上的Wmc474的引物对其幼苗DNA进行扩增，建立的混入保持系种子的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下：y＝0.2109+0.6797x，其中x为混入的保持系种子的检测值，y为混入的保持系种子的计算值；
以位于1B染色体上的Barc8的引物对其幼苗DNA进行扩增，建立的混入保持系种子的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下：y＝0.4083+0.7583x，其中x为混入的保持系种子的检测值，y为混入的保持系种子的计算值。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明根据AL型(普通小麦细胞质雄性不育)杂种小麦品种与其不育系和恢复系亲本在DNA水平上的多样性差异，利用小麦2A染色体上的分子标记Wmc474和1B染色体上的分子标记barc8与育性恢复基因连锁，对杂交种内混杂不同比例的亲本种子可以有效区分，并在此基础上建立了一种AL型杂交小麦种子纯度分子标记检测方法，该方法解决了需要田间种植进行杂种纯度鉴定费时费力的问题。确保小麦杂交种纯度分子标记检测的实用性，必将对种子企业和农民推广小麦杂交种产生积极作用。
附图说明
图1至图6为本发明实施例中三系杂交小麦种子纯度检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
本发明实施例提供了一种三系杂交小麦种子纯度分子标记及其引物对，该分子标记为SSR分子标记，本发明实施提供的分子标记为位于2A染色体上的Wmc474或位于1B染色体上的Barc8。
上述分子标记的引物对具体如下，其中
位于2A染色体上的Wmc474的引物对的序列为：
Xwmc474L：ATGCTATTAAACTAGCATGTGTCG，
Xwmc474R：AGTGGAAACATCATTCCTGGTA；
位于1B染色体上的Barc8的引物对的序列为：
Xbarc8L：GCGGGAATCATGCATAGGAAAACAGAA，
Xbarc8R：GCGGGGGCGAAACATACACATAAAAACA。
本发明实施例在上述分子标记的基础上，提供了一种三系杂交小麦种子纯度分子标记检测方法，将上述的分子标记应用于AL型三系杂交小麦种子纯度检测中。
本发明实施例根据AL型(普通小麦细胞质雄性不育)杂种小麦品种与其不育系和恢复系亲本在DNA水平上的多样性差异，利用小麦2A染色体上的SSR分子标记Wmc474和1B染色体上的分子标记barc8与育性恢复基因连锁，对杂交种中混杂不同比例的非杂交种种子进行有效区分。
作为上述实施例优选，本发明实施例的三系杂交小麦种子纯度分子标记在AL型三系杂交小麦种子纯度检测中的应用具体包括如下步骤：
将三系杂交小麦种子与非杂交种子按不同的设计比例混合形成多个试验组，待发苗后提取DNA；
用上述的SSR分子标记对应的引物对其幼苗DNA进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳染色检测，分别统计各试验组的杂交种子和非杂交种子的检测数量；
将统计出的检测值与设计的理论值作相关性分析和回归分析得到小麦杂交种纯度计算方程；
将待测三系杂交小麦种子抽样发苗、提取叶片DNA，然后利用所述SSR分子标记对应的引物进行检测，将检测值代入上述方程，最终得到待测小麦杂交种子纯度。
小麦杂交种是由母本和父本杂交获得的，因此，在基因型上同时具有母本带型和父本带型，属杂合带。通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳染色检测后，杂交种在凝胶上显示杂合带型，与父本、母本均可从凝胶带型上区别开来。PCR扩增后，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以杂交种与亲本恢复系和杂交种与亲本保持系作为对照，根据杂合带型与亲本带型的区别，即可将杂交种和非杂交种的数量统计出来。按照统计出来的数量计算杂交小麦种子纯度会与实际纯度有一定的误差，因此，本实施例中将统计的检测值与设计的理论值进行回归分析，得到检测值与理论值之间的方程，将检测值代入上述方程得到的纯度更加接近实际纯度。
作为上述实施例的优选，三系杂交小麦种子分别与恢复系和保持系种子按不同的设计比例混合形成多个试验组。三系杂交小麦种与恢复系按不同的设计比例混合形成多个试验组，待发苗后提取DNA；然后分别用两组引物对提取的DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳染色检测，分别回归得到相应的方程。三系杂交小麦种与保持系按不同的设计比例混合形成多个试验组，待发苗后提取DNA；然后分别用两组引物对提取的DNA进行PCR扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳染色检测，分别回归得到相应的方程。
本发明实施例中，以AL型三系杂交小麦新冬43号(新农审字2013第5号)的亲本不育系(AL18A)和恢复系(99AR144-1)为材料。抽取纯度100％的杂交小麦新冬43号种子1400粒，等分成14份，每份100粒。其中7份人为混合恢复系种子，见表1，另外7份人为混合保持系种子，见表2。不同种子纯度比例设计如下：100％，97％，94％，91％，88％，85％和82％。具体方法是将100粒种子分别按表1和表2比例充分混匀后，摆成圆形，采用四分法用直尺将其分成均匀的四等份，每份种子量为25粒，随机选取1份按单粒在穴盘上发苗，然后提取叶片DNA。
表1：人为混入恢复系试验设计方案
杂交种理论纯度 100％ 97％ 94％ 91％ 88％ 85％ 82％
混杂恢复系粒数 0 3 6 9 12 15 18
杂交种粒数 100 97 94 91 88 85 82
表2：人为混入保持系试验设计方案
杂交种理论纯度 100％ 97％ 94％ 91％ 88％ 85％ 82％
混杂保持系粒数 0 3 6 9 12 15 18
杂交种粒数 100 97 94 91 88 85 82
按照上述方法扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳染色检测，统计得到的恢复系检测值x见表3，设计的纯度及恢复系的设计的理论值及回归得到的恢复系的小麦杂交种纯度理论值y与检测值x的方程见表3。
按照上述方法扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳染色检测，统计得到的保持系检测值x见表4，设计的纯度及保持系的设计的理论值及回归得到的保持系的小麦杂交种纯度理论值y与检测值x的方程见表4。
表3：杂交种混杂不同比例恢复系种子分子标记纯度分析(25粒)
表4：杂交种混杂不同比例保持系种子分子标记纯度分析(25粒)
上述4个回归方程相关系数均＞0.9相关极显著，表明建立的4个回归方程在人为混入非杂交种纯度鉴别中均可使用。
上述实施例中是针对混入的非杂交种粒数进行修正，回归得到非杂交种的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程。当然，本发明实施例的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程，不仅指上述实施例的非杂交种数量的检测值与理论值的方程，还可以是杂交种数量的检测值与计算值的方程或者直接是杂交种纯度的测量值(根据测量结果直接得到的纯度值)与计算值的方程。
下面按不同比例混合，分别检测验证。
Xwmc474(2A)对混杂恢复系和保持系种子纯度检测
100粒种子97％为新冬43号杂种种子，3％为恢复系种子进行充分的混合，从中随机选取25粒种子进行分子标记纯度检测。图1为混杂恢复系种子杂种纯度97％检测图。图中M为Marker，1为新冬43号杂交种，2为99AR144-1恢复系，3-27为检测种子，从图中可以看出仅有序号23显示恢复系条带，其余24个都显示杂合带。将x＝1代入方程y＝4.4-10+0.7875x(表3)，计算纯度为96.8％。
100粒种子94％为新冬43号杂种种子，6％为保持系种子进行充分混合，从中随机选取25粒种子进行分子标记纯度检测。图2为混杂保持系种子杂种纯度94％检测图。图中M为Marker，1为新冬43号杂交种，2为18B保持系，3-27为检测种子，从图2中可以看出与保持系相同的条带为序号15、21共计2个，其余23个都显示杂种带。将x＝2代入方程y＝0.2109+0.6797x(表4)，计算纯度为93.7％。
Xbarc8(1B)对混杂恢复系和保持系种子纯度检测
100粒种子85％为新冬43号杂种种子，15％为恢复系种子进行充分混合，从中随机选取25粒种子进行分子标记纯度检测。图3为混杂恢复系种子杂种纯度85％检测图。图中M为Marker，1为新冬43号杂交种，2为99AR144-1恢复系，3-27为检测种子，从图中可以看出与恢复系相同的条带为序号4、6、7、17共计4个，其余21个都显示杂种带。将x＝4代入方程y＝-0.1452+0.9314x(表3)，计算纯度为85.7％。
100粒种子82％为新冬43号杂种种子，18％为保持系种子进行充分混合，从中随机选取25粒种子进行分子标记纯度检测。图4为混杂保持系种子杂种纯度82％检测图。图中M为Marker，1为新冬43号杂交种，2为18B保持系，3-27为检测种子，从图中可以看出与保持系相同的条带为序号4、18、19、22、26、27共计6个，其余19个都显示杂种带。将x＝6代入方程y＝0.4083+0.7583x(表4)，计算纯度为80.2％。
下面实际应用对本发明实施例的效果进行验证。
在隔离区，不育系AL36A与恢复系99AR144-1种子按85％∶15％比例混合播种。从播种收获的种子中分别抽取1000粒种子，再用四分法随机取25粒种子发苗，提取叶片DNA，然后利用引物Xbarc8进行检测，得出小麦杂交种纯度检测结果，检测结果参见附图5，检测出与恢复系相同的条带有4、13和24共3个，显杂合带有22个。将检测结果x＝3代入表3引物Xbarc8纯度检测回归方程y＝-0.1452+0.9314x，y＝2.65，1﹣(2.65÷25)×100得到89.4％检测纯度与理论纯度88％(参见表3、4中非杂交种检测个数与对应的理论纯度)结果高度一致。
在隔离区，不育系AL36A与恢复系99AR144-1种子按行比5∶1播种。仅收获母本不育系所结杂交种子，从中抽取1000粒种子，再用四分法随机取25粒种子发苗，提取叶片DNA，然后利用引物Xwmc474进行检测，检测结果见附图6，25个均显杂合带，得出小麦杂交种纯度为100％的检测结果。
从而验证小麦杂交种纯度检验方程在大田生产小麦杂交种纯度检验的可靠性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.三系杂交小麦种子纯度分子标记，所述分子标记为SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记为位于2A染色体上的Wmc474或位于1B染色体上的Barc8。
2.权利要求1所述的三系杂交小麦种子纯度分子标记的引物对，其中
位于2A染色体上的Wmc474的引物对的序列如下：
Xwmc474L：ATGCTATTAAACTAGCATGTGTCG，
Xwmc474R：AGTGGAAACATCATTCCTGGTA；
位于1B染色体上的Barc8的引物对的序列如下：
Xbarc8L：GCGGGAATCATGCATAGGAAAACAGAA，
Xbarc8R：GCGGGGGCGAAACATACACATAAAAACA。
3.权利要求1所述的三系杂交小麦种子纯度分子标记在AL型三系杂交小麦种子纯度检测中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
将三系杂交小麦种与非杂交种按不同的设计比例混合形成多个试验组，待发苗后提取DNA；
用所述SSR分子标记对应的引物对幼苗DNA进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳染色检测，分别统计各试验组的杂交种和非杂交种的检测数量；
将统计出的检测值与设计的理论值作相关性分析和回归分析得到小麦杂交种纯度计算值与检测值的方程；
将待测三系杂交小麦种子抽样发苗、提取叶片DNA，然后利用所述SSR分子标记对应的引物进行检测，将检测值代入上述方程，得到待测小麦杂交种检测纯度。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述三系杂交小麦种子分别与恢复系和保持系种子按不同的设计比例混合形成多个试验组。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述三系杂交小麦种子与恢复系种子混合发苗后提取DNA时，
以位于2A染色体上的Wmc474引物对进行扩增，建立的混入恢复系种子的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下：y＝4.4-10+0.7875x，其中x为混入的恢复系种子的检测值，y为混入的恢复系种子的计算值；
以位于1B染色体上的Barc8的引物对进行扩增，建立的混入恢复系种子的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下：y＝-0.1452+0.9314x，其中x为混入的恢复系种子的检测值，y为混入的恢复系种子的计算值；
所述三系杂交小麦种子与保持系种子混合发苗后提取DNA时，
以位于2A染色体上的Wmc474的引物对进行扩增，建立的混入保持系种子的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下：y＝0.2109+0.6797x，其中x为混入的保持系种子的检测值，y为混入的保持系种子的计算值；
以位于1B染色体上的Barc8的引物对进行扩增，建立的混入保持系种子的小麦杂交种纯度理论值与检测值的方程如下：y＝0.4083+0.7583x，其中x为混入的保持系种子的检测值，y为混入的保持系种子的计算值。
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