CN101255461A - 甘蓝型油菜自交不亲和的显性scar分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于油菜育种领域，具体涉及油菜自交不亲和性完全连锁的显性SCAR标记及其应用。人工创造了一些甘蓝型油菜自交不亲和S位点的显性SCAR分子标记，这些分子标记包括自交不亲和系S位点显性标记和自交不亲和恢复系S位点显性标记，其中自交不亲和系S位点显性SCAR标记被命名为SRKa，SRKb和SP11a，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，2，6所示；自交不亲和恢复系S位点的显性SCAR标记被命名为SLGa，SLGb和SLGc，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3，4，5所示。这些分子标记能够通过一次PCR就能区分纯合亲和，杂合亲和以及纯合不亲和三种基因型。应用这些分子标记对甘蓝型油菜自交不亲和表型进行了验证。本发明为油菜分子育种提供了实用标记和利用方法。

Description

甘蓝型油菜自交不亲和的显性SCAR分子标记及应用

技术领域

本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及人工创造的甘蓝型油菜自交不亲和的显性SCAR分子标记及其在甘蓝型油菜标记辅助选择中的应用。

背景技术

与甘蓝型油菜当前主要的杂种优势利用途径-细胞质雄性不育相比，自交不亲和杂种具有选育周期短、恢复系多、无不良胞质效应、制种产量高等优点，是油菜杂种优势利用的重要途径之一，近年来成为国内外育种学家研究的热点之一。

白菜型油菜(AA)和甘蓝(CC)都表现为天然的自交不亲和，而甘蓝型油菜(AACC)却表现为自交亲和，自交不亲和资源缺乏。通过对甘蓝型油菜自交不亲和变异株的定向选择、属间杂交、种间杂交等途径可选育出优良的甘蓝型油菜自交不亲和材料。然而甘蓝型油菜自交不亲和的遗传机制十分复杂，环境和外界因素影响较大，表现不稳定。传统的表型选择容易受到环境条件影响，存在许多缺点，效率低。分子标记辅助选择是一种高效的育种方法，它可在任何生长期进行，不受环境条件影响，可排除非等位基因相互作用而造成的干扰，具有快速、经济，效率高、准确性强等优点。在甘蓝型油菜自交不亲和系育种过程中将分子标记技术与回交育种相结合是一种全新的杂种优势利用途径。不但可以借助分子标记对自交不亲和性状的基因型进行直接而快速地选择，以排除环境和外界因素的影响，同时对背景进行选择，加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限和减轻连锁累赘的作用。

芸薹属的自交不亲和性受单位点(S位点)、复等位基因控制，三个S位点基因：SLG(S-locus glycoprotein)，SRK(S-locus receptor kinase)和SP 11(S-locus protein 11)参与了花粉识别反应。在研究自交不亲和反应机理的过程中，分离克隆了很多甘蓝和白菜型油菜以及部分甘蓝型油菜的自交不亲和基因。本发明就是以这些基因为甘蓝型油菜自交不亲和性的侯选基因进行研究的。在甘蓝型油菜中，Parkin IAP等(Parkin IAP等，Identification of the Aand C genomes of amphidiploid Brassica napus(oilseed rape).，Genome，1995，38：1122-1131)发展了一个RFLP标记来定位甘蓝型油菜的S位点。Ekuere等(Ekuere UU等，Latent S alleles arewidespread in cultivated self-compatible Brassica napus.，Genome，2004，42：257-265)利用RFLP标记来鉴定人工合成的以及普通甘蓝型油菜的自交不亲和基因型。

等(

S等，Development of a molecular CAPS marker for the self-incompatibility locus in Brassica napusand identification of different S alleles.，Plant Breeding，2005，124：105-110)得到与甘蓝型油菜自交不亲和性完全连锁的共显性CAPS标记。这些工作为分子标记辅助选择(MAS)自交不亲和性奠定了基础，但目前在甘蓝型油菜自交不亲和的研究中鲜有应用。

发明内容

本发明的目的在于利用已有的自交不亲和基因序列设计引物，找到与甘蓝型油菜自交不亲和性连锁的SCAR(Sequence characterized amplified regions，序列特征扩增区域)分子标记，应用得到的SCAR分子标记对甘蓝型油菜自交不亲和表型进行快速而又准确的选择，以加快油菜自交不亲和新品系的选育。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过筛选，得到一批人工创造的甘蓝型油菜自交不亲和S位点的显性SCAR分子标记，包括自交不亲和系S位点显性标记和自交不亲和恢复系S位点显性标记，其中自交不亲和系S位点显性标记被分别命名为SRKa，SRKb和SP11a，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，2，6所示；自交不亲和恢复系S位点的显性标记分别被命名为SLGa，SLGb和SLGc，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3，4，5所示。

一种筛选甘蓝型油菜自交不亲和S位点显性SCAR分子标记的方法，其步骤如下：

1)以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本，以来自加拿大的甘蓝型油菜自交不亲和恢复系Defendor为父本进行杂交，得到F₁种子，将F₁种子播种得到F₁植株，对该植株套袋自交得到F₂分离群体，取F₁植株花粉与SI1300进行回交，获得BC₁分离群体；

2)调查F₂和BC₁植株的自交不亲和表型，采用亲和指数法进行分类；

3)利用同源序列法设计引物，对步骤1)的S-1300和Defendor进行PCR扩增和电泳检测，选有差异的引物对F₂和BC₁分离群体进行标记性状关联分析，确定其是否与自交不亲和性状连锁；

4)回收、克隆、测序步骤3)筛选得到的甘蓝型油菜自交不亲和S位点SCAR标记的DNA片段；

5)根据步骤3)所示的引物，获得两个多重PCR标记，使其能通过一次PCR反应区分纯合亲和，杂合亲和以及纯合不亲和三种基因型，并验证辅助选择效果。

在上述发明中，步骤3)所述的引物的序列如下所示：

其中与甘蓝型油菜自交不亲和系的S位点完全连锁的显性标记引物的DNA序列如下：

SRKa

正向引物5′-CAAGTTCTAATGAACGAGGTGG-3′，

反向引物5′-CTGAGGAATAATAGGAGATACG-3′；

SRKb

正向引物5′-CGTATCTCCTATTATTCCTCAG-3′，

反向引物5′-GCACATGCGGTCATATTATTCT-3′；

SP11a

正向引物5′-CATAAGTCATGAGATATGCTAC-3′，

反向引物5′-CCGTCGTATATTGCATAGAGTA-3′；

其中检测甘蓝型油菜自交不亲和恢复系S位点的三个显性SCAR标记的正、反向引物DNA序列如下所示：

SLGa

正向引物5’-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3’，

反向引物5′-ATTACAGTCGCTAAGGCACC-3′；

SLGb

正向引物5’-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3’，

反向引物5′-TTGGATACAGTTACACACCGGT-3′；

SLGc

正向引物5’-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3’，

反向引物5′-GAAGACGTTCCATACCACTGAT-3′。

申请人已将上述制备的分子标记成功地应用在甘蓝型油菜自交不亲和系辅助选择上。本发明的积极效果是：

本发明成功得到与甘蓝型油菜自交不亲和S位点完全连锁的显性SCAR分子标记，并成功转化得到两对多重PCR标记。本发明进行了F₂，BC₁，F₃，BC₁F₂等不同世代群体的分子标记选择结果与亲和指数法鉴定表型结果的比较，发现无错选单株，也无检测到标记与S位点发生重组，证明本发明制备的这些分子标记辅助选择效率达到100％，可以应用在甘蓝型油菜自交不亲和品系选育中。利用这些分子标记进行辅助育种，可以克服油菜育种过程中根据表型选择的缺点，大大的减少育种工作量，缩短育种年限，为快速培育甘蓝型油菜自交不亲和新品系奠定了基础。

附图说明

图1：A是本发明的育种亲本之一S-1300自交与剥蕾自交的表现，B是成熟的荚果发育比较。

图2：是本发明得到的SCAR标记在甘蓝型油菜品种S-1300和Defendor中的扩增结果。图中泳道P₁代表S-1300，泳道P₂代表Defendor，M表示分子量大小，六对引物如图所示。

图3：是本发明制备的SLGa标记在油菜BC₁群体中的扩增效果。图中泳道P₁为油菜品种S-1300，泳道P₂为油菜品种Defendor，泳道3为F₁，泳道1-10为本发明制造的甘蓝型油菜自交不亲和单株，泳道11-20为甘蓝型油菜自交亲和单株，图中M表示分子量大小。

图4：是本发明制造的SRKa在油菜F₂群体中的扩增效果。图中泳道P₁为油菜品种S-1300，泳道P₂为油菜品种Defendor，泳道3为F₁，泳道1-10为本发明制造的甘蓝型油菜自交不亲和单株，泳道11-20为甘蓝型油菜自交亲和单株，图中M表示分子量大小。

图5：是本发明得到的SRKb标记的DNA序列与目的序列Blast结果，图5中序列的257bp处有一个碱基“T”的插入(插入位置请参见下划线处)。

图6：是本发明制备的多重PCR标记SLGb+SP11a在甘蓝型油菜自交不亲和F₂群体的不同基因型单株中的扩增效果。图中泳道P₁为油菜品种S-1300，泳道P₂为油菜品种Defendor，泳道3为F₁，泳道1-10为本发明制造的甘蓝型油菜自交不亲和单株，泳道11-20为甘蓝型油菜自交亲和单株，图中M表示分子量大小。

具体实施方式

实施例1

申请人通过筛选，得到一批人工创造的甘蓝型油菜自交不亲和S位点的显性SCAR分子标记，包括自交不亲和系S位点显性标记和自交不亲和恢复系S位点显性标记，其中自交不亲和系S位点显性标记被分别命名为SRKa，SRKb和SP11a，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，2，6所示；自交不亲和恢复系S位点的显性标记分别被命名为SLGa，SLGb和SLGc，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3，4，5所示。

一种筛选甘蓝型油菜自交不亲和S位点显性SCAR分子标记的方法，其步骤如下：

1)以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本，以来自加拿大的甘蓝型油菜自交不亲和恢复系Defendor为父本进行杂交，得到F₁种子，将F₁种子播种得到F₁植株，对该植株套袋自交得到F₂分离群体，取F₁植株花粉与SI1300进行回交，获得BC₁分离群体；

2)调查F₂和BC₁植株的自交不亲和表型，采用亲和指数法进行分类；

3)利用同源序列法设计引物对，对步骤1)的S-1300和Defendor进行PCR扩增和电泳检测，选有差异的引物对(见表1)进行F₂和BC₁分离群体标记性状的关联分析，确定其是否与自交不亲和性状连锁；

4)回收、克隆、测序步骤3)筛选得到的甘蓝型油菜自交不亲和S位点SCAR标记的DNA片段；

5)根据步骤3)所示的引物，获得两个多重PCR标记，使其能通过一次PCR反应区分纯合亲和，杂合亲和以及纯合不亲和三种基因型，并验证辅助选择效果。

1、分离群体的获得

以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300(见文献：马朝芝等，甘蓝型油菜双低自交不亲和系的选育，华中农业大学学报，1998，17(3)：211-213)为母本，以来自加拿大的甘蓝型油菜自交不亲和恢复系Defendor为父本(见文献：沈金雄等，甘蓝型油菜自交不亲和系杂种优势的初步研究，华中农业大学学报，2001，20(6)：528-530)进行杂交，得到F₁种子，将F₁种子播种得到F₁植株，对该植株套袋自交得到F₂分离群体，取F₁植株花粉与S-1300进行回交，获得BC₁分离群体。

2、DNA的提取

从本发明构建的所有油菜植株的小苗中提取和纯化DNA，具体制备方法参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)报道的方法进行。

3、利用亲和指数法判断表型：

表型调查方法参见Yang等(Yang等，Genetic analysis of four self-incompatible lines in Brassicanapus.，Plant Breeding，2001，120：57-61)。对所有调查的油菜单株进行套袋自交，当主枝上有3-5朵花开放时，摘除主枝已开花朵和花序中心的小蕾以限制主枝无限生长，然后用硫酸钠纸袋套住主枝和2-3侧枝，每隔一天把纸袋向上抽提，在抽提的过程中用手轻拍纸袋使花粉散落有利于自交授粉，起到辅助授粉的作用。当硫酸钠纸袋内不再有花开放时，去掉纸袋让角果充分发育，并根据结实情况和角果发育初步判断表型(附图1)。种子成熟时分单株收获、脱粒，考察主枝结实情况，以亲和指数表示，并参考侧枝结实情况。按照公式：亲和指数(Self-compatibility Index，SCI)＝籽粒数/花朵数。根据亲和指数分布结果，参考Yang等(2001)分类研究结果，以该文献中定义的2为标准，将所有植株分成两类：SCI值为小于2为自交不亲和，SCI值为大于2为自交亲和。对自交不亲和单株选择两个分枝进行剥蕾自交收获种子。遗传分析表明单位点控制甘蓝型油菜自交不亲和表型，自交不亲和恢复系S位点对自交不亲和系S位点为显性。申请人将甘蓝型油菜自交不亲和系S等位基因命名为SI，自交不亲和恢复系S等位基因命名为SC，这两个等位基因可组成三种基因型即SISI，SCSI，SCSC，其中具有SISI基因型的植株表现自交不亲和，具有SCSI和SCSC的植株表现自交亲和。

4、利用同源序列法设计引物，筛选与甘蓝型油菜自交不亲和S位点连锁的SCAR标记

在美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上已经公布的甘蓝型油菜S-A10的SLG基因序列(GenBank登录号：Z21608)和白菜型油菜S60单倍型的SRK基因序列(GenBank收录号：AB097116)和SP11基因(GenBank收录号：AB067446)，用Primer3引物设计软件(http://redb.croplab.org/modules/redbtools/primer3.php)设计特异引物。要求引物GC含量为40％-70％，Tm值为60℃-70℃，目标片段长度在400～1300bp之间，引物的长度为20bp-22bp，引物内无二级结构，引物间不能相互配对。引物的序列如表1所示。所有引物由上海生物工程公司合成。

表1本发明的显性SCAR标记的引物序列、相位及片段的大小

5、PCR扩增条件

PCR反应体系：1×PCR buffer，1.35mmol/L MgCl₂，0.08mmol/L dNTPs，1.0U Taqpolymerase(四者均为MBI Fermentas，Lithuania)，100ng DNA，0.45μmol/L正反向引物(Forward，Reverse)，ddH₂O补充至终体积20μl。热循环参数为：94℃3min；94℃30s，复性温度45s，72℃60s，38个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存，反应是在PTC-225PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.2％琼脂糖凝胶电泳分离检测，使用1×TAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH8.0)，电压3V/cm，电泳1.5hrs左右。电泳完毕，凝胶成像系统(UVP)拍照保存，记录多态性结果。

6、甘蓝型油菜自交不亲和S位点的显性SCAR标记

表1所示的六对引物在S-1300和Defendor中的扩增见附图2。命名为SLGa，SLGb和SLGc的三对引物在Defendor有扩增产物，而S-1300中无。用杂交组合S-1300与Defendor的F₂和BC₁群体进行标记性状关联分析时，发现所有亲和单株产生相应的带型，出现情况一致，而不亲和单株如S-1300一样无任何扩增产物(附图3)，表明该标记与自交不亲和恢复系S等位基因SC完全连锁。三对引物命名为SRKa，SRKb和SP11a在S-1300中有扩增产物而Defendor中无。用上述同样的分离群体分析时，除所有不亲和单株扩增出目标片段外，2/3的亲和单株也出现扩增产物(附图4)，说明这些标记与自交不亲和系的隐性S等位基因SI完全连锁。

7、回收、克隆、测序筛选到的SCAR标记的片段

扩增的目标DNA片段从1.2％的琼脂糖胶上用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(购自上海生物工程公司)进行回收。操作程序按试剂盒说明书提供的方法：用刀片挖出目标片段放入1.5ml的离心管，加入Bing Buffer II，置于50-60℃水浴中加热10min，每隔2min混匀一次；将融化的胶溶液转移至套在收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8,000rmp离心1min；倒掉收集管中的废液，加入500μl Wash Solution，8,000rmp室温离心1min，此步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12,000rmp离心15sec；将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加30μl Elution Buffer，室温放置2min；12,000rmp离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

取上述回收的目标DNA片段2μl作模板，用表1所示的引物进行PCR扩增，在1.2％的琼脂糖胶检测扩增片段是否为所需的目标片段。如果不是则需要重新扩增回收；如果是所需目标片段则进行下一步TA-克隆操作。回收的目标片段连接在pMDT-18载体(购自TaKaRa公司，大连宝生物公司代理)。操作程序按试剂盒说明书提供的方法：试剂盒中试剂在使用前先短暂离心将其收集在管底部；在0.5ml的离心管中建立如表2所示的连接反应体系：

表2目标片段连接在pMDT-18载体的反应体系

用移液管来回吸几次混匀，置4℃冰箱进行过夜连接反应；准备LB液体培养基和LB固体培养基(含100mg/ml氨苄青霉素amp，24mg/ml的IPTG异丙基硫代-β-D-半乳糖苷和20mg/ml的X-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)；从-70℃冰箱中取出感受态细胞放在冰上待它慢慢解冻(大约5min)；离心收集连接反应液，取2μl反应液加入到一个已经灭菌的1.5ml离心管(放在冰上预冷)；用手指轻弹装有感受态细胞的管底以混匀，取50μl感受态细胞加入装有2μl连接反应液的1.5ml离心管，用手指轻弹混匀，放在冰上20min；在42℃水浴中热激90sec(勿摇动)，然后在冰上放置2min；加500ul的LB液体培养基后在37℃振荡培养1.5hrs(150rmp/min)；吸取振荡培养后的转化液100μl涂在无菌的LB固体培养基上，在37℃放置16-24hrs；蓝、白斑筛选，挑选12个阳性克隆在无菌的液体LB培养基(含50ug/ml的amp)振荡培养16-24hrs；取2μl菌液作PCR模板，用M13引物(正向引物：5′-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3′；反向引物：5′-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3′)扩增，在1.2％的琼脂糖胶上检测目标片段是否转化成功。如果所得的片段比目标片段大200bp左右，证明转化成功，编号并吸取300μl送给上海生工公司进行序列测定。剩余200μl浑浊菌液加200μl 50％无菌的甘油在1.5ml无菌的离心管中于-70℃编号保存。

测序结果通过NCBI网站公开使用的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，与GeneBank数据库中公布的甘蓝型油菜自交不亲和基因进行序列同源性比较(表3)。表中：Bn表示甘蓝型油菜(Brassica napus)，Br表示白菜型油菜(B.rapa)，SLG-A10表示自交不亲和S-A10位点的SLG基因。结果表明，这些片段与候选基因序列同源性很高。SLGa，SLGb和SLGc与同一个序列BnSLG-A10(GenBank注册号：Z21608)同源性达99％，都是在三个位置有碱基差异，12bp处C突变为G，425bp处A突变为G，711bp处有个简并碱基S，而BnSLG-A10对应位置是C。

SRKa的片段与BrSRK-60的25072-26129有两个碱基差异，在111bp和519bp处发生了A到G的突变。SRKb对应的片段序列与BrSRK-60的26108-26650在257bp处有1个碱基T的插入，其余序列100％相同(附图5)。SP11a的片段与目的片段BrSP11-60(GenBank注册号：AB067446)在序列5’方向180bp完全不同，而与BrSP11-60(GenBank注册号：AB097116)仅在正向引物的前三个碱基不同，其余432bp 100％相同。

表3本发明制备的SCAR标记与侯选基因序列同源性

8、转化多重PCR标记

将自交不亲和系S位点的显性SCAR标记和自交不亲和恢复系S位点的显性SCAR标记引物结合转化成同时区分等位基因的多重PCR标记。经过多次反复实验，成功得到两个多重PCR标记，一是SLGa+SRKa，一是SLGb+SP11a。PCR反应体系：以100ng DNA为模板，1×PCR buffer，1.35mmol/L MgCl₂，0.08mmol/L dNTPs，1.0U Taq polymerase(四者均为MBI Fermentas，Lithuania)，引物组合中扩增片段小的引物即SLGa和SP11a 0.30μmol/L，另一个引物即SRKa和SLGb 0.45μmol/L，ddH₂O补充至终体积20μl。热循环参数为：94℃3min；94℃ 30s，59℃ 1min，72℃ 90s，35个循环；72℃ 10min，1个循环；4℃保存。两个多重PCR标记能够明确区分纯合亲和，杂合亲和以及纯合不亲和三种基因型(附图6)。

9、标记性状关联分析

杂交组合S-1300与Defendor的F₂和BC₁群体的基因型和基因频率分布见表4。

表4甘蓝型油菜自交不亲和分离群体的基因型和基因频率分布

从表4可见，在甘蓝型油菜自交不亲和F₂群体中，等位基因SC和SI的基因频率为中等，在基因型分布上，SCSI基因型占总数的1/2。在与SI1300回交的两个回交群体中，等位基因SI的基因频率为SC的3倍，在基因型分布上，理论上SCSI基因型与SISI基因型分布相等，但实际观察结果SCSI基因型占优势。

10、多重PCR标记在甘蓝型油菜自交不亲和系辅助选择上的应用

应用本发明制备的如序列表SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6所示的分子标记，对甘蓝型油菜杂交组合S-1300×06-育9(中国的半冬性油菜(分类命名Brassica napus L)品系，于2007年9月20日保藏在中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：P200703)的F₂和BC₁分离群体进行了检测。根据多重PCR标记推测单株的自交不亲和基因型，依据田间调查和亲和指数鉴定表型，结果发现这两个群体的基因型和基因频率分布与组合S-1300×Defendor结果相似(见表4)。

选S-1300×Defendor的F₂和BC₁群体中6个纯合亲和单株，19个杂合亲和单株以及21个纯合不亲和单株的自交后代对多重PCR标记进行评价。鉴定的甘蓝型油菜自交不亲和基因型与调查表型结果完全一致，基因型和基因频率分布也与预期吻合(见表5)。

表5甘蓝型油菜不同基因型单株后代基因型和基因频率分布检测

序列表

<110>华中农业大学

<120>甘蓝型油菜自交不亲和的显性SCAR分子标记及应用

<130>

<141>2007-09-22

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1058

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1058)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(111)..(111)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(519)..(519)

<223>

<400>1

caagttctaa tgaacgaggt ggtgttacca agaaagaaga tacatttttc tggtgaggac    60

gaagtagaaa atttggaact ttcattgatg gagtttgaag ctgttgtcac ggccaccgaa    120

catttctctg attttaacaa ggtcggaaaa ggtggttttg gtgttgttta caaggtataa    180

ataatatgaa ggaatcacta tgaatttttt tctttttttg tgaaaaacat caatggtgaa    240

aacccactta gagtttctaa aaaaatatag tttaacaaaa tcaatatcta atctattaaa    300

actgaaacac aattagtact taactctagt ttttacttaa tatttacaat ggaaatacta    360

tactaggcgt atacactgtg ttttataact taactaacgc gcctaataaa tttacgtcta    420

cttaaaactt aaataacaaa accgattgaa cctaaaatca tgtggtttgt taaataatat    480

atgcatcagt ttaatttggt ctgcagaaat caaaacaagc atgtttcggt acaaaatatt    540

ccttggttaa atgttagtct acataaacaa aaccaaatta tacatagttc ggttcactac    600

gtaaaaacaa attttgtaaa tacttaacca cataatttcg atccaatata tataatgatt    660

aagaaatcat gtaattatca aggaactgtt tctcgtctta actattgttt aaatatagtt    720

ttgtgtactc ggtttttgtt atgaaccgaa tattgttaat atcatggtat atattatgat    780

tcatatagca tgtataaaat tgaaattaat aacttcgggt agttattatc attatactcg    840

tgcaaatcaa aaccgtcgat tccaaacatt gataacattc ctaaaaagtt tcctattatt    900

acgcattcat ctaagaatac aactaacgca atctactttc aaacttgcaa atcatgtttg    960

gcttagctta gaaataagaa tattatgttt attatgatga ttatctaaaa gaaatgtaca    1020

ttaattaatt caaatacgta tctcctatta ttcctcag                            1058

<210>2

<211>544

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

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<220>

<221>mutation

<222>(257)..(257)

<223>

<400>2

cgtatctcct attattcctc agaataaagt ctacaaaata tcccaatata tctatatcta    60

tactattatt tgcgaattga tttttcacaa taaagctcaa acgttaaaag ttaaagcggt    120

taatatcgtt tataccctta atggatttta tataattaaa aacaaatttc aagttaataa    180

tagatttatt ttctagataa ttgattataa attaatattt tcaaaaaaat aaaaataatt    240

cttatataca ttgtgttgtt atctaaaaat aatattttct attaaaaaat aaaattaaga    300

tataacataa tttatgatta aatattaatc aaacaaaaat atttgtataa agatattttc    360

taaaatattt ataatatctg agtatctata aatttcaacc caataataag catatatatt    420

ttgatgaaaa tatgtcatat atcaataatt taatgtttga tttaaaaaat ttaaaacata    480

aataataatt tattatattg agttttgaat tagtaaatcg taagaataat atgaccgcat    540

gtgc                                                                 544

<210>3

<211>805

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(805)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(12)..(12)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(425)..(425)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(711)..(711)

<223>

<400>3

gattctactt cgtcctgcct tttcgattaa cactttgtct tctgaagaat ctcttacaat    60

atcaagcaac agaacacttg tatctcgggg tgatgtcttc gagctcggtt tcttcaagac    120

cacctctagt tctcgttggt atctcgggat atggtacaag aaatttccat atagaaccta    180

tgtatgggtt gccaacagag ataaccctct ccccaattcc attggaaccc tcaaaatatc    240

caacatgaac cttgtcctcc ttgatcactc taataaatct gtttggtcca cgaatcttac    300

tagacgtaat gagagaactc cggtgatggc agagcttctc gctaatggaa acttcgtgat    360

gagagactcc aataacaacg atgcaagtga attcttgtgg caaagtttcg attaccctac    420

agatgctttg cttccagaga tgaaactggg ttacaacctc aaaaaagggc taaacaggtt    480

ccttatatca tggagaagtt cagatgatcc gtcaagcggg gattactcgt acaagctcga    540

accccgaagg cttcctgagt tttatctact gcaaggagac gttcgagagc atcggagtgg    600

tccatggaac ggaatccgat ttagtgggat actagaggac caaaagctga gttacatgga    660

gtacaatttc acagagacta gtgaggaggt cgcttataca ttccgaatga scaacaacag    720

cttctactcg agattgacac taagctccac agggtatttt gagcgactga cgtgggctcc    780

gtcatcagtg gtatggaacg tcttc                                          805

<210>4

<211>901

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(901)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(12)..(12)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(425)..(425)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(711)..(711)

<223>

<400>4

gattctactt cgtcctgcct tttcgattaa cactttgtct tctgaagaat ctcttacaat    60

atcaagcaac agaacacttg tatctcgggg tgatgtcttc gagctcggtt tcttcaagac    120

cacctctagt tctcgttggt atctcgggat atggtacaag aaatttccat atagaaccta    180

tgtatgggtt gccaacagag ataaccctct ccccaattcc attggaaccc tcaaaatatc    240

caacatgaac cttgtcctcc ttgatcactc taataaatct gtttggtcca cgaatcttac    300

tagacgtaat gagagaactc cggtgatggc agagcttctc gctaatggaa acttcgtgat    360

gagagactcc aataacaacg atgcaagtga attcttgtgg caaagtttcg attaccctac    420

agatgctttg cttccagaga tgaaactggg ttacaacctc aaaaaagggc taaacaggtt    480

ccttatatca tggagaagtt cagatgatcc gtcaagcggg gattactcgt acaagctcga    540

accccgaagg cttcctgagt tttatctact gcaaggagac gttcgagagc atcggagtgg    600

tccatggaac ggaatccgat ttagtgggat actagaggac caaaagctga gttacatgga    660

gtacaatttc acagagacta gtgaggaggt cgcttataca ttccgaatga scaacaacag    720

cttctactcg agattgacac taagctccac agggtatttt gagcgactga cgtgggctcc    780

gtcatcagtg gtatggaacg tcttctggtc ttctcctaac caccagtgcg atatgtacaa    840

gatttgtggg ccttactctt actgtgacgt gaccacatca ccggtgtgta actgtatcca    900

a                                     901

<210>5

<211>1099

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1099)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(12)..(12)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(425)..(425)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(711)..(711)

<223>

<400>5

gattctactt cgtcctgcct tttcgattaa cactttgtct tctgaagaat ctcttacaat  60

atcaagcaac agaacacttg tatctcgggg tgatgtcttc gagctcggtt tcttcaagac  120

cacctctagt tctcgttggt atctcgggat atggtacaag aaatttccat atagaaccta  180

tgtatgggtt gccaacagag ataaccctct ccccaattcc attggaaccc tcaaaatatc  240

caacatgaac cttgtcctcc ttgatcactc taataaatct gtttggtcca cgaatcttac  300

tagacgtaat gagagaactc cggtgatggc agagcttctc gctaatggaa acttcgtgat  360

gagagactcc aataacaacg atgcaagtga attcttgtgg caaagtttcg attaccctac  420

agatgctttg cttccagaga tgaaactggg ttacaacctc aaaaaagggc taaacaggtt  480

ccttatatca tggagaagtt cagatgatcc gtcaagcggg gattactcgt acaagctcga  540

accccgaagg cttcctgagt tttatctact gcaaggagac gttcgagagc atcggagtgg  600

tccatggaac ggaatccgat ttagtgggat actagaggac caaaagctga gttacatgga  660

gtacaatttc acagagacta gtgaggaggt cgcttataca ttccgaatga scaacaacag  720

cttctactcg agattgacac taagctccac agggtatttt gagcgactga cgtgggctcc  780

gtcatcagtg gtatggaacg tcttctggtc ttctcctaac caccagtgcg atatgtacaa  840

gatttgtggg ccttactctt actgtgacgt gaccacatca ccggtgtgta actgtatcca  900

agggttcaga cccaagaacc ggcagcagtg ggatctgaga atctcattaa gggggtgtat  960

aagaaggacg cggctgagct gcagtggaga tggttttgcc aggatgaagt atatgaagtt  1020

gccagaaact acgatggcta ttgtcgaccg cagtattggt gtgaaagaat gtgagaagag  1080

gtgccttagc gactgtaat                                               1099

<210>6

<211>435

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(435)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(1)..(1)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(2)..(2)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(3)..(3)

<223>

<400>6

cagaagtcat gagatatgct acttctatat atacattttt aacaaatata cactacttat    60

gtttcatatt tttgattttg acatatgttc aaggtaaact atatcaataa ctttccccct    120

tttatggacg ctttaggatt tttcttacct aattgcaatt cataattttt tgttaattta    180

aagcactaga tgtgggagct tggaaatgcc ctgaaggcat cgtctatccg agtcctatct    240

caggaaggtg cattaattcc aggagcacag agtgtaaaaa acactatgaa gttgagggac    300

agaatgttac taattgccgt tgtgatactt atagcatgca aaatcctgcg aggattactt    360

gctactgttg caaagttaaa tcataattga tcaacgaaac atccagagac ggttactcta    420

tgcaatatac  gacgg                                                    435

Claims (4)

1、人工创造的甘蓝型油菜自交不亲和S位点的显性SCAR分子标记，包括自交不亲和系S位点显性标记和自交不亲和恢复系S位点显性标记，其中自交不亲和系S位点显性SCAR标记被命名为SRKa，SRKb和SP11a，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，2，6所示；自交不亲和恢复系S位点的显性SCAR标记被命名为SLGa，SLGb和SLGc，它们的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：3，4，5所示。

2、一种筛选甘蓝型油菜自交不亲和S位点显性SCAR分子标记的方法，其步骤如下：

1)以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本，以甘蓝型油菜自交不亲和恢复系Defendor为父本进行杂交，得到F₁种子，将F₁种子播种得到F₁植株，对该植株套袋自交得到F₂分离群体，取F₁植株花粉与SI1300进行回交，获得BC₁分离群体；

2)调查F₂和BC₁植株的自交不亲和表型，采用亲和指数法进行分类；

3)利用同源序列法设计引物，对步骤1)的S-1300和Defendor进行PCR扩增和电泳检测，选有差异的引物对F₂和BC₁分离群体进行标记与关联分析，确定其是否与自交不亲和性状连锁；

4)回收、克隆、测序步骤3)筛选得到的甘蓝型油菜自交不亲和S位点SCAR标记的DNA片段；

5)根据步骤3)所示的引物，获得两个多重PCR标记，使其能通过一次PCR反应区分纯合亲和，杂合亲和以及纯合不亲和三种基因型，并验证辅助选择效果。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的引物的序列如下所示：

其中与甘蓝型油菜自交不亲和系的S位点完全连锁的显性标记引物DNA序列如下：

SRKa

正向引物5′-CAAGTTCTAATGAACGAGGTGG-3′，

反向引物5′-CTGAGGAATAATAGGAGATACG-3′；

SRKb

正向引物5′-CGTATCTCCTATTATTCCTCAG-3′，

反向引物5′-GCACATGCGGTCATATTATTCT-3′；

SP11a

正向引物5′-CATAAGTCATGAGATATGCTAC-3′，

反向引物5′-CCGTCGTATATTGCATAGAGTA-3′；

其中检测甘蓝型油菜自交不亲和恢复系S位点的三个显性SCAR标记的正、反向引物DNA序列如下所示：

SLGa

正向引物5’-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3’，

反向引物5′-ATTACAGTCGCTAAGGCACC-3′；

SLGb

正向引物5’-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3’，

反向引物5′-TTGGATACAGTTACACACCGGT-3′；

SLGc

正向引物5’-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3’，

反向引物5′-GAAGACGTTCCATACCACTGAT-3′。

4、权利要求1所述的分子标记在甘蓝型油菜自交不亲和系辅助选择中的应用。

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