CN104278025B - 甘蓝型油菜全基因组scar分子标记及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记及制备方法和应用，人工创造的甘蓝型油菜全基因组的SCAR标记110个，其步骤：（1）在白菜基因组序列数据库和甘蓝基因组序列数据库，每间隔一段长度挑选序列；（2）搜索与所得序列同源性最高的甘蓝型油菜序列；（3）比较与所得Tapidor和Ningyou7同源序列的差异；根据差异序列设计PCR扩增引物；（4）利用所得PCR引物，扩增Tapidor和Ningyou7基因组DNA，产生SCAR分子标记；（5）筛选得到在油菜品种稳定扩增的阳性标记PS3+21和RAC1‑P3+4，作为SCAR标记检测体系的阳性对照；（6）利用所得SCAR分子标记鉴别冬油菜品种。本发明极大地节约人力物力、缩短鉴定周期、提高新品种鉴定效率，提供了一种方便快速鉴定甘蓝型油菜不同品种的方法。

Description

甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记及制备方法和应用

技术领域

本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记，同时还涉及一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的制备方法，还涉及一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记在甘蓝型油菜品种鉴定中的应用。

背景技术

粮食安全是我国国民经济的基础和人民生活的重要保障，种子是粮食生产的最核心要素。我国消费的植物油60%以上依靠进口，自给率不足40%；国产植物油约60%的原料来自于油菜籽。杂交种的选育和推广促进了我国油菜品种产量的大幅度提高，品种更新换代速度加快。开发鉴别品种和鉴定杂种纯度的技术体系用于种子质量管理非常必要和紧迫。

现有的油菜品种鉴定和杂种纯度检测方法主要包括传统的形态学方法和分子检测方法。形态学方法依据的是油菜全生育期的表型性状如叶型、叶色、株高、株型、生长势、花期、产量性状、品质性状等，目标性状有限、且易受外界环境影响（刘华等，1997）。另外，形态学鉴定方法需要田间种植、并在油菜全生育期多次进行观察，非常费时费力。分子检测方法是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础、在分子水平检测生物间的差异。分子检测方法能对各个发育时期的个体、各个组织甚至细胞做检测，标记数量多、不受环境影响。

自1980年第一个分子标记技术—RFLP（Restriction Fragment LengthPolymorphism，限制性片段长度多态性，）产生以来，已经出现的分子标记技术有几十种，它们的原理为DNA分子杂交、DNA分子扩增，以及DNA分子杂交结合分子扩增。每一种分子标记技术在检测的基因序列、多态性水平、位点的特异性、重复性、技术要求以及检测成本等方面各有差异和优缺点。我国自2003年启动甘蓝型油菜品种DNA指纹检测以来，相继经历了AFL P（Amplified Fragment Length Polymophism，扩增片段长度多态性）、SSR（SimpleSeque nce Repeats，简单重复序列）和ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats，简单重复间隔序列）三种标记技术，其中SSR标记技术由于重复性好而得到重视。尽管如此，SSR标记技术检测油菜品种DNA指纹存在两大不足：（1）年份、品种、不同操作者所得数据不能整合；（2）分子扩增的品种DNA指纹需要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行检测，操作程序复杂、花费时间长、对操作者技术水平要求高。

SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions，序列特征性扩增区域），是1993年Paran(Sartorato et al.,2000)提出的分子标记，基本原理是将特异扩增产物进行回收测序，根据测序结果重新设计特异引物，对基因组DNA进行特异PCR扩增（赵军胜等，2012）。SCAR技术只扩增特定DNA区域，结果仅仅是标记‘有’或‘无’，判别容易，可用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测，操作简单，不需要DNA测序仪等精密仪器。SCAR技术可以克服SSR技术的缺点，但是开发SCAR标记的前提是已知差异扩增片段及其序列，由于特异扩增产物回收测序成本高，因而SCAR标记的数量受到限制，规模化开发SCAR标记的报道尚无。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记，该标记具有可用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测、操作简单，扩增结果为“有”或“无”、判别容易、便于统计等优点，适用对象广泛。

本发明的目的之二在于提供了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的制备方法。该方法利用了白菜和甘蓝、以及甘蓝型油菜的基因组序列信息，具有覆盖油菜全基因组、数量多、成本低等优点，另外利用在任何油菜品种均能有扩增产物的标记作为阳性对照，保证了SCAR分子标记结果正确。

本发明的目的之三在于提供了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记在甘蓝型油菜品种鉴定和杂种种子纯度检测中的用途，具有操作程序简单、周期短等技术优势，不同年份、不同品种、不同操作者所得数据均能整合，因而，可以构建历年和当前油菜品种的DNA指纹数据库，并利用指纹库信息进行杂种种子纯度检测。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过序列查询、比对和引物设计，筛选到分布甘蓝型油菜全基因组的SCAR标记110个；得到两个阳性标记PS3+21和RAC1-P3+4以确保检测结果正确；检测2011-2012年国家区域试验冬油菜品种（172份）以验证可用于SCAR分子标记鉴定油菜品种；创建SCAR标记技术体系应用于品种鉴定和杂种纯度检测的方法。

一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的制备方法，其步骤如下：

（1）在白菜基因组序列数据库（http://brassicadb.org/brad/）和甘蓝基因组序列数据库(http://122.205.95.67/blast/blast.php)，每间隔100kb挑选一段10kb长度的序列。

（2）搜索与步骤1）所得序列同源性最高的甘蓝型油菜Tapidor序列和Ningyou7序列。

（3）比较与步骤2）所得Tapidor和Ningyou7同源序列的差异；根据差异序列设计PCR扩增引物。

（4）利用步骤3）所得PCR引物，扩增Tapidor和Ningyou7基因组DNA；筛选能产生清晰、稳定、在Tapidor和Ningyou7中有差异扩增带的引物110对，产生110个SCAR分子标记。引物序列和标记的详细信息列于表1。

表1本发明筛选的特异引物

（5）筛选得到在油菜品种稳定扩增的阳性标记PS3+21和RAC1-P3+4，长度分别为1300bp和200bp，作为SCAR标记检测体系的阳性对照。

阳性SCAR标记PS3+21：

正向引物5'-ATGAAAGGGGTACAGAACAT-3'，

反向引物5'-CTCAAGTCCCACTGCTGCGG-3'；

阳性SCAR标记RAC1-P3+4：

正向引物5'-CTATCCTCCGTCTCGATCTCGC-3'，

反向引物5'-CTTAGCCGTCTCCAGCTCTTGC-3'。

（6）利用步骤4）所得SCAR分子标记鉴别172份2011-2012年国家区域试验冬油菜品种。

一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记在甘蓝型油菜品种鉴定和杂种种子纯度检测中的应用，其步骤是：

A、利用所得的110对引物扩增甘蓝型油菜品种基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR扩增结果，有扩增带记为“1”、无扩增带记为“0”，将结果输入Microsoft-Ex cel，利用NTSYS-pc2.1数据分析软件计算品种间的遗传相似系数、并构建树状的聚类图。

B、利用所得的110对引物扩增甘蓝型油菜杂种的双亲基因组DNA，筛选扩增父本、母本的引物；利用分别在父本、母本扩增的两对引物检测杂种种子DNA；统计杂种带型（即同时具有父本和母本扩增带）出现的种子占被检测种子的比例，即杂种种子纯度。

申请人已将上述筛选的SCAR分子标记成功地应用在油菜品种鉴定方面和杂种种子纯度鉴定上。

本发明的积极效果是：

本发明成功得到可以鉴定甘蓝型油菜品种的SCAR分子标记，包括覆盖甘蓝型油菜全基因组的110个SCAR分子标记，筛选到2个阳性SCAR标记以确保检测结果正确。本发明将SCAR分子标记用来鉴定品种，能够区分172份品种，证明本发明制备的SCAR分子标记可以准确地鉴定甘蓝型油菜品种；应用于杂种纯度鉴定，可以清晰地区分父本、母本和杂种三种基因型。利用这些SCAR标记鉴定品种DNA，可以克服SSR标记年份、品种、不同操作者所得数据不能整合，以及标记检测技术操作程序复杂、花费时间长、对操作者技术水平要求高等缺点，极大地节约人力物力、缩短鉴定周期、提高新品种鉴定效率，为方便快速的鉴定甘蓝型油菜不同品种和检测杂种纯度提供了一种行之有效的方法。

附图说明

图1为一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的方框示意图。

图2为一种阳性标记的扩增结果。

M：标准分子量；a：SCAR分子标记RGAF1R1；b：阳性标记PS3+21；c：阳性标记RAC1-P3+4。

图3为一种SCAR分子标记RGAF1R1在部分甘蓝型油菜的扩增结果。

M：标准分子量；编号16-80为品种实验编号，与表2相同。

图4为一种依据本发明的110个SCAR分子标记检测结果构建的172份油菜品种聚类树示意图。四对相同的材料没有被区分开：样品50（NJ0801）与样品108（NJ0801）、样品114（创杂油5号）与样品170（创杂油5号）、样品143（丰油9号）与样品172（丰油9号）、样品93（南油12）与样品128（南油12）；其余的均被清楚地区分。

具体实施方式

实施例1：

一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的制备方法，其步骤如下：

1.试验材料：

本发明试验材料包括冬油菜品种Tapidor和半冬性油菜品种宁油7号（Ningyou7）（Tapi dor为欧洲冬性油菜品种，宁油7号为我国半冬性品种，以Tapidor和Ningyou7为亲本构建的小孢子培养群体，作为国际公认的作图群体被广泛地用于基因定位、基因克隆、基因组测序，详见文献：D.Qiu等，A comparative linkage map of oilseed rape and its usefor QT L analysis of oil seed and erucic acid content.Theor Appl Genet,2006,114:67-80）；以及参加2011-2012年国家冬油菜品种区域试验的172份甘蓝型油菜品种（表2）（详细介绍见文献：中国冬油菜新品种动态—2011-2012年度国家冬油菜品种区域试验汇总报告，张芳和郭瑞星主编，2013年5月第1版，中国农业科学技术出版社）。其中Tapidor和Ningyou7基因组已经测序（http://www.geboc.org/）。

表2参加2011-2012年国家区域试验的半冬性甘蓝型油菜品种名称

2.DNA提取：

所有材料种子播种在湿的吸水纸上于室温（20－25℃，以下相同）培养。生长一周后，S-1300×Bing409 F₁按单粒、其余每份材料随机选择10粒种子的发芽幼苗，取适量叶片混合，采用Doyle等(Doyle JJ和Doyle JL，Isolation of plant DNA from freshtissue.Focus,1990,12:13-15)的CTAB方法提取基因组DNA；利用琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA质量，利用分光光度计检测DNA浓度。

3.利用同源序列法设计PCR引物：

从白菜数据库（http://brassicadb.org/brad/）和甘蓝数据库(http:// 122.205.95.67/blast/blast.php)中每间隔100kb选取长度为10kb左右的片段；搜索与该10kb片段序列同源性最高的甘蓝型油菜Tapidor序列和Ningyou7序列；比较Tapidor和Ningyou7的序列，根据差异序列进行引物设计。

引物设计软件：Primer3(v.0.4.0)（http://frodo.wi.mit.edu/）。引物设计原则为：引物长度18-24bp,以20bp为最佳；GC含量为35-60%，最佳为50%；最佳复性温度为57℃；PCR产物长度为300-400bp或600-800bp，引物内无二级结构，引物间不能相互配对。由于5’和3’非翻译区承受的选择压小，因此多态性比外显子区域多，更容易得到在Tapidor和Ningyou7间有差异扩增的引物。共设计了617对引物。

4、PCR扩增条件：

PCR扩增的反应体系：1×PCR buffer，1.35mM MgCl₂，0.08mM dNTPs，1.0U TaqDNA聚合酶（四者均购自MBI Fermentas,Lithuania公司），100ng DNA，正、反向引物各0.45μM，ddH2O补充至终体积20μl。

PCR扩增条件：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10分钟。反应在PTC-225 PCR仪上完成，扩增产物用浓度为1.2%的（1.2g琼脂糖/100ml TAE缓冲液，以下相同）琼脂糖凝胶电泳分离检测，使用1×TAE缓冲液（0.04MTris-acetate，0.001M EDTA，pH8.0），电压3V/cm，电泳1.5hrs左右。电泳完毕，凝胶成像系统（UVP）拍照保存，记录多态性结果。

5、筛选SCAR标记：

以Tapidor和Ningyou7基因组DNA为模板进行PCR反应，在617对引物中，有110对具有差异扩增情况；每对引物重复扩增三次，最终筛选到清晰、稳定、在Tapidor和Nin gyou7中有差异的SCAR标记110个。SCAR标记的详细信息列于表1。甘蓝型油菜19条染色体上都有SCAR标记分布，A1-A10共有59个，C1-C9共有41个。

6、设置阳性标记：

由于SCAR标记技术揭示的是“有”与“无”扩增带的差异，为了避免因为实验操作过程造成的没有扩增带，在PCR反应体系中加入阳性标记，阳性标记需要满足的条件为：在所有油菜品种中恒定扩增；PCR反应的退火温度与本发明筛选到的SCAR标记相同；标记长度与本发明筛选到的SCAR标记的有明显的差异、可以利用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测。

本发明得到的110个SCAR标记长度为300～400bp或600～800bp，进行PCR扩增的退火温度都为57℃。有研究表明，甘蓝型油菜都含有来自于甘蓝的自交不亲和Ⅱ类SLG基因(Nishio等,Registration of S alleles in Brassica campestris L by the restrictionfragment sizes of SLGs，Theo.Appl.Genetics,1996,92:388-394)；Actin为植物的看家基因，作为阳性对照用于基因的表达分析(Changbin Gao et al.,2013)。利用扩增Ⅱ类SLG基因的引物PS3+21和扩增Actin的引物RAC1-P3+4扩增Tapidor和Ningyou7基因组DNA，在Tapidor和N ingyou7中都有相同的扩增，长度分别为1300bp和200bp，扩增结果稳定，条带清晰，与目标片段易区分，作为SCAR标记检测体系的阳性标记，以其引物名称，分别记为PS3+21和RAC1-P3+4（表3）。

表3阳性标记信息

阳性标记PCR反应混合液：总体积25ul，其中模板DNA2ul，SCAR引物1ul，对照引物0.5ul，Reaction Mix 21.5ul。PCR反应条件：94℃预扩5min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，共32个循环；72℃再延伸5min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。图2为两对阳性对照引物扩增结果，SCAR引物RGAF1R1扩增结果，目标片段大小约200bp，阳性对照引物PS3+21、RAC1-P3+4与SCAR引物RGAF1R1扩增结果，阳性标记清晰、容易与目标片段区分。其中，条带a为SCAR引物RGAF1R1的特异性扩增条带，条带b为阳性对照引物PS3+21的扩增条带，条带c为阳性对照引物RAC1-P3+4的扩增条带。

实施例2：

一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记在甘蓝型油菜品种鉴定和杂种种子纯度检测中的应用，其步骤是：

1、本发明的SCAR应用于鉴别甘蓝型油菜品种：

（1）DNA提取：

所有材料种子播种在湿的吸水纸上于室温培养。生长一周后，每份材料随机选择10粒种子的发芽幼苗，取适量叶片混合，采用Doyle等(Doyle JJ和Doyle JL，Isolation ofplant DNA from fresh tissue.Focus,1990,12:13-15)的CTAB方法提取基因组DNA；利用琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA质量，利用分光光度计检测DNA浓度。

（2）利用本发明的110个SCAR标记引物，扩增2011-2012年度国家区域试验冬油菜区域172份参试品种的基因组DNA。

PCR扩增的反应体系：1×PCR buffer，1.35mM MgCl₂，0.08mM dNTPs，1.0U TaqDNA聚合酶（四者均购自MBI Fermentas,Lithuania公司），100ng DNA，正、反向引物各0.45μM，ddH2O补充至终体积20μl。

PCR扩增条件：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10分钟。反应在PTC-225PCR仪上完成，扩增产物用浓度为1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离检测，使用1×TAE缓冲液（0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH8.0），电压3V/cm，电泳1.5hrs左右。电泳完毕，凝胶成像系统（UVP）拍照保存，记录多态性结果。

（3）记录扩增结果，有扩增记为‘1’、无扩增记为‘0’（图3）。

（4）将结果输入Microsoft-Excel得到了172×110阵列数据表。

（5）利用NTSYS-pc2.1数据分析软件计算品种间的遗传相似系数、并构建树状的聚类图（图4）。除了四对相同的材料没有被区分开，其余的均有区别。四对相同的材料是：样品50（NJ0801）与样品108（NJ0801）、样品114（创杂油5号）与样品170（创杂油5号）、样品143（丰油9号）与样品172（丰油9号）、样品93（南油12）与样品128（南油12）。聚类的结果说明，本发明得到的SCAR标记能准确鉴别品种。

2、本发明的SCAR应用于甘蓝型油菜杂种种子纯度检测：

（1）DNA提取：

将甘蓝型油菜杂交种“华油杂95”（2010年湖北省审定；2011年国家审定）种子播种在湿的吸水纸上于室温培养。生长一周后，按单粒取种子的发芽幼苗适量，采用Doyle等(Doyle JJ和Doyle JL，Isolation of plant DNA from fresh tissue.Focus,1990,12:13-15)的CTAB方法提取基因组DNA；利用琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA质量，利用分光光度计检测DNA浓度。

（2）利用本发明的110个SCAR标记引物，筛选扩增“华油杂95”的父本“浙油18”、母本“S-1300”的引物，得到标记Bn1-18L+R只在“浙油18”扩增、标记Bn6-30L+R只在“S-1300”中扩增。

（3）利用标记Bn1-18L+R和标记Bn6-30L+R检测“华油杂95”种子杂种种子的基因型，共检测了500粒种子，其中36粒只有标记Bn6-30L+R，与母本基因型相同，15粒既没有母本的标记Bn6-30L+R、也没有父本的标记Bn6-30L+R，剩余的449粒种子同时具有父本和母本的基因型，为真杂种。计算真杂种占被测种子的比例，为89.8%。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记及制备方法和应用

<130> 甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记及制备方法和应用

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<213> 甘蓝型油菜

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<213> 甘蓝型油菜

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gcggaggaac agttgtgtcc 20

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tgcgcgcact agaagaataa 20

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tttccccaga aaaagtggtg 20

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aagcaatctc taatctatta tatccg 26

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aaaaagtaca acacgtatta ctccat 26

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ccgaatctca ccccttatct agc 23

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acagctcaga cgcgatctcc ta 22

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<213> 甘蓝型油菜

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tctcatctaa agaaagatcc tctaac 26

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<213> 甘蓝型油菜

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gcagcaggtg accgataaat 20

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tgttgttttc ccatcgtcaa 20

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<210> 163

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 163

gcgagacgcg ttagtgtgtg 20

<210> 164

<211> 25

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 164

ctctggtata atctattgtt tggag 25

<210> 165

<211> 22

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 165

cagaattttc gagaccaaaa gc 22

<210> 166

<211> 24

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 166

aacagatcca ctatatgcga ctat 24

<210> 167

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 167

tttgatcgag actgccactg 20

<210> 168

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 168

cacacaccaa ccacgttttc 20

<210> 169

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 169

tggtgagatt tcgagggaac 20

<210> 170

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 170

cctcttggat ctttccacca 20

<210> 171

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 171

gccagccaaa gatcaaacat 20

<210> 172

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 172

gtttctgtgg aggctgaagg 20

<210> 173

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 173

cgttgggatt cagaataaga aca 23

<210> 174

<211> 24

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 174

atcttcttac ggatatgatc catc 24

<210> 175

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 175

tggggattgc tttgtttttc 20

<210> 176

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 176

ccccaaaacc tcatttctca 20

<210> 177

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 177

tacttgttgg gcggaggtag 20

<210> 178

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 178

gacgacaggg tagggtttga 20

<210> 179

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 179

cgcatgtgaa gcattgtacc 20

<210> 180

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 180

ttcaagctag gctgcaaaca 20

<210> 181

<211> 19

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 181

tcgcacctga aaacgcctt 19

<210> 182

<211> 22

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 182

agagttggaa gaaggatgat gc 22

<210> 183

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 183

ttgtgtagcc tttcttcatt gac 23

<210> 184

<211> 25

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 184

aatcaagtaa ttggtaagaa agcat 25

<210> 185

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 185

tctgtcaaga acggatgctg 20

<210> 186

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 186

gttcagcaca atcccaaggt 20

<210> 187

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 187

ggaatcatat tcattacctg cct 23

<210> 188

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 188

ctccttgtct taatcccttc ctg 23

<210> 189

<211> 26

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 189

tggtgtatat gtcagtaagt ctgtct 26

<210> 190

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 190

tgcggtcgtg aaagaaattg ata 23

<210> 191

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 191

tcggagcttt ggtgctagat 20

<210> 192

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 192

agggtgtcca catcggacta 20

<210> 193

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 193

aaactcgcgg aaacgtattg 20

<210> 194

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 194

tttcgaaacg tgaaaacgtg 20

<210> 195

<211> 26

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 195

aacaccaaca ttcttacact tgattc 26

<210> 196

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 196

tcattatcac gttggtaact gca 23

<210> 197

<211> 25

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 197

ttaccacatc aaaagaacct aaaac 25

<210> 198

<211> 26

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 198

gcatagacat ctggtaagat tactga 26

<210> 199

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 199

gctgaacttg tcattatggc ctc 23

<210> 200

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 200

gctttggacc catatatctg aac 23

<210> 201

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 201

actaggaatc tcgccgacag 20

<210> 202

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 202

gaccacccat agacgcctta 20

<210> 203

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 203

acgcctcagc agagtggtat 20

<210> 204

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 204

gctccagatt ttgcaatggt 20

<210> 205

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 205

cgctgaagga tttgctaagg 20

<210> 206

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 206

gcagtctcgc atgaagtgaa 20

<210> 207

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 207

gctctgtgcc attgcttgta 20

<210> 208

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 208

gtggagtgcg tagcaatgaa 20

<210> 209

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 209

ggaagatgca tccagatggt 20

<210> 210

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 210

acactttttc cgtccacacc 20

<210> 211

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 211

aggcagagga tatggcattg 20

<210> 212

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 212

cctcacttgg gacagatgct 20

<210> 213

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 213

attgttcggt ttgctgatcc 20

<210> 214

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 214

tctcctttca ccccagtcac 20

<210> 215

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 215

ccaaggctca gatggtgaat 20

<210> 216

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 216

ccacctcatc tgcactctca 20

<210> 217

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 217

tcttgggttc ggaaagaatg 20

<210> 218

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 218

tgacatcccc agtcatcaaa 20

<210> 219

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 219

ttgattttag gccagggatg 20

<210> 220

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 220

cttgctctgc caccacacta 20

Claims (3)

1.一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括110个分子标记引物对，所述的引物对为：

分子标记Bn1-30L+R引物对为：正向引物：ctttggtggtgaatcgtcaa

反向引物：accagaggcttggttctttg；

分子标记Bn1-31L+R引物对为：正向引物：ttggtactccaagggtcctg

反向引物：tgcagtgtttcaggcaaaag；

分子标记Bn1-32L+R引物对为：正向引物：ggggaaaatgaaatttgtgc

反向引物：gtggtggtggtgtggtgtta；

分子标记Bn1-33L+R引物对为：正向引物：cccaaaaccataccaacctg

反向引物：gttggatttgctccaatggt；

分子标记Bn1-34L+R引物对为：正向引物：cagcatctgacgcgtgtact

反向引物：gcctggtacggatcgttaag；

分子标记Bn1-35L+R引物对为：正向引物：gccttaacgatccgtaccag

反向引物：gctcaaaccgcagttaccat；

分子标记Bn1-36L+R引物对为：正向引物：aacaaccgcgagagagagag

反向引物：agcaacaagcagacccaagt；

分子标记Bn1-18L+R引物对为：正向引物：caccggagagatacctgaagatc

反向引物：aatgattcccgaagaggtcaat；

分子标记Bn1-19L+R引物对为：正向引物：acaacaactctctccaaggaact

反向引物：atttccatcaagagacaacacaag；

分子标记Bn1-G1L+R引物对为：正向引物：ctaacacaccacaggtggagtg

反向引物：atcaatgctattgttacttgagac；

分子标记Bn1-G3L+R引物对为：正向引物：atctttgtgaagtgatcatgcagat

反向引物：ggtctatatggtatttacttgtgcg；

分子标记Bo1-10L+R引物对为：正向引物：taaagtatatttgatggtacacgggtat

反向引物：caaaaatagaacaatgcctatgtacaa；

分子标记Bn2-30L+R引物对为：正向引物：gcacatgggctctctctctc

反向引物：ccgaggaagcttgattgaaa；

分子标记Bn2-31L+R引物对为：正向引物：ggcaagtcagcgaaaacatt

反向引物：cccatgaactttggggtcta；

分子标记Bn2-2L+R引物对为：正向引物：tggaattgaatggttggatctg

反向引物：tcatcattatcatcaaaagtacacaa；

分子标记Bn3-30L+R引物对为：正向引物：tttcccttcgacctcagcta

反向引物：tgaagcaacttcagccattg；

分子标记Bn3-31L+R引物对为：正向引物：tagggcatgattatcgcaca

反向引物：gttggggcaggttttagtga；

分子标记Bn3-31L+R引物对为：正向引物：cgttgaaaattcccatgctt

反向引物：tctcttggtgatcgggagtc；

分子标记Bn3-32L+R引物对为：正向引物：tacaaaaacgcaacgcagag

反向引物：cattgggggaaaacagaaaa；

分子标记Bn3-4L+R引物对为：正向引物：taccacactagcaatgacaacacct反向引物：ttcagacaaaggctctgtttcagact；

分子标记Bn3-6L+R引物对为：正向引物：acaaacatcacacagtgccatctt

反向引物：agtattggtttattctctaggctgc；

分子标记Bn3-7L+R引物对为：正向引物：caaacaatttcaaatcttagcagcc

反向引物：cgagctctgctggacgaact；

分子标记Bn4-30L+R引物对为：正向引物：ccggagaaccacttacctga

反向引物：agatcggaaccgaggaaaat；

分子标记Bn4-31L+R引物对为：正向引物：catgggaggattcctttgaa

反向引物：ttttagccgcgaaattgagt；

分子标记Bn4-3L+R引物对为：正向引物：attctaatccacattcaactactcg

反向引物：ttgcatctttatattcatcatcttca；

分子标记Bn4-G1L+R引物对为：正向引物：gcatcgtgtcaccctttaaatc

反向引物：tccctgttacaaagcaaagcatt；

分子标记Bn5-30L+R引物对为：正向引物：tgtttcggtaggcattctcc

反向引物：tgtggaatggcatgaagtgt；

分子标记Bn5-31L+R引物对为：正向引物：cgaagatcgaagggagacag

反向引物：ccttcccacatcttgcctaa；

分子标记Bn5-32L+R引物对为：正向引物：ggctccctcttgtttgacag

反向引物：gaagcgttgttggttggatt；

分子标记Bn5-33L+R引物对为：正向引物：ctgcaggaaaagaggagctg

反向引物：gggacaccttcgacttgaaa；

分子标记Bn5-34L+R引物对为：正向引物：ataatcgcctgtccaccaag

反向引物：ccgctggaacgatgtttact；

分子标记Bn5-35L+R引物对为：正向引物：cgcgcttaacctaccattct

反向引物：gaacaaagggggagaaaagc；

分子标记Bn5-G2L+R引物对为：正向引物：taagttaggagaatctcatgagttgt

反向引物：agtttaagattaacattgtcctgtctc；分子标记Bn6-30L+R引物对为：正向引物：gtgaaatcgaggagctggag

反向引物：tttgcctccccactaacaac；

分子标记Bn6-31L+R引物对为：正向引物：tttatggttgcgattccaca

反向引物：tgtccagattcactcgcttg；

分子标记Bn6-32L+R引物对为：正向引物：tctcgcaaggaatagcgaat

反向引物：gactgagtcccaggaagctg；

分子标记Bn6-33L+R引物对为：正向引物：agcgaccgctaacacctaaa

反向引物：gtgtgggaacggtctgagat；

分子标记Bn6-34L+R引物对为：正向引物：tggccatatcaatcgtcaaa

反向引物：ttgagcgatctgtggctatg；

分子标记Bn6-35L+R引物对为：正向引物：cgcttttggtttcttgatcc

反向引物：tatttgggcccatcaaacat；

分子标记Bn6-4L+R引物对为：正向引物：ctctgytctttctctcttttgtcg

反向引物：gagcttgtcctcctcaactttg；

分子标记Bn6-G15L+R引物对为：正向引物：aaacaccaaaaggaacaaatgag

反向引物：cagctgttacacagatggtttacag；

分子标记Bn6-G16L+R引物对为：正向引物：agctttgtcccaatcagcacc

反向引物：cagctgttacacagatggtttacag；

分子标记Bn6-9L+R引物对为：正向引物：atccattgtctctgaagatgatga

反向引物：aaattcacgttcaatctcgtcaag；

分子标记Bn7-30L+R引物对为：正向引物：gatggattggtggtctgctt

反向引物：tcctccttgaatccaacacc；

分子标记Bn7-31L+R引物对为：正向引物：gaggtggttagccgccttat

反向引物：gtgcccagttgacgaatttt；

分子标记Bn7-32L+R引物对为：正向引物：atggccaatggaaagttcag

反向引物：acatctcgctctccatcacc；

分子标记Bn8-30L+R引物对为：正向引物：aggacaccacaccacactga

反向引物：tgcctcctccacttcttctc；

分子标记Bn8-31L+R引物对为：正向引物：cctctcaccatcaccgtctt

反向引物：gagaagccacaagcatcaca；

分子标记Bn8-1L+R引物对为：正向引物：atcttcctcgtgatatattgatgtg

反向引物：aaacagctctttgtaaccgttc；

分子标记Bn8-3L+R引物对为：正向引物：atttatcaggtgggacgcagtg

反向引物：tgattttcgtgtggatttggat；

分子标记Bn8-5L+R引物对为：正向引物：ccctcaagttggaggtgaaagat

反向引物：ccttgacacgtcgatctctaagc；

分子标记Bn8-G8L+R引物对为：正向引物：catgtaatatgtgaagcaatctcc

反向引物：gttgtgcaagttgtacagcagaag；

分子标记Bn8-G10L+R引物对为：正向引物：atattttgaaaggtctataatggaat反向引物：gattcttggtgaagggaagagc；

分子标记Bn8-4L+R引物对为：正向引物：aggagttggagagggagtggt

反向引物：ttttggggtgagagcatcctc；

分子标记Bn9-30L+R引物对为：正向引物：agggcatactggttcaaacg

反向引物：ttaaatcgcccaaaatctcg；

分子标记Bn9-31L+R引物对为：正向引物：tgggctgagatttttgaagc

反向引物：cggtgcagaatgaggatacc；

分子标记Bn10-30L+R引物对为：正向引物：tcaatacgcaccgaacaaaa

反向引物：gtccaaacccagactcttcg；

分子标记Bn10-31L+R引物对为：正向引物：ttgcaattgggagctatgac

反向引物：atgaaggcatgaaccaaagc；

分子标记Bn10-32L+R引物对为：正向引物：cttgacgacggattgtgatg

反向引物：gctagaggagcatggctacg；

分子标记Bo1-30L+R引物对为：正向引物：ggagatgctctaacgagacga

反向引物：accgaggctgtattggtgaa；

分子标记Bo1-31L+R引物对为：正向引物：tcaaagccggtgctctaaat

反向引物：gcccgtcgattaaagaaaca；

分子标记Bo1-32L+R引物对为：正向引物：gcatgcgtttcaagatgaga

反向引物：cccattgaacctgaagcatt；

分子标记Bo1-33L+R引物对为：正向引物：gcatgcgtttcaagatgaga

反向引物：cccattgaacctgaagcatt；

分子标记Bo1-34L+R引物对为：正向引物：tgttcgacatcaagggtgaa

反向引物：gttcccattttcgtctgcat；

分子标记Bo1-4L+R引物对为：正向引物：tagcgtaagcacagatagaggcaa

反向引物：tttagctcaatgccattgacacta；

分子标记Bo1-8L+R引物对为：正向引物：attaatgtattctaaactcccttcc

反向引物：atgtaccatcaaagatagtttagagtac；

分子标记Bo1-2L+R引物对为：正向引物：accgctagaaaccgtaaccact

反向引物：tgattattaacctttaattgatgatg；

分子标记C1G2-1L+R引物对为：正向引物：gcggaggaacagttgtgtcc

反向引物：ggataatataaaatatgattgattc；

分子标记Bo2-30L+R引物对为：正向引物：tcctgcacagccttttcttt

反向引物：ccactcgctatgcgtaaaca；

分子标记Bo2-2L+R引物对为：正向引物：ataattgccaacgcgggtta

反向引物：cacatcggattattcgggtca；

分子标记Bo3-30L+R引物对为：正向引物：tgcgcgcactagaagaataa

反向引物：tttccccagaaaaagtggtg；

分子标记Bo3-31L+R引物对为：正向引物：tgcgcgcactagaagaataa

反向引物：tttccccagaaaaagtggtg；

分子标记Bo3-32L+R引物对为：正向引物：tgtttcgctgtggtatctgc

反向引物：tgcaaagattggtggaatca；

分子标记Bo3-33L+R引物对为：正向引物：ggtggcttctctgttcttcg

反向引物：tgcatctccagcaacaagtc；

分子标记Bo3-4L+R引物对为：正向引物：aagcaatctctaatctattatatccg

反向引物：gagatgccaacagataaacgat；

分子标记Bo3-5L+R引物对为：正向引物：aagcaatctctaatctattatatccg

反向引物：catctatgtgacactgaaaagctatc；

分子标记Bo3-8L+R引物对为：正向引物：acagcttgagtacataagagatgg

反向引物：aaaaagtacaacacgtattactccat；

分子标记Bo3-9L+R引物对为：正向引物：ccgaatctcaccccttatctagc

反向引物：ccttagatgccataaccatagaga；

分子标记Bo3-13L+R引物对为：正向引物：acagctcagacgcgatctccta

反向引物：tctcatctaaagaaagatcctctaac；

分子标记Bo4-30L+R引物对为：正向引物：gcagcaggtgaccgataaat

反向引物：tgttgttttcccatcgtcaa；

分子标记Bo4-5L+R引物对为：正向引物：gcgagacgcgttagtgtgtg

反向引物：aggtaaaagtactgaatgggtctac；

分子标记Bo4-6L+R引物对为：正向引物：gcgagacgcgttagtgtgtg

反向引物：ctctggtataatctattgtttggag；

分子标记C4G2-1L+R引物对为：正向引物：cagaattttcgagaccaaaagc

反向引物：aacagatccactatatgcgactat；

分子标记Bo5-30L+R引物对为：正向引物：tttgatcgagactgccactg

反向引物：cacacaccaaccacgttttc；

分子标记Bo5-31L+R引物对为：正向引物：tggtgagatttcgagggaac

反向引物：cctcttggatctttccacca；

分子标记Bo5-32L+R引物对为：正向引物：gccagccaaagatcaaacat

反向引物：gtttctgtggaggctgaagg；

分子标记Bo5-4L+R引物对为：正向引物：cgttgggattcagaataagaaca

反向引物：atcttcttacggatatgatccatc；

分子标记Bo6-30L+R引物对为：正向引物：tggggattgctttgtttttc

反向引物：ccccaaaacctcatttctca；

分子标记Bo6-31L+R引物对为：正向引物：tacttgttgggcggaggtag

反向引物：gacgacagggtagggtttga；

分子标记Bo6-32L+R引物对为：正向引物：cgcatgtgaagcattgtacc

反向引物：ttcaagctaggctgcaaaca；

分子标记Bo7-8L+R引物对为：正向引物：tcgcacctgaaaacgcctt

反向引物：agagttggaagaaggatgatgc；

分子标记Bo7-9L+R引物对为：正向引物：ttgtgtagcctttcttcattgac

反向引物：aatcaagtaattggtaagaaagcat；

分子标记Bo8-30L+R引物对为：正向引物：tctgtcaagaacggatgctg

反向引物：gttcagcacaatcccaaggt；

分子标记Bo8-15L+R引物对为：正向引物：ggaatcatattcattacctgcct

反向引物：ctccttgtcttaatcccttcctg；

分子标记Bo8-20L+R引物对为：正向引物：tggtgtatatgtcagtaagtctgtct

反向引物：tgcggtcgtgaaagaaattgata；

分子标记Bo9-30L+R引物对为：正向引物：tcggagctttggtgctagat

反向引物：agggtgtccacatcggacta；

分子标记Bo9-31L+R引物对为：正向引物：aaactcgcggaaacgtattg

反向引物：tttcgaaacgtgaaaacgtg；

分子标记Bo9-20L+R引物对为：正向引物：aacaccaacattcttacacttgattc

反向引物：tcattatcacgttggtaactgca；

分子标记Bo9-21L+R引物对为：正向引物：ttaccacatcaaaagaacctaaaac

反向引物：gcatagacatctggtaagattactga；

分子标记Bo9-25L+R引物对为：正向引物：gctgaacttgtcattatggcctc

反向引物：gctttggacccatatatctgaac；

分子标记Bol03AF1R1引物对为：正向引物：actaggaatctcgccgacag

反向引物：gaccacccatagacgcctta；

分子标记Bol03BF3R3引物对为：正向引物：acgcctcagcagagtggtat

反向引物：gctccagattttgcaatggt；

分子标记Bol03CF2R2引物对为：正向引物：cgctgaaggatttgctaagg

反向引物：gcagtctcgcatgaagtgaa；

分子标记Bol00BF3R3引物对为：正向引物：gctctgtgccattgcttgta

反向引物：gtggagtgcgtagcaatgaa；

分子标记Bol00CF1R1引物对为：正向引物：ggaagatgcatccagatggt

反向引物：acactttttccgtccacacc；

分子标记Bol02AF1R1引物对为：正向引物：aggcagaggatatggcattg

反向引物：cctcacttgggacagatgct；

分子标记Bol02AF3R3引物对为：正向引物：attgttcggtttgctgatcc

反向引物：tctcctttcaccccagtcac；

分子标记Bol00AF1R1引物对为：正向引物：ccaaggctcagatggtgaat

反向引物：ccacctcatctgcactctca；

分子标记Bol00AF2R2引物对为：正向引物：tcttgggttcggaaagaatg

反向引物：tgacatccccagtcatcaaa；

分子标记SPLF2R2的引物对为：正向引物：ttgattttaggccagggatg

反向引物：cttgctctgccaccacacta。

2.权利要求1所述的一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记试剂盒在甘蓝型油菜品种鉴定中的应用。

3.权利要求1所述的一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记试剂盒在甘蓝型油菜杂种种子纯度检测中的应用。