CN101701263B - 甘蓝型油菜显性核不育恢复系的分子标记及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜显性核不育恢复系的共显性SCAR分子标记的制备，及其作为标记辅助选择在选育甘蓝型油菜显性核不育恢复系中的应用。本发明利用引物对YQ-Rf1、YQ-Rf2扩增显性核不育系甘蓝型油菜材料纯合两型系GMS3种植后第一代分离的不育系4185A和甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2基因组DNA，分别得到4个扩增的DNA片段，然后对所述的DNA扩增片段进行克隆、测序、核苷酸序列比对，根据序列的差异设计引物对YQ-Rfa、YQ-Rfb，PCR扩增和选择效果检验，进而获得甘蓝型油菜显性核不育恢复系的共显性SCAR分子标记，本发明为油菜分子育种提供了一种新标记。本发明还公开了制备所述分子标记的方法及应用。

Description

甘蓝型油菜显性核不育恢复系的分子标记及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜显性核不育恢复系的分子标记，其制备方法与应用。

背景技术

甘蓝型油菜显性核不育是一类由核基因突变而形成的雄性不育类型，具有败育彻底、不育性稳定、其育性受环境因素影响较小且不存在细胞质效应等特点(周永明，甘蓝型油菜轮回选择研究.作物学报，1993，1(19)：70-75)。不同来源的甘蓝型油菜显性核不育材料的遗传基础存在差异。Mathias(Mathias R.Anew dominant gene for male sterility in rapeseed(Brassica Napus L.).Z Pflanzenzüchtg，1985，94：170-173)曾报道过一种受单个显性基因控制的油菜显性核不育材料。李树林等通过对宜3A及其衍生系(23A、204A、6A、9A)、川七A和05A等材料的遗传分析，提出这类甘蓝型油菜雄性核不育受一对显性基因Ms控制，但同时存在一对显性抑制基因Rf能恢复显性核不育的育性，首次提出了油菜显性核不育性受两对互作基因控制的遗传模式(李树林等，甘蓝型油菜细胞核雄性不育的遗传规律探讨及其应用，上海农业学报，1985，1(2)：1-12；李树林等.甘蓝型油菜细胞核雄性不育性的遗传验证.上海农业学报，1986，2：1-8；李树林等，显性核不育油菜的遗传，上海农业学报，1987，3：1-8)。之后，其他研究者以不同的材料也得到类似的结果(王通强等，甘蓝型双低油菜细胞核显性核不育系黔油2AB的选育，贵州农业科学，1999，27：14-18；胡胜武等，甘蓝型油菜核不育材料Shaan-GMS恢复基因的筛选及其遗传分析；西北农林科技大学学报，2004，32：9-12.)。显性核不育基因抑制基因(恢复基因)的发现，使得油菜显性细胞核雄性不育系统用于杂交种生产成为可能。

宋来强等采用临保系测验法和测交后代可育株自交与回交等方法发现甘蓝型油菜不育系609AB可育株的抑制基因(Mf)与不育基因(Ms)等位，即Ms为显性雄性不育基因，Mf为Ms的等位显性抑制位点，ms为正常可育位点，并且具有Mf＞Ms＞ms的显性遗传效应，从而提出不育系609AB育性符合1对复等位基因遗传模式(宋来强等，1对复等位基因控制的油菜(Brassica napus L.)显性核不育系609AB的遗传验证.作物学报，2005，7(31)：869-875)。洪登峰等的试验表明甘蓝型油菜不育系RS1046AB的遗传也符合上述一对复等位基因遗传的模式(Hong Dengfeng等，Development and characterization of SCAR markersassociated with a dominant genic male sterility in rapeseed，Plant Breeding(2008)127：69-73)。上述两种遗传模式控制的显性核不育材料的等位性尚未见相关的研究报道。

李树林等首先提出了利用两对基因互作控制的显性核不育进行“三系”法生产杂交种的步骤。即将纯合不育(MsMsrfrf)与双隐性可育株(msmsrfrf，临保系)杂交得到的100％不育株(Msmsrfrf)群体，再与带有RfRf位点的可育株(恢复系)杂交得到群体育性完全恢复的F₁种子(李树林等，甘蓝型油菜细胞核雄性不育的遗传规律探讨及其应用，上海农业学报，1985，1(2)：1-12)。按照类似的思路，受一对复等位基因模式控制的显性核不育材料也可以实现“三系”法生产杂交种(宋来强等，一对复等位基因控制的油菜(Brassicanapus L.)显性核不育系609AB的遗传验证，作物学报，2005，7(31)：869-875)。目前，已利用显性核不育材料育成了一批油菜杂交种。如周熙荣等选育的核杂3号和核杂7号等(周熙荣等，甘蓝型(Brassicanapus L)显性核不育双低油菜杂交新品种核杂3号的选育，上海交通大学学报(农业科学版)，2003，21：304-308；周熙荣，甘蓝型油菜显性核不育三系杂交种“核杂7号”，农业科技通讯，2005，33：62.)；石华娟等育成的川油15号等杂交种(石华娟等，川油15核不育三系制种技术的应用研究，西南农业学报，2004，17：12-15)。

Song等以甘蓝型油菜纯合两型系609AB为材料，构建了4个群体(包括3个BC1群体，一个DH群体)。通过分离群体分组分析法(BSA法)筛选到4个与Ms连锁的AFLP标记，其中最近的两个标记与Ms基因的遗传距离分别0.3cM和1.6cM；通过克隆测序和PCR步行的方法，将上述两个最近的标记成功转化为SCAR标记SC6与SC9，并将SC9转化成与Rf基因连锁的SCAR标记SC9f(Lai-Qiang Song等，Molecular validation of multiple allele inheritance for dominant genic male sterility gene in Brassica napus L.Theor Appl Genet(2006)113：55-62)。Hong等以甘蓝型油菜纯合两型系RS1046AB为材料，通过构建近等基因系(NIL)和BSA法等获得6个与Rf连锁的AFLP标记，最近的3个标记与Rf基因的遗传距离均为0.7cM，同样采用通过克隆测序和PCR步行的方法将所得的3个AFLP标记转化成2个与Ms连锁的SCAR标记SP6和SCE3，遗传距离分别均为0.7cM；3个Rf连锁的SCAR标记SCHDA、SCHDC和SCHDF，遗传距离分别均为0.7cM(Hong Dengfeng等.AFLP and SCAR markers linked to the suppressor gene(Rf)ofa dominant genic male sterility in rapeseed(Brassica napus L.).Euphytica，2006，151：401-409；HongDengfeng等，Development and characterization of SCAR markers associated with a dominant genic male sterilityin rapeseed.Plant Breeding，2008，127：69-73)。

油菜显性核不育恢复系的选育是利用此类材料生产杂交种的关键。在选育恢复系过程中，需要通过当代测交和下一代鉴定的交替程序，来确定恢复基因的存在与否和位点的纯合状态，育种周期较长。因此，开发能有效用于恢复基因鉴定的分子标记十分必要。尽管已有对不育基因和恢复基因定位的报道，迄今尚未见将甘蓝型油菜显性核不育恢复系的分子标记应用到恢复基因鉴定和选择的报道。

发明内容

本发明的目的在于制备一种适用于甘蓝型油菜显性核不育恢复系选育的分子标记，为甘蓝型油菜显性核不育恢复系的鉴定和辅助选育提供一种新的分子标记，从而加速甘蓝型油菜显性核不育恢复系的选育进程，提高育种的准确性和选择效率。

本发明是通过以下方案实现：

申请人通过试验获得一种适用于选育甘蓝型油菜显性核不育恢复系共显性SCAR分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

申请人提供了一种适用于选育甘蓝型油菜显性核不育恢复系的显性SCAR分子标记的制备方法，其步骤如下：

利用发明人设计的引物对YQ-Rf1、YQ-Rf2扩增甘蓝型油菜显性核不育材料纯合两型系GMS3种植后第一代分离的不育株(编号为甘蓝型油菜4185A，其来源如实施例1所述)和甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2(该4185B-2材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏(见CCTCC的临时保藏收据)，其保藏号为CCTCC-P200907)基因组DNA，得到4个DNA扩增片段，然后对所述的4个DNA扩增片段进行克隆，测序。得到如下所述的引物对：引物对YQ-Rf1从甘蓝型油菜显性核不育系4185A、甘蓝型油菜显性核不育系4185B-2中扩增得到如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；利用引物对YQ-Rf2从甘蓝型油菜显性核不育系4185A、甘蓝型油菜显性核不育系4185B-2中扩增得到如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

与序列表SEQ ID NO：1相比，在序列表SEQ ID NO：2的第63-64bp处有1个15bp的插入突变，插入碱基是CGAAGAAGAAGAAGA；在第199-208bp处有一个10bp的缺失突变，缺失碱基是AGAGTTCCTT(见附图2)，因第63-64bp处的15bp的插入碱基为简单重复序列，而第199-208bp处突变直接导致序列特异扩增区域多态性，申请人根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2在该位点的差异设计引物对YQ-Rfa。SEQID NO：4与SEQ ID NO：3相比，在SEQ ID NO：4的第1688-1689bp处有一个26bp的插入突变，插入碱基是GTCTATTAGATTTTATTTGTGACATT(见附图3)，该突变导致序列特异扩增区域多态性，申请人根据这一差异设计引物对YQ-Rfb。将引物对YQ-Rfa和YQ-Rfb进行PCR扩增，得到与甘蓝型油菜显性核不育恢复基因连锁的共显性SCAR分子标记(即本发明的目标分子标记)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

在上述方法中，所用引物对的核苷酸序列如下所示：

引物对(1)，编号为YQ-Rf1：

正向引物5′-GCAAGATTCCTAGGATTGTAGA-3′，

反向引物5′-TGGGACCTATTGCGAAC-3′。

引物对(2)编号为YQ-Rf2：

正向引物5′-TTAAGCAAGTTTGGAGGG-3′，

反向引物5′-GAAGATCAAATCACAAAGTAACG-3′。

引物对(3)编号为YQ-Rfa：

正向引物5′-AAGGTTTCTTTAGAGTTCC-3′，

反向引物5′-AAAAAAAGCAGGTCCTAG-3′。

引物对(4)编号为YQ-Rfb：

正向引物5′-CACTTCGGTGACCTTACA-3′，

反向引物5′-GTTAATGTCACAAATAAAATC-3′。

其中，引物对YQ-Rf1用于扩增序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；引物对YQ-Rf2用于扩增序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；引物对YQ-Rfa、YQ-Rfb分别用于扩增序列表中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

本发明的积极效果：

本发明成功得到与前人不同的甘蓝型油菜显性核不育恢复基因的共显性SCAR分子标记，运用该标记可鉴别具备显性核不育恢复性的甘蓝型油菜基因型，从而可以克服传统育种中依靠表型进行选择的缺点。利用本发明制备的分子标记作为甘蓝型油菜显性核不育恢复系分子标记辅助选择，可以明显减少育种工作量，缩短育种年限，加快甘蓝型油菜显性核不育恢复系育种的进程。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1-4是本发明扩增的甘蓝型油菜显性核不育材料纯合两型系GMS3种植后第一代分离的不育株4185A和甘蓝型油菜显性核恢复系4185B-2的基因组DNA获得的四段核苷酸序列；

序列表SEQ ID NO：5-6是本发明制备的甘蓝型油菜显性核不育恢复系共显性SCAR分子标记的核苷酸序列。

图1：利用引物对YQ-Rf1、YQ-Rf2在甘蓝型油菜显性核不育系4185A和甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2以及F₁的基因组DNA中的扩增结果。图中：P₁代表4185A；P₂代表4185B；F₁代表4185A×4185B-2；M代表DNA marker(片段大小依次为3000，2600，2050，1650，1000，700，500和278bp)。

图2：利用引物对YQ-Rf1在甘蓝型油菜显性核不育系4185A和甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2基因组中的扩增的DNA片段序列比对，图中：三角形表示序列的第63-64位的15核苷酸插入突变和第199-208位10bp的缺失突变，缺失碱基是AGAGTTCCTT；设计的引物位置(即引物对YQ-Rfa的正向引物序列)参见下划线处。

图3：利用引物对YQ-Rf2在甘蓝型油菜显性核不育系4185A和甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2基因组中的扩增的DNA片段序列比对，图中：三角形表示序列第在1688-1689位的26核苷酸的插入突变；设计的引物位置(即引物对YQ-Rfb的反向引物序列)参见下划线处。

图4：本发明获得的引物对YQ-Rfa、YQ-Rfb在甘蓝型油菜显性核不育系4185A、甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2、(4185A×4185B-2)F₁的检测结果。图中：P₁代表4185A；P₂代表4185B-2；F₁代表4185A×4185B；M代表DNA marker(片段大小依次为1500，1200，1000，900，800，700，600，500，400，300，200和100bp)，箭头所示为分子量大小。

图5：本发明获得的多重PCR标记YQ-Rfa和YQ-Rfb检测甘蓝型油菜显性核不育系4185A、甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2、(4185A×4185B-2)F₁、以及甘蓝型油菜显性核不育的恢复系、不育系和临保系结果。图中：P₁代表4185A；P₂代表4185B-2；F₁代表(4185A×4185B-2)；1-6、7-12、13-18分别代表甘蓝型油菜显性核不育材料的不同来源的恢复系；不育系(其中7-9为纯合不育单株、10-12为杂合不育单株)和临保系；M代表DNA marker(片段大小依次为1500，1200，1000，900，800，700，600，500，400，300，200和100bp)。

图6：是本发明的技术流程图。

图7：是两种遗传模式下恢复系与临保系杂交可育株自交(I)和回交(II)的育性分离比较图。图中，MA代表一对复等位基因控制模式，UD两对基因互作模式。

图8：两种遗传模式下F2群体的育性分离比较图。图中，MA代表一对复等位基因控制模式，UD两对基因互作模式。

图9：两种遗传模式下测交群体育性分离的比较比较图。图中，MA代表一对复等位基因控制模式，UD两对基因互作模式。

具体实施方式

实施例1：甘蓝型油菜显性核不育材料遗传特性分析

本发明所用材料之一(即用于甘蓝型油菜不育系提取基因组DNA材料之一即亲本4185A来自于周永明报道的甘蓝型油菜显性核不育材料纯合两型系GMS3(参见周永明，甘蓝型油菜轮回选择研究，作物学报，1993，1(19)：70-75)，该系内植株呈可育株与不育株为1∶1分离(由于甘蓝型油菜纯合的核不育材料是无法收获种子的，每代需通过系内兄妹交保持不育系，换言之就是保存该纯合两型系GMS3，每年通过一个常用的前述的杂交和简单的选择方法就可以得到用于制备基因组DNA的不育株(参见周永明，甘蓝型油菜轮回选择研究，作物学报，1993，1(19)：70-75)，该方法为本领域用于保存甘蓝型油菜显性核不育材料的常用方法和常识性知识，只要得到该甘蓝型油菜显性核不育材料纯合两型系GMS3的种子就可以利用上述报道的方法得到上述的甘蓝型油菜不育系材料即本发明所述的亲本4185A，为便于叙述该4185A是申请人自己编号命名的，以便于区分其他育种材料，下同)。本发明利用甘蓝型油菜显性核不育纯合两型系GMS3种植后第一代分离的不育株(编号为4185A，获得该甘蓝型油菜显性核不育第一代分离的不育株的方法为本领域获公知方法和常识性知识)，甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2(该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC-P200907)以及甘蓝型油菜显性核不育临保系4187(其为育性正常的油菜品种华油8号，见周永明，甘蓝型油菜轮回选择研究，作物学报，1993，1(19)：70-75)进行甘蓝型油菜显性核不育遗传特性分析和基因组DNA的提取。

1、甘蓝型油菜不育性表型的鉴定

鉴于甘蓝型油菜显性核不育系雄蕊退化明显，花丝不能伸长，花药萎缩干瘪，无花粉，本发明采用定期肉眼观察甘蓝型油菜显性核不育系育性来判断分离群体中单株的育性情况。具体作法是：当甘蓝型油菜显性核不育系植株的主枝上有10～15朵花开放时，开始观察花朵中雄蕊是否退化，花丝是否伸长，每隔7d记录一次，共记录3次，依3次观察到情况对甘蓝型油菜植株的育性做出判断。

2、甘蓝型油菜显性核不育材料遗传模式和遗传特性分析

如上所述，甘蓝型油菜显性核不育性的遗传控制主要有两对基因互作控制模式和复等位基因互作控制模式。为便于描述，本发明中将两对基因互作控制模式简写为UD模式，将复等位基因互作控制模式简写为MA模式。为确认本发明所用材料的遗传模式，发明人首先利用甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2进行不育位点基因型的鉴定。

本发明中甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2与临保系4187杂交F₂群体的育性表现见表1。如果4185B-2的基因型是MsMsRfRf，与临保系4187(msmsrfrf)杂交F₂群体会有13F∶3S的育性分离(见附图7(I))。如果恢复系的基因型是MsmsRfRf，其与临保系杂交种自交后代有一半出现13F∶3S的育性分离。如果恢复系中不携带不育基因，那么其与临保系杂交F₂群体表现为全可育，其基因型可能是msRf(MA模式)或msmsRfrf(UD模式)。

本发明中13个F₂群体育性观察结果显示全部群体表现可育(见表1)，说明恢复系4185B-2中不携带不育基因，其可能的基因型为msRf(MA模式)或msmsRfrf(UD模式)。

表1甘蓝型油菜显性核不育系4185B-2与临保系4187杂交F₂代育性分离情况

注：df＝1；χ² _0.05＝3.84，χ² _0.01＝6.63；下同；

为进一步验证上述观察得出的结论，同时采用恢复系与临保系杂交F₁与临保系4187回交判别恢复系4185B-2是否携带不育基因。对于复等位基因遗传模式，测交后代中所有可育单株的基因型只有一种即msRf，与临保系4187回交后代同自交后代一样无育性分离；而对于两对显性基因遗传模式，在已经确定恢复基因位点为纯合的情况下，F₁与临保系4187测交后代中的可育株存在2种基因型：MsmsRfrf和msmsRfrf，对可育株与临保系回交，理论上有所有(恢复系带纯合不育基因)或1/2单株(恢复系带杂合不育基因)回交群体有育性分离(见附图7(II))。本发明的恢复系与临保系测交回交结果见表2，其结果也表现为全可育，再次表明恢复系4185B-2中不携带不育基因。

表2甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2与临保系4187回交后代育性分离情况

注：08 SF 1505-1506为4187自交种，下同

在确定了恢复系4185B-2的基因型后，进一步对本发明中所有甘蓝型油菜显性核不育材料的遗传控制进行了分析。如附图8所示，不育系与恢复系杂交F₂的育性分离，在复等位基因的模式下，可育∶不育是3∶1分离；而在两对基因互作模式下则是13∶3和3∶1分离。

本实施例中，在同一F₁单株的后代的3个F₂群体中，在0.05水平下进行适合性(x²)测验，全部接受3∶1分离，两个接受13∶3分离，如果将三个相同来源的F₂群体作为一个整体分析，在0.05水平下仅接受3∶1分离而拒绝13∶3分离(表3)。

表3甘蓝型油菜显性核不育系4185A与恢复系4185B-2杂交F2代育性分离情况

表4甘蓝型油菜显性核不育系与恢复系杂交F₁(4185A×4185B-2)与临保系4187测交后代育性分离

在确定恢复系4185B-2中不携带不育基因的前提下，根据宋来强等(宋来强等，一对复等位基因控制的油菜(Brassica napus L.)显性核不育系609AB的遗传验证.作物学报，2005，7(31)：869-875))提出的利用不育系与恢复系杂交F₁代与临保系测交的方法，可采用如附图9所示方法根据测交当代的分离比确定两种遗传模式。

将不育系4185A与恢复系4185B-2杂交的F₁与临保系测交，将后代育性分离情况进行χ²测验，在0.05水平下进行，全部接受1∶1分离，两个接受3∶1分离，如果将三个相同来源的测交群体作为一个整体分析，在0.05和0.01水平下仅接受1∶1分离而拒绝3∶1分离(见表4)。因此，申请人认定本发明中所有甘蓝型油菜显性核不育材料的遗传符合一对复等位基因控制模式，其具有如下遗传特征：Ms为显性雄性不育基因，Rf为Ms的等位显性抑制位点，ms为正常可育位点，抑制基因(Rf)均与不育基因(Ms)等位，并且具有Rf＞Ms＞ms的显性遗传效应。

为了便于本发明的描述，分别将甘蓝型油菜显性核不育材料不育表型的显性遗传位点命名为Ms，基因型为MsMs；将甘蓝型油菜显性核不育材料不育表型的恢复基因遗传位点命名为Rf，基因型为RfRf；将甘蓝型油菜显性核不育材料不育表型的隐性遗传位点命名为ms，基因型为msms。根据该命名，将甘蓝型油菜显性核不育材料不育系4185A、恢复系4185B-2和临保系4187的基因型分别为MsMs、RfRf、msms。

4、构建甘蓝型油菜不育系分离群体及分离群体的育性调查

以甘蓝型油菜显性核不育材料纯合两型系GMS3种植后第一代分离的不育株4185A为母本，以甘蓝型油菜显性核恢复系4185B-2为父本进行杂交，得到F₁种子。

将上述步骤得到的F₁种子在自然条件下播种(本领域的常识)，得到F₁植株。在F₁植株上套袋自交得到(4185A×4185B-2)F₂种子，同时取F₁植株的花粉分别与上述步骤所述的甘蓝型油菜的母本4185A以及临保系4187杂交，获得1份BC₁种子和1份测交种子。将获得的3份种子(其中包括1份BC₁种子、1份F₂种子和1份测交种子)，在自然条件下种植，得到3个分离群体。共获得(4185A×4185B-2)F₂群体690个单株，4185A×(4185A×4185B-2)群体148个单株，(4185A×4185B-2)×4187群体198个单株。

调查上述步骤中得到的3个甘蓝型油菜分离群体的育性表型，其育性分离结果见表5所示。对甘蓝型油菜育性分离数据进行适合性(x²)测验(参见：南京农业大学主编，田间试验和统计方法，中国农业出版社，1985，第二版)。表5是本发明中3个甘蓝型油菜育性分离群体的育性分离结果。其中，(4185A×4185B-2)F₂群体共获得690个单株，包括519个可育单株和171个不育单株，可育与不育的比值符合3∶1的分离比例。4185A×(4185A×4185B-2)群体中，全部148个单株中可育、不育的单株分别为71、77，可育与不育的比值符合1∶1的分离比例。(4185A×4185B-2)×4187群体有198个单株，包括102可育单株和96个不育单株，可育与不育的比值符合1∶1的分离比例。

表5本发明中3个甘蓝型油菜育性分离群体的育性分离

分离群体	总株数	可育	不育	期望比值	x2	P值
							(4185A×4185B-2)F2	690	519	171	3∶1	0.008	0.90-0.95
4185A×(4185A×4185B-2)	148	71	77	1∶1	0.169	0.65-0.70
							(4185A×4185B-2)×4187	198	102	96	1∶1	0.126	0.70-0.75

实施例2：甘蓝型油菜显性核不育恢复系共显性SCAR标记开发

1、提取甘蓝型油菜基因组DNA

从上述实施例1获得的三个分离群体以及双亲(即上述步骤所述的甘蓝型油菜显性核不育系4185A及甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2和F₁(4185A×4185B-2)的鲜嫩叶片中提取基因组DNA，具体制备方法参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)报道的方法进行，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA样品的质量，并用紫外分光光度计(型号：Pharmacia Biotech，GeneQuant II)检测DNA样品浓度。

2、利用引物对YQ-Rf1、YQ-Rf2扩增分析双亲和F₁的基因组DNA

利用本申请人设计的引物对YQ-Rf1、YQ-Rf2(引物序列见表6所示)来扩增分析甘蓝型油菜显性核不育系4185A、甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2和F₁的基因组DNA。

PCR反应体系如下：1×PCR buffer，1.35mM MgCl₂，0.08mM dNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶(四者均购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，100ng DNA，正、反向引物各0.45μM，ddH₂O补充至终体积20μl。热循环参数为：94℃3min；94℃30sec，复性温度58℃30sec，72℃60sec，28个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存，反应是在PTC-ALD1244PCR仪上完成。两个材料均进行两次重复。扩增产物在水平电泳槽上1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用1×TAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH 8.0)，电压8V/cm，电泳30min。电泳完毕，凝胶成像系统(UVP)拍照保存。

本发明中引物对YQ-Rf1在双亲和F1的基因组DNA中扩增产物均为1000bp左右的单一亮带，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测片段长度无差异；引物对YQ-Rf2在双亲和F₁的基因组DNA中扩增产物均为2000bp左右的单一亮带，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测片段长度无差异(见附图1)。

表6本发明设计的引物对的编号及其核苷酸序列

3、回收、克隆、测序引物YQ-Rf1、YQ-Rf2在双亲中扩增的DNA片段

回收上述步骤中获得的引物对YQ-Rf1、YQ-Rf2在甘蓝型油菜显性核不育系4185A和甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2中扩增的DNA片段。操作程序按GenClean柱式DNA胶回收试剂盒(购自上海捷瑞生物工程公司)并按照试剂盒提供的说明书介绍的方法操作，具体是：用刀片从1.2％的琼脂糖胶上挖出扩增的DNA片段，放入1.5ml的离心管，按每100mg琼脂糖凝胶加入300μl Binding Solution B，置于55℃水浴中加热10min，每隔2min混匀一次；将融化的胶溶液转移至套在收集管内的GenClean Column中，室温放置2min，3,000rpm离心30sec；倒掉收集管中的废液，加入500μl Wash Solution，8,000rpm室温离心30sec，此步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将GenClean Column放入同一个收集管中，10,000rpm离心1min；将GenClean Column放入一根新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加30ul Elution Buffer，室温放置2min；10,000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

取上述回收的目标DNA片段2μl作模板，用引物YQ-Rf1按照上述步骤进行PCR扩增，在1.0％的琼脂糖胶检测扩增的DNA片段。如果扩增的DNA片段长度与上述步骤中扩增的结果不相同，需要重新扩增回收；如果扩增的DNA片段长度与上述步骤中扩增的结果相同，说明回收得到的DNA片段即是目标DNA片段，可用于下一步的T-A克隆。

将回收的目标DNA片段连接在pMDT-18载体上(该载体购自TaKaRa公司，即宝生物工程(大连)有限公司代理)。操作程序按该试剂盒说明书介绍的方法：试剂在使用前先短暂离心将其收集在管底部；在0.5ml的离心管中进行连接反应，连接反应体系为DNA 2.0μl，pMDT-18载体0.5μl和Solution I 2.5μl。用移液管来回吸几次混匀，置4℃冰箱进行过夜连接反应；准备LB液体培养基和LB固体培养基(含100mg/ml氨苄青霉素，24mg/ml的异丙基-硫代β-D-半乳糖苷和20mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)；从-70℃冰箱中取出感受态细胞放在冰上待它慢慢解冻(约5min)；离心收集连接反应液，取2μl反应液加入到一个已经灭菌的1.5ml离心管(放在冰上预冷)；用手指轻弹装有感受态细胞的管底以混匀，取50μl感受态细胞加入装有2μl连接反应液的1.5ml离心管，用手指轻弹混匀，放在冰上20min；在42℃水浴中热激90sec(勿摇动)，然后在冰上放置5min；加500μl的LB液体培养基后在37℃振荡培养1h(150rmp/min)；吸取振荡培养后的转化液200μl涂在无菌的LB固体培养基上，在37℃放置16-20h；进行蓝、白斑筛选，挑选24个阳性克隆进行编号，并在无菌的液体LB培养基(含50ug/ml的氨苄青霉素)振荡培养16-20h；取振荡培养后的菌液2μl作PCR模板，用M13作引物(正向引物：5′-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3′；反向引物：5′-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3′)扩增，PCR反应如上述步骤所述。扩增结果在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。如果所得的DNA片段比目标DNA片段大200bp左右，说明转化成功，选5份转化成功的菌液各吸取100μl送华大基因科技股份有限公司进行序列测定。剩余400μl浑浊菌液加400μl 50％无菌的甘油在2ml无菌的离心管中于-70℃编号保存。

本发明中，引物对YQ-Rf1、YQ-Rf2在甘蓝型油菜显性核不育系4185A和甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2中扩增的DNA片段各5次重复测序，其中序列结果一致。引物YQ-Rf1在甘蓝型油菜显性核不育系4185A、甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2中的扩增DNA片段长分别为975bp、979bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；引物对YQ-Rf2在甘蓝型油菜显性核不育系4185A、甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2中的扩增DNA片段长分别为1940bp、1948bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示

4、制备甘蓝型油菜中与显性核不育恢复基因连锁的SCAR标记

对上述步骤得到的引物对YQ-Rf1、YQ-Rf2在甘蓝型油菜显性核不育系4185A和甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2中扩增的片段序列用EBI Tools ClustalW软件(http://www.ebi.ac.uk/)在线分析进行序列比对。比对结果显示，SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1相比，除部分单碱基差异外，学列表SEQ ID NO：2在63-64bp处有一个15bp的插入突变，插入碱基是CGAAGAAGAAGAAGA；在第199-208bp处有一个10bp的缺失突变，缺失碱基是AGAGTTCCTT(见附图2)。序列表SEQ ID NO：4与SEQ ID NO：3相比，其最大的差异部分在于SEQ ID NO：4在第在1688-1689bp处有一个26bp的插入突变，插入碱基是GTCTATTAGATTTTATTTGTGACATT；除此处外，在其他区域还存在若干2-6bp的插入或缺失突变(见附图3)。

根据引物对YQ-Rf1、YQ-Rf2在甘蓝型油菜显性核不育系4185A和甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2中扩增DNA片段的核苷酸序列(如序列表SEQ ID NO：1-4所示)，利用Primer Premier 5.0软件(http://www.PremierBiosoft.com)，在序列SEQ ID NO：1中的第188-206bp之间的位置设计一条正向引物。设计时要求引物长度为17～22bp，复性温度50～62℃，GC含量为40～50％。筛选得到一对目标引物，将其命名为YQ-Rfa(序列见表6中引物对YQ-Rfa，正向引物位置见图2中下划线所示)，预期在4185A的基因组DNA中扩增出441bp的片段，而在甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2的基因组DNA中无任何扩增产物；按照相同的方法，在序列SEQ ID NO：4中的第1684-1704bp之间的位置设计一条反向引物。按上述要求筛选得到一对目标引物(序列见表6中引物对YQ-Rfb，反向引物位置见附图3中下划线所示)，预期在甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2的基因组DNA中扩增出1100bp的片段，而在甘蓝型油菜4185A的基因组DNA中无任何扩增产物。

本发明利用上述步骤设计的引物对进行PCR，PCR反应体系同上所述，复性温度均为52℃。扩增结果在1.2％的琼脂糖胶上检测。其中引物YQ-Rfa组合在甘蓝型油菜显性核不育系4185A和F₁的基因组DNA中扩增出441bp的目标片段，而在甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2无任何扩增产物，引物对YQ-Rfb组合在甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2和F₁的基因组DNA中扩增出1100bp的目标片段，而在甘蓝型油菜显性核不育系4185A无任何扩增产物(见附图4)，因此该扩增片段可作为甘蓝型油菜显性核不育恢复系的显性SCAR分子标记，

因引物对YQ-Rfb组合在作为显性核不育恢复系选择的时候无法区分其是否携带纯合或杂合的恢复基因，这就要求其与引物对YQ-Rfa共同使用，为简化检测程序，本发明利用上述步骤设计的引物组合进行多重PCR，具体操作步骤如下：在同一PCR反应体系中，以100ng DNA为模板，1×PCR buffer，1.35mmol/LMgCl₂，0.08mmol/L dNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶(四者均购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，SCAR引物YQ-Rfa、YQ-Rfb正反向引物各0.40μmol/L，ddH₂O补充至终体积20μl。热循环参数为：94℃3min；94℃30s，52℃1min，72℃90s，35个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存。扩增结果在1.2％的琼脂糖胶上检测。其中引物对YQ-Rfa、YQ-Rfb组合在甘蓝型油菜显性核不育系4185A和F₁的基因组DNA中扩增出441bp的目标片段，而在甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2和F₁的基因组DNA中扩增出1100bp的目标片段(见附图5)，在不同来源的6个甘蓝型油菜显性核不育系4185A的恢复系中均出现与甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2一致的1100bp的目标片段(附图5中1-6)，而在纯合型不育系(附图5中7-9)和杂合型不育系(附图5中10-12)以及不同来源的临保系(附图5中13-18)扩增产物均与4185A一致，因此该扩增片段可作为甘蓝型油菜显性核不育恢复系的共显性SCAR分子标记，可作为筛选携带显性核不育纯合恢复基因甘蓝型油菜(即恢复系)的共显性分子标记。

实施例3：共显性SCAR标记的应用效果验证

将上述步骤中获得的甘蓝型油菜显性核不育恢复系的共显性SCAR标记分析本发明中的三个分离群体，分析结果见表7。在(4185A×4185B-2)F₂群体中，所有171个不育单株与亲本不育系4185A一样仅有441bp扩增片段。在4185A×(4185A×4185B-2)回交群体中，71个可育单株出现与4185B-2一样的DNA片段，而77个不育单株出现与4185A一样DNA片段。在(4185A×4185B-2)×4187群体中，102个可育单株出现与4185B-2一样的DNA片段单株100个，另外两个单株与4185A一样DNA片段，而96个不育单株出现与4185A一样的DNA片段。这些数据说明该标记是与甘蓝型油菜显性核不育恢复系高度紧密连锁的。

表7本发明的共显性SCAR标记在三个甘蓝型油菜显性核不育系分离群体中的分析

说明：表7中的“A、B、AB”分别表示具有与4185A、4185B-2、(4185A×4185B-2)F₁一样的扩增片段的单株，“-”表示未进行试验，下同。

本发明的基本出发点是用于简便、快速筛选和鉴定甘蓝型油菜显性核不育恢复系，为检测本发明中标记的选择效率。申请人选取了33份不同来源的材料进行分析，并以甘蓝型油菜显性核不育系4185A为母本，被检测的33份材料作父本进行杂交，通过测交F₁代育性表现检测来确认这些材料中是否携带纯合或杂合的恢复基因，其分析结果见表8。如表8所示，在被检测与甘蓝型油菜显性核不育恢复系4185B-2带型一致(即“B带型”)的17份材料中，其中14份材料100％恢复4185A的育性，另外3份出现1-2个单株仍表现为不育，其产生可能的原因是机械混杂或假杂种。在被检测与甘蓝型油菜显性核不育系4185A带型一致(即“A带型”)的5份材料中，其中3份材料表现为100％保持4185A育性，说明其不携带恢复基因，另外两份材料分别出现3/45、16/41的可育株，对于3/45的可育株产生可能的原因是机械混杂或假杂种，但对于16/41的可育株，其原因很可能是本发明中所使用的甘蓝型油菜不育系4185A存在其他来源的恢复基因，该类恢复基因不能使用本发明所获标记检测出。在被检测与甘蓝型油菜显性核不育不育系与恢复系F₁带型一致(即“AB带型”)的9份材料中，其测交后代育性全部接受不育比可育1∶1分离，说明上述14份材料中携带杂合恢复基因。综上所述，本发明所获得标记在不考虑机械混杂或假杂种等情况下，对于甘蓝型油菜显性核不育恢复系的选择效率可以达到97％以上，这将大大简化和加快甘蓝型油菜显性核不育恢复系的选育效率。

表8本发明的共显性SCAR标记在33个甘蓝型油菜油菜中分析及选择结果

序列表

<110>华中农业大学

<120>甘蓝型油菜显性核不育恢复系的分子标记及制备方法与应用

<130>

<141>2009-11-08

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>975

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(975)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(959)..(975)

<223>

<220>

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<222>(611)..(628)

<223>

<220>

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<222>(188)..(206)

<223>

<220>

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<222>(1)..(22)

<223>

<400>1

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tcgcattagg tccca                                                     975

<210>2

<211>979

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(979)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(64)..(78)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(213)..(214)

<223>

<220>

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<222>(963)..(979)

<223>

<220>

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<222>(1)..(22)

<223>

<400>2

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ggtgagttta gagcagagta gactttgatg ttgagttatg aatcatggaa actgacaatt    960

tggttcgcat taggtccca                    979

<210>3

<211>1940

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1940)

<223>

<220>

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<222>(1918)..(1940)

<223>

<220>

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<222>(1)..(19)

<223>

<400>3

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<210>4

<211>1948

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(18)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(1676)..(1701)

<223>

<220>

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<222>(1926)..(1948)

<223>

<220>

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<222>(1684)..(1704)

<223>

<220>

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<222>(605)..(622)

<223>

<220>

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<222>(1)..(18)

<223>

<400>4

tcaagcaagt ttggagggcg gtttgtcaag ggaactccac tcccagagca tccacacaat    60

cgaggtgcct gttcaataca ataaaagatc attcacataa tgaatggcaa cgcaacctac    120

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gcaaagaagg ccacggttga gagattggcg atggtcatgg tatggtagaa gaggtattca    240

gtcagaaaat ggcctaaggc gtagataaat gagagaaagg tagccaagta taacggtttg    300

ttttcggggt tgaatgcaca aagaaagcag agagtgcagg tcaatagtgt ccatactccg    360

aatgttcgtc catgaacttc actcactgca acacagttaa aacagaagaa agaacatcct    420

gagtagtgag gagggtacta taattgcaat aaaccaaaag gagccatcac tagaaaccta    480

aagttagaca gacacctcaa gttcaactat atctagataa tctttttttt ttgtttccta    540

ttcacaaatt gttcatatga tgcaaagttg ctactacttt tgttatcaaa atcaatgaac    600

taaacacttc ggtgacctta caatcacagg aaaaacaaaa caatgttcca taatacttcc    660

tttgtcgaaa tcaagcacca caaactacga tgaaaaaaca gaaaaaaaac atcaagttgc    720

ttctgttcta atacatctac atcatctgat acacttcacc tggtcattga cttacttcaa    780

cagtattgta tcaacaagaa aagaggttat gcattggact ctgtaaactg taaccaattc    840

tagatccaaa tactttcccc cttcctaaaa tctagcgaat ggtggtccac ttcctaaaag    900

tagttccttc acaatgaatt gtataagaat tactaagatt gcatatcttt cttggatgtg    960

tgcttcggtc tgctgctcta tgtactagct agtctctttc tctacatatc atgtatgtat    1020

catgacagga tcactgagaa atgtcgacag aaacaaacat tgtcctcaag gaaagtaact    1080

gcctaggttg aacttaggga ggatcatgcc caatagcccg tcatgtgact tgttaatacg    1140

agcgattaag aagcttcaaa aatacctaaa tattcacatc atcataactt atagaaactt    1200

tgaacaacta actacttggg gacacaaacc aaagataatt tgtaaattaa taatctcaaa    1260

ttgcaagaaa gactaatctt ggagagataa acaaaaaaaa gccataatga tcaagaaaaa    1320

aaaaatacca actagctcaa ctttgcaatt aaaggaacat taagaaccaa aaaaattaag    1380

caactagaaa gagcatggat atgttcaaag aatccacaaa accattggca ttacagattc    1440

aatggactag caaaaaatca atatcaaatc cagaaagccc catgttctac atctcatagt    1500

gcttagggat cccaaattgg atccataact caatgaagtc acggaaaact aagaacctag    1560

ttcctctaaa cgtagcatta tcttttacac aaaacacagt acatgccact gaccaatgta    1620

tgaccagaat ctcagagact aaggaagtca attggataga ataaatctat caagtgtcta    1680

ttagatttta tttgtgacat taacaacgga agtaacgaaa ttttaagcac cagttaatag    1740

aacaattgta aaatggatat taaaaaaaaa ggagggagga gaagaacaga actggtggtc    1800

tgagagaaga cggcgagacg aagagcccaa atgttgaaga aaccaaacca aaccgaagct    1860

agtctcagtg accctaccac cattagccaa taccctaacg ccttcatctt cctcctagtt    1920

tgcttcgtta ctttgtgatt tgttcttc                                       1948

<210>5

<211>441

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(441)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(424)..(441)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(29)

<223>

<400>5

aaggtttctt tagagttcct tttgttgtgt gtgtttggtt gtattcgatt tgaagctgtt    60

tcttgataat gttttgtgtg tgcagtgctc agaactggag atttgctgct aagcagatgc    120

ttaagaagta tcctcaggat ctcatcgttc actgtgagtc cttttctctc tccatgattg    180

atggaaatga tctttgaagg aagaaagaac cacactttag attcttagag cttcagttct    240

tgtttctctc agatctttac tgaagatcca actctagatc ttgttaccat aatgagtatt    300

gagatttgga gagaatggtt tgtgatgatt tggaaccctt ttgcaggaag tagacggaac    360

cattctacac agacgtttga tggagttgat gttatgggtc aaagattagc agaagaggta    420

tgactaggac ctgctttttt t                                              441

<210>6

<211>1100

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1100)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1080)..(1100)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(18)

<223>

<400>6

cacttcggtg accttacaat cacaggaaaa acaaaacaat gttccataat acttcctttg    60

tcgaaatcaa gcaccacaaa ctacgatgaa aaaacagaaa aaaaacatca agttgcttct    120

gttctaatac atctacatca tctgatacac ttcacctggt cattgactta cttcaacagt    180

attgtatcaa caagaaaaga ggttatgcat tggactctgt aaactgtaac caattctaga    240

tccaaatact ttcccccttc ctaaaatcta gcgaatggtg gtccacttcc taaaagtagt    300

tccttcacaa tgaattgtat aagaattact aagattgcat atctttcttg gatgtgtgct    360

tcggtctgct gctctatgta ctagctagtc tctttctcta catatcatgt atgtatcatg    420

acaggatcac tgagaaatgt cgacagaaac aaacattgtc ctcaaggaaa gtaactgcct    480

aggttgaact tagggaggat catgcccaat agcccgtcat gtgacttgtt aatacgagcg    540

attaagaagc ttcaaaaata cctaaatatt cacatcatca taacttatag aaactttgaa    600

caactaacta cttggggaca caaaccaaag ataatttgta aattaataat ctcaaattgc    660

aagaaagact aatcttggag agataaacaa aaaaaagcca taatgatcaa gaaaaaaaaa    720

ataccaacta gctcaacttt gcaattaaag gaacattaag aaccaaaaaa attaagcaac    780

tagaaagagc atggatatgt tcaaagaatc cacaaaacca ttggcattac agattcaatg    840

gactagcaaa aaatcaatat caaatccaga aagccccatg ttctacatct catagtgctt    900

agggatccca aattggatcc ataactcaat gaagtcacgg aaaactaaga acctagttcc    960

tctaaacgta gcattatctt ttacacaaaa cacagtacat gccactgacc aatgtatgac    1020

cagaatctca gagactaagg aagtcaattg gatagaataa atctatcaag tgtctattag    1080

attttatttg tgacattaac                                                1100

Claims (4)

1.一种甘蓝型油菜显性核不育恢复系的SCAR分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示，如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列组合使用作为甘蓝型油菜显性核不育恢复系的SCAR分子标记。

2.扩增甘蓝型油菜显性核不育恢复系SCAR分子标记的引物对YQ-Rfa和YQ-Rfb，引物对YQ-Rfa和YQ-Rfb组合使用扩增甘蓝型油菜显性核不育恢复系SCAR分子标记，它的核苷酸序列如下所示：

引物对(1)YQ-Rfa：

正向引物5′-AAGGTTTCTTTAGAGTTCC-3′，

反向引物5′AAAAAAAGCAGGTCCTAG-3′；

引物对(2)YQ-Rfb：

正向引物5′-CACTTCGGTGACCTTACA-3′，

反向引物5′-GTTAATGTCACAAATAAAATC-3′。

3.如权利要求1所述的序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列组合使用作为甘蓝型油菜显性核不育恢复系的SCAR分子标记在甘蓝型油菜显性核不育恢复系辅助选择中的应用。

4.如权利要求2所述的引物对YQ-Rfa和YQ-Rfb组合使用在甘蓝型油菜显性核不育恢复系辅助选择中的应用。

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