CN108796110B

CN108796110B - 一种水稻蜡质基因的功能标记及其应用

Info

Publication number: CN108796110B
Application number: CN201810521785.5A
Authority: CN
Inventors: 张泽民; 陈雄辉; 梁嘉燕; 邹虎成
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2038-05-28
Also published as: CN108796110A

Abstract

本发明公开了一种水稻蜡质基因的功能标记及其应用。本发明中根据水稻蜡质基因Waxy在Wx^a和Wx^b两类等位基因在第1内含子5'端剪切处发生的突变合成了三条引物：Waxy‑a、Waxy‑b和Waxy‑c，三条引物在同一PCR体系中对水稻DNA进行扩增，然后对扩增产物通过电泳检测蜡质基因的基因型。利用该功能标记可在水稻苗期区分水稻材料的蜡质基因类型，大大提高了选育中对直链淀粉性状的选择效率。

Description

一种水稻蜡质基因的功能标记及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种水稻蜡质基因的功能标记及其应用。

背景技术

水稻籽粒淀粉直链/支链淀粉比例是水稻收获期性状，直接影响稻米的食味品质。研究揭示稻米的蒸煮与食味品质(ECQs)由直链淀粉含量(AC)、胶稠度(GC)和糊化温度(GT)形成的复杂遗传网络决定的。蜡质基因Waxy是唯一的，对AC和GC具有主效作用的基因，而对GT具有微效性，因此Waxy基因对ECQs有极大影响。

水稻蜡质基因Waxy编码颗粒淀粉合成酶，是控制直链淀粉合成的主效基因，直接影响胚乳中直链淀粉的含量。Waxy位于水稻第6染色体短臂端，非糯性基因(Wx)对糯性基因(wx)表现为不完全显性，存在较明显的剂量效应；若水稻植株基因型纯合wx，产出的稻米为糯米。

在非糯品种中，Waxy基因有多个等位基因，Wx^a、Wx^b和Wx-mq等。Wx-mq是通过化学诱变粳稻品种“越光”产生的低直链淀粉等位基因；自然产生的等位基因有Wx^a和Wx^b两种。其中籼稻以Wx^a为主，直链淀粉含量较高，食味口感偏硬；粳稻基本为Wx^b，直链淀粉含量较低，口感偏软。Wx^b的第1内含子5'端剪切处发生由GT→TT的突变，导致第1内含子剪接效率降低及剪接不正常，成熟Waxy转录本含量降低，从而引起直链淀粉含量下降。有研究通过图位克隆证实Waxy还是控制粳/籼杂交胶稠度的主效QTL，影响籼粳杂交后代的食味品质。

主要育种目标性状基因的功能标记开发是我国主要农作物良种创新的重点任务。作为优质水稻育种最主要的育种目标，目前仍未有针对区分Wx^a和Wx^b开发的功能标记。因此，对低直链淀粉稻米的选育只能通过连锁的微卫星标记多态性进行初步筛选，由于连锁可能被打破，还需在收获后对胚乳直链淀粉含量进行测定才能确定水稻Waxy基因型，整个筛选过程耗时耗力。另外，在加强籼粳亚种杂种优势利用中，为实现对广大范围育种亲本的Waxy基因型鉴定、对籼粳杂后代的Waxy基因型的筛选，均需要高效精准的Waxy功能标记作为技术支撑。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种水稻蜡质基因的功能标记。

本发明的另一目的在于提供所述水稻蜡质基因的功能标记的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种水稻蜡质基因的功能标记，所述的水稻蜡质基因共显性功能标记Waxy通过如下三条引物获得功能标记，序列方向为5’-3’：

Waxy-a：CATCAGGTAGAACATCTGCAATT；

Waxy-b：GGCAGAACATCTGCTAGG；

Waxy-c：GAAAAACGAGCAATGAAAGATG。

所述的引物用于扩增水稻基因组DNA时，在Wx^a类型水稻中显示为95bp的片段，在Wx^b类型水稻中显示为100bp的片段；其中，Wx表示非糯性基因，在非糯品种中，Waxy基因分化为Wx^a和Wx^b两种等位基因。

所述的水稻蜡质基因的功能标记，采用以下步骤进行分子标记：

(1)提取水稻基因组DNA；

(2)PCR扩增：将所述的Waxy-a、Waxy-b和Waxy-c引物加到PCR反应体系中，并对所述水稻基因组DNA进行扩增得到扩增产物；

(3)将步骤(2)中得到的扩增产物进行凝胶电泳，并进行染色，得到电

泳图；

(4)根据步骤(3)中得到的电泳图进行分析，如果显示为95bp的片段，则为Wx^a类型水稻，如果显示为100bp的片段，则为Wx^b类型水稻。

步骤(1)中所述的水稻基因组DNA的提取方法为常规提取方法；优选为TPS简易法。

步骤(2)中所述的PCR的反应体系为20μl反应体系：2.0μl的10×PCR buffer；0.5μl的10mM dNTPs；10μM的Waxy-a、Waxy-b和Waxy-c各0.5μl；0.2μl的Taq DNA聚合酶，2.0μl的模板DNA；13.8μl的ddH₂O。

步骤(2)中所述的PCR的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸5min。

步骤(3)中所述的凝胶电泳为在6％(w/w)聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳。

步骤(3)中所述的染色为硝酸银染色。

所述的水稻蜡质基因的功能标记在水稻育种中的应用，该水稻蜡质基因的功能标记可在水稻苗期区分水稻材料的蜡质基因类型，大大提高了选育中对直链淀粉性状的选择效率。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明旨在设计功能标记，用于区分水稻Wx^a和Wx^b的第1内含子剪切端差异，并提出其在分子育种中的应用。

(2)本发明利用PCR和电泳技术即可有效地对水稻蜡质基因进行基因型筛选鉴别，可在水稻苗期区分水稻材料的蜡质基因类型，大大提高了选育中对直链淀粉性状的选择效率。

附图说明

图1是本发明蜡质功能标记的位置示意图(扩增区段的方框内碱基为目标SNP；扩增区域带有下划波浪线的序列为Waxy-c结合位置；Waxy-a和Waxy-b中下划线标注为人为引入的错配碱基)。

图2是本发明蜡质功能标记检测3个水稻品种的电泳图；其中，M为DNA分子量marker；1为Wx^b品种台中65，经Waxy功能标记检测，显示100bp的片段；2和3为Wx^a品种华粳籼74和O.glaberrima，Waxy功能标记检测，显示为95bp的片段。

图3是本发明蜡质基因功能标记检测Wx^a品种华粳籼74和Wx^b品种台中65杂交后代的检测结果；其中，M为DNA分子量marker；泳道1～20为F₂分离群体(泳道1～5、8、9、11、13和15～18为Wx^a，泳道6和20为Wx^b；泳道7、10、12、14和19为杂合带型)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明基于水稻蜡质基因Waxy在Wx^a和Wx^b两类等位基因(Wx表示非糯性基因)在第1内含子5'端剪切处发生GT→TT的突变，根据该位点设计了PCR功能标记。

水稻蜡质基因共显性功能标记命名为Waxy，所述的Waxy包括3条引物，所述的引物方向为5’-3’，引物序列如下：

Waxy-a：CATCAGGTAGAACATCTGCAATT；

Waxy-b：GGCAGAACATCTGCTAGG；

Waxy-c：GAAAAACGAGCAATGAAAGATG。

实施例1利用功能标记Waxy检测3个水稻品种

(1)提取3个水稻品种(台中65、华粳籼74和非洲稻O.glaberrima)的基因组DNA：分别取水稻苗期叶片，通过TPS简易法获得水稻基因组DNA。

(2)PCR扩增

PCR反应体系为20μl：2.0μl的10×PCR buffer；0.5μl的10mM dNTPs；10μM的三种引物(Waxy-a、Waxy-b和Waxy-c)各0.5μl；0.2μl的Taq DNA聚合酶，2.0μl的模板DNA；13.8μl的ddH₂O。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸5min后得到扩增产物。

(3)扩增产物的检测

将扩增产物在6％(w/w)聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳，硝酸银染色得到电泳图。

(4)结果与分析

电泳结果如图2所示，经Waxy功能标记检测，扩增片段大小与图1中设计目标一致：Wx^b品种台中65，经Waxy功能标记检测，显示100bp的片段；Wx^a品种华粳籼74和O.glaberrima，Waxy功能标记检测，显示为95bp的片段。结果表明Waxy功能标记能很好地区分Wx^a和Wx^b品种，可用于水稻蜡质基因Waxy的分子标记辅助选择。

实施例2利用功能标记Waxy对水稻品种华粳籼74和台中65杂交后代F₂群体基因型进行检测

(1)提取3类水稻品种(台中65、华粳籼74和两者的F₂杂交后代)的基因组DNA：分别取水稻苗期叶片，通过TPS简易法获得水稻基因组DNA。

(2)PCR扩增

(3)扩增产物的检测

(4)结果与分析

电泳结果如图3所示，经Waxy功能标记检测，Wx^a品种华粳籼74和Wx^b品种台中65杂交后代F₂出现3种带型，包括100bp的Wx^b和95bp的Wx^a的纯合型，以及Wx^a和Wx^b同时存在的杂合带型。表明Waxy功能标记能区分蜡质基因位点的Wx^a和Wx^b基因型，并且是共显性标记。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种水稻蜡质基因的功能标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Waxy-a

<400> 1

catcaggtag aacatctgca att 23

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Waxy-b

<400> 2

ggcagaacat ctgctagg 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Waxy-c

<400> 3

gaaaaacgag caatgaaaga tg 22

Claims

1.一种水稻蜡质基因的检测方法，其特征在于，采用如下步骤：

（1）提取水稻基因组DNA；

（2）PCR扩增：将Waxy-a、Waxy-b和Waxy-c引物加入到PCR反应体系中，并对步骤（1）中提取的水稻基因组DNA进行扩增，得到扩增产物；

（3）将步骤（2）中得到的扩增产物进行凝胶电泳，并用硝酸银进行染色，得到电泳图；

（4）根据步骤（3）中得到的电泳图进行分析，如果显示为95bp的片段，则为Wx^a类型水稻，如果显示为100bp的片段，则为Wx^b类型水稻；

步骤（2）中所述的Waxy-a、Waxy-b和Waxy-c引物的核苷酸序列如下所示：

Waxy-a：CATCAGGTAGAACATCTGCAATT；

Waxy-b：GGCAGAACATCTGCTAGG；

Waxy-c：GAAAAACGAGCAATGAAAGATG。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的PCR的反应体系为20µl反应体系：2.0µl的10×PCR buffer；0.5µl的10mM dNTPs；10µM的Waxy-a、Waxy-b和Waxy-c各0.5µl；0.2µl的Taq DNA聚合酶；2.0µl的模板DNA；13.8µl的ddH₂O。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的PCR的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸5min。

4.权利要求1～3任一项所述的水稻蜡质基因的检测方法在水稻育种中的应用。