CN105950734B

CN105950734B - 一种与油菜脂肪酸性状相关的单体型BnHapFatty及应用

Info

Publication number: CN105950734B
Application number: CN201610362173.7A
Authority: CN
Inventors: 刘胜毅; 唐敏强; 黄军艳; 童超波; 刘越英; 程晓晖; 董彩华; 张园园
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2019-07-16
Anticipated expiration: 2036-05-27

Abstract

本发明公开了一种与油菜脂肪酸性状相关的单体型BnHapFatty及应用，申请人利用来自不同育成年代、国内外遗传差异较大的370份硫甙含量不同的油菜组成的关联群体，结合基因型数据及棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸和芥酸含量表型数据进行全基因组关联分析，获得了对上述指标贡献率分别达到66.57%、62.96%、80.26%、62.19%、79.54%和80.89%的单体型BnHapFatty。本发明提高了选择效率，单体型BnHapFatty对表型贡献率大，检测方便快速，可快速初步筛选出这6个性状含量高低单株或者株系用于不同目的的油菜育种，育种选择目标明确，节约了成本。

Description

一种与油菜脂肪酸性状相关的单体型BnHapFatty及应用

技术领域

本发明涉及遗传育种和分子生物学技术领域。具体涉及一种与油菜脂肪酸性状相关的单体型BnHapFatty及应用。

背景技术

油菜是世界上三大油料作物之一，其产生的植物油大约占世界植物油总量的13％。除此之外，油菜也是重要的潜在能源作物和植物蛋白来源之一。作为植物食用油的来源之一，油菜以实现“双低、三高、两化”(低芥酸、低硫苷，高产、高抗、高效，产业化和机械化)为首要育种目标；作为能源作物和工业原料，油菜除了追求“三高”和“两化”育种目标之外，还以高不饱和脂肪酸(高亚油酸、高亚麻酸和高芥酸等)为主要育种目标。20世纪末，我国已成为世界油菜种植大国，成为芥酸主要生产国之一。产品除满足国内需求外，还出口到至日本、欧美等国家(蒲定福，袁代斌，等.工业专用高芥酸油菜新品种绵油15号选育.中国油料作物学报，2005，27(4):38-40)。目前加拿大和法国等油菜主要出口国都基本实现了全程机械化生产。其生产成本低，菜籽的含油量也普遍比我国长江流域及黄淮冬油菜区高2-3个百分点，严重冲击我国油菜产业的发展(李加纳.我国油菜生产加工现状、面临的挑战及对策[M].北京:中国农业出版社，2002，27–31)。我国食用植物油一直供不应求，进口量每年呈递增趋势，至2010年消费总量达2300-2400万吨，而国产食用植物油仅为1000万吨左右，需要进口来弥补不足，食油安全形势十分严峻(张冬青.浙江省优质油菜育种进展[J].浙江农业科学,2015,05:650-654.)。因此，加快我国油菜育种进程，提高我国油菜生产水平，提升国际竞争力已迫在眉睫。

棕榈酸，又称软脂酸，是一种饱和高级脂肪酸，以甘油酯的形式普遍存在于动植物油脂中，在自然界中分布很广，主要用于生产肥皂、蜡烛、润滑剂、软化剂、合成洗涤剂等。硬脂酸，即十八烷酸，广泛用于制作化妆品、塑料耐寒增塑剂、脱模剂、稳定剂、表面活性剂、橡胶硫化促进剂、防水剂、抛光剂、金属皂、软化剂、医药品及其他有机化学药品等。但是棕榈酸和硬脂酸都属于饱和脂肪酸，作为食用植物油，它们含量不应太高。因为饱和脂肪酸摄入量过高会导致血胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇升高，继发引起动脉管腔狭窄，形成动脉粥样硬化，增加患冠心病的风险。二十碳烯酸属于不饱和脂肪酸，是长链脂肪酸合成途径中必不可少中间代谢产物，属于不饱和脂肪酸，主要用于工业生产。油酸和亚油酸有助于人体吸收消化，具有降低人体内血清胆固醇和甘油三酯及软化血管和阻止血栓形成等功效，因此提高菜籽油的油酸和亚油酸含量成为目前油菜育种上的重要目标。在油菜的几种主要脂肪酸成分中，芥酸含量与其它脂肪酸含量呈负相关，因此低芥酸育种为高油酸和高亚油酸育种提供了有利的基础(邬贤梦,官春云,李栒.油菜脂肪酸品质改良的研究进展[J].作物研究,2003,03:152-158)。

芥酸是一种复杂的脂肪酸类化合物，含有一个双键的不饱和脂肪酸，可溶于水、乙醇和甲醇等，极易溶于乙醚。芥酸分子碳链较长，具有较强的疏水性和防水性，优异的润滑性(吴关庭，郎春秀，陈锦清.芥酸的生产及其衍生产品开发.中国油脂，2007年第32卷，第6期:27-31)。芥酸的应用起源于1960年代，是一种重要的油脂化工产品，在制造、机械、橡胶、化工、油漆、纺织、冶金和医药等领域中具有广泛用途(邓定辉.高、低芥酸菜籽油的开发利用.农牧产品开发，1997，(5):16-17)。除了芥酸自身的价值外，其衍生物在医药、农药、化妆品、防腐、洗涤剂、石油开发、涂料等方面也得到广泛应用(曾登发.芥酸的用途及制取.江西科学，1989，7(3)：43-46)。虽然，芥酸在工业上应用范围较广，但是摄入过多的芥酸对人体会产生一定的危害，可能会引起心肌脂肪沉积和心脏受损。动物实验证明，大量摄入芥酸含量高的菜籽油，可致心肌纤维化，引起心肌病变，造成动物增重迟缓，发育不良，生殖力下降等不良影响。因此作为工业用油菜，需追求高芥酸含量的油菜籽，而作为动物饲料和食用植物油，降低芥酸含量是脂肪酸改良的首要任务。

分子标记辅助选择(MAS，marker—assisted selection)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，是在基因克隆或定位的基础上，借助目标基因本身或与之紧密连锁的分子标记可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择、基因渗入(Gene transgression)、构建基因系等方面。其优点主要有以下几个方面：(1)可以同时对多个基因为目标进行材料筛选，将多个基因聚合到同一个材料内，使其得到优化；(2)可以根据基因型信息提前对目标性状进行筛选，减少后期工作量；(3)延迟对目标性状的鉴定，比如在对多种病虫害的抗性鉴定时，因为某些病虫害的危害导致植株提前死亡或者颗粒无收，这样就会使得表型难以同时鉴定，并且有可能丧失具有优异表现的材料，但是可以采用分子标记技术则可先鉴定多个性状的目标基因，待下一代再进行表型的验证(朱玉君，樊叶杨，黄得润，庄杰云等.分子标记辅助选择在水稻育种中的应用[J].核农学报2012，26(5):756-761)。目前，分子标记辅助选择技术应用主要集中在基因聚合(Ge ne pyramiding)。

连锁不平衡(Linkage disequilibriuln，LD)指的是不同基因座位上等位基因的非随机性组合。关联分析(Association analysis)是在植物数量性状研究和植物育种中应用的一种较新的分析方法。它以连锁不平衡为基础鉴定某一群体内性状与遗传标记或候选基因间的关系(Mackay I，Powell W.Methods for linkage disequllibrium mapping incrops[J].Trends Pl ant Sci，2007，12:57-63)。与重组群体比较，它的显著优点是高通量，即能在全基因组范围内有效地检测大量的具有不同遗传背景的种质资源材料的性状控制基因位点或区域；除高通量优点外，由于全基因组关联分析一般是以现有的自然群体为材料，所以比一般的重组群体花费的时间要少很多；同时，精度高，可达到单基因的水平(杨小红等.植物数量性状关联分析研究进展[J].作物学报，2007，33(4):523-530)。

连锁不平衡的衰减距离(LD decay)决定了进行全基因组范围的关联分析时所需标记的数目以及精确度，自然群体中的LD水平一定程度上决定了全基因组关联分析的分辨率(M ichael D，et al.Genetic properties of the maize nested associationmapping population[J].Science，2009，737:325)。位点之间的等位基因频率的大小和重组率会影响连锁不平衡的水平，所以在群体中的自然突变、重组、亚群体结构、人工选择的压力、以及遗传漂变等都会影响连锁不平衡(LD)的结构(Gupta et al.，2005；Oraguzie etal.，2007)。在进行全基因组关联分析时，群体中的亚群结构和材料之间亲缘关系使得整个关联群体的连锁不平衡程度增强，这可能会提供假阳性结果。所以，在进行关联分析前有必要对群体结构和亲缘关系进行分析，并且要以群体结构和亲缘关系作为协变量可以有效地减少假阳性标记的产生。

单体型(Haplotype)是位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，又称单倍体型或单元型。同一染色体上的连锁不平衡的多个分子标记的情况即为单体型。而油菜籽中的脂肪酸相关性状属于简单的数量性状，开发鉴定特定性状相关的单体型即可在苗期初步鉴定植株后期油菜籽的这些性状的含量。

本研究通过构建370份油菜品种的关联群体，利用高密度SNP芯片进行基因分型，结合三年两点共五个环境下的6个脂肪酸相关性状的表型数据进行了全基因组关联分析，旨在定位筛选出与这些性状含量相关的分子标记，并构建单体型，用于分子标记辅助选择、分子育种及相关基因的克隆。

发明内容

本发明目的在于提供了一种与油菜脂肪酸性状相关的单体型BnHapFatty，所述的单体型BnHapFatty由三个SNP分子标记构成，分别为Bn-A08-p12814556、Bn-A08-p12820786和Bn-A08-p12599446。所述的Bn-A08-p12814556对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述的Bn-A08-p12820786对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所示；所述的Bn-A08-p12599446对应的包含SNP的序列为SEQ ID N O.5或SEQ IDNO.6所示。

本发明的还有一个目的在于提供了一种与油菜脂肪酸性状相关的单体型BnHapFatty在油菜脂肪酸含量性状育种中的应用，所述的脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸或芥酸。该单体型可以在任何时期快速鉴定油菜籽的这6个脂肪酸相关性状的含量，为分子标记辅助选择提供有价值的依据，同时为今后这些性状的相关基因的克隆提供了一定的基础。

本发明的另一个目的在于提供了基于单体型BnHapFatty三个SNP位点设计的引物或探针，优选的，其引物分别为：Bn-A08-p12814556：TGTTCACAACCGCACTCTTT,TGCATTATTTCAGATGTCTCAGA；Bn-A08-p12820786：TCTGAAGTTTTGATTTCGTGAGT，ACATGGACGATTAAAGTAAGT；Bn-A08-p12599446：TCTTATCGGACCTTCGCTCC，CCACCTCCAACCAACACCTA。优选的，其探针分别为：Bn-A08-p12814556的探针序列为：AT AAAAATATTTTTACTGTTTTGCATTATTTCAGATGTCTCAGAAAGTTA；Bn-A08-p12820786的探针序列为：TTATCTTCTTCTTTTTCTATTACTTTAACATGGACGATTAAAGTAAGTT T；Bn-A08-p12599446的探针序列为：TCCACCTCCAACCAACACCTAACAACACACTTA CACTTGTAAGAAAGTCA。

本发明的最后一个目的在于提供了基于单体型BnHapFatty三个SNP位点设计的引物或探针在油菜脂肪酸含量性状育种中的应用。利用本发明提供的引物或探针，可对单体型Bn HapFatty的类型进行鉴定，快速，准确，简单。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种鉴定油菜6个脂肪酸相关性状的单体型BnHapFatty的获得方法，它包括如下步骤：

a)利用收集来自全世界主要油菜生产国的共370份甘蓝型油菜构建关联群体；

b)采用CTAB方法提取叶片总DNA(Doyle J.Arapid DNA isolation procedurefor small quantities of fresh leaf tissue.Phytochemical Bulletin，1987，19，11-15)提取关联群体的每份材料的叶片总DNA，然后用60K SNP芯片对群体的DNA进行SNP分型检测。

c)通过对芯片质量进行检测和高质量SNP的筛选，具体标准为：call frequency≥85％，MAF≥0.05，cluster separation scored≥0.4，heterozygosity≤0.15。并将挑选出来的SNP的source序列与基因组(Chalhoub B，et al.Early allopolyploid evolution inthe post-Neolithi c Brassica napus oilseed genome.Science 345，950-3(2014).)进行比对，获得位置唯一的高质量SNP数据集。

d)利用Structure和Tassel软件进行群体结构和亲缘关系分析，得到Q和K矩阵，用于后续的全基因组关联分析。

e)待成熟时收集关联群体材料的种子进行近红外扫描，测定种子中的6个脂肪酸相关性状的含量。

f)结合基因型和6个脂肪酸相关性状表型数据，在Tassel软件中进行全基因组关联分析，鉴定6个脂肪酸相关性状显著相关的位点，并得到与6个脂肪酸相关性状紧密显著相关的SNP，然后根据相关位点的基因型数据构建单体型BnHapFatty。

利用上述技术措施，发明人最终获得了与6个脂肪酸相关性状的多个显著相关的SNP位点，并将最显著、贡献值最大的三个SNP构建成了一个单体型BnHapFatty，具体如下：该单体型BnHapFatty，位于A08染色体，由SNP标记Bn-A08-p12814556、Bn-A08-p12820786和Bn-A08-p12599446共同构成。其中所述的Bn-A08-p12814556对应的包含SNP的序列为SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述的Bn-A08-p12820786对应的包含SNP的序列为SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示；所述的Bn-A08-p12599446对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。利用Tassel 5.0软件分析检测得到三个SN P(Bn-A08-p12814556、Bn-A08-p12820786和Bn-A08-p12599446)与6个脂肪酸相关性状极显著相关，三个SNP构成单体型BnHapFatty对棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸和芥酸的表型贡献率分别达到66.57％、62.96％、80.26％、62.19％、79.54％和80.89％。

本发明的保护内容还包括基于单体型BnHapFatty对应的包含SNP的序列中的SNP设计的引物或探针，优选的，针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6中的SNP设计的引物为：

Bn-A08-p12814556：TGTTCACAACCGCACTCTTT,TGCATTATTTCAGATGTCTCAG A；

Bn-A08-p12820786：TCTGAAGTTTTGATTTCGTGAGT，ACATGGACGATTAAAGTA AGT；

Bn-A08-p12599446：TCTTATCGGACCTTCGCTCC，CCACCTCCAACCAACACCTA。

优选的，针对脂肪酸含量单体型BnHapFatty包含的SNP序列设计的探针为：

Bn-A08-p12814556的探针序列为：ATAAAAATATTTTTACTGTTTTGCATTATTTCAGATGTCTCAGAAAGTTA；

Bn-A08-p12820786的探针序列为：TTATCTTCTTCTTTTTCTATTACTTTAACATGGACGATTAAAGTAAGTTT；

Bn-A08-p12599446的探针序列为：TCCACCTCCAACCAACACCTAACAACACACTTACACTTGTAAGAAAGTCA。

脂肪酸含量单体型BnHapFatty或基于其SNP位点设计的引物或探针在油菜分子遗传育种中的应用，包括但不限于利用现有技术的常规方式，对待检测油菜DNA进行测序，确定是属于SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6中的哪一种，以确定其基因型。或是利用SNP分子标记引物或探针对甘蓝型油菜DNA进行PCR扩增，来快速判断SNP位点情况，以确定基因型。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明利用全基因组关联分析方法定位了油菜中的1个影响6个脂肪酸相关性状的单体型BnHapFatty，它对油菜6个脂肪酸相关性状的贡献率分别达到66.57％、62.96％、80.26％、62.19％、79.54％和80.89％，为油菜这6个脂肪酸相关性状的QTL中贡献率最高。在传统育种方法中，这6种脂肪酸含量的测定需待油菜籽收获时才能测定，所需时间长，不确定因素较多，因此会大大增加了不同用途的油菜育种的时间和成本。而通过检测植株的单体型Bn HapFatty，可以在油菜苗期淘汰不符合育种家意愿的单株或株系，不仅节约了生产成本而且大大提高了选择效率。本发明中6个脂肪酸相关性状单体型BnHapFatty的位点位置明确，表型贡献率大，检测方便快速，不受环境影响，育种效率高。利用6个脂肪酸相关性状的S NP标记信息检测即可以初步预测6个脂肪酸相关性状的含量高低，进而可以快速筛选出不同用途的高、低含量的油菜单株或株系，辅助育种选择目标明确，节约了育种成本。

附图说明

图1是关联群体的三年两点共5个环境下的6个脂肪酸相关性状经过最优线性无偏估计(B LUP)处理后的表型频率分布图。

结果表明6个脂肪酸相关性状表现分布呈连续性分布，但变异分布不呈正态分布，证明6个脂肪酸相关性状属于简单的数量性状，且存在主效基因位点；

图2是群体结构分析结果。

A：Ln(D)值在K＝1-10上的分布；B：ΔK在K＝2-9的分布。结果表明关联群体划分为三个亚群最为合理；

图3是关联群体亲缘关系的分布图。

结果表明整个群体的材料之间的亲缘关系较弱，适用于全基因组关联分析的研究。

图4是6个脂肪酸相关性状全基因组关联分析结果的曼哈顿图。

横坐标的表示不同的染色体(1-19分别代表A01-A10和C01-C09)上按位置顺序排列的SN P，纵坐标为SNP的-log₁₀(P)值，横线代表显著性水平的阈值(-log₁₀(P)＝6.34)，横线上的点代表与表型显著相关的SNP。

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。本发明所用试剂和方法如未特别说明，均来源于商业渠道，所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例1：

关联群体的6个脂肪酸相关性状的测定

本实施例中使用的群体为来自世界主要油菜生产国的370份甘蓝型油菜材料。本研究中所用的关联群体由来自不同育成年代、国内外遗传差异较大的370份甘蓝型油菜构成，其中国内材料共295份，主要来自湖北、湖南、陕西、江苏等地，国外材料75份，主要来自法国、澳大利亚、日本和瑞典等国家。三年两点共五个环境的6个脂肪酸相关性状的测定均使用近红外扫描油菜籽获得。多年多点的数据使用最优线性无偏估计(BLUP)进行处理，得到棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸和芥酸的遗传率分别为：85.2％，93.4％，97.8％，95.6％，97.5％，98.1％，表明这些性状的含量的高低主要受遗传因子决定。关联群体的这6个性状的含量分布结果呈连续性分布，但变异分布不呈正态分布，证明这些性状属于简单的数量性状且存在主效基因位点(见图1)。

实施例2：

关联群体叶片总DNA的提取

使用CTAB法提取关联群体叶片总DNA(Doyle J.A rapid DNA isolationprocedure f or small quantities of fresh leaf tissue.Phytochemical Bulletin，1987，19，11-15)，具体方法为：

a)将幼嫩叶片置10％乙醇中漂洗；然后剪取0.1-0.2g叶片放入碾钵中，利用液氮快速碾磨至粉末状，装入2mL离心管中；

b)加入预热DNA提取液700μL；混匀后置65℃水浴锅中1h，每10-15min混匀1次；

c)加入700μL混合液(苯酚:氯仿:异戊醇＝25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀10min；室温下，10 000×g离心15min；

d)吸取上清液至新的2mL离心管中；加入等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，颠倒混匀，静置5min，10000×g，离心15min，用枪吸取上清液到新的离心管中；

e)加入2倍体积无水乙醇，混匀后在–20℃静置1h，10 000×g，离心10min，弃上清液；再加入500μL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，去上清液；经过连续2次洗涤沉淀后，晾干；

f)加入含有2％RNase A溶液100μL，在37℃静置1h后4℃过夜；用等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)再次抽提DNA溶液，颠倒混匀，静置10min，10 000×g，离心15或20min，去除RNase A，吸取上清液(约60μL)，再次离心，1min；

g)利用琼脂糖凝胶电泳(0.8％)和紫外分光光度计检测DNA浓度、质量及完整性；

h)确定所有DNA样品的吸光度260/280比值在1.8-2.0之间。检测浓度后于-20℃冰箱中保存备用。并利用60K SNP芯片对材料DNA进行基因分型。

实施例3：

关联群体群体结构和亲缘关系分析

由于群体中如果存在较为明显群体结构和较近的亲缘关系有可能会对关联分析结果产生假阳性的SNP，所以在进行全基因组关联分析时有必要进行群体结构及亲缘关系分析。群体结构分析使用Structure 2.3软件进行，结果表明关联群体分为三个亚群最合适(图2)。亲缘关系本身是定义两特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间的遗传相似度的相对值。运用Tassel5.0软件进行亲缘关系(relative kinship)的评估，计算出亲缘关系值的矩阵(K矩阵)。结果表明：该群体材料之间的亲缘关系总平均值为0.1077(图3)，其中发现亲缘关系为0的为58.04％，亲缘关系为0-0.05的为7.87％，这些结果表明整个群体的材料之间的亲缘关系较弱，适合用于全基因组关联分析。

实施例4：

6个脂肪酸相关性状的全基因组关联分析及单体型BnHapFatty的构建

在获得6个脂肪酸相关性状的表型及基因型数据后，在Tassel 5.0软件中运用混合线性模型(MLM)中的Q+K模型进行全基因组关联分析。结果(图4和表1)显示所有性状在A08染色体上检测到显著相关的峰值(p<4.57×10^-7)，共同检测到SNP有4个。将A08共同检测到，且最显著的三个SNP(Bn-A08-p12814556、Bn-A08-p12820786和Bn-A08-p12599446)构建为单体型BnHapFatty(表2)，它们之间的紧密连锁，其中所述的Bn-A08-p12814556对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述的Bn-A08-p12820786对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；所述的Bn-A08-p12599446对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

针对Bn-A08-p12814556、Bn-A08-p12820786和Bn-A08-p12599446三个SNP分子标记对应的SNP位点设计的引物如下：

Bn-A08-p12814556：TGTTCACAACCGCACTCTTT,TGCATTATTTCAGATGTCTCAGA；

Bn-A08-p12820786：TCTGAAGTTTTGATTTCGTGAGT，ACATGGACGATTAAAGTAAGT；

Bn-A08-p12599446：TCTTATCGGACCTTCGCTCC，CCACCTCCAACCAACACCTA。

最终370份甘蓝型油菜，通过检测，BnHapFatty的单体型类型共分为三种(表2)，当BnHapFatty的基因型为AA_CC_AA时棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸和芥酸平均含量为3.27％，0.34％，18.97％，13.54％，10.90％和39.56％，为AG_AC_AG时上述六个脂肪酸的平均含量为3.86％，0.57％，39.04％，16.40％，6.33％和23.14％，而当基因型GG_AA_GG时则上述六个脂肪酸的平均含量为4.23％，0.68％，54.08％，18.57％，2.33％和10.32％，运用ANOVA计算单体型BnHapFatty对这6个性状的表型的贡献率达到66.57％，62.96％，80.26％，62.19％，79.54％和80.89％。

因此，可通过单体型的类型，对待检测甘蓝型油菜的棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸和芥酸的平均含量进行预先评估，以加快育种速度。

表1 全基因关联分析检测到与6个脂肪酸相关性状显著的SNP及其信息

表2 BnHapFatty的单体型类型及表型数据统计

实施例5：

单体型BnHapFatty在油菜6个脂肪酸相关性状高低含量育种中的应用

对高油酸、高亚油酸、低二十碳烯酸、低芥酸材料中双11号、中双4号和华双5号三个材料在苗期分别取叶片提取DNA，利用BnHapFatty的三个SNP标记的引物(引物见实施例4)进行分子鉴定，并于后期成熟时测量种子中的6个脂肪酸相关性状。结果表明：中双11号的单体型BnHapFatty为：GG_AA_GG，棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸和芥酸的含量分别为4.19％、0.51％、59.81％、17.78％、0.27％和8.99％；中双4号的单体型BnHapFatty为：GG_AA_GG，棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸和芥酸的含量分别为4.08％、0.53％、62.23％、17.48％、0.85％、7.14％；华双5号的单体型BnHapF atty也为GG_AA_GG，上述6个性状分别为：4.02％、0.81％、61.74％、17.33％、1.31％、4.77％，说明分子标记筛选能在苗期根据单体型的基因型有效地初步鉴定这些性状的含量。

对低油酸、低亚油酸、和高二十碳烯酸、高芥酸的材料中油821、浙油7号(76337)和胜利52这三个材料在苗期分别取叶片提取DNA，利用BnHapFatty的三个SNP标记的引物进行分子鉴定，并于后期成熟时测量种子中的6个脂肪酸相关性状。结果表明：这三个材料的单体型BnHapFatty为AA_CC_AA，而中油821的棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸和芥酸的含量分别为3.12％、0.31％、15.97％、12.25％、12.03％和43.39％；浙油7号(76337)分别为3.13％、0.017％、8.23％、13.56％、11.94％和48.48％；胜利52这6种脂肪酸性状的含量分别为3.11％、0.20％、9.16％、13.46％、12.55％和47.32％。

通过鉴定上述单体型BnHapFatty来预测油菜籽中6种脂肪酸性状的含量的高低，在苗期进行淘汰即可进行单株或株系的淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，可迅速提高油菜品种的育种进程。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种与油菜脂肪酸性状相关的单体型BnHapFatty及应用

<130> 一种与油菜脂肪酸性状相关的单体型BnHapFatty及应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttatgtttta aaataaatgt attatttrca tatgttcaca accgcactct tttagaataa 60

ataactttct gagacatctg aaataatgca aaacagtaaa aatattttta ttagttattg 120

g 121

<210> 2

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttatgtttta aaataaatgt attatttrca tatgttcaca accgcactct tttagaataa 60

gtaactttct gagacatctg aaataatgca aaacagtaaa aatattttta ttagttattg 120

g 121

<210> 3

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcttccaca ttaggctggt aaagtctcar ttctgaagtt ttgatttcgt gagtaacaac 60

taaacttact ttaatcgtcc atgttaaagt aatagaaaaa gaagaagata atttytaatc 120

t 121

<210> 4

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcttccaca ttaggctggt aaagtctcar ttctgaagtt ttgatttcgt gagtaacaac 60

gaaacttact ttaatcgtcc atgttaaagt aatagaaaaa gaagaagata atttytaatc 120

t 121

<210> 5

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttctccagc aactcggtcg ccatggaagg gatcttatcg gaccttcgct cccacatcaa 60

aaaggtaatc actttgatgt ctaattgttt tgcagagacg atgactttct tacaagtgta 120

agtgtgttgt taggtgttgg ttggaggtgg agaggaggcw gtgaagagga acacaagtag 180

aaacaagctt ttgcctagag a 201

<210> 6

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttctccagc aactcggtcg ccatggaagg gatcttatcg gaccttcgct cccacatcaa 60

aaaggtaatc actttgatgt ctaattgttt tgcagagacg gtgactttct tacaagtgta 120

agtgtgttgt taggtgttgg ttggaggtgg agaggaggcw gtgaagagga acacaagtag 180

aaacaagctt ttgcctagag a 201

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgttcacaac cgcactcttt 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgcattattt cagatgtctc aga 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tctgaagttt tgatttcgtg agt 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acatggacga ttaaagtaag t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcttatcgga ccttcgctcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccacctccaa ccaacaccta 20

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ataaaaatat ttttactgtt ttgcattatt tcagatgtct cagaaagtta 50

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttatcttctt ctttttctat tactttaaca tggacgatta aagtaagttt 50

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tccacctcca accaacacct aacaacacac ttacacttgt aagaaagtca 50

Claims

1.与油菜脂肪酸性状相关的单体型BnHapFatty在油菜脂肪酸含量性状育种中的应用，所述的单体型包括三个SNP分子标记，分别为：Bn-A08-p12814556、Bn-A08-p12820786和Bn-A08-p12599446；

所述的Bn-A08-p12814556对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；

所述的Bn-A08-p12820786对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；

所述的Bn-A08-p12599446对应的包含SNP的序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

2.针对权利要求1所述的应用中的三个SNP分子标记设计的引物组合在油菜脂肪酸含量性状育种中的应用；

所述的三个SNP分子标记，分别为：Bn-A08-p12814556、Bn-A08-p12820786和Bn-A08-p12599446；

3.根据权利要求2所述的引物组合：

扩增Bn-A08-p12814556的引物对序列为：TGTTCACAACCGCACTCTTT,TGCATTATTTCAGATGTCTCAGA；

扩增Bn-A08-p12820786的引物对序列为：TCTGAAGTTTTGATTTCGTGAGT，ACATGGACGATTAAAGTAAGT；

扩增Bn-A08-p12599446的引物对序列为：TCTTATCGGACCTTCGCTCC，CCACCTCCAACCAACACCTA。

4.根据权利要求1或2所述的应用，所述的脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸或芥酸。