CN112259164B - 一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性indel分子标记的开发方法 - Google Patents

一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性indel分子标记的开发方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112259164B
CN112259164B CN202011172345.7A CN202011172345A CN112259164B CN 112259164 B CN112259164 B CN 112259164B CN 202011172345 A CN202011172345 A CN 202011172345A CN 112259164 B CN112259164 B CN 112259164B
Authority
CN
China
Prior art keywords
competitive
radish
molecular marker
ogu
cms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN202011172345.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112259164A (zh
Inventor
李宝
李莓
王同华
郭一鸣
刘新红
张瑶婷
周兴
曲亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HUNAN INSTITUTE OF CROPS
Original Assignee
HUNAN INSTITUTE OF CROPS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HUNAN INSTITUTE OF CROPS filed Critical HUNAN INSTITUTE OF CROPS
Priority to CN202011172345.7A priority Critical patent/CN112259164B/zh
Publication of CN112259164A publication Critical patent/CN112259164A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112259164B publication Critical patent/CN112259164B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，以包含Rfo基因的Scalfold 131序列为目标模板，与甘蓝型油菜参考基因组进行比对，获取存在插入/缺失的同源序列，并将甘蓝型油菜序列在白菜、甘蓝和多个甘蓝型油菜基因组中进行比对，获取在这些物种中高度保守的同源序列。在这些序列插入/缺失两侧高度保守的区域设计特异引物，将这些特异引物在Ogu‑CMS恢复系与不育系和常规甘蓝型油菜中进行筛选，并通过Ogu‑CMS恢复基因分离群体进行验证，最终获得萝卜质恢复系特异竞争性INDEL标记。本发明的分子标记CIN6为竞争性INDEL标记，可有效的降低PCR假阳性和假阴性。

Description

一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记 的开发方法
技术领域
本发明涉及分子生物学及油菜育种技术领域，具体涉及一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法。
背景技术
萝卜质雄性不育（Ogura CMS，Ogu-CMS）最初在萝卜（Raphanus sativus）中发现，因不育性稳定，以其为不育系统生产的杂交种具有较高的纯度(Ogura 1968) (Yu et al2016b)。近年来，萝卜质雄性不育系统在芸薹属作物中得到广泛应用(Yu et al 2016b)。但在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜等芸薹属作物中不存在萝卜质不育系的恢复源，因此恢复系选育成为萝卜质不育系统在芸薹属作物中利用的重点。研究人员通过种间杂交、细胞融合和回交等手段，将萝卜中的恢复基因（Rfo）相继导入到甘蓝型油菜、甘蓝和白菜，而分子标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）为恢复基因的转育提供了快速、准确和高效的工具(Heyn 1976; Heath et al 1994; Kirti et al 1995; Primard-Brisset et al2005; 陈卫江 et al 2013; Yu et al 2016a; Yu et al 2016b; Wei et al 2019)。
然而，由于甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中的恢复基因都为外源导入，现有开发分子标记技术完全基于萝卜导入片段设计，检测过程中仅扩增萝卜外源导入片段，因缺乏竞争模板，当PCR反应体系中存在微量污染时，容易出现假阳性(Yu et al 2016; 杨其东 et al2016)。同时在大规模样品PCR检测过程中，样品的反应条件难以达到一致，样品之间也存在交叉感染污染问题，假阳性和假阴性问题难以避免，从而导致检测结果出现偏差(夏志辉et al 2009)。竞争性 PCR 是目前公认较好的消除PCR假阳性和假阴性方法之一：在PCR反应体系中，竞争模板和目标模板竞争同一引物，且两种模板的PCR产物大小具有差异，可通过电泳进行区分。理论上每个PCR反应中都存在竞争模板，因此没有任何扩增产物的为PCR假阴性。此外，当PCR反应体系中存在微量污染时，因竞争模板的总量是目标模板污染量的上千倍，微量的污染不会被检测到，从而有效的降低PCR假阳性(Mariasegaram et al2006; 夏志辉 et al 2009)。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，以解决目前因PCR假阳性和假阴性而导致分子标记辅助选择和OGUCMS系统杂交种纯度鉴定结果偏差等问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，以包含Rfo基因的Scalfold 131序列(GenBank Accession AJ550021)为目标模板(Brown et al2003)，与甘蓝型油菜参考基因组进行比对，获取存在插入/缺失的同源序列，在这些序列插入/缺失的两侧的高度保守区域设计特异引物，将这些特异引物在Ogu-CMS恢复系与不育系和常规甘蓝型油菜中进行筛选，并通过Ogu-CMS恢复基因分离群体进行验证，最终获得与萝卜质恢复基因共分离的竞争性INDEL标记；具体包括如下步骤：
S1、根据已公布的萝卜参考基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），提取包含Rfo基因(Brown et al 2003)的Scalfold 131序列(GenBank Accession AJ550021)；
S2、将包含Rfo基因的127 Kb序列与甘蓝型油菜Darmor-bzh参考基因组（http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）进行比对，共获得12个存在插入/缺失差异，且两侧序列保守的位点；
S3、将上述位点的序列在白菜、甘蓝以及多个甘蓝型油菜基因组中进行比对（http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus/），获得8个在这些基因组中高度保守的位点，并在这些位点开发特异引物，共设计12对特异引物；
S4、利用12对特异引物在多个OGU CMS恢复系、OGU CMS不育系以及正常甘蓝型油菜中扩增，实现多态性竞争性INDEL分子标记的筛选，筛选标准为：1）所有恢复系中带型一致；2）所有不育系和常规甘蓝型油菜材料带型一致；3）在恢复系和不育系之间存在多态性；4）恢复系的扩增产物包括萝卜导入片段（目标模板）扩增产物和甘蓝型油菜本底序列（竞争模板）扩增产物，而不育系和恢复系中有且仅有竞争模板扩增产物；5）目标模板扩增产物于竞争模板扩增产物之间差异大于5bp，方便采用琼脂糖凝胶电泳进行区分；结果显示：其中，一对引物CIN6具有多态性，在6个恢复系中CIN6扩增产物具有两条带，分别对应萝卜导入片段（目标模板扩增产物）和甘蓝型油菜本底序列扩增片段（竞争模板扩增产物），而在不育系和常规甘蓝型油菜材料中仅有竞争模板扩增产物；
S5、通过Ogu-CMS恢复基因分离群体实现多态性竞争性INDEL分子标记的验证；具体的，将CIN6在OGU CMS育性分离的F2和BC1群体中进行扩增，结果显示CIN6与F2和BC1F1群体的育性呈现共分离，表明CIN6为与OGU CMS恢复基因紧密连锁的INDEL标记，可用于OGUCMS恢复系选育的分子标记辅助选择。
本发明为外源导入片段检测分子标记设计提供了一个新的方法，同时所得的分子标记CIN6可用于Ogu-CMS恢复系选育分子标记辅助育种以及OGU CMS系统杂交种纯度鉴定。
本发明具有以下有益效果：
1）本发明涉及的分子标记开发方法可为萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记，以及外源导入片段竞争性INDEL分子标记开发提供技术支撑。
2）本发明获得分子标记CIN6为竞争性INDEL标记，可有效的降低PCR假阳性和假阴性。
3）本发明获得分子标记CIN6可用于甘蓝型油菜萝卜质恢复系选育分子标记辅助选择，以及OGU CMS系统杂交种纯度鉴定。
4）本发明标记开发基于的竞争模板序列在甘蓝型油菜中高度保守，因此在不同甘蓝型油菜背景中具有广泛的适用性。
附图说明
图1为CIN6标记序列的比对示意图。
图2为CIN6引物筛选示意图；
图中：a.采用4%的琼脂糖凝胶进行检测；b.采用6%聚丙烯酰胺凝胶进行检测；恢复系为不同背景萝卜质恢复系，不育系为H28A。
图3为CIN6在育性分离群体种验证结果示意图。
图4为CIN6在Ogu-CMS系统在杂交种纯度鉴定中的应用结果示意图：
图中：a.田间取样鉴定结果。b.室内播种取样鉴定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记设计
1.1根据已公布的萝卜参考基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），提取包含Rfo基因(Brown et al 2003)的Scalfold 131序列(GenBank Accession AJ550021)，序列共长127Kb，以该序列作为目标模板。
1.2将上述127Kb序列在甘蓝型油菜Darmor-bzh参考基因组（http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）进行比对。从中筛选目标序列，筛选的标准为：1）萝卜序列和甘蓝型油菜序列同源性高于80%；2）萝卜序列和甘蓝型油菜序列存在插入/缺失位点，且插入或缺失大于等于5bp。3）插入/缺失位点上下游100bp序列保守，序列一致性大于90%的序列长度大于20bp。共筛选获得8个符合条件的位点（图1），以这8个位点的甘蓝型油菜序列作为竞争模板。
1.3在上述8个位点两侧序列一致性大于90%的序列长度大于20bp的位置设计引物，引物的设计采用Oligo6软件，设计的标准为：
1）、长度：19-30bp，其有效长度[Ln=2(G+ C)+(A+T)]一般不大于38。
2）、G十C含量：应在40%一60%之间。
3）、碱基分布的随机性：应避免连续出现5个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。
4）、引物自身：不能含有自身互补序列超过3个，否则会形成发夹样二级结构。
5）、引物之间：两个引物之间不应有多于5个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
6）、上下游引物的互补性：一个引物的3’末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。
7）、3’末端：如果可能的话，每个引物的3’末端碱基应为G或C。
共设计8对特异引物（表1，图1）。
表1. 竞争性INDEL分子标记引物序列
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例2
萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记筛选
2.1实施材料
甘蓝型油菜萝卜质不育恢复材料CLR650和CLR095，CLR650由萝-蓝与甘蓝型油菜通过嫁接技术选育而来，其细胞质为萝卜雄性不育细胞质，细胞核含有萝卜细胞质恢复基因Rfo，因此表现为正常可育（见文献：陈卫江, 李莓, 王同华, 惠荣奎, 涂金星, 傅廷栋:甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复材料的创制. Agricultural Science Technology,2013）。Ogu-INRA CMS（叶色低温正常）不育系 H28A，由湖南省作物研究所从欧洲引进材料中转育（见文献：陈卫江, 李莓, 王同华, 惠荣奎, 涂金星, 傅廷栋: 甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复材料的创制. Agricultural Science Technology, 2013）。CLR095为通过CLR650与甘蓝型油菜常规品系20B通过回交和自交获得（见文献：王同华, 陈卫江, 李莓,等. 一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法及在甘蓝型油菜育种上的应用）。其他其它36份常规甘蓝型油菜材料取自湖南省作物研究所育种中间材料（见文献：陈卫江, 李莓, 王同华, 惠荣奎, 涂金星, 傅廷栋: 甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复材料的创制. Agricultural Science Technology, 2013）。萝卜质细胞质雄性不育恢复基因F2和BC1分离群体来源于CLR650和20B（见文献：王同华, 陈卫江, 李莓,等. 一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法及在甘蓝型油菜育种上的应用）。OGU CMS系统杂交组合由CLR095与H28A组配。
2.2多态性竞争性INDEL分子标记筛选
将上述8对特异引物首先在恢复系、不育系和常规甘蓝型油菜材料中进行PCR扩增，扩增体系和程序：1.2μLDNA模板，0.5μL 10mM引物（Reverse+Forward），1.0μL 10×PCRBuffer [含有（NH4）2SO4，0.8μL 25mMMgCl2，0.2μL 10mMdNTPsMix和0.1μL Taq酶（MBIFermentas）（5U/μL）]，6.2μL ddH2O，10μL矿物油覆盖。PCR程序为：94℃变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃20s，共10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃；94℃30s，55℃30s，72℃20s，共29个循环；72℃10min；25℃10min。SSR和IP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶（420g尿素，100ml5×TBE，57g丙烯酰胺，3g甲叉丙烯酰胺，超纯水定容至1L）进行检测，或采用4%的琼脂糖凝胶进行检测。
标记筛选标准为：1）所有恢复系中带型一致；2）所有不育系和常规甘蓝型油菜材料带型一致；3）在恢复系和不育系之间存在多态性；4）恢复系的扩增产物包括萝卜导入片段（目标模板）扩增产物和甘蓝型油菜本底序列（竞争模板）扩增产物，而不育系和恢复系中有且仅有竞争模板扩增产物。5）目标模板扩增产物于竞争模板扩增产物之间差异大于5bp，方便采用琼脂糖凝胶电泳进行区分。从8对引物中筛选到一个标记符合上述要求，命名为Competitive INDEL6（CIN6）（图1），CIN6目标模板扩增产物比竞争模板扩增产物大8bp，可用4%的琼脂糖凝胶（图2a）或6%聚丙烯酰胺凝胶进行检测（图2b）。
实施例3
萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记验证
将上述分子标记在萝卜质细胞质雄性不育恢复基因F2和BC1分离群体中进行验证，PCR程序和体系以及PCR检测方法同2.2上述方法。从F2群体和BC1分离群体中各随机选取22个可育单株和22个不育单株，并将这些单株利用CIN6标记进行分析，利用CLR650和20B分别作为阳性和阴性对照。标记结果显示，CIN6标记基因型与F2和BC1群体育性分离一一对应，说明CIN6与Rfo恢复基因共分离。
实施例4
萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的应用
4.1 OGU CMS系统杂交组合组配
以CLR095作为恢复系，以H28A作为不育系，组配杂交组合，命名为H1。将CLR095与H28A在隔离网室进行种植，自然授粉后收获杂交种。将杂交种分为两份，一份在大田播种，一份室内培养盒进行播种。
4.2纯度鉴定
将一份在田间播种，挂牌取样后，利用CIN6标记对幼苗基因组DNA进行PCR扩增，并将这些单株在花期调查育性，结果显示CIN6标记基因型与单株育性一一对应，纯度为94.8%。另一份在培养盒中播种，在室内取样后提取DNA，利用CIN6进行PCR扩增，结果显示杂交组合H1纯度为94.7%，与田间育性鉴定的结果高度一致，3个供试样品的鉴定结果差异在3%以内，且CIN6可区分PCR过程中假阴性和母本假杂种，提高纯度鉴定的准确性。
CIN6为竞争性INDEL分子标记，在阳性样品中可以扩增得到目标模板扩增产物和竞争模板扩增产物，而在阴性样品仅包含竞争模板扩增产物。其中竞争模板产物既可以用来区分阴性和因PCR问题引起的假阴性，同时在所有检测样品都含有竞争模板，当PCR反应体系中存在微量污染时，因竞争模板的总量是目标模板污染量的上千倍，微量的污染不会被检测到，从而有效的降低PCR假阳性。因此，CIN6作为萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记，可同时有效降低PCR假阳性和PCR假阴性，提高Ogu-CMS恢复系选育分子标记辅助育种和杂交种纯度鉴定的准确性，同时本发明涉及的分子标记开发方法可为外源导入片段竞争性INDEL分子标记开发提供技术支撑。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (3)

1.一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，其特征在于：以包含Rfo基因的Scalfold 131序列为目标模板，与甘蓝型油菜参考基因组进行比对，获取存在插入/缺失的同源序列，在这些序列插入/缺失的两侧的高度保守区域设计特异引物，将这些特异引物在Ogu-CMS恢复系与不育系和常规甘蓝型油菜中进行筛选，并通过Ogu-CMS恢复基因分离群体进行验证，最终获得与萝卜质恢复基因共分离的竞争性INDEL标记；具体包括如下步骤：
S1、根据已公布的萝卜参考基因组，提取包含Rfo基因的Scalfold 131序列；
S2、将包含Rfo基因的127 Kb序列与甘蓝型油菜Darmor-bzh参考基因组进行比对，共获得12个存在插入/缺失差异，且两侧序列保守的位点；
S3、将上述位点的序列在白菜、甘蓝以及多个甘蓝型油菜基因组中进行比对，获得8个在这些基因组中高度保守的位点，并在这些位点开发特异引物，共设计12对特异引物；
S4、利用12对特异引物在多个OGU CMS恢复系、OGU CMS不育系以及正常甘蓝型油菜中扩增，实现多态性竞争性INDEL分子标记的筛选，筛选标准为：1）所有恢复系中带型一致；2）所有不育系和常规甘蓝型油菜材料带型一致；3）在恢复系和不育系之间存在多态性；4）恢复系的扩增产物包括萝卜导入片段扩增产物和甘蓝型油菜本底序列扩增产物，而不育系和恢复系中有且仅有竞争模板扩增产物；5）目标模板扩增产物于竞争模板扩增产物之间差异大于5bp，方便采用琼脂糖凝胶电泳进行区分；结果显示：其中，一对引物CIN6具有多态性，在6个恢复系中CIN6扩增产物具有两条带，分别对应萝卜导入片段和甘蓝型油菜本底序列扩增片段，而在不育系和常规甘蓝型油菜材料中仅有竞争模板扩增产物；
S5、通过Ogu-CMS恢复基因分离群体实现多态性竞争性INDEL分子标记的验证；具体的，将CIN6在OGU CMS育性分离的F2和BC1群体中进行扩增，结果显示CIN6与F2和BC1F1群体的育性呈现共分离，表明CIN6为与OGU CMS恢复基因紧密连锁的INDEL标记，可用于OGU CMS恢复系选育的分子标记辅助选择。
2.如权利要求1所述的一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，其特征在于：所述多态性竞争性INDEL分子标记可用于Ogu-CMS恢复系选育分子标记辅助育种。
3.如权利要求1所述的一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，其特征在于：所述多态性竞争性INDEL分子标记可用于OGU CMS系统杂交种纯度鉴定。
CN202011172345.7A 2020-10-28 2020-10-28 一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性indel分子标记的开发方法 Expired - Fee Related CN112259164B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011172345.7A CN112259164B (zh) 2020-10-28 2020-10-28 一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性indel分子标记的开发方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011172345.7A CN112259164B (zh) 2020-10-28 2020-10-28 一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性indel分子标记的开发方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112259164A CN112259164A (zh) 2021-01-22
CN112259164B true CN112259164B (zh) 2022-07-05

Family

ID=74261115

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011172345.7A Expired - Fee Related CN112259164B (zh) 2020-10-28 2020-10-28 一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性indel分子标记的开发方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112259164B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113355453B (zh) * 2021-08-09 2021-10-29 华智生物技术有限公司 一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101701263A (zh) * 2009-11-25 2010-05-05 华中农业大学 甘蓝型油菜显性核不育恢复系的分子标记及其制备方法与应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1493328A1 (en) * 2003-07-04 2005-01-05 Institut National De La Recherche Agronomique Method of producing double low restorer lines of brassica napus having a good agronomic value
CN101956007B (zh) * 2010-08-30 2012-09-05 南京农业大学 一种利用标记辅助选择进行萝卜cms雄性不育系培育的方法
CN102220316B (zh) * 2011-04-20 2012-10-03 中国农业科学院油料作物研究所 一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法及应用
KR101319265B1 (ko) * 2012-03-21 2013-10-18 농업회사법인 주식회사 농우바이오 세포질 웅성 불임성을 가지는 ｎｗｂ―ｃｍｓ 양채류 식물체 및 이의 용도
KR20160082292A (ko) * 2014-12-30 2016-07-08 가톨릭대학교 산학협력단 무 유전자원 분석을 위한 분자표지 및 이의 용도
CN107347632B (zh) * 2017-08-24 2020-03-24 湖南省作物研究所 一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法及在甘蓝型油菜育种上的应用
CN107541517B (zh) * 2017-08-24 2021-04-06 湖南省作物研究所 一种外源萝卜片段特异标记及其制备方法和应用
CN108642061B (zh) * 2018-05-16 2021-10-08 西南大学 Ogura CMS不育恢复基因RfoB、RfoB植物表达载体及其应用
CN108913800B (zh) * 2018-07-24 2021-12-28 信阳师范学院 一种白菜hau CMS不育胞质特异分子标记及其应用
CN111172156A (zh) * 2018-11-11 2020-05-19 上海市农业科学院 一个甘蓝型油菜显性核不育系的snp分子标记及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101701263A (zh) * 2009-11-25 2010-05-05 华中农业大学 甘蓝型油菜显性核不育恢复系的分子标记及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112259164A (zh) 2021-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yin et al. Physical mapping of the Rf 1 fertility-restoring gene to a 100 kb region in cotton
Maxwell et al. MlAG12: a Triticum timopheevii-derived powdery mildew resistance gene in common wheat on chromosome 7AL
CN111424111B (zh) 一种萝卜根肿病抗性鉴定的方法
Chaintreuil et al. A gene-based map of the Nod factor-independent Aeschynomene evenia sheds new light on the evolution of nodulation and legume genomes
CN110894542A (zh) 一种鉴别水稻gs5基因和glw7基因类型的引物及其应用
CN110747288A (zh) 水稻大粒基因功能标记及应用
CN112259164B (zh) 一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性indel分子标记的开发方法
Rosellini et al. Sexual polyploidization in Medicago sativa L.: Impact on the phenotype, gene transcription, and genome methylation
Fan et al. Molecular marker-directed development of a novel cytoplasmic male sterile line in rice
CN112501335A (zh) 一种鉴定小麦抗旱性的方法及其专用成套试剂
Chen et al. Distribution of new satellites and simple sequence repeats in annual and perennial Glycine species
Shu et al. A dominant gene for male sterility in Salvia miltiorrhiza Bunge
CN104946630B (zh) 黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记及其专用引物和应用
Sun et al. Pectin methylesterase regulates pollen germination on stigma after pollination in water lily
Ahn et al. Microsatellite marker information from high-throughput next-generation sequence data of Capsicum annuum varieties Mandarin and Blackcluster
CN113278723B (zh) 合成芥菜中导入的白菜基因组片段或遗传多样性分析的组合物及应用
CN106148499B (zh) 玉米穗部性状杂种优势主效qtl的分子标记及其应用
US10954555B2 (en) Anthranilate synthase allele fragments for increasing rice yield and uses thereof
KR100764561B1 (ko) Ｒａｐｄ 표지인자를 이용한 양파의 웅성불임회복 유전자판별 방법
CN110093425B (zh) 一种检测小尾寒羊ormdl1基因cnv标记的方法及其应用
CN108950050B (zh) 东野型水稻胞质雄性不育恢复基因Rf(DW)10的检测引物、试剂盒及应用与检测方法
CN107164547B (zh) 一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记、引物及其应用
Liu et al. Genetic diversity and the population structure at two ploidy levels of Lycoris radiata as revealed by SCoT analysis
Usha et al. Whole-Genome Sequencing of Plants: Past, Present, and Future
Xie et al. OsBLS6. 2: A rice bacterial leaf streak resistance gene identified by GWAS and RNA-seq

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20220705