JP6997121B2 - CRISPR関連方法および支配gRNAのある組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、その内容全体を参照により本明細書に援用する、2013年11月7日に出
願された、米国仮特許出願第61/901,215号明細書の優先権を主張する。
核酸配列の編集のための構成要素とに関する。
Short Palindromic Repeats:規則的な間隔をもってクラスタ
ー化された短鎖反復回文配列)は細菌中で発達し、ウイルスの攻撃から防御する適応性免
疫系である。ウイルスへの曝露に際して、ウイルスDNAの短い断片がCRISPR遺伝
子座に組み込まれる。ウイルス配列を含むCRISPR遺伝子座の部分から、RNAが転
写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含有するRNAは、ウイルスゲノム中の標的
配列へのCas9タンパク質の標的化を媒介する。Cas9タンパク質は、ウイルス標的
を切断することで、その発現を消失させる。
いる。部位特異的二本鎖切断(DSB)の導入は、非相同末端結合非(NHEJ)または
相同指向修復(HDR)のどちらかの2つの内在性DNA修復機構の1つを通じた、標的
配列改変を可能にする。CRISPR/Casシステムはまた、標的配列を改変しない、
転写の抑制および活性化をはじめとする遺伝子制御のために利用されている。CRISP
R/Casシステムに基づく標的化遺伝子制御は、酵素的に不活性なCas9(触媒不活
性型Cas9としてもまた知られている)を使用する。
かわらず、真核細胞での利用のために、これらのシステムの改善された制御および調節に
対する必要性がなおも存在する。
RNA分子と複合体形成したCas9分子などの組成物とが開示される。開示される方法
および組成物で使用されるCas9分子/gRNA分子複合体に応じて、標的核酸の特定
の編集またはペイロードの送達が実施され得る。
はそれを含む、方法および組成物は、「支配(governing)gRNA分子」をさ
らに使用し、またはそれを含み得る。支配gRNA分子は、Cas9分子と複合体形成し
て、Cas9システムの構成要素を不活性化またはサイレンシングすることができる。一
態様では、本開示は、Cas9システムの構成要素を標的とする標的化ドメインを含む、
本明細書で支配gRNA分子と称されるgRNA分子を特徴とする。一実施形態では、支
配gRNA分子は、以下を標的化してサイレンシングする。(1)Cas9分子をコード
する核酸(すなわち、Cas9標的化gRNA分子)、(2)gRNA分子をコードする
核酸(すなわち、gRNA標的化gRNA分子)、または(3)細胞内のその他の核酸配
列に対する相同性が最小でオフターゲット切断を最小化するように設計された、Cas9
構成要素に組み込まれた核酸配列(すなわち、操作された制御配列標的化gRNA分子)
。
/またはオフターゲット効果を低下させまたは最小化するように選択され得る。例えば、
支配gRNAは、Cas9分子をコードする核酸を不活性化(例えば、切断)することで
、例えば、標的核酸のCas9媒介改変後の「再切断」、またはCas9のオフターゲッ
ト切断などの望ましくない切断を最小化し得る。一実施形態では、支配gRNAは、Ca
s9分子/gRNA分子複合体の発現または活性レベルに、時間的制限またはその他の制
限を設ける。一実施形態では、支配gRNAは、オフターゲットまたはその他の望まれな
い作用を低下させる。
れ得る。これは、例えば、低下または最小化されたオフターゲット効果のために選択され
、またはそれをもたらす配列などのCas9配列または非Cas9配列であり得る。サイ
レンシングまたは不活性化は、標的核酸配列を切断することにより、または標的核酸配列
にCas9分子/支配gRNA分子複合体を結合させることにより、もたらされ得る。
A分子を特徴とする。一実施形態では、gRNA分子は、Cas9分子をコードする核酸
配列を標的化する。例えば、Cas9分子をコードする配列は、Cas9分子のアミノ酸
配列をコードする配列、非翻訳配列を含むCas9分子のアミノ酸配列をコードする配列
、または非転写配列を含むCas9分子のアミノ酸配列をコードする配列の1つまたは複
数を含み得る。
9分子はeiCas9分子である。
分子が媒介する切断事象を提供するように構成される。一実施形態では、gRNA分子は
、Cas9分子をコードする核酸配列中における、Cas9分子が媒介する切断事象を提
供するように構成される標的化ドメインを含む。
核酸配列のCas9分子-アミノ酸コード配列を標的化する、
核酸配列のCas9分子-アミノ酸コード配列中においてCas9分子が媒介する切断
事象を提供するように構成される、または
核酸配列のCas9分子-アミノ酸コード配列中においてCas9分子が媒介する切断
事象を提供するように構成される標的化ドメインを含む。
核酸配列の非コード配列を標的化する、
核酸配列の非コード配列中におけるCas9分子が媒介する切断事象を提供するように
構成される、または
核酸配列の非コード配列中におけるCas9分子が媒介する切断事象を提供するように
構成される標的化ドメインを含む。
核酸配列の非翻訳配列を標的化する、
核酸配列の非翻訳配列中におけるCas9分子が媒介する切断事象を提供するように構
成される、または
核酸配列の非翻訳配列中におけるCas9分子が媒介する切断事象を提供するように構
成される標的化ドメインを含む。
Cas9分子-アミノ酸コード領域の5’核酸配列を標的化する、
Cas9分子-コード領域の5’核酸配列中におけるCas9分子が媒介する切断事象
を提供するように構成される、または
Cas9分子-コード領域の5’ 核酸配列中におけるCas9分子が媒介する切断事
象を提供するように構成される標的化ドメインを含む。
Cas9分子-コード領域の3’のCas9分子をコードする核酸配列を標的化する、
Cas9分子-コード領域の3’核酸配列中におけるCas9分子が媒介する切断事象
を提供するように構成される、または
Cas9分子-コード領域の3’ 核酸配列中におけるCas9分子が媒介する切断事
象を提供するように構成される標的化ドメインを含む。
核酸配列のプロモーター領域を標的化する、
核酸配列のプロモーター領域中におけるCas9分子が媒介する切断事象を提供するよ
うに構成される、または
核酸配列のプロモーター領域中におけるCas9分子が媒介する切断事象を提供するよ
うに構成される標的化ドメインを含み、
ここでプロモーター領域は、Cas9分子アミノ酸コード領域と機能的に連結する。
核酸配列のCas9分子イントロン配列を標的化する、
核酸配列のCas9分子イントロン配列中におけるCas9分子が媒介する切断事象を
提供するように構成される、または
核酸配列のCas9分子イントロン配列中におけるCas9分子が媒介する切断事象を
提供するように構成される標的化ドメインを含む。
分子である。別の実施形態では、Cas9分子は、S.アウレウス(S.aureus)
のCas9分子である。
gRNA分子は、表E7~E12から選択される。
ジュラーgRNAである。
、コード配列、または例えば、プロモーターなどの制御領域を標的化する。例えば、gR
NAは、Cas9のコード配列を、または例えば、Cas9コード配列の発現を制御する
プロモーターなどの制御領域を標的化し得る。一実施形態では、例えば、Cas9標的化
gRNA分子などの支配gRNAまたはそれをコードする核酸は、例えば、Cas9分子
またはそれをコードする核酸よりも後に、別途導入される。例えば、AAVベクターのよ
うなウイルスベクターなどの第1のベクターが、Cas9と1つまたは複数のgRNAと
をコードする核酸を導入し得、例えば、AAVベクターのようなウイルスベクターなどの
第2のベクターが、例えば、Cas9標的化gRNA分子などの支配gRNA分子をコー
ドする核酸を導入し得る。第2のベクターは、第1のベクターの後に導入され得る。一実
施形態では、例えば、Cas9標的化gRNA分子などの支配gRNAまたはそれをコー
ドする核酸は、例えば、同時にまたは同一ベクター内で、Cas9分子またはそれをコー
ドする核酸と共に導入され得るが、それは、例えば、しばらくするとCas9の転写が停
止されるように、例えば、後から活性化されるプロモーターまたはエンハンサーなどの転
写制御要素下にある。一実施形態では、転写制御因子は、内因的に活性化される。一実施
形態では、転写要素は、外部トリガーの導入を通じて活性化される。
一実施形態では、支配gRNA分子は、Cas9分子標的化gRNA分子を含む。一実施
形態では、核酸は、本明細書に記載されるgRNA分子をコードする配列を含む。一実施
形態では、核酸は精製される。
a)例えば、Cas9分子標的化gRNA分子またはgRNA分子標的化gRNA分子
などの支配gRNA分子をコードする、第1の核酸配列、および
b)例えば、eaCas9またはeiCas9分子などのCas9分子をコードする第
2の核酸配列
を含む、1つまたは複数のAAVベクターのような1つまたは複数のウイルスベクターな
どの1つまたは複数のベクターなどの核酸を特徴とする。
実施形態では、支配gRNA分子は、gRNA分子標的化gRNA分子を含む。
s9分子標的化gRNA分子は、Cas9分子をコードする第2の核酸配列を標的化する
。
9分子はeiCas9分子である。
切断事象を提供するように構成される。一実施形態では、gRNA分子は、第2の核酸配
列中におけるCas9分子が媒介する切断事象を提供するように構成される標的化ドメイ
ンを含む。一実施形態では、gRNA分子は、本明細書に記載されるgRNA分子であり
、第2の核酸配列を標的化する。
一ベクターである、同一核酸上に、構成要素a)および構成要素b)が提供される。別の
実施形態では、例えば、異なるAAVベクターのような異なるウイルスベクターなどの異
なるベクターである、異なる核酸上に、構成要素a)および構成要素b)が提供される。
記核酸から生成されたCas9分子と複合体を形成するように構成される。
る核酸配列を切断することで、不活性化またはサイレンシングする能力がある。一実施形
態では、不活性化するステップが、切断するステップを含む。
の制御下にあり、前記第2の核酸配列は、例えば、プロモーターなどの第2の制御領域の
制御下にあり、例えば、プロモーターなどの前記第1および第2の制御領域は異なり、例
えば、1つは構成的プロモーターであり、1つは誘導性プロモーターである。
て、例えば、発現レベルに関してまたは時間的に差次的に発現され、例えば、第1の配列
は、前記第2の配列よりも遅く発現され、または第1の配列は前記第2の配列よりも低い
レベルで発現される。
c)例えば、第2のgRNA分子などのgRNA分子をコードし、標的核酸と相補的な標
的化ドメインを含む第3の核酸配列をさらに含み、例えば、その中で第2のgRNAはb
)を標的化しない。
14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18、VII-19、VI
I-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-24、IX-1、IX
-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVIIIで、本明細書に記載
される遺伝子または経路からの配列などの標的核酸が、本明細書で開示される。
の制御下にあり、
前記第2の核酸配列は、例えば、プロモーターなどの前記第2の制御領域、または例え
ば、プロモーターなどの第3の制御領域の制御下にあり、
前記第3の核酸配列は、例えば、プロモーターなどの前記第2の制御領域、または例えば
、プロモーターなどの前記第3の制御領域の制御下にあり、
例えば、プロモーターなどの前記第1の制御領域は、例えば、プロモーターなどの前記第
2および/または前記第3の制御領域と異なる。
例えば、発現レベルに関してまたは時間的に差次的に発現されて、例えば、第1の配列は
、前記第3の配列よりも遅く発現され、または第1の配列は前記第3の配列よりも低いレ
ベルで発現される。
5’および3’隣接領域配列を有する、テンプレート核酸(本明細書で同義的に交換核酸
配列と称される)をさらに含む。
される)Cas9分子配列またはgRNA分子配列を含むまたはそれをコードする核酸配
列は、例えばCas9分子配列またはgRNA分子配列を含むまたはそれをコードする核
酸配列から、(例えば、本明細書に記載される方法によって)切断または切除された後に
、例えば相同組換えのためのドナーDNAとして、テンプレート核酸として利用されるこ
とができる核酸配列をさらに含む。一実施形態では、第1の支配gRNA分子は、テンプ
レート核酸配列を含む核酸配列の領域5’を標的化し、第2の支配gRNA分子は、テン
プレート核酸配列を含む核酸配列の領域3’を標的化する。例えば、少なくとも2つの(
例えば、2、3、4、5つ以上の)支配gRNAを使用して、1つまたは複数の(例えば
、2、3、4つ以上の)テンプレート核酸が作成され得る。別の実施形態では、単一支配
gRNA分子は、テンプレート核酸配列を含む核酸配列の5’ 領域および3’ 領域の双
方を標的化する。例えば、テンプレート核酸配列を含む核酸配列の5’領域(例えば、支
配gRNA分子によって標的化される)は、テンプレート核酸配列を含む核酸配列の3’
領域(例えば、支配gRNA分子によって標的化される)と同一または実質的に同一であ
り得る。一実施形態では、テンプレート核酸配列を構成する核酸配列は、例えば、本明細
書に記載されるベクターなどのベクター内にある。一実施形態では、ベクターは、例えば
、AAVベクターなどのウイルスベクターである。
施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは
、AAVベクターである。
a)例えば、本明細書に記載される支配gRNA分子などの支配gRNA分子、または例
えば、本明細書に記載される核酸などの支配gRNA分子をコードする核酸を含む、医薬
組成物などの組成物を特徴とする。
b)例えば、本明細書に記載されるCas9分子などのCas9分子、または例えば、
本明細書に記載される核酸配列などのCas9分子をコードする核酸配列、
c)第2のgRNA分子または第2のgRNA分子をコードする核酸、または
d)テンプレート核酸
の1つまたは複数(例えば、2つまたは全て)を含む。
施形態では、Cas9分子標的化gRNAは、本明細書に記載されるgRNA分子を含む
。
s9分子が媒介する切断事象を提供するように構成される。
ドする核酸とを含む。別の実施形態では、組成物は、Cas9分子標的化gRNA分子と
、Cas9分子とを含む。
c)第2のgRNA分子または第2のgRNA分子をコードする核酸をさらに含む。
d)テンプレート核酸をさらに含む。
含む。
を媒介するように構成される。
一核酸分子上でコードされる。一実施形態では、第1の配列は、a)、b)、c)、およ
びd)から選択され、第1の核酸分子上でコードされ、第2の配列は、a)、b)、c)
、およびd)から選択され、第2の核酸分子上でコードされる。
組成物を特徴とする。例えば、1つまたは複数のAAVベクターのような1つまたは複数
のウイルスベクターなどの1つまたは複数のベクターなどの核酸は、
a)例えば、Cas9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの支
配gRNA分子をコードする第1の核酸配列、および
b)例えば、eaCas9またはeiCas9分子などのCas9分子をコードする第
2の核酸配列
を含み得る。
RNA分子などの支配gRNA分子をコードするDNAなどの核酸配列と、
a)Cas9分子、
b)第2のCas9分子、
c)gRNA分子、および
d)第2のgRNA分子
の1つまたは複数とを含む、医薬組成物などの組成物を特徴とする。
上でコードされる。一実施形態では、第1の配列は、a、b、c、およびdから選択され
、第1の核酸分子上でコードされ、第2の配列は、a、b、c、およびdから選択され、
第2の核酸分子上でコードされる。一実施形態では、前記核酸は、c、a、c、およびd
;またはa、b、c、およびdをコードする。
本明細書に記載されるgRNA分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
を含む医薬品を特徴とする。
本明細書に記載されるgRNA分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
を含む細胞を特徴とする。
Cas9分子をコードする核酸配列と、ここで、前記Cas9分子をコードする配列は
、Cas9分子のアミノ酸配列をコードする配列、非翻訳配列を含むCas9分子のアミ
ノ酸配列をコードする配列、および非転写配列を含むCas9分子のアミノ酸配列をコー
ドする配列の1つまたは複数を含んでよく、
支配gRNA分子と
を含み得る。
るgRNA分子を含む。一実施形態では、gRNA分子は、本明細書に記載されるgRN
A分子である。
分子をさらに含む。一実施形態では、第2のgRNAは、Cas9分子を標的核酸に標的
化する。
ート核酸は、第2のgRNA分子によって配置された標的核酸中の切断の修復を媒介する
ように構成される。
によって切断された、標的核酸を含む。
は、テンプレート核酸により媒介された修復を含む。
態では、Cas9分子をコードする核酸配列は、Cas9分子を発現し得る。
り媒介された標的化によって切断されている。一実施形態では、Cas9分子をコードす
る切断された核酸配列は、切断されていない同一分子と比較して、Cas9分子を発現す
る能力が低下している。一実施形態では、Cas9分子をコードする切断された核酸配列
は、Cas9分子を実質的に発現できない。
Cas9分子をコードする切断された核酸配列、または
Cas9分子が媒介する切断事象が修復されている標的核酸
の片方または双方を含む。
シチメンチョウ、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、霊長類、またはヒト細胞である。
または双子葉植物である。
、または出生前細胞である。一実施形態では、細胞は、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、
幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コンピテント細胞である。
含む、細胞を改変する方法を特徴とし、例えば、細胞の標的核酸配列などの構造が改変さ
れる。例えば、1つまたは複数のAAVベクターのような1つまたは複数のウイルスベク
ターなどの1つまたは複数のベクターなどの核酸は、
a)例えば、Cas9を標的化するgRNA分子またはgRNAを標的化するgRNA
分子などの支配gRNA分子をコードする第1の核酸配列、および
b)例えば、eaCas9またはeiCas9分子などのCas9分子をコードする第
2の核酸配列
を含み得る。
細胞は、例えば、セクションVIIAで、本明細書に記載される細胞などのヒト細胞であ
る。一実施形態では、細胞は、例えば、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、幹細胞、有糸分
裂コンピテント細胞、または減数分裂コンピテント細胞などの体細胞、胚芽細胞、出生前
細胞である。一実施形態では、標的核酸は染色体核酸である。
本明細書に記載されるgRNA分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
の有効量に接触させるステップを含む、細胞を改変する方法を特徴とし、例えば、細胞の
標的核酸配列などの構造が改変される。
シチメンチョウ、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、霊長類、またはヒト細胞である。
または双子葉植物である。
、または出生前細胞である。一実施形態では、細胞は、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、
幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コンピテント細胞である。
プを含む、例えば標的核酸の配列を改変するなど構造を改変することで、対象を治療する
方法を特徴とする。例えば、1つまたは複数のAAVベクターのような1つまたは複数の
ウイルスベクターなどの1つまたは複数のベクターなどの核酸は、
a)例えば、Cas9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの支
配gRNA分子をコードする第1の核酸配列、および
b)例えば、eaCas9またはeiCas9分子などのCas9分子をコードする第
2の核酸配列
を含み得る。
核酸は、例えば、セクションVIIAで、本明細書に記載される細胞などのヒト細胞の核
酸である。一実施形態では、標的核酸は、例えば、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、幹細
胞、有糸分裂コンピテント細胞、または減数分裂コンピテント細胞などの体細胞、胚芽細
胞、出生前細胞の核酸である。一実施形態では、標的核酸は染色体核酸である。
本明細書に記載されるgRNA分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
の有効量に接触させるステップを含む、例えば、対象の細胞内で、標的核酸の構造を改変
するなど配列を改変することで、対象を治療する方法を特徴とする。
シチメンチョウ、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、霊長類、またはヒト細胞である。
または双子葉植物である。
、または出生前細胞である。一実施形態では、細胞は、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、
幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コンピテント細胞である。
本明細書に記載されるgRNA分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
とを含む反応混合物を特徴とする。
れる細胞などの細胞とを含む反応混合物を特徴とする。
本明細書に記載されるgRNA分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
を含むキットを特徴とする。
、ベクター、または組成物の使用説明書を含む。
組成物などの組成物を特徴とする。
s9分子をさらに含む。一実施形態では、前記Cas9分子はeaCas9分子である。
一実施形態では、前記Cas9分子はeiCas9分子である。
、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18、VII-
19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-24、IX
-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVIIIで、本明
細書に記載される遺伝子または経路からの配列などの本明細書で開示される標的核酸から
の標的配列と相補的な標的化ドメインを含む、gRNA分子をさらに含む。
物などの組成物を特徴とする。
s9分子をさらに含む。一実施形態では、前記Cas9分子はeaCas9分子である。
別の実施形態では、前記Cas9分子はeiCas9分子である。
VI-2、VI-3、VI-4、VI-5、またはVI-6で、本明細書に記載されるペ
イロードなどのペイロードを含む。
のエピジェネティックな修飾因子;例えば、セクションVIで、本明細書に記載されるエ
ピジェネティックな修飾因子のようなヒストンを修飾する分子などの構成要素;例えば、
セクションVIで、本明細書に記載される転写因子などの転写因子;転写活性化因子ドメ
イン;例えば、抗転写因子抗体、またはその他の阻害剤などの転写因子の阻害剤;小分子
;抗体;酵素;例えば、ヘリカーゼ、制限酵素、リガーゼ、またはポリメラーゼなどのD
NAと相互作用する酵素;および/または例えば、リボザイム、またはmRNA、siR
NAのような酵素的に活性な核酸などのアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸を含む。
一実施形態では、組成物は、例えば、eiCas9分子などのCas9分子をさらに含む
。
、例えば、共有結合または非共有結合する。一実施形態では、前記ペイロードは、リンカ
ーによって前記Cas9分子と結合する。一実施形態では、前記リンカーは、例えば、細
胞核条件などの生理学的条件下で切断可能な結合であり、またはそれを含む。一実施形態
では、前記リンカーは、例えば、セクションXIで、本明細書に記載される結合であり、
またはそれを含む。一実施形態では、前記リンカーは、エステル結合であり、またはそれ
を含む。一実施形態では、前記ペイロードは、例えば、eaCas9分子またはeiCa
s9分子などのCas9分子に融合した、融合パートナーを含む。
結合的する。一実施形態では、前記ペイロードは、リンカーによって前記gRNA分子と
結合する。一実施形態では、前記リンカーは、例えば、細胞核条件などの生理学的条件下
で切断可能な結合であり、またはそれを含む。一実施形態では、前記リンカーは、例えば
、セクションXIで、本明細書に記載される結合であり、またはそれを含む。一実施形態
では、前記リンカーは、エステル結合であり、またはそれを含む。
的核酸中で二本鎖切断を形成するeaCas9分子を含む。
む。一実施形態では、前記一本鎖切断は、標的核酸の相補鎖中に形成される。一実施形態
では、前記一本鎖切断は、標的核酸の相補鎖でない鎖中に形成される。
メイン切断活性は有さず、または顕著に有しない。一実施形態では、組成物はN末端Ru
vC様ドメイン切断活性を含むが、HNH様ドメイン切断活性は有さず、または顕著に有
しない。
0、50、100、150または200ヌクレオチド以内である。一実施形態では、前記
一本鎖切断は、標的位置のヌクレオチドの10、20、30、40、50、100、15
0または200ヌクレオチド以内である。
レート核酸などのテンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプレート核酸は
、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-
18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VI
I-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションV
IIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、
10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも1ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと5、10、20または30%以下が異
なる、10~500、10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
第2のgRNA分子をさらに含む。
置の隣接領域などの、標的核酸中の異なる部位における切断を媒介する。一実施形態では
、前記gRNA分子および前記第2のgRNA分子は、同一標的鎖と相補的である。一実
施形態では、前記gRNA分子および前記第2のgRNA分子は、異なる標的鎖と相補的
である。
よって生成される第1および第2の切断が、標的位置の隣接領域に位置するように構成さ
れる。一実施形態では、前記二本鎖切断は、標的位置のヌクレオチドの10、20、30
、40、50、100、150または200ヌクレオチド以内である。
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-
18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VI
I-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションV
IIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、
10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片である。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも1ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと5、10、20または30%以下が異
なる、10~500、10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片
である。
列の場合は、テンプレート鎖または非テンプレート鎖中などの同一標的核酸鎖中に、第1
および第2の切断が形成されるように構成される。
て、標的位置のヌクレオチドの10、20、30、40、50、100、150または2
00ヌクレオチド以内にある。
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。一実施形態では
、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションVIIBで、例えば、表VII-13、
VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18、VII-1
9、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-24、IX-
1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVIIIで、本明細
書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置のヌクレオチドに対
応するヌクレオチドを含む。
I-15、VII-16、VII-17、VII-18、VII-19、VII-20、
VII-21、VII-22、VII-23、VII-24、IX-1、IX-1A、I
X-3、またはXII-1中で、またはセクションVIII中で、本明細書に記載される
遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、10~400、10~300
、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも1ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと5、10、20または30%以下が異
なる、10~500、10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
に、第1および第2の切断が形成されるように構成される。一実施形態では、前記第1お
よび第2の切断は、標的位置の隣接領域に位置する。一実施形態では、前記第1および第
2の一本鎖切断の1つ、またはその双方は、独立して、標的位置のヌクレオチドの10、
20、30、40、50、100、150または200ヌクレオチド以内にある。
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-
18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VI
I-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションV
IIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、
10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも1ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと5、10、20または30%以下が異
なる、10~500、10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
、eiCas9分子である。一実施形態では、前記eiCas9分子は、リンカーによっ
てペイロードと結合し、前記第2のeiCas9分子は、第2のリンカーによって第2の
ペイロードと結合する。
態では、前記ペイロードおよび前記第2のペイロードは異なる。一実施形態では、前記リ
ンカーおよび前記第2のリンカーは同一である。一実施形態では、前記リンカーおよび前
記第2のリンカーは異なり、例えば、異なる放出速度などの異なる放出特性を有する。
VIで、例えば、表VI-1、VI-2、VI-3、VI-4、VI-5、またはVI-
6で、それぞれ本明細書に記載される。一実施形態では、前記ペイロードおよび前記第2
のペイロードは相互作用し得て、例えば、それらはタンパク質のサブユニットである。
、eaCas9分子である。
s9分子は第2の切断活性を含む。一実施形態では、前記切断活性および前記第2の切断
活性は同一であり、例えばどちもN末端RuvC様ドメイン活性であり、またはどちらも
HNH様ドメイン活性である。一実施形態では、前記切断活性および前記第2の切断活性
は異なり、例えば、1つはN末端RuvC様ドメイン活性であり、1つはHNH様ドメイ
ン活性である。
対して特異的であり、例えば、1つはNGGに対して特異的であり、もう1つは例えば、
NGGNG、NNAGAAW(W=AまたはT)、またはNAAR((R)=AまたはG
)に対して特異的である。一実施形態では、S.アウレウス(S.aureus)の前記
Cas9分子は、配列モチーフNNGRR((R)=AまたはG)を認識して、例えば、
その配列から3~5塩基対上流などの1~10塩基対上流の標的核酸配列の切断を誘導す
る。一実施形態では、前記Cas9分子および前記第2のCas9分子の1つは、S.ア
ウレウス(S.aureus)のPAMを認識する。一実施形態では、N.メニンジチデ
ィス(N.meningitidis)の前記Cas9分子は、配列モチーフNNNNG
ATTを認識して、例えば、その配列から3~5塩基対上流などの標的核酸配列の1~1
0塩基対上流の切断を誘導する。一実施形態では、前記Cas9分子および前記第2のC
as9分子の1つは、N.メニンジチディス(N.meningitidis)PAMを
認識する。
断を媒介する。
対して特異的であり、例えば、1つはNGGに対して特異的であり、もう1つは例えば、
本明細書に記載されるPAMなどの別のPAMに対して特異的である。一実施形態では、
前記gRNA分子および前記第2のgRNA分子は、第1および第2の切断が、標的位置
の隣接領域に位置するように構成される。一実施形態では、前記第1および第2の二本鎖
切断の1つ、またはその双方は、独立して、標的位置のヌクレオチドの10、20、30
、40、50、100、150または200ヌクレオチド以内にある。
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-1
8、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII
-24、IX-1、IX-1A、IX-3、XII-1、またはセクションVIII中で
、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置のヌクレオ
チドに対応するヌクレオチドを含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、
10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも1ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと5、10、20または30%以下が異
なる、10~500、10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
を媒介し、もう1つは一本鎖切断を媒介する。
対して特異的であり、例えば、1つはNGGに対して特異的であり、もう1つは例えば、
本明細書に記載されるPAMなどの別のPAMに対して特異的である。一実施形態では、
前記gRNA分子および前記第2のgRNA分子は、第1および第2の切断が、標的位置
の隣接領域に位置するように構成される。一実施形態では、前記第1および第2の切断は
、標的位置の隣接領域に位置する。一実施形態では、前記第1および第2の切断の1つ、
またはその双方は、独立して、標的位置のヌクレオチドの10、20、30、40、50
、100、150または200ヌクレオチド以内にある。
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-
18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VI
I-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションV
IIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、
10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも1ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと5、10、20または30%以下が異
なる、10~500、10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
断を媒介する。
対して特異的であり、例えば、1つはNGGに対して特異的であり、もう1つは例えば、
本明細書に記載されるPAMなどの別のPAMに対して特異的である。一実施形態では、
前記第1および第2の切断は、標的位置の隣接領域に位置する。
て、標的位置のヌクレオチドの10、20、30、40、50、100、150または2
00ヌクレオチド以内にある。
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-
18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VI
I-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションV
IIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、
10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも1ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと5、10、20または30%以下が異
なる、10~500、10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
断が、同一鎖中にあるように構成される。
対して特異的であり、例えば、1つはNGGに対して特異的であり、もう1つは例えば、
本明細書に記載されるPAMなどの別のPAMに対して特異的である。一実施形態では、
前記gRNA分子、前記第2のgRNA分子は、第1および第2の切断が、標的位置の隣
接領域に位置するように構成される。一実施形態では、前記第1および第2の一本鎖切断
の1つ、またはその双方は、独立して、標的位置のヌクレオチドの10、20、30、4
0、50、100、150または200ヌクレオチド以内にある。
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-
18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VI
I-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションV
IIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、
10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも1ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと5、10、20または30%以下が異
なる、10~500、10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
対して特異的であり、例えば、1つはNGGに対して特異的であり、もう1つは例えば、
本明細書に記載されるPAMなどの別のPAMに対して特異的である。一実施形態では、
前記gRNA分子、前記第2のgRNA分子は、第1および第2の切断が、異なる鎖上に
あるように構成される。
断が、標的位置の隣接領域に位置するように構成される。一実施形態では、前記第1およ
び第2の切断は、標的位置の隣接領域に位置する。
て、標的位置のヌクレオチドの10、20、30、40、50、100、150または2
00ヌクレオチド以内にある。
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-
18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VI
I-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションV
IIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、
10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
I-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18、
VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-2
4、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1、またはセクションVIII中
で、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なくと
も1ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと5、10、20または30%以下が異な
る、10~500、10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片で
あり、またはそれを含む。
NA分子またはgRNA標的化gRNA分子、gRNA分子、および第2のgRNA分子
などの支配gRNA分子を含む、医薬組成物などの組成物を特徴とする。
、DNAまたはmRNAなどの核酸をさらに含む。一実施形態では、組成物は、例えば、
本明細書に記載される第2のCas9分子をコードする、DNAまたはRNAなどの核酸
をさらに含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるテンプレート核酸をさ
らに含む。
またはgRNA標的化gRNA分子、および1つまたは複数のgRNA分子のような支配
gRNA分子をコードするDNAなどの核酸配列を含む、医薬組成物などの組成物を特徴
とする。
をコードする配列と作動可能に連結する、プロモーターを含む。
A分子をコードする配列と作動可能に連結する、第2のプロモーターを含む。一実施形態
では、プロモーターおよび第2のプロモーターは、異なるプロモーターである。一実施形
態では、プロモーターおよび第2のプロモーターは同一である。
実施形態では、核酸は、本明細書に記載される第2のCas9分子をさらにコードする。
をコードする配列と作動可能に連結する、プロモーターを含む。
をコードする配列と作動可能に連結する、第2のプロモーターを含む。一実施形態では、
プロモーターおよび第2のプロモーターは、異なるプロモーターである。一実施形態では
、プロモーターおよび第2のプロモーターは同一である。
レート核酸などのテンプレート核酸をさらに含む。
gRNA分子、d)第2のgRNA分子、およびe)例えば、Cas9標的化gRNA分
子またはgRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子をコードする核酸配列の1
つまたは複数を含む、医薬組成物などの組成物を特徴とする。
酸分子上でコードされる。
第1の核酸分子上でコードされ、第2の配列は、a)、b)、c)、d)、およびe)か
ら選択され、第2の核酸分子上でコードされる。
);またはa)、b)、c)、d)、およびe)をコードする。
または複数を含み、前記核酸はCas9分子をコードしない。
、Cas9分子の1つまたは複数をコードする1つまたは複数のmRNAを含み、前記核
酸はCas9分子をコードしない。
レート核酸などのテンプレート核酸をさらに含む。
NA分子などのgRNA分子の組み合わせ);b)eaCas9分子(または例えば、e
aCas9分子と第2のeaCas9分子などのeaCas9分子の組み合わせ);およ
びc)任意選択的に、例えば、セクションIVで、本明細書に記載されるテンプレート核
酸などのテンプレート核酸を含む組成物を特徴とする。
RNA分子などのgRNA分子の組み合わせ);b)例えば、eaCas9分子(または
例えば、eaCas9分子と第2のeaCas9分子などのeaCas9分子の組み合わ
せ)をコードするDNAまたはmRNAなどの核酸;c)任意選択的に、例えば、セクシ
ョンIVで、本明細書に記載されるテンプレート核酸などのテンプレート核酸;およびd
)例えば、Cas9標的化gRNA分子などの支配gRNA分子を含む組成物を特徴とす
る。
第2のgRNA分子などのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの核酸;
b)eaCas9分子(または例えば、eaCas9分子と第2のeaCas9分子など
のeaCas9分子の組み合わせ);c)任意選択的に、例えば、セクションIVで、本
明細書に記載されるテンプレート核酸などのテンプレート核酸;およびd)例えば、gR
NA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子を含む組成物を特徴とする。
分子と第2のgRNA分子などのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの
核酸;b)例えば、eaCas9分子(または例えば、eaCas9分子と第2のeaC
as9分子などのeaCas9分子の組み合わせ)をコードするDNAまたはmRNAな
どの核酸(ここでgRNA分子をコードする核酸およびeaCas9分子をコードする核
酸は、同一であるかまたは異なる分子であり得る);c)任意選択的に、例えば、セクシ
ョンIVで、本明細書に記載されるテンプレート核酸などのテンプレート核酸;およびd
)例えば、Cas9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの支配g
RNA分子を含む組成物を特徴とする。
1)a)gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子などのgR
NA分子の組み合わせ)、
b)eaCas9分子(または例えば、eaCas9分子と第2のeaCas9分子
などのeaCas9分子の組み合わせ)、および
c)任意選択的に、例えば、セクションIVで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸
を含む組成物;
2)a)gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子などのgR
NA分子の組み合わせ)、
b)例えば、eaCas9分子(または例えば、eaCas9分子と第2のeaCa
s9分子などのeaCas9分子の組み合わせ)をコードするDNAまたはmRNAなど
の核酸、および
c)任意選択的に、例えば、セクションIVで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸、および
d)例えば、Cas9標的化gRNA分子などの支配gRNA分子
を含む組成物;
3)a)例えば、gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子な
どのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの核酸、
b)eaCas9分子(または例えば、eaCas9分子と第2のeaCas9分子
などのeaCas9分子の組み合わせ)、および
c)任意選択的に、例えば、セクションIVで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸、および
d)例えば、Cas9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの
支配gRNA分子
を含む組成物;および/または
4)a)例えば、gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子な
どのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの核酸、
b)例えば、eaCas9分子(または例えば、eaCas9分子と第2のeaCa
s9分子などのeaCas9分子の組み合わせ)をコードするDNAまたはmRNAなど
の核酸(ここでgRNA分子をコードする核酸およびeaCas9分子をコードする核酸
は、同一であるかまたは異なる分子であり得る)、および
c)任意選択的に、例えば、セクションIVで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸、および
d)例えば、Cas9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの
支配gRNA分子
を含む組成物
に、前記細胞を接触させるステップを含む、例えば、細胞の標的核酸配列などの構造を改
変することで、細胞改変する方法を特徴とする。
s9分子またはeaCas9分子をコードする核酸は、1つの剤形、送達様式、または製
剤中で、またはそれによって送達される。
形、第1の送達様式、または第1の製剤中で、またはそれによって送達され;b)eaC
as9分子、またはeaCas9分子をコードする核酸は、第2の剤形、第2の送達様式
、または第2の製剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、C
as9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子(
またはそれをコードする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、また
は別の剤形、送達様式、または製剤中で提供される。
類、霊長類、またはヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、例えば、セクションVI
IAで、本明細書に記載されるものからの細胞などのヒト細胞である。一実施形態では、
細胞は、例えば、接合体、胚盤胞または胎芽、胚盤胞細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテン
ト細胞、減数分裂コンピテント細胞などの体細胞、胚芽細胞、出生前細胞である。一実施
形態では、細胞は、例えば、疾患または障害によって特徴付けられる、がん細胞またはそ
の他の細胞などのヒト細胞である。
胞小器官核酸である。一実施形態では、標的核酸は、ミトコンドリア核酸である。一実施
形態では、標的核酸は、葉緑体核酸である。
の疾患を引き起こす生物の細胞である。
などの疾患を引き起こす生物の核酸である。
性化するステップを含む。
けられる細胞である。一実施形態では、前記細胞は、例えば、ウイルス性ゲノムの構成要
素などの望まれないゲノムの構成要素によって特徴付けられる細胞である。一実施形態で
は、細胞は、例えば、セクションIIAで、本明細書に記載される細胞である。一実施形
態では、少なくとも、2、3、4、5または6つ以上の遺伝子の制御または構造的配列が
改変される。
遺伝子を含む再配置である。一実施形態では、標的核酸は、キナーゼ遺伝子または腫瘍抑
制遺伝子を含む。
100、150または200ヌクレオチド以内で標的核酸を切断するステップを含む。一
実施形態では、前記組成物は、テンプレート核酸を含む。
ドを含む。
表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-
18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VI
I-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションV
IIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
I-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18、
VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-2
4、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVIII
で、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、1
0~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを含
む。
I-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18、
VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-2
4、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVIII
で、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なくと
も1ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと5、10、20または30%以下が異な
る、10~500、10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片で
あり、またはそれを含む。
a)例えば、シス作用性または、トランス作用性制御領域などの遺伝子の制御領域が切
断され、
b)例えば、制御領域の制御下にある遺伝子の発現が調節され、例えば、増大または低
下などの改変によって、シス作用性またはトランス作用性制御領域などの遺伝子の制御領
域の配列が改変され、例えば、制御配列が妨害され、または新規制御配列が挿入され、
c)遺伝子のコード配列が切断され、
d)例えば、遺伝子のコード配列などの転写領域の配列が改変され、例えば、変異が修
正または導入され、遺伝子産物の発現または活性を高める改変がもたらされ、例えば、変
異が修正され、および/または
e)例えば、遺伝子のコード配列などの転写領域の配列が改変され、例えば、変異が修
正または導入され、遺伝子産物の発現または活性を低下させる改変がもたらされ、例えば
、変異が挿入され、例えば、停止コドンが挿入されるように1つまたは複数のヌクレオチ
ドの配列が改変される。
ド配列などの制御領域または転写領域が改変される。
1)a)gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子などのgR
NA分子の組み合わせ)、
b)eaCas9分子(または例えば、eaCas9分子と第2のeaCas9分子
などのeaCas9分子の組み合わせ)、および
c)任意選択的に、例えば、セクションIVで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸
を含む組成物;
2)a)gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子などのgR
NA分子の組み合わせ)、
b)例えば、eaCas9分子(または例えば、eaCas9分子と第2のeaCa
s9分子などのeaCas9分子の組み合わせ)をコードするDNAまたはmRNAなど
の核酸、
c)任意選択的に、例えば、セクションIVで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸、および
d)例えば、Cas9標的化gRNA分子などの支配gRNA分子
を含む組成物;
3)a)例えば、gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子な
どのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの核酸、
b)eaCas9分子(または例えば、eaCas9分子と第2のeaCas9分子
などのeaCas9分子の組み合わせ)、および
c)任意選択的に、例えば、セクションIVで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸;および
d)例えば、gRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子
を含む組成物;および/または
4)a)例えば、gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子な
どのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの核酸、
b)例えば、eaCas9分子(または例えば、eaCas9分子と第2のeaCa
s9分子などのeaCas9分子の組み合わせ)をコードするDNAまたはmRNAなど
の核酸(ここでgRNA分子をコードする核酸およびeaCas9分子をコードする核酸
は、同一であるかまたは異なる分子であり得る)、および
c)任意選択的に、例えば、セクションIVで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸、および
d)例えば、Cas9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの
支配gRNA分子を含む組成物
の有効量を対象に投与するステップを含む、標的核酸の構造を改変することで、例えば、
配列を改変することで、対象を治療する方法を特徴とする。
s9分子またはeaCas9分子をコードする核酸は、1つの剤形、送達様式、または製
剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、Cas9標的化gR
NA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子(またはそれをコー
ドする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、または別の剤形、送達
様式、または製剤中で提供される。
第1の送達様式で、または第1の製剤中で、またはそれによって送達され;およびeaC
as9分子、またはeaCas9分子をコードする核酸は、第2の剤形、第2の送達様式
、または第2の製剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、C
as9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子(
またはそれをコードする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、また
は別の剤形、送達様式、または製剤中で提供され得る。
霊長類、またはヒトである。
細胞などのヒト細胞の核酸である。一実施形態では、標的核酸は、例えば、接合体、胚盤
胞または胎芽、胚盤胞細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コンピテント
細胞などの体細胞、胚芽細胞、出生前細胞の核酸である。
胞小器官核酸である。一実施形態では、核酸は、ミトコンドリア核酸である。一実施形態
では、核酸は、葉緑体核酸である。
などの疾患を引き起こす生物の核酸である。一実施形態では、前記方法は、遺伝子の発現
を調節するステップまたは疾患生物を不活性化するステップを含む。
けられる細胞の核酸である。一実施形態では、前記標的核酸は、例えば、ウイルスゲノム
構成要素などの望まれないゲノムの構成要素を含む。一実施形態では、少なくとも、2、
3、4、5または6つ以上の遺伝子の制御または構造的配列が改変される。一実施形態で
は、標的核酸は、再配置、キナーゼ遺伝子を含む再配置、または腫瘍抑制遺伝子を含む再
配置である。一実施形態では、標的核酸は、キナーゼ遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を含む
。
100、150または200ヌクレオチド以内で標的核酸を切断するステップを含む。
ート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-
18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VI
I-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションV
IIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
II-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18
、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-
24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVII
Iで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの10~500、
10~400、10~300、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
レオチドと5、10、20または30%以下が異なる、10~500、10~400、1
0~300、10~200ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを含む。
a)例えば、シス作用性または、トランス作用性制御領域などの遺伝子の制御領域が切
断され、
b)例えば、制御領域の制御下にある遺伝子の発現が調節され、例えば、増大または低
下などの改変によって、シス作用性またはトランス作用性制御領域などの遺伝子の制御領
域の配列が改変され、例えば、制御配列が妨害され、または新規制御配列が挿入され、
c)遺伝子のコード配列が切断され、
d)例えば、遺伝子のコード配列などの転写領域の配列が改変され、例えば、変異が修
正または導入され、遺伝子産物の発現または活性を高める改変がもたらされ、例えば、変
異が修正され、
e)遺伝子の非コード配列または遺伝子の間の遺伝子間領域が切断され、および/また
は
f)例えば、遺伝子のコード配列などの転写領域の配列が改変され、例えば、変異が修
正または導入され、遺伝子産物の発現または活性を低下させる改変がもたらされ、例えば
、変異が挿入され、例えば、停止コドンが挿入されるように1つまたは複数のヌクレオチ
ドの配列が改変される。
ド配列などの制御領域または転写領域が改変される。
NA分子などのgRNA分子の組み合わせ);b)例えば、eiCas9分子(または例
えば、eiCas9分子と第2のeiCas9分子などのCas9分子の組み合わせ)な
どのCas9分子;およびc)gRNA分子およびCas9分子の複合体と共有結合また
は非共有結合する、例えば、Cas9分子またはgRNA分子と結合するペイロードを含
む組成物を特徴とする。
RNA分子などのgRNA分子の組み合わせ);b)例えば、eiCas9分子(または
例えば、eiCas9分子と第2のeiCas9分子などのCas9分子の組み合わせ)
などのCas9分子をコードするDNAまたはmRNAなどの核酸;およびc)gRNA
分子と共有結合または非共有結合的しまたはCas9分子の融合パートナーであるペイロ
ードを含む組成物を特徴とする。
第2のgRNA分子などのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの核酸;
b)例えば、eiCas9分子(または例えば、eiCas9分子と第2のeiCas9
分子などのCas9分子の組み合わせ)などのCas9分子;c)Cas9分子と共有結
合または非共有結合するペイロード;およびd)例えば、gRNA標的化gRNA分子な
どの支配gRNA分子を含む組成物を特徴とする。
分子と第2のgRNA分子などのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの
核酸;b)例えば、その中でgRNA分子をコードする核酸およびeaCas9分子をコ
ードする核酸が、同一であるかまたは異なる分子であり得る、eiCas9分子(または
例えば、eiCas9分子と第2のeiCas9分子などのCas9分子の組み合わせ)
などのCas9分子をコードするDNAまたはmRNAなどの核酸);c)Cas9分子
の融合パートナーであるペイロード;およびd)例えば、Cas9標的化gRNA分子ま
たはgRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子を含む組成物を特徴とする。
1)a)gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子などのgR
NA分子の組み合わせ)、
b)例えば、eiCas9分子(または例えば、eiCas9分子と第2のeiCa
s9分子などのCas9分子の組み合わせ)などのCas9分子;および
c)gRNA分子およびCas9分子複合体と共有結合または非共有結合する、例え
ば、Cas9分子またはgRNA分子と結合するペイロード
を含む組成物;
2)a)gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子などのgR
NA分子の組み合わせ)、
b)例えば、eiCas9分子(または例えば、eiCas9分子と第2のeiCa
s9分子などのCas9分子の組み合わせ)などのCas9分子をコードするDNAまた
はmRNAなどの核酸、
c)gRNA分子と共有結合または非共有結合的し、またはCas9分子の融合パー
トナーであるペイロード
を含む組成物と、
3)a)例えば、gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子な
どのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの核酸、
b)例えば、eiCas9分子(または例えば、eiCas9分子と第2のeiCa
s9分子などのCas9分子の組み合わせ)などのCas9分子、
c)Cas9分子と共有結合または非共有結合するペイロード、および
d)例えば、gRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子
を含む組成物;および/または
4)a)例えば、gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子な
どのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの核酸、
b)例えば、その中でgRNA分子をコードする核酸およびeaCas9分子をコー
ドする核酸が、同一であるかまたは異なる分子であり得る、eiCas9分子(または例
えば、eiCas9分子と第2のeiCas9分子などのCas9分子の組み合わせ)な
どのCas9分子をコードするDNAまたはmRNAなどの核酸)、
c)Cas9分子の融合パートナーであるペイロード、および
d)例えば、Cas9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの
支配gRNA分子
を含む組成物に、前記細胞を接触させるステップを含む、例えば、標的核酸にペイロード
を標的化することで、細胞にペイロードを送達する方法を特徴とする。
s9分子またはeaCas9分子をコードする核酸は、1つの剤形、送達様式、または製
剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、Cas9標的化gR
NA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子(またはそれをコー
ドする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、または別の剤形、送達
様式、または製剤中で提供される。
第1の送達様式、または第1の製剤中で、またはそれによって送達され;Cas9分子、
またはCas9分子をコードする核酸は、第2の剤形、第2の送達様式、または第2の製
剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、Cas9標的化gR
NA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子(またはそれをコー
ドする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、または別の剤形、送達
様式、または製剤中で提供される。
類、霊長類、またはヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、例えば、セクションVI
IAで、本明細書に記載されるヒト細胞などのヒト細胞である。一実施形態では、細胞は
、例えば、接合体、胚盤胞または胎芽、胚盤胞細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞
、減数分裂コンピテント細胞などの体細胞、胚芽細胞、出生前細胞である。一実施形態で
は、細胞は、例えば、がん細胞や、例えば、ウイルスゲノムの全部または一部のような望
まれない遺伝要素を含む細胞などのヒト細胞である。
NAは、選択されたゲノムシグネチャの標的化を媒介する。一実施形態では、gRNAは
、細胞小器官核酸の標的化を媒介する。一実施形態では、gRNAは、ミトコンドリア核
酸の標的化を媒介する。一実施形態では、gRNAは、葉緑体核酸の標的化を媒介する。
の疾患を引き起こす生物の細胞である。
などの疾患を引き起こす生物の核酸の標的化を媒介する。
イロードを含む。
けられる細胞である。一実施形態では、前記細胞は、例えば、ウイルス性ゲノムの構成要
素などの望まれないゲノムの構成要素によって特徴付けられる。
造的配列が改変される。
変異などの選択されたゲノムシグネチャを標的化する。一実施形態では、標的核酸は、再
配置、キナーゼ遺伝子を含む再配置、または腫瘍抑制遺伝子を含む再配置である。一実施
形態では、標的核酸は、キナーゼ遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を含む。一実施形態では、
gRNAは、例えば、セクションVIIAで、本明細書で開示されるがん細胞などのがん
細胞を標的化する。一実施形態では、gRNAは、ウイルスに感染している細胞を標的化
する。
1)a)gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子などのgR
NA分子の組み合わせ)、
b)例えば、eiCas9分子(または例えば、eiCas9分子と第2のeiCa
s9分子などのCas9分子の組み合わせ)などのCas9分子、および
c)gRNA分子およびCas9分子複合体と共有結合または非共有結合する、例え
ば、Cas9分子と結合するペイロード
を含む組成物;
2)a)gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子などのgR
NA分子の組み合わせ)、
b)例えば、eiCas9分子(または例えば、eiCas9分子と第2のeiCa
s9分子などのCas9分子の組み合わせ)などのCas9分子をコードするDNAまた
はmRNAなどの核酸、
c)gRNA分子と共有結合または非共有結合的し、またはCas9分子の融合パー
トナーであるペイロード、
d)例えば、Cas9標的化gRNA分子などの支配gRNA分子
を含む組成物;
3)a)例えば、gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子な
どのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの核酸、
b)例えば、eiCas9分子(または例えば、eiCas9分子と第2のeiCa
s9分子などのCas9分子の組み合わせ)などのCas9分子、および
c)Cas9分子と共有結合または非共有結合するペイロード、および
d)例えば、gRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子
を含む組成物、;および/または
4)a)例えば、gRNA分子(または例えば、gRNA分子と第2のgRNA分子な
どのgRNA分子の組み合わせ)をコードするDNAなどの核酸、
b)例えば、eiCas9分子(または例えば、eiCas9分子と第2のeiCa
s9分子などのCas9分子の組み合わせ)などのCas9分子をコードするDNAまた
はmRNAなどの核酸)(ここでgRNA分子をコードする核酸およびeaCas9分子
をコードする核酸が、同一であるかまたは異なる分子であり得る)、
c)Cas9分子の融合パートナーであるペイロード、および
d)例えば、Cas9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの
支配gRNA分子
を含む組成物の有効量を対象に投与するステップを含む、標的核酸にペイロードを標的化
することで、対象を治療する方法を特徴とする。
s9分子またはeaCas9分子をコードする核酸は、1つの剤形、送達様式、または製
剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、Cas9標的化gR
NA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子(またはそれをコー
ドする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、または別の剤形、送達
様式、または製剤中で提供され得る。
送達様式形態または製剤中で、またはそれによって送達され;Cas9分子、またはCa
s9分子をコードする核酸は、第2の剤形、送達様式、または製剤中で、またはそれによ
って送達される。一実施形態では、例えば、Cas9標的化gRNA分子またはgRNA
標的化gRNA分子などの支配gRNA分子(またはそれをコードする核酸は、それが不
活性化する構成要素を含有する剤形中で、または別の剤形、送達様式、または製剤中で提
供され得る。
類、霊長類、またはヒト細胞である。
ヒト細胞などのヒト細胞の標的化を媒介する。一実施形態では、gRNAは、例えば、接
合体、胚盤胞または胎芽、胚盤胞細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コ
ンピテント細胞などの体細胞、胚芽細胞、出生前細胞の標的化を媒介する。一実施形態で
は、gRNAは、がん細胞または例えば、ウイルスゲノムの全部または一部などの望まれ
ないゲノム要素を含む細胞の標的化を媒介する。一実施形態では、gRNAは、染色体核
酸の標的化を媒介する。一実施形態では、gRNAは、選択されたゲノムシグネチャの標
的化を媒介する。一実施形態では、gRNAは、細胞小器官核酸の標的化を媒介する。一
実施形態では、gRNAは、ミトコンドリア核酸の標的化を媒介する。一実施形態では、
gRNAは、葉緑体核酸の標的化を媒介する。一実施形態では、gRNAは、例えば、ウ
イルス、細菌、真菌、原虫、または寄生生物などの疾患を引き起こす生物の核酸の標的化
を媒介する。一実施形態では、gRNAは、例えば、セクションVIIAからの、例えば
、表VII-11からのがん細胞のようながん細胞などの望まれない増殖によって特徴付
けられる細胞を標的化する。一実施形態では、gRNAは、例えば、ウイルスゲノム構成
要素などの望まれないゲノム構成要素によって特徴付けられる細胞を標的化する。
れる。一実施形態では、標的核酸は、再配置、キナーゼ遺伝子を含む再配置、または腫瘍
抑制遺伝子を含む再配置である。一実施形態では、標的核酸は、キナーゼ遺伝子または腫
瘍抑制遺伝子を含む。一実施形態では、gRNAは、例えば生殖細胞系変異または後天性
体細胞変異のような変異などの選択されたゲノムシグネチャを標的化する。
ウイルスに感染している細胞を標的化する。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、セクションVIで、本明細書に記載されるペイ
ロードを含む。
が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に
記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料が、本発明でまたは本発明の試験で
使用され得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、
全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照により
援用する。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図
されない。
提示を目的とし、制限は意図されない。
になるであろう。
い。
「支配gRNA分子」は、本明細書の用法では、Cas9分子と複合体を形成して、C
as9システムの構成要素を不活性化またはサイレンシングし得るgRNA分子を指す。
一実施形態では、支配gRNA分子は、Cas9分子をコードする配列を含む核酸を不活
性化またはサイレンシングする。一実施形態では、それは、gRNA分子をコードする配
列を含む核酸を不活性化またはサイレンシングする。一実施形態では、例えば、Cas9
標的化gRNA分子、またはgRNA標的化gRNA分子などの支配gRNAは、Cas
9分子/gRNA分子複合体-媒介遺伝子ターゲッティングの効果を制限する。一実施形
態では、それは、Cas9分子/gRNA分子複合体の活性に、時間的制限、発現レベル
制限、またはその他の制限を課す。一実施形態では、それは、オフターゲットまたはその
他の望まれない活性を低下させる。支配gRNA分子は、例えば、Cas9分子などのC
as9システムの構成要素の生成を例えば、完全に阻害しまたは実質的に阻害するように
作用し得て、それによってその活性を制限し、またはそれに影響を与える。
れる領域内または領域外の、負制御されるべき構成要素をコードする配列を含む核酸の任
意の領域を標的化し得る。
存在する核酸上の標的配列と相補的な標的化配列を含む。
配列を含む。
配列がある、核酸を標的化する標的配列を含み得る。
配列を含み得る。
する核酸を標的化する標的配列を含み得る。
配列を含み得る。
用される。特に断りのない限り、ドメインは、任意の特定の機能特性を有する必要はない
。
る)の計算は、次のようにして実施される。配列は、最適な比較目的で整列され(例えば
、最適アライメントのために、第1および第2のアミノ酸または核酸配列の片方または双
方にギャップが装入されることができ、非相同配列は比較目的で無視され得る)。最適ア
ライメントは、Blosum62重み行列による、ギャップペナルティ12、ギャップ延
長ペナルティ4、およびフレームシフトギャップペナルティ5で、GCGソフトウェアパ
ッケージのGAPプログラムを使用して、最高スコアとして評価される。次に対応するア
ミノ酸位置またはヌクレオチド配列部位にある、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較
する。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基または
ヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一である。(本明細
書の用法では、一実施形態では、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸
「相同性」と同等である)。2つの配列間の同一性百分率は、配列によって共有される同
一の位置数の関数である。
えば、酵素活性、転写活性、または翻訳活性)、量、分布、または構造を改変し得る薬剤
などの実体を指す。一実施形態では、調節は、例えば、共有結合または非共有結合の破壊
などの切断、または例えば、部分の対象分子への付着などの共有結合または非共有結合の
形成を含む。一実施形態では、修飾物質は、対象分子の三次元、二次、三次、または四次
構造を変化させる。修飾物質は、対象活性を増大させ、低下させ、開始し、または排除し
得る。
、50、60、70、80、90、または100kDの分子量を有する分子を指す。大分
子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、生物製剤、および炭水化物が挙げられる
。
ノ酸のポリマーを指す。一実施形態では、それは50、20、または10個未満のアミノ
酸残基を有する。
では、例えば、修飾または候補Cas9分子などである対象Cas9分子または対象gR
NA分子などの対象分子が、それに対して比較される分子を指す。例えば、Cas9分子
は、参照Cas9分子のヌクレアーゼ活性の10%以下を有するとして特徴付けられ得る
。参照Cas9分子の例としては、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、
またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)のCas9分子などである
、天然起源のCas9分子などの天然起源の未修飾Cas9分子が挙げられる。一実施形
態では、参照Cas9分子は、それが比較されるCas9分子と、最も近い配列同一性ま
たは相同性を有する天然起源のCas9分子である。一実施形態では、参照Cas9分子
は、例えば、変異などの変化がその上で起こった親形態である、天然起源または既知の配
列などの配列である。
の制限は必要でなく、置換実体が存在することのみを示す。
kD未満、または約0.75kD未満などの約2kD未満の分子量を有する化合物を指す
。
用語は、哺乳類(例えば、ヒト、その他の霊長類、ブタ、齧歯類(例えば、マウスおよび
ラットまたはハムスター)、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、お
よびヤギ)を含むが、これに限定されるものではない。一実施形態では、対象はヒトであ
る。一実施形態では、対象は家禽である。
reatment)」は、本明細書の用法では、例えば、(a)疾患を阻害し、すなわち
、その進行を抑止または予防し;(b)疾患を緩和し、すなわち、疾病状態の退縮を引き
起こし;または(c)疾患を治癒させることをはじめとする、例えば、ヒトなどの哺乳類
の疾患の治療を意味する。
アミノ酸(例えば、20個の天然アミノ酸のいずれか)を指す。
gRNA分子は、本明細書での用法では、gRNA分子/Cas9分子複合体の標的核
酸への特定の標的化または自動誘導を促進する核酸を指す。gRNA分子は、本明細書で
「キメラ」gRNAと称されることもある単分子(単一RNA分子を有する)、またはモ
ジュラー(2つ以上、典型的に2つの別々のRNA分子を含む)であり得る。gRNA分
子は、いくつかのドメインを含む。gRNA分子ドメインは、下で詳述される。典型的に
、gRNAは、例えば、プロセシングされたまたは成熟crRNAおよびプロセシングさ
れたまたは成熟tracrRNAの機能などのcrRNAおよびtracrRNAの双方
の機能または構造を取り入れる。キメラまたは単分子gRNA分子は、単一RNA分子を
有することができ、例えば、それは、crRNAの機能または構造およびtracrRN
Aの機能または構造の双方を取り入れる。モジュラーgRNA分子は、crRNA機能ま
たは構造を取り入れたRNA分子と、tracrRNA機能または構造を取り入れた別の
RNA分子を含み得る。その上にドメインが示されるいくつかの代表的なgRNA構造は
、図1に提供される。gRNAの活性形態の三次元形態、または鎖内または鎖間相互作用
に関する理論による拘束は望まないが、高度相補性領域は、図1で時に二本鎖として示さ
れ、その他の描写は、本明細書で提供される。
方向に、
例えば、(標的核酸と相補的な)15、16、17、18、19、または20ヌクレオ
チドなどを含む、標的化ドメイン、
第1の相補的ドメイン、
連結ドメイン、
(第1の相補的ドメインと相補的な)第2の相補的ドメイン、
隣接ドメイン、および
任意選択的に、テールドメイン
を含む。
標的化ドメイン(例えば、セクションVIIBで、例えば、表VII-13、VII-
14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18、VII-19、VI
I-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-24、IX-1、IX
-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVIIIで、本明細書に記載
される遺伝子または経路からの配列などの本明細書で開示される標的核酸からの標的配列
と相補的な)、および
第1の相補的ドメインを含む第1の鎖、および
好ましくは、5’から3’方向に、
任意選択的に、5’伸長ドメイン、
第2の相補的ドメイン、および
隣接ドメイン、および
任意選択的に、テールドメインを含む第2の鎖
を含む。
1)標的化ドメイン:
図1A~1Gは、標的化ドメインの配置の例を提供する。
たは95%相補的であり、例えば、完全に相補的である、相補的なヌクレオチド配列を含
む。標的化ドメインはRNA分子の一部であり、したがって塩基ウラシル(U)を含む一
方で、gRNA分子をコードする任意のDNAは、塩基チミン(T)を含む。理論による
拘束は望まないが、標的配列と標的化ドメインとの相補性は、標的核酸とgRNA分子/
Cas9分子複合体との相互作用の特異性に寄与すると考えられる。標的化ドメインおよ
び標的配列対合中では、標的化ドメイン中のウラシル塩基が、標的配列中のアデニン塩基
と対合するものと理解される。一実施形態では、標的ドメインそれ自体が、5’から3’
方向に、任意選択の二次ドメイン、およびコアドメインを含む。一実施形態では、コアド
メインは、標的配列と完全に相補的である。一実施形態では、標的化ドメインは、例えば
、10~40、例えば、10~30、例えば、15~30、例えば、15~25など、5
~50ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチド長である。
標的化ドメインがそれと相補的である標的核酸の鎖は、本明細書で相補鎖と称される。ド
メインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションXに見られる
修飾などの修飾を有し得る。
図1A~1Gは、第1の相補的ドメインの例を提供する。
2の相補的ドメインと、少なくともいくつかの生理的条件下で二重鎖領域を形成するのに
十分な相補性を有する。一実施形態では、第1の相補的ドメインは、5~30ヌクレオチ
ド長である。一実施形態では、第1の相補的ドメインは、5~25ヌクレオチド長である
。一実施形態では、第1の相補的ドメインは、7~25ヌクレオチド長である。一実施形
態では、第1の相補的ドメインは、7~22ヌクレオチド長である。一実施形態では、第
1の相補的ドメインは、7~18ヌクレオチド長である。一実施形態では、第1の相補的
ドメインは、7~15ヌクレオチド長である。一実施形態では、第1の相補的ドメインは
、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19
、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド長である。
中心サブドメイン、および3’サブドメインの、3つのサブドメインを含む。一実施形態
では、5’サブドメインは、例えば、4、5、6、7、8または9など、4~9ヌクレオ
チド長である。一実施形態では、中心サブドメインは、例えば、1など、1、2、または
3ヌクレオチド長である。一実施形態では、3’サブドメインは、例えば、4~22、4
~18、または4~10、または3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13
、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25な
ど、3~25ヌクレオチド長である。
はそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、S.ピオゲネス(S.pyog
enes)、またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)の第1の相補
的ドメインなどの本明細書で開示される第1の相補的ドメインと、少なくとも50%の相
同性を有する。
れる修飾などの修飾を有し得る。
図1B~1Eは、連結ドメインの例を提供する。
連結するのに役立つ。連結ドメインは、第1および第2の相補的ドメインを共有結合的に
または非共有結合的に連結し得る。一実施形態では、連結は、共有結合である。一実施形
態では、連結ドメインは、第1および第2の相補的ドメインと共有結合的に連結し、例え
ば、図1B~1Eを参照されたい。一実施形態では、連結ドメインは、第1の相補的ドメ
インと第2の相補的ドメインの間に挿入された共有結合であり、またはそれを含む。典型
的に、連結ドメインは、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10などの1
つまたは複数のヌクレオチドを含む。
2つの分子が結合されることができ、例えば、図1Aを参照されたい。
ンは、共有結合からなり得て、または例えば、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長
などの1つまたは少数のヌクレオチド程度に短くあり得る。
0、または25ヌクレオチド長以上である。一実施形態では、連結ドメインは、2~50
、2~40、2~30、2~20、2~10、または2~5ヌクレオチド長である。一実
施形態では、連結ドメインは、例えば、第2の相補的ドメインに対して5’であるtra
crRNAの配列などの天然起源の配列と相同性を共有し、またはそれに由来する。一実
施形態では、連結ドメインは、本明細書で開示される連結ドメインと、少なくとも50%
の相同性を有する。
れる修飾などの修飾を有し得る。
一実施形態では、モジュラーgRNAは、本明細書で5’伸長ドメインと称される、第
2の相補的ドメインに対して5’の追加的な配列を含むことができ、例えば、図1Aを参
照されたい。一実施形態では、5’伸長ドメインは、2~10、2~9、2~8、2~7
、2~6、2~5、2~4ヌクレオチド長である。一実施形態では、5’伸長ドメインは
、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド長以上である。
図1A~1Fは、第2の相補的ドメインの例を提供する。
2の相補的ドメインと、少なくともいくつかの生理的条件下で二重鎖領域を形成するのに
十分な相補性を有する。例えば、図1Aまたは図1Bに示されるように、一実施形態では
、第2の相補的ドメインは、例えば、二重鎖領域からループアウトする配列などの第1の
相補的ドメインとの相補性を欠く配列を含み得る。
態では、それは、第1の相補性領域より長い。
態では、第2の相補的ドメインは、7~25ヌクレオチド長である。一実施形態では、第
2の相補的ドメインは、7~20ヌクレオチド長である。一実施形態では、第2の相補的
ドメインは、7~17ヌクレオチド長である。一実施形態では、相補的ドメインは、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20
、21、22、23、24、または25ヌクレオチド長である。
中心サブドメイン、および3’サブドメインである、3つのサブドメインを含む。一実施
形態では、5’サブドメインは、例えば、4~22、4~18、または4~10、または
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18
、19、20、21、22、23、24、または25など、3~25ヌクレオチド長であ
る。一実施形態では、中心サブドメインは、例えば、3など、1、2、3、4または5ヌ
クレオチド長である。一実施形態では、3’サブドメインは、例えば、4、5、6、7、
8または9など、4~9ヌクレオチド長である。
、第2の相補的ドメインの3’サブドメインおよび5’サブドメインとそれぞれ相補的で
あり、例えば、完全に相補的である。
はそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、S.ピオゲネス(S.pyog
enes)、またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)の第1の相補
的ドメインなどの本明細書で開示される第2の相補的ドメインと、少なくとも50%の相
同性を有する。
れる修飾などの修飾を有し得る。
図1A~1Fは、隣接ドメインの例を提供する。
隣接ドメインは、天然起源の隣接ドメインと相同性を共有し、またはそれに由来し得る。
一実施形態では、それは、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、またはS
.サーモフィルス(S.thermophilus)隣接ドメインなどの本明細書で開示
される隣接ドメインと、少なくとも50%の相同性を有する。
れる修飾などの修飾を有し得る。
図1Aおよび図1C~1Fは、テールドメインの例を提供する。
テールドメインが、gRNA分子として使用するのに適する。一実施形態では、テールド
メインは、0(不在)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド
長である。一実施形態では、テールドメインヌクレオチドは、天然起源のテールドメイン
の5’末端からの配列に由来し、またはそれと相同性を共有し、例えば、図1Dまたは図
1Eを参照されたい。一実施形態では、テールドメインは、互いに相補的で、少なくとも
いくつかの生理的条件下では、二重鎖領域を形成する配列を含む。
る。一実施形態では、テールドメインは、天然起源の隣接テールドメインと相同性を共有
し、またはそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、S.ピオゲネス(S.
pyogenes)、またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)テー
ルドメインなどの本明細書で開示されるテールドメインと、少なくとも50%の相同性を
有する。
れる修飾などの修飾を有し得る。
転写法に関連する、3’末端のヌクレオチドを含む。gRNAのインビトロ転写のために
T7プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、DNAテンプレートの3
’末端より上流に存在する、任意のヌクレオチドであってもよい。インビボ転写のために
U6プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、UUUUUU配列であっ
てもよい。交互のpol-IIIプロモーターが利用される場合、これらのヌクレオチド
は、様々な数であってもまたはウラシル塩基であってもよく、または交互の塩基を含んで
もよい。
gRNAの「標的化ドメイン」は、標的核酸上の「標的ドメイン」と相補的である。g
RNAのコアドメインと相補的なヌクレオチド配列を含む標的核酸の鎖は、本明細書で、
標的核酸の「相補鎖」と称される。標的化ドメインの選択の指標は、例えば、Fu Y
et al.,NAT BIOTECHNOL 2014(doi:10.1038/n
bt.2808)、およびSternberg SH et al.,NATURE 2
014(doi:10.1038/nature13011)にある。
2、23、24、25、または26ヌクレオチド長である。
2、23、24、25、または26ヌクレオチド長を構成する。
0+/-5、50+/-5、60+/-5、70+/-5、80+/-5、90+/-5
、または100+/-5ヌクレオチド長である。
0、50+/-10、60+/-10、70+/-10、80+/-10、90+/-1
0、または100+/-10ヌクレオチド長である。
70、10~60、10~50、10~40、10~30、10~20または10~15
ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、20~100、20~90
、20~80、20~70、20~60、20~50、2040、20~30、または2
0~25ヌクレオチド長である。
ドメインは、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、1、2、3、4、
5、6、7または8ヌクレオチドを有し、またはそれを含む。
ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な1、2、3、4または5ヌクレオチドを含む
。一実施形態では、標的ドメインは、その3’末端の5ヌクレオチド以内にある、標的化
ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な1、2、3、4または5ヌクレオチドを含む
。
ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、1、2、3または4ヌクレオチドを含
む。一実施形態では、標的ドメインは、その3’末端の5ヌクレオチド以内にある、標的
化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、1、2、3または4ヌクレオチドを
含む。
の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
チド以内にあり、標的化ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または標的化
ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた、2つの連続する非
相補的ヌクレオチドなどの標的ドメインと相補的でない2連続ヌクレオチド(「非相補的
ヌクレオチド」)を含む。
インの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の
末端から5ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある2連続ヌクレオチドは、いずれも標
的化ドメインと相補的でない。
3’末端の5ヌクレオチド以内、または標的化ドメインの片方または双方の末端から5ヌ
クレオチドを超えて離れた領域内に、非相補的ヌクレオチドはない。
タイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、標的化ドメインは、例え
ば、分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生
体適合性にするための修飾などの1つまたは複数の修飾を含む。一例として、標的化ドメ
インの骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションXからのその他の修飾に
より、修飾され得る。一実施形態では、標的化ドメインのヌクレオチドは、例えば、2’
アセチル化、例えば、2’メチル化、またはセクションXからのその他の修飾などの2’
修飾(例えば、リボース上の2’位における修飾)を含み得る。
飾を含む。一実施形態では、標的化ドメインは、その5’末端の5ヌクレオチド以内にあ
る、1、2、3、または4つの修飾を含む。一実施形態では、標的化ドメインは、その3
’末端の5ヌクレオチド以内にある、1、2、3、または4程度の数の修飾を含む。
チド以内にあり、標的化ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または標的化
ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた2連続ヌクレオチド
などの2連続ヌクレオチドの修飾を含む。
インの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の
末端から5ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある2連続ヌクレオチドは、いずれも修
飾されていない。一実施形態では、標的化ドメインの5’末端の5ヌクレオチド以内にあ
り、標的化ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片
方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた領域内にあるヌクレオチドは、い
ずれも修飾されていない。
験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ
、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補標的化ドメインを有するgRNAは、
セクションIIIのシステム中で評価され得る。候補標的化ドメインは、選択された標的
について機能的であることが知られているgRNA分子/Cas9分子システム中に、単
独で配置され、または1つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得
る。
レオチドと相補的であり、ハイブリダイズできる。一実施形態では、1、2、3、4、5
、6、7または8つ以上の修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌク
レオチドと相補的でなくまたはハイブリダイズできない。
よびコアドメインを含む。これらのドメインは、下でより詳細に考察される。
標的化ドメインの「コアドメイン」は、標的核酸上の「コアドメイン標的」と相補的で
ある。一実施形態では、コアドメインは、標的化ドメインの3’末端から約8~約13ヌ
クレオチド(例えば、標的化ドメインの最も3’側の8~13ヌクレオチド)を含む。
、10+/-2、11+/-2、12+/-2、13+/-2、14+/-2、15+/
-2、または16+/-2ヌクレオチド長である。
15、または16ヌクレオチド長である。
9~13、9~12、9~11、または9~10などの8~13ヌクレオチド長である。
、7~13、7~12、7~11、7~10、8~14、8~13、8~12、8~11
、8~10、または8~9など、6~16ヌクレオチド長である。
ドメイン標的との正確な相補性を有する。一実施形態では、コアドメインは、コアドメイ
ンの対応するヌクレオチドと相補的でない、1、2、3、4または5ヌクレオチドを有し
得る。一実施形態では、相補性の程度は、gRNAのその他の性質と合わせて、Cas9
分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
相補的である。
6ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、12~17ヌクレオチド長である
。
5ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、12~17ヌクレオチド長である
。
4ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、11~16ヌクレオチド長である
。
3ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、10~15ヌクレオチド長である
。
2ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、9~14ヌクレオチド長である。
1ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、8~13ヌクレオチド長である。
0ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、7~12ヌクレオチド長である。
9ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、6~11ヌクレオチド長である。
8ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、5~10ヌクレオチド長である。
7ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、4~9ヌクレオチド長である。
6ヌクレオチド長であり、コアドメイン(標的化ドメインの3’末端から数えられる)が
、8~13ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、3~8ヌクレオチド長である。
11、12、13、14または15ヌクレオチド長である。
ドメイン標的との正確な相補性を有する。一実施形態では、二次ドメインは、二次ドメイ
ンの対応するヌクレオチドと相補的でない、1、2、3、4または5ヌクレオチドを有し
得る。一実施形態では、相補性の程度は、gRNAのその他の性質と合わせて、Cas9
分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
イプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、コアドメインは、例えば、
分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生体適
合性にするための修飾などの1つまたは複数の修飾を含む。一例として、コアドメインの
骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションXからのその他の修飾により、
修飾され得る。一実施形態では、コアドメインのヌクレオチドは、例えば、2’アセチル
化、例えば、2’メチル化、または、セクションXからのその他の修飾などの2’修飾(
例えば、リボース上の2’位における修飾)を含み得る。典型的に、コアドメインは、1
、2、または3つ以下の修飾を含有する。
することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、
配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補コアドメインを有するgRNAは、セク
ションIIIに記載されるシステム中で評価され得る。候補コアドメインは、選択された
標的について機能的であることが知られているgRNA分子/Cas9分子システム中に
、単独で配置され、または1つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価さ
れ得る。
イプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、二次ドメインは、例えば、
分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生体適
合性にするための修飾などの1つまたは複数の修飾を含む。一例として、二次ドメインの
骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションXからのその他の修飾により、
修飾され得る。一実施形態では、二次ドメインのヌクレオチドは、例えば、2’アセチル
化、例えば、2’メチル化、またはセクションXからのその他の修飾などの2’修飾(例
えば、リボース上の2’位における修飾)を含み得る。典型的に、二次ドメインは、1、
2、または3つ以下の修飾を含有する。
することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、
配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補二次ドメインを有するgRNAは、セク
ションIIIに記載されるシステム中で評価され得る。候補二次ドメインは、選択された
標的について機能的であることが知られているgRNA分子/Cas9分子システム中に
、単独で配置され、または1つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価さ
れ得る。
ドメインとその標的の間の相補性程度は、異なってもよい。一実施形態では、(1)が、
(2)を上回ってもよい。一実施形態では、(1)が、(2)を下回ってもよい。一実施
形態では、(1)および(2)が同一であってもよく、例えば、それぞれが、その標的と
完全に相補的であってもよい。
からの修飾)、および(2)二次ドメインのヌクレオチドの修飾数(例えば、セクション
Xからの修飾)は、異なってもよい。一実施形態では、(1)が、(2)を下回ってもよ
い。一実施形態では、(1)が、(2)を上回ってもよい。一実施形態では、(1)およ
び(2)が同一であってもよく、例えば、それぞれが、修飾を含まなくてもよい。
第1の相補的ドメインは、第2の相補的ドメインと相補的である。
一実施形態では、第1の相補的ドメインは、第2の相補的ドメインの対応するヌクレオチ
ドと相補的でない1、2、3、4または5ヌクレオチドを有し得る。一実施形態では、例
えば、3ヌクレオチドなどの1、2、3、4、5または6ヌクレオチドは、二本鎖中で対
合せず、例えば、非二重鎖領域またはループアウト領域を形成する。一実施形態では、例
えば、3ヌクレオチドのループアウトなどの不対またはループアウト領域が、第2の相補
的ドメイン上に存在する。一実施形態では、不対領域は、第2の相補的ドメインの5’末
端から例えば、4番目などの1、2、3、4、5、または6番目のヌクレオチドで開始す
る。
の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
独立して、6+/-2、7+/-2、8+/-2、9+/-2、10+/-2、11+
/-2、12+/-2、13+/-2、14+/-2、15+/-2、16+/-2、1
7+/-2、18+/-2、19+/-2、もしくは20+/-2、21+/-2、22
+/-2、23+/-2、もしくは24+/-2ヌクレオチド長;
独立して、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19
、20、21、22、23、24、25、もしくは26ヌクレオチド長;または
独立して、5~24、5~23、5~22、5~21、5~20、7~18、9~16
、もしくは10~14ヌクレオチド長
である。
レオチドが6個分より長いなど、例えば、2、3、4、5、または6個分より長い。
Xで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。
分解の影響を受けにくくする、または例えば、それをより低い免疫原性などより生体適合
性にする修飾などの1つまたは複数の修飾を含む。一例として、ドメインの骨格は、ホス
ホロチオエートにより、または、セクションXからのその他の修飾により、修飾され得る
。一実施形態では、ドメインのヌクレオチドは、例えば、2’アセチル化、例えば、2’
メチル化、またはセクションXからのその他の修飾などの2’修飾(例えば、リボース上
の2’位における修飾)を含み得る。
、6、7または8つ以上の修飾を含む。一実施形態では、第1および第2の相補的ドメイ
ンは、独立して、その5’末端の5ヌクレオチド以内に、1、2、3、または4つの修飾
を含む。一実施形態では、第1および第2の相補的ドメインは、独立して、その3’末端
の2ヌクレオチド以内に、1、2、3、または4程度の数の修飾を含む。
5’末端の5ヌクレオチド以内にあり、ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり
、またはドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた2連続ヌク
レオチドなどの2連続ヌクレオチドに、修飾を含む。一実施形態では、第1および第2の
相補的ドメインは、独立して、ドメインの5’末端の5ヌクレオチド以内にあり、ドメイ
ンの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、またはドメインの片方または双方の末端から
5ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある修飾された2連続ヌクレオチドを含まない。
一実施形態では、第1および第2の相補的ドメインは、独立して、ドメインの5’末端の
5ヌクレオチド以内にあり、ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、またはド
メインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある、修飾さ
れたヌクレオチドを含まない。
験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ
、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補相補的ドメインを有するgRNAは、
セクションIIIに記載されるシステム中で評価され得る。候補相補的ドメインは、選択
された標的について機能的であることが知られているgRNA分子/Cas9分子システ
ム中に、単独で配置され、または1つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、
評価され得る。
nes)、またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)などの天然起源
の第1の相補的ドメイン、または例えば、図1A~1Fなどで本明細書に記載される第1
の相補的ドメインなどの、参照の第1の相補的ドメインと、少なくとも60、70、80
、85%、90%、または95%の相同性を有し、またはそれと1、2、3、4、5、ま
たは6個以下のヌクレオチドが異なる。
nes)、またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)などの天然起源
の第2の相補的ドメイン、または例えば、図1A~1Fなどで本明細書に記載される第2
の相補的ドメインなどの、参照の第2の相補的ドメインと、少なくとも60、70、80
、85%、90%、または95%の相同性を有し、またはそれと1、2、3、4、5、ま
たは6個以下のヌクレオチドが異なる。
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21ま
たは22塩基対長である(任意のループアウトまたは不対ヌクレオチドを除いて)。
一実施形態では、モジュラーgRNAは、第2の相補的ドメインに対して5’の追加的
な配列を含み得る。一実施形態では、5’伸長ドメインは、2~10、2~9、2~8、
2~7、2~6、2~5、または2~4ヌクレオチド長である。一実施形態では、5’伸
長ドメインは、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド長以上である
。
るタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、5’伸長ドメインは、
例えば、分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などによ
り生体適合性にするための修飾などの1つまたは複数の修飾を含む。一例として、5’伸
長ドメインの骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションXからのその他の
修飾により、、修飾され得る。一実施形態では、5’伸長ドメインのヌクレオチドは、例
えば、2’アセチル化、例えば、2’メチル化、またはセクションXからのその他の修飾
などの2’修飾(例えば、リボース上の2’位における修飾)を含み得る。
の修飾を含み得る。一実施形態では、5’伸長ドメインは、例えば、モジュラーgRNA
分子中などのその5’末端の5ヌクレオチド以内に、1、2、3、または4程度の数の修
飾を含む。一実施形態では、5’伸長ドメインは、例えば、モジュラーgRNA分子中な
どのその3’末端の5ヌクレオチド以内に、1、2、3、または4程度の数の修飾を含む
。
レオチド以内にあり、5’伸長ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または
5’伸長ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた2連続ヌク
レオチドなどの2連続ヌクレオチドに、修飾を含む。一実施形態では、5’伸長ドメイン
の5’末端の5ヌクレオチド以内にあり、5’伸長ドメインの3’末端の5ヌクレオチド
以内にあり、または5’伸長ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超え
て離れた2連続ヌクレオチドは、修飾されていない。一実施形態では、5’伸長ドメイン
の5’末端の5ヌクレオチド以内にあり、5’伸長ドメインの3’末端の5ヌクレオチド
以内にあり、または5’伸長ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超え
て離れたクレオチドは、修飾されていない。
試験することで評価されるgRNA分子効率を妨げないように、選択され得る。選択され
た長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補5’伸長ドメインを有するgR
NAは、セクションIIIに記載されるシステム中で評価され得る。候補5’伸長ドメイ
ンは、選択された標的について機能的であることが知られているgRNA分子/Cas9
分子システム中に、単独で配置され、または1つまたは複数のその他の候補変化と共に配
置されて、評価され得る。
s)、またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)などの天然起源の5
’伸長ドメインと、例えば、図1Aおよび図1Fで本明細書に記載される5’伸長ドメイ
ンなどの参照5’伸長ドメインと、少なくとも60、70、80、85、90または95
%の相同性を有し、またはそれと1、2、3、4、5、または6個以下のヌクレオチドが
異なる。
単分子gRNA分子中では、連結ドメインは、第1および第2の相補的ドメインの間に
配置される。モジュラーgRNA分子中では、2つの分子は、互いに相補的ドメインによ
って結合する。
+/-5、50+/-5、60+/-5、70+/-5、80+/-5、90+/-5、
または100+/-5ヌクレオチド長である。
、50+/-10、60+/-10、70+/-10、80+/-10、90+/-10
、または100+/-10ヌクレオチド長である。
0、10~60、10~50、10~40、10~30、10~20または10~15ヌ
クレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、20~100、20~90、
20~80、20~70、20~60、20~50、20~40、20~30、または2
0~25ヌクレオチド長である。
、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド長である
。
/または第2の相補的ドメインの5’末端に隣接するもしくは末端から1、2もしくは3
ヌクレオチド以内である、二重鎖領域を含む。一実施形態では、二重鎖領域は、20+/
-10、30+/-10、40、+/-10または50+/-10塩基対の長さであり得
る。一実施形態では、二重鎖領域は、10+/-5、15+/-5、20+/-5、また
は30+/-5塩基対の長さであり得る。一実施形態では、二重鎖領域は、1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15塩基対の長さであ
り得る。
では1、2、3、4、5、6、7または8個程度の数のヌクレオチドが、対応するヌクレ
オチドと相補的でない。
イプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、連結ドメインは、例えば、
分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生体適
合性にするための修飾などの1つまたは複数の修飾を含む。一例として、連結ドメインの
骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションXからのその他の修飾により、
、修飾され得る。一実施形態では、連結ドメインのヌクレオチドは、例えば、2’アセチ
ル化、例えば、2’メチル化、またはセクションXからのその他の修飾などの2’修飾(
例えば、リボース上の2’位における修飾)を含み得る。
飾を含み得る。
することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、
配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補連結ドメインを有するgRNAは、セク
ションIIIに記載されるシステム中で評価され得る。候補連結ドメインは、選択された
標的について機能的であることが知られているgRNA分子/Cas9分子システム中に
、単独で配置され、または1つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価さ
れ得る。
ドメインなどの参照連結ドメインと、少なくとも60、70、80、85、90または9
5%の相同性を有し、またそれと1、2、3、4、5,または6個以下のヌクレオチドが
異なる。
一実施形態では、隣接ドメインは、6+/-2、7+/-2、8+/-2、9+/-2
、10+/-2、11+/-2、12+/-2、13+/-2、14+/-2、14+/
-2、16+/-2、17+/-2、18+/-2、19+/-2、または20+/-2
ヌクレオチド長である。
14、16、17、18、19、または20ヌクレオチド長である。
ヌクレオチド長である。
イプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、隣接ドメインは、例えば、
分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生体適
合性にするための修飾などの1つまたは複数の修飾を含む。一例として、隣接ドメインの
骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションXからのその他の修飾により、
、修飾され得る。一実施形態では、隣接ドメインのヌクレオチドは、例えば、2’アセチ
ル化、例えば、2’メチル化、またはセクションXからのその他の修飾などの2’修飾(
例えば、リボース上の2’位における修飾)を含み得る。
飾を含み得る。一実施形態では、隣接ドメインは、例えば、モジュラーgRNA分子中な
どのその5’末端の5ヌクレオチド以内に、1、2、3、または4程度の数の修飾を含む
。一実施形態では、標的ドメインは、例えば、モジュラーgRNA分子中などのその3’
末端の5ヌクレオチド以内に、1、2、3、または4程度の数の修飾を含む。
以内にあり、隣接ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または隣接ドメイン
の片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた2連続ヌクレオチドなどの2
連続ヌクレオチドの修飾を含む。一実施形態では、隣接ドメインの5’末端の5ヌクレオ
チド以内にあり、隣接ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または隣接ドメ
インの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた2連続ヌクレオチドは、
修飾されていない。一実施形態では、隣接ドメインの5’末端の5ヌクレオチド以内にあ
り、隣接ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または隣接ドメインの片方ま
たは双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れたヌクレオチドは、修飾されていない。
することで評価されるgRNA分子効率を妨げないように、選択され得る。選択された長
さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補隣接ドメインを有するgRNAは、
セクションIIIに記載されるシステム中で評価され得る。候補隣接ドメインは、選択さ
れた標的について機能的であることが知られているgRNA分子/Cas9分子システム
中に、単独で配置され、または1つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評
価され得る。
、またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)などの天然起源の隣接ド
メインと、または例えば、図1A~1Fで本明細書に記載される隣接ドメインなどの参照
隣接ドメインと、少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、または95%の
相同性を有し、またはそれと1、2、3、4、5,または6個以下のヌクレオチドが異な
る。
一実施形態では、テールドメインは、10+/-5、20+/-5、30+/-5、4
0+/-5、50+/-5、60+/-5、70+/-5、80+/-5、90+/-5
、または100+/-5ヌクレオチド長である。
0、50+/-10、60+/-10、70+/-10、80+/-10、90+/-1
0、または100+/-10ヌクレオチド長である。
70、10~60、10~50、10~40、10~30、10~20または10~15
ヌクレオチド長である。
70、20~60、20~50、20~40、20~30、または20~25ヌクレオチ
ド長である。
レオチド長である。
タイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、テールドメインは、例え
ば、分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生
体適合性にするための修飾などの1つまたは複数の修飾を含む。一例として、テールドメ
インの骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションXからのその他の修飾に
より、、修飾され得る。一実施形態では、テールドメインのヌクレオチドは、例えば、2
’アセチル化、例えば、2’メチル化、またはセクションXからのその他の修飾などの2
’修飾(例えば、リボース上の2’位における修飾)を含み得る。
修飾を有し得る。一実施形態では、標的ドメインは、その5’末端の5ヌクレオチド以内
に、1、2、3、または4程度の数の修飾を含む。一実施形態では、標的ドメインは、そ
の3’末端の5ヌクレオチド以内に、1、2、3、または4程度の数の修飾を含む。
メインを含む。一実施形態では、テール二重鎖領域は、3、4、5、6、7、8、9、1
0、11、または12塩基対の長さであり得る。一実施形態では、テール二重鎖ドメイン
に対して3’に、さらなる一本鎖ドメインが存在する。一実施形態では、このドメインは
、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド長である。一実施形態では、こ
れは、4~6ヌクレオチド長である。
)、またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)の天然起源のテールド
メイン、または例えば、図1Aおよび図1C~1Fで本明細書に記載されるテールドメイ
ンなどの参照テールドメインと、少なくとも60、70、80、または90%の相同性を
有し、または1、2、3、4、5,または6個以下のヌクレオチドが異なる。
れる場合などに、3’配列UUUUUUを含む。
れる場合などに、3’配列UUUUを含む。
の終結シグナル次第で、可変の3’Uの数を含む。
プレートに由来する可変の3’配列を含む。
転写が使用される場合などに、DNAテンプレートに由来する可変の3’配列を含む。
モーターが使用される場合などに、DNAテンプレートに由来する可変の3’配列を含む
。
験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ
、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補テールドメインを有するgRNAは、
セクションIIIに記載されるシステム中で評価され得る。候補テールドメインは、選択
された標的について機能的であることが知られているgRNA分子/Cas9分子システ
ム中に、単独で配置され、または1つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、
評価され得る。
チド以内にあり、テールドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、またはテール
ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた2連続ヌクレオチド
などの2連続ヌクレオチドの修飾を含む。一実施形態では、テールドメインの5’末端の
5ヌクレオチド以内にあり、テールドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、ま
たはテールドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた2連続ヌ
クレオチドは、修飾されていない。一実施形態では、テールドメインの5’末端の5ヌク
レオチド以内にあり、テールドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、またはテ
ールドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れたヌクレオチドは
、修飾されていない。
5’[標的化ドメイン]-[第1の相補的ドメイン]-[連結ドメイン]-[第2の相
補的ドメイン]-[隣接ドメイン]-[テールドメイン]-3’の構造を有し、
式中、
標的化ドメインは、コアドメインおよび任意選択的に二次ドメインを含み、10~50
ヌクレオチド長であり、
第1の相補的ドメインは、5~25ヌクレオチド長であり、一実施形態では、本明細書
で開示される参照の第1の相補的ドメインと、少なくとも50、60、70、80、85
、90、または95%の相同性を有し、
連結ドメインは、1~5ヌクレオチド長であり、
隣接ドメインは、5~20ヌクレオチド長であり、一実施形態では、本明細書で開示さ
れる参照隣接相補的ドメインと、少なくとも50、60、70、80、85、90、また
は95%の相同性を有し、
かつ、
テールドメインは不在であり、またはヌクレオチド配列は、1~50ヌクレオチド長で
あり、一実施形態では、本明細書で開示される参照テールドメインと、少なくとも50、
60、70、80、85、90または95%の相同性を有する。
一実施形態では、単分子gRNAまたはキメラgRNAは、好ましくは、5’から3方
向に、
例えば、(標的核酸と相補的な)15、16、17、18、19、または20ヌクレオ
チドなどを含む標的化ドメイン、
第1の相補的ドメイン、
連結ドメイン、
(第1の相補的ドメインと相補的な)第2の相補的ドメイン、
隣接ドメイン、および
テールドメイン
を含み、
式中、
(a)隣接およびテールドメインは、両者あわせて、少なくとも15、18、20、25
、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドを含み;
(b)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少なくとも15、18、
20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドがあ
り;または
(c)第1の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメイ
ンの最後のヌクレオチドの3’側に、少なくとも16、19、21、26、31、32、
36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドが存在する。
対応する配列と、または本明細書に記載されるgRNAと、少なくとも60、75、80
、85、90、95、または99%の相同性を有する。
、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドを
含む。
15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌク
レオチドが存在する。
相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少なくとも16、19、21、26、
31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドが存在する。
18、19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチド(例えば、16、1
7、18、19、20、21、22、23、24または25連続ヌクレオチド)を含み、
それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、16、17、18、19
、20、21、22、23、24または25ヌクレオチド長である。
チド(例えば、16連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、16ヌクレオチド長である。
チド(例えば、17連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、17ヌクレオチド長である。
チド(例えば、18連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である。
チド(例えば、19連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である。
チド(例えば、20連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である。
チド(例えば、21連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である。
チド(例えば、22連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である。
チド(例えば、23連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である。
チド(例えば、24連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、24ヌクレオチド長である。
チド(例えば、25連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、25ヌクレオチド長である。
チド(例えば、26連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、26ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは
、標的ドメインとの相補性を有する、16ヌクレオチド(例えば、16連続ヌクレオチド
)を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、16ヌクレオ
チド長である。隣接およびテールドメインは、両者あわせて、少なくとも15、18、2
0、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドを含む
。
チド(例えば、16連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、16ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、16連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、16ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、17連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、17ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、17連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、17ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、17連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、17ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、18連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、18連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、18連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、19連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、19連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、19連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、20連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、20ヌクレオチド長であり、隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、20連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、20連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、21連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、21連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、21連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、22連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、22連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、22ヌクレオチド長であり;第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、22連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、23連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、23連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、23連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、24連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、24ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、24連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、24ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、24連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、24ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、25連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、25ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、25連続ヌクレオチド)を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ド
メインは、25ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3
’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、5
0、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、25連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、25ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、26連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、26ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、26連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、26ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、26連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、26ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、モジュラーgRNAは、
好ましくは、5’から3’方向に、
例えば、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドを含む標的化ドメイ
ン、
第1の相補的ドメイン
を含む第1の鎖と、
好ましくは、5’から3’方向に、
任意選択的に、5’伸長ドメイン、
第2の相補的ドメイン、
隣接ドメイン、および
テールドメイン
を含む第2の鎖と
を含み、
式中、
(a)隣接およびテールドメインは、両者あわせて、少なくとも15、18、20、25
、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドを含み、
(b)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少なくとも15、18、
20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドがあ
り、または
(c)第1の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメイ
ンの最後のヌクレオチドの3’側に、少なくとも16、19、21、26、31、32、
36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドが存在する。
対応する配列と、または本明細書に記載されるgRNAと、少なくとも60、75、80
、85、90、95、または99%の相同性を有する。
、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドを
含む。
15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌク
レオチドが存在する。
相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少なくとも16、19、21、26、
31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドが存在する。
18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチド(例えば、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26連続ヌクレ
オチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチド長で
ある。
チド(例えば、16連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、16ヌクレオチド長である。
チド(例えば、17連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、17ヌクレオチド長である。
チド(例えば、18連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である。
チド(例えば、19連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である。
チド(例えば、20連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である。
チド(例えば、21連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である。
チド(例えば、22連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である。
チド(例えば、23連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である。
チド(例えば、24連続ヌクレオチド)を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ド
メインは、24ヌクレオチド長である。
チド(例えば、25連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、5ヌクレオチド長である。
チド(例えば、26連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、5ヌクレオチド長である。
チド(例えば、16連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、16ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、16連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、16ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、16連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、16ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、17連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、17ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、17連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、17ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、17連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、17ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、18連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、18連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、18連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、19連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、19連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、19連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、20連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、20連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、20連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、21連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、21連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、21連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、22連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、22連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、22連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、23連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、23連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、23連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、24連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、24ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、24連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、24ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、24連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、24ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、25連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、25ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、25連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、25ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、25連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、25ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、26連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、26ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、
50、または53ヌクレオチドを含む。
チド(例えば、26連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、26ヌクレオチド長である。第2の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの3’側に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、4
5、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
チド(例えば、26連続ヌクレオチド)を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、26ヌクレオチド長である。第1の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少な
くとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または5
4ヌクレオチドが存在する。
標的ドメインを選択し、デザインし、検証する方法をはじめとする、gRNAをデザイ
ンする方法が本明細書に記載される。代表的な標的化ドメインもまた、本明細書で提供さ
れる。本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるgRNAに組み込
むことができる。
et al.,2013 SCIENCE 339(6121):823-826;H
su et al.,2013 NAT BIOTECHNOL,31(9):827-
32;Fu et al.,2014 NAT BIOTECHNOL,doi:10.
1038/nbt.2808.PubMed PMID:24463574;Heigw
er et al.,2014 NAT METHODS 11(2):122-3.d
oi:10.1038/nmeth.2812.PubMed PMID:244812
16;Bae et al.,2014 BIOINFORMATICS PubMed
PMID:24463181;Xiao A et al.,2014 BIOINF
ORMATICS PubMed PMID:24389662に記載される。
ット活性の最小化など、使用者の標的配列内のgRNAの選択が最適化され得る。オフタ
ーゲット活性は、切断以外であってもよい。例えば、S.ピオゲネス(S.pyogen
es)Cas9を使用して、想定される各gRNA選択肢について、ツールは、最大で一
定の数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個)のミスマッチ塩
基対を含有する、(例えば、NAGまたはNGG PAMのどちらかに先行する)ゲノム
全体にわたる全てのオフターゲット配列を同定し得る。各オフターゲット配列における切
断効率は、例えば、実験的に誘導される重みづけスキームを使用して予測され得る。次に
、想定される各gRNAが、その総予測オフターゲット切断に従って格付けされ、最高位
のgRNAは、最大のオンターゲットと最小のオフターゲット切断を有する可能性が高い
ものに相当する。例えば、CRISPR構築のための自動化された試薬デザイン、オンタ
ーゲットサーベイヤーアッセイ用のプライマーデザイン、および次世代シーケンシングを
介したオフターゲット切断のハイスループット検出と定量化のためのプライマーデザイン
などのその他の機能もまた、ツールに含め得る。候補gRNA分子は、当該技術分野で周
知の方法によって、または本明細書のセクションIVに記載されたようにして、評価され
得る。
多様な生物種のCas9分子が、本明細書に記載される方法および組成物で使用され得
る。S.ピオゲネス(S.pyogenes)およびS.サーモフィルス(S.ther
mophilus)Cas9分子が、本明細書の開示の多くの対象である一方で、本明細
書で列挙されるその他の生物種からの、それに由来する、またはそのCas9タンパク質
をベースとする、Cas9分子もまた使用され得る。換言すれば、本明細書の記述の多く
が、S.ピオゲネス(S.pyogenes)およびS.サーモフィルス(S.ther
mophilus)Cas9分子を利用する一方で、例えば、スタフィロコッカス・アウ
レウス(Staphylococcus aureus)およびナイセリア・メニンジチ
ディス(Neisseria meningitidis)のCas9分子などのその他
の生物種からのCas9分子が、それらを置き換え得る。追加的なCas9種としては、
アシドボラクス・アベナエ(Acidovorax avenae)、アクチノバチルス
・プルロニューモニアエ(Actinobacillus pleuropneumon
iae)、アクチノバチルス・サクシノゲネス(Actinobacillus suc
cinogenes)、アクチノバチルス・スイス(Actinobacillus s
uis)、アクチノミセス属(Actinomyces)種、アリシクリフィルス・デニ
トリフィカンス(Alicycliphilus denitrificans)(cy
cliphilus denitrificans)、アミノモナス・パウシボランス(
Aminomonas paucivorans)、バチルス・セレウス(Bacill
us cereus)、バチルス・スミシイ(Bacillus smithii)、バ
チルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バ
クテロイデス属(Bacteroides)種、ブラストピレルラ・マリナ(Blast
opirellula marina)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizo
bium)種、ブレビバチルス・ラテロスポラス(Brevibacillus lat
erosporus)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter col
i)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、
カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンジダツス・プ
ニセイスピリルム(Candidatus puniceispirillum)(Ca
ndidatus Puniceispirillum)、クロストリジウム・セルロリ
チカム(Clostridium cellulolyticum)、クロストリジウム
・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コリネバク
テリウム・アクコレンス(Corynebacterium accolens)、コリ
ネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheria
)、コリネバクテリウム・マトルコチイ(Corynebacterium matru
chotii)、ディノロセオバクター・シバエ(Dinoroseobacter s
hibae)、ユウバクテリウム・ドリクム(Eubacterium dolichu
m)、ガンマプロテオバクテリア綱(gamma proteobacterium)、
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス(Gluconacetobacter
diazotrophicus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemop
hilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・スプトラム(Haemo
philus sputorum)、ヘリコバクター・カナデンシス(Helicoba
cter canadensis)、ヘリコバクター・シナエディ(Helicobac
ter cinaedi)、ヘリコバクター・ムステラエ(Helicobacter
mustelae)、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter poly
tropus)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ラクトバチ
ルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、リステリ
ア・イバノビイ(Listeria ivanovii)、リステリア・モノサイトゲネ
ス(Listeria monocytogenes)、リステリア科(Listeri
aceae)細菌、メチロシスチス科(Methylocystis)種、メチロシナス
・トリコスポリウム(Methylosinus trichosporium)、モビ
ルンカス・ムリエリス(Mobiluncus mulieris)、ナイセリア・バシ
リフォルミス(Neisseria bacilliformis)、ナイセリア・シネ
レア(Neisseria cinerea)、ナイセリア・フラベッセンス(Neis
seria flavescens)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria
lactamica)、ナイセリア属(Neisseria)種、ナイセリア・ワズワー
シイ(Neisseria wadsworthii)、ニトロソモナス属(Nitro
somonas)種、パルビバクラム・ラバメンチボランス(Parvibaculum
lavamentivorans)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurell
a multocida)、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス(Ph
ascolarctobacterium succinatutens)、ラルストニ
ア・シジジイ(Ralstonia syzygii)、ロドシュードモナス・パルスト
リス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドブラム属(Rh
odovulum)種、シモンシエラ・ムエレリ(Simonsiella muell
eri)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)種、スポロラクトバチルス
・ビネア(Sporolactobacillus vineae)、スタフィロコッカ
ス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、ス
トレプトコッカス属(Streptococcus)種、サブドリグラヌルム属(Sub
doligranulum)種、チストレラ・モビリス(Tistrella mobi
lis)、トレポネーマ属(Treponema)種、またはベルミネフロバクター・エ
イセニア(Verminephrobacter eiseniae)が挙げられる。
子と協調して、標的ドメインおよびPAM配列を含む部位に局在する(例えば、標的とし
または追尾する)分子を指す。
を切断する能力があるCas9分子は、本明細書でeaCas9(酵素的に活性なCas
9)分子と称される。一実施形態では、eaCas9分子は、以下の機能の1つまたは複
数を含む。
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を
切断する能力、
一実施形態では2つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわ
ち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力、
エンドヌクレアーゼ活性、
エキソヌクレアーゼ活性、および
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
を切断して、二本鎖切断をもたらす。一実施形態では、eaCas9分子は、例えば、そ
れに対してgRNAがハイブリダイズする鎖、またはgRNAとハイブリダイズする鎖と
相補的な鎖などの1本の鎖のみを切断する。一実施形態では、eaCas9分子は、HN
H様ドメインに関連した切断活性を含む。一実施形態では、eaCas9分子は、N末端
RuvC様ドメインに関連した切断活性を含む。一実施形態では、eaCas9分子は、
HNH様ドメインに関連した切断活性と、N末端RuvC様ドメインに関連した切断活性
とを含む。一実施形態では、eaCas9分子は、活性のまたは切断能力があるHNH様
ドメインと、不活性のまたは切断能力がないN末端RuvC様ドメインとを含む。一実施
形態では、eaCas9分子は、不活性のまたは切断能力がないHNH様ドメインと、活
性のまたは切断能力があるN末端RuvC様ドメインとを含む。
配列依存性である。PAM配列は、標的核酸中の配列である。一実施形態では、標的核酸
の切断は、PAM配列の上流で起こる。異なる細菌種からのeaCas9分子は、異なる
配列モチーフ(例えば、PAM配列)を認識し得る。一実施形態では、S.ピオゲネス(
S.pyogenes)のeaCas9分子は、配列モチーフNGGを認識して、その配
列から、例えば、3~5塩基対などの1~10塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導
する。例えば、Mali et al.,SCIENCE 2013;339(6121
):823-826を参照されたい。一実施形態では、S.サーモフィルス(S.the
rmophilus)のeaCas9分子は、配列モチーフNGGNGおよびNNAGA
AW(W=AまたはT)を認識して、これらの配列の例えば、3~5塩基対などの1~1
0塩基対上流で、コア標的核酸配列の切断を誘導する。例えば、Horvath et
al.,SCIENCE 2010;327(5962):167-170、およびDe
veau et al.,J BACTERIOL 2008;190(4):1390
-1400を参照されたい。一実施形態では、S.ミュータンス(S.mutans)の
eaCas9分子は、配列モチーフNGGまたはNAAR(R=AまたはG)を認識して
、この配列の例えば、3~5塩基対など1~10塩基対上流で、コア標的核酸配列切断を
誘導する。例えば、Deveau et al.,J BACTERIOL 2008;
190(4):1390-1400を参照されたい。一実施形態では、S.アウレウス(
S.aureus)のCas9分子は、配列モチーフNNGRR(R=AまたはG)を認
識して、例えば、その配列から3~5塩基対上流などの1~10塩基対上流の標的核酸配
列の切断を誘導する。一実施形態では、N.メニンジチディス(N.meningiti
dis)のCas9分子は、配列モチーフNNNNGATTを認識して、例えば、その配
列から3~5塩基対上流などの標的核酸配列の1~10塩基対上流の切断を誘導する。例
えば、Hou et al.,PNAS EARLY EDITION 2013,1-
6を参照されたい。Cas9分子が、PAM配列を認識する能力は、例えば、Jinek
et al.,SCIENCE 2012,337:816に記載される形質転換アッ
セイを使用して判定され得る。
併せて、コア標的ドメインを追尾する(例えば、標的化または局在化される)が、標的核
酸を切断できず、または効率的な速度で切断できない。切断活性を有しない、または実質
的に有しないCas9分子は、本明細書でeiCas9(酵素的に不活性なCas9)分
子と称される。例えば、eiCas9分子は、切断活性を欠如し、または本明細書に記載
されるアッセイによる測定で、例えば、参照Cas9分子の切断活性の20、10、5、
1または0.1%未満である、実質的により低い切断活性を有し得る。
iology 2013;10:5,727-737に記載される。このようなCas9
分子としては、クラスター1細菌科、クラスター2細菌科、クラスター3細菌科、クラス
ター4細菌科、クラスター5細菌科、クラスター6細菌科、クラスター7細菌科、クラス
ター8細菌科、クラスター9細菌科、クラスター10細菌科、クラスター11細菌科、ク
ラスター12細菌科、クラスター13細菌科、クラスター14細菌科、クラスター15細
菌科、クラスター16細菌科、クラスター17細菌科、クラスター18細菌科、クラスタ
ー19細菌科、クラスター20細菌科、クラスター21細菌科、クラスター22細菌科、
クラスター23細菌科、クラスター24細菌科、クラスター25細菌科、クラスター26
細菌科、クラスター27細菌科、クラスター28細菌科、クラスター29細菌科、クラス
ター30細菌科、クラスター31細菌科、クラスター32細菌科、クラスター33細菌科
、クラスター34細菌科、クラスター35細菌科、クラスター36細菌科、クラスター3
7細菌科、クラスター38細菌科、クラスター39細菌科、クラスター40細菌科、クラ
スター41細菌科、クラスター42細菌科、クラスター43細菌科、クラスター44細菌
科、クラスター45細菌科、クラスター46細菌科、クラスター47細菌科、クラスター
48細菌科、クラスター49細菌科、クラスター50細菌科、クラスター51細菌科、ク
ラスター52細菌科、クラスター53細菌科、クラスター54細菌科、クラスター55細
菌科、クラスター56細菌科、クラスター57細菌科、クラスター58細菌科、クラスタ
ー59細菌科、クラスター60細菌科、クラスター61細菌科、クラスター62細菌科、
クラスター63細菌科、クラスター64細菌科、クラスター65細菌科、クラスター66
細菌科、クラスター67細菌科、クラスター68細菌科、クラスター69細菌科、クラス
ター70細菌科、クラスター71細菌科、クラスター72細菌科、クラスター73細菌科
、クラスター74細菌科、クラスター75細菌科、クラスター76細菌科、クラスター7
7細菌科、またはクラスター78細菌科のCas9分子が挙げられる。
られる。例としては、S.ピオゲネス(S.pyogenes)(例えば、SF370、
MGAS10270、MGAS10750、MGAS2096、MGAS315、MGA
S5005、MGAS6180、MGAS9429、NZ131およびSSI-1株)、
S.サーモフィルス(S.thermophilus)(例えば、LMD-9株)、S.
シュードポルシヌス(S.pseudoporcinus)(例えば、SPIN 200
26株)、S.ミュータンス(S.mutans)(例えば、UA159、NN2025
株)、S.マカカエ(S.macacae)(例えば、NCTC11558株)、S.ガ
ロリチカス(S.gallolyticus)(例えば、UCN34、ATCCBAA-
2069株)、S.エクイヌス(S.equinus)(S.equines)(例えば
、ATCC9812、MGCS124株)、S.ディスガラクチアエ(S.dysgal
actiae)(S.dysdalactiae)(例えば、GGS124株)、S.ボ
ビス(S.bovis)(例えば、ATCC700338株)、S.アンギノーサス(S
.anginosus)(例えば、F0211株)、S.アガラクチアエ(S.agal
actiae)(例えば、NEM316、A909株)、リステリア・モノサイトゲネス
(Listeria monocytogenes)(例えば、F6854株)、リステ
リア・イノキュア(Listeria innocua)(L.イノキュア(L.inn
ocua))、例えば、Clip11262株)、エンテロコッカス・イタリクス(En
terococcus italicus)(例えば、DSM 15952株)、または
エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)(例えば
、1,231,408株)のCas9分子が挙げられる。追加的な例示的Cas9分子は
、ナイセリア・メニンジチディス(Neisseria meningitidis)(
Hou et al.PNAS Early Edition 2013,1-6)のC
as9分子およびS.アウレウス(S.aureus)のCas9分子である。
子は、
本明細書に記載される任意のCas9分子配列、または例えば、本明細書で列挙され、
またはChylinski et al.,RNA Biology 2013,10:
5,727-737;Hou et al.PNAS Early Edition 2
013,1-6に記載される、生物種からのCas9分子などの天然起源のCas9分子
配列と比較すると、
60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%
、98%、または99%の相同性を有し、
2、5、10、15、20、30、または40%以下のアミノ酸残基が異なり、
少なくとも1、2、5、10または20個のアミノ酸であるが、100、80、70、
60、50、40または30個以下のアミノ酸が異なり、または
同一である、
アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、Cas9分子は、以下の機能の1つまたは複数を含む:ニッカーゼ活
性;二本鎖切断活性(例えば、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活
性);ヘリカーゼ活性;またはgRNA分子と一緒に、標的核酸に局在化する能力。
中、「*」は、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.t
hermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、およびL.イノキ
ュア(L.innocua)のCas9分子のアミノ酸配列中の対応する位置に見られる
任意のアミノ酸を示し、「-」は、任意のアミノ酸を示す。一実施形態では、Cas9分
子は、図2で開示されるコンセンサス配列の配列と、少なくとも1個であるが、2、3、
4、5、6、7、8、9、または10個以下のアミノ酸残基が異なる。一実施形態では、
Cas9分子は、図5の配列番号7のアミノ酸配列を含み、図中、「*」は、S.ピオゲ
ネス(S.pyogenes)、またはN.メニンジチディス(N.meningiti
dis)のCas9分子のアミノ酸配列の対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し
、「-」は、任意のアミノ酸を示し、「-」は、任意のアミノ酸または不在を示す。一実
施形態では、Cas9分子は、配列番号6または7の配列と、少なくとも1個であるが、
2、3、4、5、6、7、8、9、または10個以下のアミノ酸残基が異なる。
これらは、次のように同定される。
領域1(残基1~180、または領域1’の場合は残基120~180)
領域2(残基360~480);
領域3(残基660~720);
領域4(残基817~900);および
領域5(残基900~960)。
列と共に、例えば、本明細書に記載される少なくとも1つの活性を有するCas9分子な
どの生物活性分子を提供する。一実施形態では、領域1~6のそれぞれは、独立して、例
えば、図2または図5からの配列などの本明細書に記載されるCas9分子の対応する残
基と、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、9
8%または99%の相同性を有する。
子は、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸1~1
80(番号付けは図2中のモチーフ配列に従い、図2中の4つのCas9配列中の52%
の残基は保存的である)と、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%
、96%、97%、98%または99%の相同性を有し、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、L.イノキュア(L.inno
cua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレ
ウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸1~180と、少なくと
も1、2、5、10または20個のアミノ酸であるが、90、80、70、60、50、
40または30個以下のアミノ酸が異なり、または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、L.イノキュア(L.inno
cua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレ
ウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列の1~180と同一である、
領域1と称されるアミノ酸配列を含む。
子は、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.i
nnocua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.
アウレウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸120~180(
図2中の4つのCas9配列の55%の残基は保存的である)と、55%、60%、65
%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または
99%の相同性を有し、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.i
nnocua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.
アウレウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸120~180と
、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸、しかし、35、30、25、20または1
0個以下のアミノ酸が異なり、または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、L.イノキュア(L.inno
cua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレ
ウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列の120~180と同一である、
領域1と称されるアミノ酸配列を含む。
子は、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.i
nnocua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.
アウレウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸360~480(
図2中の4つのCas9配列の52%の残基は保存的である)と、50%、55%、60
%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98
%または99%の相同性を有し、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.i
nnocua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.
アウレウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸360~480と
、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸、しかし、35、30、25、20または1
0個以下のアミノ酸が異なり、または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、L.イノキュア(L.inno
cua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレ
ウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列の360~480と同一である、
領域2と称されるアミノ酸配列を含む。
子は、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.i
nnocua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.
アウレウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸660~720(
図2中の4つのCas9配列の56%の残基は保存的である)と、55%、60%、65
%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または
99%の相同性を有し、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.i
nnocua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.
アウレウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸660~720と
、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸、しかし、35、30、25、20または1
0個以下のアミノ酸が異なり、または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、L.イノキュア(L.inno
cua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレ
ウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列の660~720と同一である、
領域3と称されるアミノ酸配列を含む。
子は、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.i
nnocua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.
アウレウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸817~900(
図2中の4つのCas9配列の55%の残基は保存的である)と、50%、55%、60
%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98
%または99%の相同性を有し、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.i
nnocua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.
アウレウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸817~900と
、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸、しかし、35、30、25、20または1
0個以下のアミノ酸が異なり、または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、L.イノキュア(L.inno
cua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレ
ウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列の817~900と同一である、
領域4と称されるアミノ酸配列を含む。
子は、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.i
nnocua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.
アウレウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸900~960(
図2中の4つのCas9配列の60%の残基は保存的である)と、50%、55%、60
%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98
%または99%の相同性を有し、
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.i
nnocua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.
アウレウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸900~960と
、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸、しかし、35、30、25、20または1
0個以下のアミノ酸が異なり、または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、L.イノキュア(L.inno
cua)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレ
ウス(S.aureus)のCas9のアミノ酸配列の900~960と同一である、
領域5と称されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、Cas9分子は、HNH様ドメインおよびRuvC様ドメインを含む
。一実施形態では、切断活性は、RuvC様ドメインおよびHNH様ドメインに依存する
。例えば、eaCas9またはeiCas9分子などのCas9分子は、以下のドメイン
の1つまたは複数を含み得る:RuvC様ドメインおよびHNH様ドメイン。一実施形態
では、Cas9分子はeaCas9分子であり、eaCas9分子は、例えば、以下に記
載されるRuvC様ドメインなどのRuvC様ドメイン、および/または例えば、以下に
記載されるHNH様ドメインなどのHNH様ドメインを含む。一実施形態では、Cas9
分子は、参照Cas9分子と比較して、RuvC様ドメインおよび/またはHNH様ドメ
イン中に1つまたは複数の差異を含むeiCas9分子であり、eiCas9分子は核酸
を切断せず、または例えば、切断アッセイで野性型と比較した場合に、野性型よりも有意
により低い効率で切断し、例えば、明細書に記載されるように、本明細書に記載されるア
ッセイによる測定で、参照Cas9分子の50、25、10、または1%未満の効率で切
断する。
一実施形態では、RuvC様ドメインは、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本
鎖を切断する。Cas9分子は、2つ以上のRuvC様ドメイン(例えば、1、2、3つ
以上のRuvC様ドメイン)を含み得る。一実施形態では、RuvC様ドメインは、少な
くとも5、6、7、8アミノ酸長であるが、20、19、18、17、16または15ア
ミノ酸長以下である。一実施形態では、Cas9分子は、例えば、約15アミノ酸長など
の約10~20個のアミノ酸のN末端RuvC様ドメインを含む。
いくつかの天然起源のCas9分子は、2つ以上のRuvC様ドメインを含み、切断は
N末端RuvC様ドメインに依存する。したがって、Cas9分子は、N末端RuvC様
ドメインを含み得る。代表的なN末端RuvC様ドメインは、以下に記載される。
式I:
D-X1-G-X2-X3-X4-X5-G-X6-X7-X8-X9(配列番号8)
のアミノ酸配列を含むN末端RuvC様ドメインを含み、
式中、
X1は、I、V、M、L、およびTから選択され(例えば、I、V、およびLから選択
され)、
X2は、T、I、V、S、N、Y、E、およびLから選択され(例えば、T、V、およ
びIから選択され)、
X3は、N、S、G、A、D、T、R、M、およびF(例えば、AまたはN)から選択
され、
X4は、S、Y、N、およびF(例えば、S)から選択され、
X5は、V、I、L、C、T、およびFから選択され(例えば、V、I、およびLから
選択され)、
X6は、W、F、V、Y、S、およびL(例えば、W)から選択され、
X7は、A、S、C、V、およびGから選択され(例えば、AおよびSから選択され)
、
X8は、V、I、L、A、M、およびHから選択され(例えば、V、I、M、およびL
から選択され)、かつ、
X9は、任意のアミノ酸から選択されまたは不在である(例えば、T、V、I、L、Δ
、F、S、A、Y、M、およびRから選択され、または例えば、T、V、I、L、および
Δから選択される)。
、2、3、4、または5以下の数の残基が異なる。
式II:
D-X1-G-X2-X3-S-X5-G-X6-X7-X8-X9(配列番号9)
のアミノ酸配列を含むN末端RuvC様ドメインを含み、
式中、
X1は、I、V、M、L、およびTから選択され(例えば、I、V、およびLから選択
され)、
X2は、T、I、V、S、N、Y、E、およびLから選択され(例えば、T、V、およ
びIから選択され)、
X3は、N、S、G、A、D、T、R、M、およびF(例えば、AまたはN)から選択
され、
X5は、V、I、L、C、T、およびFから選択され(例えば、V、I、およびLから
選択され)、
X6は、W、F、V、Y、S、およびL(例えば、W)から選択され、
X7は、A、S、C、V、およびGから選択され(例えば、AおよびSから選択され)
、
X8は、V、I、L、A、M、およびHから選択され(例えば、V、I、M、およびL
から選択され)、かつ、
X9は、任意のアミノ酸から選択されまたは不在である(例えば、T、V、I、L、Δ
、F、S、A、Y、M、およびRから選択され、または例えば、T、V、I、L、および
Δから選択される)。
、2、3、4、または5以下の数の残基が異なる。
式III:
D-I-G-X2-X3-S-V-G-W-A-X8-X9(配列番号10)
のアミノ酸配列を含み、
式中、
X2は、T、I、V、S、N、Y、E、およびLから選択され(例えば、T、V、およ
びIから選択され)、
X3は、N、S、G、A、D、T、R、M、およびF(例えば、AまたはN)から選択
され、
X8は、V、I、L、A、M、およびHから選択され(例えば、V、I、M、およびL
から選択され)、かつ、
X9は、任意のアミノ酸から選択されまたは不在である(例えば、T、V、I、L、Δ
、F、S、A、Y、M、およびRから選択され、または例えば、T、V、I、L、および
Δから選択される)。
が、2、3、4、または5以下の数の残基が異なる。
D-I-G-T-N-S-V-G-W-A-V-X(配列番号11)
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Xは、非極性アルキルアミノ酸またはヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Xは、V
、I、L、およびTから選択される(例えば、eaCas9分子は、図2に示されるN末
端RuvC様ドメインを含み得る(「Y」として示される))。
が、2、3、4、または5以下の数の残基が異なる。
で開示されるN末端RuvC様ドメインの配列と、1程度であるが、2、3、4、または
5以下の数の残基が異なる。一実施形態では、図3Aまたは図5で同定される高度に保存
された残基の1つ、2つ、または3つ全てが存在する。
るN末端RuvC様ドメインの配列と、1程度であるが、2、3、4、または5以下の数
の残基が異なる。一実施形態では、図3Bで同定される高度に保存された残基の1つ、2
つ、3つまたは4つ全てが存在する。
N末端RuvC様ドメインに加えて、例えば、eaCas9分子などのCas9分子は
、1つまたは複数の追加的なRuvC様ドメインを含み得る。一実施形態では、Cas9
分子は、2つの追加的なRuvC様ドメインを含み得る。好ましくは、追加的なRuvC
様ドメインは、例えば、15未満のアミノ酸長、例えば、5~10アミノ酸長、例えば、
8アミノ酸長などの少なくとも5アミノ酸長である。
I-X1-X2-E-X3-A-R-E(配列番号12)
のアミノ酸配列を含むことができ、
式中、
X1はVまたはHであり、
X2はI、LまたはV(例えば、IまたはV)であり、かつ、
X3はMまたはTである。
I-V-X2-E-M-A-R-E(配列番号13)
のアミノ酸配列を含み、
式中、
X2はI、LまたはV(例えば、IまたはV)である(例えば、eaCas9分子は、
図2または図5に示される追加的なRuvC様ドメインを含み得る(「B」として示され
る))。
H-H-A-X1-D-A-X2-X3(配列番号14)
のアミノ酸配列を含むことができ、
式中、
X1はHまたはLであり、
X2はRまたはVであり、かつ、
X3はEまたはVである。
H-H-A-H-D-A-Y-L(配列番号15)
のアミノ酸配列を含む。
4の配列と、1程度であるが、2、3、4、または5以下の数の残基が異なる。
式V:
K-X1’-Y-X2’-X3’-X4’-Z-T-D-X9’-Y(配列番号16)
の配列であり、
式中、
X1’は、KおよびPから選択され、
X2’はV、L、I、およびF(例えばV、I、およびL)から選択され、
X3’は、G、A、およびS(例えば、G)から選択され、
X4’はL、I、V、およびF(例えば、L)から選択され、
X9’は、D、E、N、およびQから選択され、かつ、
Zは、例えば、上述されるようなN末端RuvC様ドメインである。
一実施形態では、HNH様ドメインは、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖などの一本鎖
相補的ドメインを切断する。一実施形態では、HNH様ドメインは、少なくとも15、2
0、25アミノ酸長であるが、40、35または30以下のアミノ酸長であり、例えば、
20~35アミノ酸長、例えば、25~30アミノ酸長である。代表的なHNH様ドメイ
ンは、以下に記載される。
式VI:
X1-X2-X3-H-X4-X5-P-X6-X7-X8-X9-X10-X11-
X12-X13-X14-X15-N-X16-X17-X18-X19-X20-X2
1-X22-X23-N(配列番号17)
のアミノ酸配列を有するHNH様ドメインを含み、
式中、
X1は、D、E、Q、およびN(例えば、DおよびE)から選択され、
X2は、L、I、R、Q、V、M、およびKから選択され、
X3は、DおよびEから選択され、
X4は、I、V、T、A、およびL(例えば、A、I、およびV)から選択され、
X5は、V、Y、I、L、F、およびW(例えば、V、I、およびL)から選択され、
X6は、Q、H、R、K、Y、I、L、F、およびWから選択され、
X7は、S、A、D、T、およびK(例えば、SおよびA)から選択され、
X8は、F、L、V、K、Y、M、I、R、A、E、D、およびQ(例えば、F)から
選択され、
X9は、L、R、T、I、V、S、C、Y、K、F、およびGから選択され、
X10は、K、Q、Y、T、F、L、W、M、A、E、G、およびSから選択され、
X11は、D、S、N、R、L、およびT(例えば、D)から選択され、
X12は、D、N、およびSから選択され、
X13は、S、A、T、G、およびR(例えば、S)から選択され、
X14は、I、L、F、S、R、Y、Q、W、D、K、およびH(例えば、I、L、お
よびF)から選択され、
X15は、D、S、I、N、E、A、H、F、L、Q、M、G、Y、およびVから選択
され、
X16は、K、L、R、M、T、およびF(例えば、L、R、およびK)から選択され
、
X17は、V、L、I、A、およびTから選択され、
X18は、L、I、V、およびA(例えば、LおよびI)から選択され、
X19は、T、V、C、E、S、およびA(例えば、TおよびV)から選択され、
X20は、R、F、T、W、E、L、N、C、K、V、S、Q、I、Y、H、およびA
から選択され、
X21は、S、P、R、K、N、A、H、Q、G、およびLから選択され、
X22は、D、G、T、N、S、K、A、I、E、L、Q、R、およびYから選択され
、かつ、
X23は、K、V、A、E、Y、I、C、L、S、T、G、K、M、D、およびFから
選択される。
が、2、3、4、または5個以下の残基が異なる。
式VII:
X1-X2-X3-H-X4-X5-P-X6-S-X8-X9-X10-D-D-S
-X14-X15-N-K-V-L-X19-X20-X21-X22-X23-N(配
列番号18)
のアミノ酸配列を含むHNH様ドメインを含み、
式中、
X1は、DおよびEから選択され、
X2は、L、I、R、Q、V、M、およびKから選択され、
X3は、DおよびEから選択され、
X4は、I、V、T、A、およびL(例えば、A、I、およびV)から選択され、
X5は、V、Y、I、L、F、およびW(例えば、V、I、およびL)から選択され、
X6は、Q、H、R、K、Y、I、L、F、およびWから選択され、
X8は、F、L、V、K、Y、M、I、R、A、E、D、およびQ(例えば、F)から
選択され、
X9は、L、R、T、I、V、S、C、Y、K、F、およびGから選択され、
X10は、K、Q、Y、T、F、L、W、M、A、E、G、およびSから選択され、
X14は、I、L、F、S、R、Y、Q、W、D、K、およびH(例えば、I、L、お
よびF)から選択され、
X15は、D、S、I、N、E、A、H、F、L、Q、M、G、Y、およびVから選択
され、
X19は、T、V、C、E、S、およびA(例えば、TおよびV)から選択され、
X20は、R、F、T、W、E、L、N、C、K、V、S、Q、I、Y、H、およびA
から選択され、
X21は、S、P、R、K、N、A、H、Q、G、およびLから選択され、
X22は、D、G、T、N、S、K、A、I、E、L、Q、R、およびYから選択され
、かつ、
X23は、K、V、A、E、Y、I、C、L、S、T、G、K、M、D、およびFから
選択される。
は5個の残基が異なる。
式VII:
X1-V-X3-H-I-V-P-X6-S-X8-X9-X10-D-D-S-X1
4-X15-N-K-V-L-T-X20-X21-X22-X23-N(配列番号19
)
のアミノ酸配列を含むHNH様ドメインを含み、
式中、
X1は、DおよびEから選択され、
X3は、DおよびEから選択され、
X6は、Q、H、R、K、Y、I、L、およびWから選択され、
X8は、F、L、V、K、Y、M、I、R、A、E、D、およびQ(例えば、F)から
選択され、
X9は、L、R、T、I、V、S、C、Y、K、F、およびGから選択され、
X10は、K、Q、Y、T、F、L、W、M、A、E、G、およびSから選択され、
X14は、I、L、F、S、R、Y、Q、W、D、K、およびH(例えば、I、L、お
よびF)から選択され、
X15は、D、S、I、N、E、A、H、F、L、Q、M、G、Y、およびVから選択
され、
X20は、R、F、T、W、E、L、N、C、K、V、S、Q、I、Y、H、およびA
から選択され、
X21は、S、P、R、K、N、A、H、Q、G、およびLから選択され、
X22は、D、G、T、N、S、K、A、I、E、L、Q、R、およびYから選択され
、かつ、
X23は、K、V、A、E、Y、I、C、L、S、T、G、K、M、D、およびFから
選択される。
は5個の残基が異なる。
式VIII:
D-X2-D-H-I-X5-P-Q-X7-F-X9-X10-D-X12-S-I
-D-N-X16-V-L-X19-X20-S-X22-X23-N(配列番号20)
のアミノ酸配列を有するHNH様ドメインを含み、
式中、
X2は、IおよびVから選択され、
X5は、IおよびVから選択され、
X7は、AおよびSから選択され、
X9は、IおよびLから選択され、
X10は、KおよびTから選択され、
X12は、DおよびNから選択され、
X16は、R、K、およびLから選択され、
X19は、TおよびVから選択され、
X20は、SおよびRから選択され、
X22は、K、D、およびAから選択され、かつ、
X23は、E、K、G、およびNから選択される(例えば、eaCas9分子は、本明
細書に記載されるようなHNH様ドメインを含み得る)。
3、4、または5以下の数の残基が異なる。
式IX:
L-Y-Y-L-Q-N-G-X1’-D-M-Y-X2’-X3’-X4’-X5’
-L-D-I-X6’-X7’-L-S-X8’-Y-Z-N-R-X9’-K-X10
’-D-X11’-V-P(配列番号21)
のアミノ酸配列を含み、
式中、
X1’は、KおよびRから選択され、
X2’は、VおよびTから選択され、
X3’は、GおよびDから選択され、
X4’は、E、Q、およびDから選択され、
X5’は、EおよびDから選択され、
X6’は、D、N、およびHから選択され、
X7’は、Y、R、およびNから選択され、
X8’は、Q、D、およびNから選択され、
X9’は、GおよびEから選択され、
X10’は、SおよびGから選択され、
X11’は、DおよびNから選択され、かつ、
Zは、例えば、上述されるようなHNH様ドメインである。
3、4、または5以下の数の残基が異なる、アミノ酸配列を含む。
れるHNH様ドメインの配列と、1程度であるが、2、3、4、または5以下の数の残基
が異なる。
様ドメインの配列と、1程度であるが、2、3、4、または5以下の数の残基が異なる。
一実施形態では、図4Bで同定される高度に保存された残基の1つ、2つ、3つ全てが存
在する。
天然起源のCas9分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性(例えば、エンドヌク
レアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性);ヘリカーゼ活性;gRNA分子と機
能的に結合する能力;および核酸上の部位を標的化する(またはそれに局在化する)能力
(例えば、PAM認識および特異性)をはじめとするいくつかの特性を有する。一実施形
態では、Cas9分子は、これらの特性の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態
では、Cas9分子は、gRNA分子と相互作用する能力を有し、gRNA分子と協調し
て、核酸中の部位に局在化する。例えば、PAM特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活
性などのその他の機能は、Cas9分子中でより幅広く変動し得る。
天然起源のCas9分子などの親Cas9分子を改変して、所望の特性を有する改変Ca
s9分子が提供される。例えば、親Cas9分子との比較で、1つまたは複数の変異また
は差異が導入され得る。このような変異および差異は、置換(例えば、保存的置換または
非必須アミノ酸置換)、挿入、または欠失を含む。一実施形態では、Cas9分子は、参
照Cas9分子と比較して、例えば、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20
、30、40または50の変異であるが、200、100、または80未満の変異などの
1つまたは複数の変異または差異を含み得る。
as9活性などのCas9活性に対する実質的効果を有しない。一実施形態では、1つの
変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるCas9活性などのCas9活
性に対する実質的効果を有する。一実施形態では、代表的な機能は、PAM特異性、切断
活性、およびヘリカーゼ活性の1つまたは複数を含む。変異は、例えば、例えば、N末端
RuvC様ドメインなどの1つまたは複数のRuvC様ドメイン;HNH様ドメイン;R
uvC様ドメインおよびHNH様ドメイン外の領域に存在し得る。一実施形態では、変異
は、N末端RuvC様ドメイン内に存在する。一実施形態では、変異は、HNH様ドメイ
ン内に存在する。一実施形態では、変異は、N末端RuvC様ドメインおよびHNH様ド
メインの双方に存在する。
に影響を及ぼしてもよいかどうかは、例えば、変異が保存的であるかどうかを評価するこ
とで、またはセクションIIIに記載される方法によって、評価または予測され得る。一
実施形態では、Cas9分子の文脈で使用されるような「非必須」アミノ酸残基は、Ca
s9活性(例えば、切断活性)を無効化することなく、またはより好ましくは、実質的に
改変することなく、例えば、eaCas9分子のような天然起源のCas9分子などのC
as9分子の野生型配列から改変され得る残基である一方で、「必須」アミノ酸残基の変
更は、実質的な活性(例えば、切断活性)喪失をもたらす。
、S.ピオゲネス(S.pyogenes)の固定アミノ酸残基を含むeaCas9分子
であり、図2または配列番号7で開示されるコンセンサス配列中の「-」によって表わさ
れる1つまたは複数の残基(例えば、2、3、5、10、15、20、30、50、70
、80、90、100、200アミノ酸残基)に、S.ピオゲネス(S.pyogene
s)のアミノ酸配列と異なる(例えば、置換を有する)1つまたは複数のアミノ酸を有す
る。一実施形態では、改変Cas9分子はeiCas9分子であり、その中で、図2で開
示されるコンセンサス配列に示されるS.ピオゲネス(S.pyogenes)の固定ア
ミノ酸残基(例えば、2、3、5、10、15、20、30、50、70、80、90、
100、200アミノ酸残基)の1つまたは複数は、変異型である。
図2で開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図2で開示されるコ
ンセンサス配列中の固定残基と、1、2、3、4、5、10、15、または20%以下異
なり、
図2で開示されるコンセンサス配列中の「*」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9分子などの天然起源のC
as9分子の対応する配列からの「*」残基と、1、2、3、4、5、10、15、20
、25、30、35、または40%以下異なり、かつ、
図2で開示されるコンセンサス配列中の「-」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9分子などの天然起源のC
as9分子の対応する配列からの「-」残基と、5、10、15、20、25、30、3
5、40、45、55、または60%以下異なる、
配列を含む。
、S.サーモフィルス(S.thermophilus)の固定アミノ酸残基を含むea
Cas9分子であり、図2で開示されるコンセンサス配列中の「-」によって表わされる
1つまたは複数の残基(例えば、2、3、5、10、15、20、30、50、70、8
0、90、100、200アミノ酸残基)に、S.サーモフィルス(S.thermop
hilus)のアミノ酸配列と異なる(例えば、置換を有する)1つまたは複数のアミノ
酸を有する。一実施形態では、改変Cas9分子はeiCas9分子であり、その中で、
図2で開示されるコンセンサス配列に示されるS.サーモフィルス(S.thermop
hilus)の固定アミノ酸残基(例えば,2、3、5、10、15、20、30、50
、70、80、90、100、200アミノ酸残基)の1つまたは複数は、変異型である
。
図2で開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図2で開示されるコ
ンセンサス配列中の固定残基と、1、2、3、4、5、10、15、または20%以下異
なり、
図2で開示されるコンセンサス配列中の「*」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、S.サーモフィルス(S.thermophilus)Cas9分子などの
天然起源のCas9分子の対応する配列からの「*」残基と、1、2、3、4、5、10
、15、20、25、30、35、または40%以下異なり、かつ、
図2で開示されるコンセンサス配列中の「-」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、S.サーモフィルス(S.thermophilus)Cas9分子などの
天然起源のCas9分子の対応する配列からの「-」残基と、5、10、15、20、2
5、30、35、40、45、55、または60%以下異なる、
配列を含む。
、S.ミュータンス(S.mutans)の固定アミノ酸残基を含むeaCas9分子で
あり、図2で開示されるコンセンサス配列中の「-」によって表わされる1つまたは複数
の残基(例えば、2、3、5、10、15、20、30、50、70、80、90、10
0、200アミノ酸残基)に、S.ミュータンス(S.mutans)のアミノ酸配列と
異なる(例えば、置換を有する)1つまたは複数のアミノ酸を有する。一実施形態では、
改変Cas9分子はeiCas9分子であり、その中で、図2で開示されるコンセンサス
配列に示されるS.ミュータンス(S.mutans)の固定アミノ酸残基(例えば、2
、3、5、10、15、20、30、50、70、80、90、100、200アミノ酸
残基)の1つまたは複数は、変異型である。
図2で開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図2で開示されるコ
ンセンサス配列中の固定残基と、1、2、3、4、5、10、15、または20%以下異
なり、
図2で開示されるコンセンサス配列中の「*」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、S.ミュータンス(S.mutans)Cas9分子などの天然起源のCa
s9分子の対応する配列からの「*」残基と、1、2、3、4、5、10、15、20、
25、30、35、または40%以下異なり、かつ、
図2で開示されるコンセンサス配列中の「-」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、S.ミュータンス(S.mutans)Cas9分子などの天然起源のCa
s9分子の対応する配列からの「-」残基と、5、10、15、20、25、30、35
、40、45、55、または60%以下異なる、
配列を含む。
、L.イノキュア(L.innocua)(L.innocula)の固定アミノ酸残基
を含むeaCas9分子であり、図2で開示されるコンセンサス配列中の「-」によって
表わされる1つまたは複数の残基(例えば、2、3、5、10、15、20、30、50
、70、80、90、100、200アミノ酸残基)に、L.イノキュア(L.inno
cua)(L.innocula)のアミノ酸配列と異なる(例えば、置換を有する)1
つまたは複数のアミノ酸を有する。一実施形態では、改変Cas9分子はeiCas9分
子であり、その中で、図2で開示されるコンセンサス配列に示されるL.イノキュア(L
.innocua)(L.innocula)の固定アミノ酸残基(例えば、2、3、5
、10、15、20、30、50、70、80、90、100、200アミノ酸残基)の
1つまたは複数は、変異型である。
図2で開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図2で開示されるコ
ンセンサス配列中の固定残基と、1、2、3、4、5、10、15、または20%以下異
なり、
図2で開示されるコンセンサス配列中の「*」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、L.イノキュア(L.innocua)(L.innocula)Cas9
分子などの天然起源のCas9分子の対応する配列からの「*」残基と、1、2、3、4
、5、10、15、20、25、30、35、または40%以下異なり、かつ、
図2で開示されるコンセンサス配列中の「-」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、L.イノキュア(L.innocua)(L.innocula)Cas9
分子などの天然起源のCas9分子の対応する配列からの「-」残基と、5、10、15
、20、25、30、35、40、45、55、または60%以下異なる、
配列を含む。
9分子は、例えば、異なる生物種の2つ以上の天然起源のCas9分子などの2つ以上の
異なるCas9分子の融合物であり得る。例えば、1つの生物種の天然起源のCas9分
子断片が、第2の生物種のCas9分子断片に融合され得る。一例として、N末端Ruv
C様ドメインを含むS.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9の断片が、HNH
様ドメインを含むS.ピオゲネス(S.pyogenes)以外の生物種(例えば、S.
サーモフィルス(S.thermophilus))のCas9の断片に融合され得る。
天然起源のCas9分子は、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.
サーモフィルス(S.thermophilus),S.ミュータンス(S.mutan
s)、S.アウレウス(S.aureus)、およびN.メニンジチディス(N.men
ingitidis)について、上に記載されるPAM認識配列などの特定のPAM配列
を認識し得る。
する。一実施形態では、Cas9分子は、天然起源のCas9分子と関連しないPAM特
異性を有し、またはそれが最も近い配列相同性を有する天然起源のCas9分子と関連し
ないPAM特異性を有する。例えば、天然起源のCas9分子は改変されることができ、
例えば、PAM認識が改変されて、例えば、Cas9分子が認識するPAM配列が改変さ
れて、オフターゲット部位が減少されおよび/または特異性が改善され;またはPAM認
識要求が排除される。一実施形態では、Cas9分子は改変されることができ、例えば、
PAM認識配列の長さが伸長され、および/またはCas9特異性が高同一性レベルに改
善されて、オフターゲット部位が減少されて、特異性が増大される。一実施形態では、P
AM認識配列の長さは、少なくとも4、5、6、7、8、9、10または15アミノ酸長
である。異なるPAM配列を認識する、および/またはオフターゲット活性の低下を有す
るCas9分子は、指向性進化を使用して生成され得る。Cas9分子の指向性進化のた
めに使用され得る代表的な方法およびシステムは、例えば、Esvelt et al.
,NATURE 2011,472(7344):499-503に記載される。候補C
as9分子は、例えば、セクションIIIに記載される方法によって評価され得る。
一実施形態では、Cas9分子は、天然起源のCas9分子と異なる切断特性を含み、
例えば、それは最も近い相同性を有する天然起源のCas9分子と異なる。例えば、Ca
s9分子は、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9分子などの天然起源のC
as9分子と、例えば、次のように異なり得る:例えば、天然起源のCas9分子(例え
ば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9分子)と比較して、二本鎖切断(
エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性)を調節する能力が、例えば
、低下または増大され;例えば、天然起源のCas9分子(例えば、S.ピオゲネス(S
.pyogenes)Cas9分子)と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の
相補鎖などの核酸の一本鎖の切断(ニッカーゼ活性)を調節する能力が、例えば、低下ま
たは増大され;または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能
力が、排除され得る。
一実施形態では、eaCas9分子は、以下の機能の1つまたは複数を含む:N末端R
uvC様ドメインに関連した切断活性;HNH様ドメインに関連した切断活性;HNHド
メインに関連した切断活性およびN末端RuvC様ドメインに関連した切断活性。
例えば、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20または配列番号21
などの本明細書に記載されるHNH様ドメイン)と、不活性なまたは切断能力がないN末
端RuvC様ドメインとを含む。代表的な不活性のまたは切断能力がないN末端RuvC
様ドメインは、N末端RuvC様ドメイン中にアスパラギン酸の変異を有することができ
、例えば、図2で開示されるコンセンサス配列の9位のアスパラギン酸、または配列番号
7の10位のアスパラギン酸が、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、e
aCas9は、N末端RuvC様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず
、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Cas9分子の切断
活性の20、10、5、1または0.1%未満の有意により低い効率で切断する。参照C
as9分子は、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、またはS.サーモフ
ィルス(S.thermophilus)のCas9分子のような、天然起源のCas9
分子などの天然起源未修飾Cas9分子であり得る。一実施形態では、参照Cas9分子
は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然起源のCas9分子である。
と、活性のまたは切断能力がある、N末端RuvC様ドメイン(例えば、配列番号8、配
列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14ま
たは配列番号15などの本明細書に記載されるHNH様ドメイン)とを含む。代表的な不
活性のまたは切断能力がないHNH様ドメインは、以下の1つまたは複数の変異を有し得
る:例えば、図2で開示されるコンセンサス配列の856位のヒスチジンなどのHNH様
ドメイン中のヒスチジンが、例えば、アラニンで置換され得る;例えば、図2で開示され
るコンセンサス配列の870位のアスパラギン、および/または図2で開示されるコンセ
ンサス配列の879位のアスパラギンなどのHNH様ドメイン中の1つまたは複数のアス
パラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、eaCas9は、HN
H様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に
記載されるアッセイによる測定で、参照Cas9分子の切断活性の20、10、5、1ま
たは0.1%未満の有意により低い効率で切断する。参照Cas9分子は、例えば、S.
ピオゲネス(S.pyogenes)、またはS.サーモフィルス(S.thermop
hilus)のCas9分子のような、天然起源のCas9分子などの天然起源未修飾C
as9分子であり得る。一実施形態では、参照Cas9分子は、最も近い配列同一性また
は相同性を有する天然起源のCas9分子である。
一実施形態では、改変Cas9分子は、核酸分子(二本鎖のまたは一本鎖核酸分子のい
ずれも)を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照
Cas9分子の切断活性の20、10、5、1または0.1%未満の有意により低い効率
で核酸分子を切断する、eiCas9分子である。参照Cas9分子は、例えば、S.ピ
オゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilu
s)、S.アウレウス(S.aureus)またはN.メニンジチディス(N.meni
ngitidis)のCas9分子のような、天然起源のCas9分子などの天然起源の
未修飾Cas9分子であり得る。一実施形態では、参照Cas9分子は、最も近い配列同
一性または相同性を有する天然起源のCas9分子である。一実施形態では、eiCas
9分子は、N末端RuvC様ドメインに関連した実質的な切断活性と、HNH様ドメイン
に関連した切断活性とを欠く。
様ドメインを含む。代表的な不活性のまたは切断能力がないN末端RuvC様ドメインは
、N末端RuvC様ドメイン中にアスパラギン酸の変異を有することができ、例えば、図
2で開示されるコンセンサス配列の9位のアスパラギン酸、または配列番号7の10位の
アスパラギン酸が、例えば、アラニンで置換され得る。
(例えば、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列
番号13、配列番号14または配列番号15などの本明細書に記載されるHNH様ドメイ
ン)を含む。代表的な不活性のまたは切断能力がないHNH様ドメインは、以下の1つま
たは複数の変異を有し得る:例えば、図2で開示されるコンセンサス配列の856位のヒ
スチジンなどのHNH様ドメイン中のヒスチジンが、例えば、アラニンで置換され得る;
例えば、図2で開示されるコンセンサス配列の870位のアスパラギン、および/または
図2で開示されるコンセンサス配列の879位のアスパラギンなどのHNH様ドメイン中
の1つまたは複数のアスパラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。
タンパク質は、gRNAと複合体形成して、gRNAの標的化ドメインによって特定化さ
れたDNA配列に局在するが、eaCas9とは異なり、それは標的DNAを切断しない
。eiCas9への転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインの融合は、gRNAに
よって特定化された任意のDNA部位へのエフェクターの動員を可能にする。遺伝子プロ
モーター領域へのeiCas9またはeiCas9融合タンパク質の部位特異的標的化は
、プロモーター領域、転写因子(例えば、転写アクチベーター)および/または転写エン
ハンサーに対するRNAポリメラーゼ結合を妨げて、転写活性化が阻害され得る。代案と
しては、遺伝子プロモーター領域に対する転写リプレッサーへのeiCas9融合物の部
位特異的標的化を使用して、転写活性が低下され得る。
しては、Kruppel結合ボックス(KRABまたはSKD)、Mad mSIN3相
互作用ドメイン(SID)またはERFリプレッサードメイン(ERD)が挙げられる。
てもよい。例えば、eiCas9分子は、ヘテロクロマチンタンパク質1(HP1)、ヒ
ストンリジンメチルトランスフェラーゼ(例えば、SUV39H1、SUV39H2、G
9A、ESET/SETDB1、Pr-SET7/8、SUV4-20H1、RIZ1)
、ヒストンリジンデメチラーゼ(例えば、LSD1/BHC110、SpLsd1/Sw
,1/Saf110、Su(var)3-3、JMJD2A/JHDM3A、JMJD2
B、JMJD2C/GASC1、JMJD2D、Rph1、JARID1A/RBP2、
JAR1D1B/PLU-1、JAR1D1C/SMCX、JARID1D/SMCY、
Lid、Jhn2、Jmj2)、ヒストンリジンデアセチラーゼ(例えば、HDAC1、
HDAC2、HDAC3、HDAC8、Rpd3、Hos1、Cir6、HDAC4、H
DAC5、HDAC7、HDAC9、Hda1、Cir3、SIRT1、SIRT2、S
ir2、Hst1、Hst2、Hst3、Hst4、HDAC11)、およびDNAメチ
ラーゼ(DNMT1、DNMT2a/DMNT3b、MET1)に融合されてもよい。e
iCas9-クロマチン改変分子融合タンパク質を使用して、クロマチン状態を改変して
標的遺伝子の発現が低下され得る。
はC末端に融合されてもよい。代案の実施形態では、異種配列(例えば、転写リプレッサ
ードメイン)が、eiCas9タンパク質の内部(すなわち、N末端またはC末端以外の
部分)に融合されてもよい。
本明細書のセクションIIIに記載される方法によって評価され得る。eaCas9また
はeiCas9のいずれかのCas9分子の活性はまた、単独でまたはgRNA分子との
複合体中で、遺伝子発現アッセイおよび例えば、クロマチン免疫沈降法(ChiP)およ
びクロマチンインビボアッセイ(CiA)などのクロマチンベースのアッセイをはじめと
する、当該技術分野で周知の方法によって評価されてもよい。
例えば、eaCas9分子またはeiCas9分子などのCas9分子をコードする核
酸が、本明細書で提供される。
2013,399(6121):819-823;Wang et al.,CELL
2013,153(4):910-918;Mali et al.,SCIENCE
2013,399(6121):823-826;Jinek et al.,SCI
ENCE 2012,337(6096):816-821に記載される。N.メニンジ
チディス(N.meningitidis)Cas9分子をコードする別の代表的な核酸
は、図6に示される。
、合成核酸分子は、例えば、セクションXに記載されるようにして、化学修飾され得る。
一実施形態では、Cas9のmRNAは、例えば、以下の全てなどの、以下の1つまたは
複数の特性を有する:キャッピングされ、ポリアデニル化され、5-メチルシチジンおよ
び/またはシュードウリジンで置換される。
例えば、少なくとも1つの一般的でないコドンまたはあまり一般的でないコドンは、一般
的コドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される
哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーmRNAの合成を
誘導し得る。
(NLS)を含んでもよい。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。
(例えば、C末端転写リプレッサーと融合するeiCas9)、停止コドンは除去される
ものと理解される。
本明細書で開示される発明は、様々なタイプのCas分子を使用して実施され得る。一
実施形態では、II型CasシステムのCas分子が使用される。一実施形態では、その
他のCasシステムのCas分子が使用される。例えば、I型またはIII型Cas分子
が使用されてもよい。代表的なCas分子(およびCasシステム)は、例えば、Haf
t et al.,PLOS COMPUTATIONAL BIOLOGY 2005
,1(6):e60、およびMakarova et al.,NATURE REVI
EW MICROBIOLOGY 2011,9:467-477に記載され、双方の参
考文献は、その内容全体が参照により本明細書に援用される。代表的なCas分子(およ
びCasシステム)は、表II-1にもまた示される。
候補Cas9分子、候補gRNA分子、候補Cas9分子/gRNA分子複合体は、当
該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価され得る。例
えば、Cas9分子のエンドヌクレアーゼ活性評価する代表的な方法は、例えば、Jin
ek et al.,SCIENCE 2012;337(6096):816-821
に記載される。
Cas9分子/gRNA分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラス
ミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成またはインビトロ転写gRN
A分子が、95℃に加熱して緩やかに室温に冷却することで、反応に先だってプレアニー
ルされる。天然または制限消化直線化プラスミドDNA(300ng(約8nM))が、
10mMのMgCl2存在下または不在下において、Cas9プラスミド切断緩衝液(2
0mMのHEPES pH7.5、150mMのKCl、0.5mMのDTT、0.1m
MのEDTA)中の精製Cas9タンパク質分子(50~500nM)およびgRNA(
50~500nM、1:1)と共に、37℃で60分間インキュベートされる。反応は、
5×DNAローディングバッファー(30%グリセロール、1.2%SDS、250mM
のEDTA)によって停止され、0.8または1%アガロースゲル電気泳動法によって分
離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Cas9分子
が、双方のDNA鎖を切断するか、または二本鎖の1本のみを切断するかどうかを示す。
例えば、直鎖DNA生成物は、双方のDNA鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成
物は、二本鎖の1本のみが切断されていることを示す。
、オリゴヌクレオチドDNA切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、DNAオ
リゴヌクレオチド(10pmol)が、1×T4ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中
の5単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼおよび約3~6pmol(約20~40mCi
)の[γ-32P]-ATPと、50μLの反応物中において37℃で30分間インキュ
ベートされることで、放射性標識される。加熱不活性化(65℃で20分間)後、カラム
に通して反応物が精製され、組み込まれていない標識が除去される。標識オリゴヌクレオ
チドと、等モル量の未標識相補的オリゴヌクレオチドとの95℃で3分間のアニーリング
によって、二本鎖基質(100nM)が生成され、室温への緩やかな冷却がそれに続く。
切断アッセイでは、95℃で30秒間加熱することでgRNA分子がアニールされ、室温
への緩やかな冷却がそれに続く。Cas9(500nM最終濃度)が、切断アッセイ緩衝
液(20mMのHEPES pH7.5、100mMのKCl、5mMのMgCl2、1
mMのDTT、5%グリセロール)中のアニールされたgRNA分子(500nM)と共
に、総容積9μlでプレインキュベートされる。1μlの標的DNA(10nM)の添加
によって反応が開始され、37℃で1時間インキュベートされる。20μlのローディン
グ色素(ホルムアミド中の5mMのEDTA、0.025%SDS、5%グリセロール)
の添加によって反応物がクエンチされ、95℃で5分間加熱される。分解産物は、7M尿
素を含有する12%変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ホスホロイメージングに
よって視覚化される。得られた分解産物は、相補鎖、非相補鎖、またはその双方が切断さ
れたかどうかを示す。
分子の適合性が評価され得る。
Cas9分子の標的DNAへの結合を評価する代表的な方法は、例えば、Jinek
et al.,SCIENCE 2012;337(6096):816-821に記載
される。
して、95℃で3分間加熱し、室温に緩やかに冷却することで、標的DNA二本鎖が形成
される。全てのDNAは、1×TBEを含有する8%天然ゲル上で精製される。DNAバ
ンドは、UVシャドーイングによって視覚化され、切除されて、ゲル小片をDEPC処理
H2Oに浸漬することで溶出される。溶出されDNAは、エタノール沈殿されて、DEP
C処理H2Oに溶解される。DNAサンプルは、[γ-32P]-ATPを使用して、T
4ポリヌクレオチドキナーゼにより37℃で30分間にわたり5’末端標識される。ポリ
ヌクレオチドキナーゼは、65℃で20分間加熱変性され、カラムを使用して、組み込ま
れていない放射性標識が除去される。結合アッセイは、20mMのHEPES pH7.
5、100mMのKCl、5mMのMgCl2、1mMのDTT、および10%グリセロ
ールを含有する緩衝液中で、総容積10μlで実施される。Cas9タンパク質分子は、
等モル量のプレアニールgRNA分子でプログラムされて、100pMから1μMに滴定
される。放射性標識DNAが、20pMの最終濃度に添加される。サンプルは、37℃で
1時間インキュベートされ、1×TBEおよび5mMのMgCl2を含有する8%天然ポ
リアクリルアミドゲル上で、4℃で分離される。ゲルは乾燥されて、DNAはホスホロイ
メージングによって視覚化される。
「テンプレート核酸」および「交換核酸」という用語は、この文献およびその優先権書
類において同義的に使用され,同一の意味を有する。
5、VII-16、VII-17、VII-18、VII-19、VII-20、VII
-21、VII-22、VII-23、VII-24、IX-1、IX-1A、IX-3
、またはXII-1で、またはセクションVIIIで、本明細書に記載される遺伝子また
は経路の変異は、本明細書で考察されるアプローチの1つを使用して修正されてもよい。
一実施形態では、例えば、セクションVIIBで、例えば、表VII-13、VII-1
4、VII-15、VII-16、VII-17、VII-18、VII-19、VII
-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII-24、IX-1、IX-
1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVIIIで、本明細書に記載さ
れる遺伝子または経路の変異は、テンプレート核酸を使用して、相同指向修復(HDR)
によって修正される(セクションIV.1を参照されたい)。一実施形態では、例えば、
セクションVIIBで、例えば、表VII-13、VII-14、VII-15、VII
-16、VII-17、VII-18、VII-19、VII-20、VII-21、V
II-22、VII-23、VII-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはX
II-1で、またはセクションVIIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路の変
異は、テンプレート核酸を使用して、非相同末端結合(NHEJ)修復によって修正され
る(セクションIV.2を参照されたい)。
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導相同指向修復(HDR)を使用して、
標的配列が改変され、ゲノム内変異が修正(例えば、修復または編集)され得る。理論に
よる拘束は望まないが、標的配列の改変は、ドナーテンプレートまたはテンプレート核酸
による相同指向修復(HDR)によって起きると考えられる。例えば、ドナーテンプレー
トまたはテンプレート核酸は、標的配列の改変を提供する。プラスミドドナーは、相同組
換えのためのテンプレートとして利用され得ることが検討される。一本鎖ドナーテンプレ
ートが、標的配列およびドナーテンプレート間で、交互の相同指向修復(例えば、一本鎖
アニーリング)方法による標的配列改変のためのテンプレートとして、使用され得ること
がさらに検討される。ドナーテンプレートがもたらす標的配列の改変は、Cas9分子に
よる切断に依存する。Cas9による切断は、二本鎖切断または2つの一本鎖切断を含み
得る。
て修正され得る。一実施形態では、変異は、(1)単一の二本鎖切断、(2)2つの一本
鎖切断、(3)切断が標的配列上の各側で起きる、2つの二本鎖切断、(4)二本鎖切断
および2つの一本鎖切断が標的配列上の各側で起きる、1つの二本鎖切断および2つの一
本鎖切断、または(5)1対の一本鎖切断が標的配列上の各側で起きる、4つの一本鎖切
断によって修正され得る。
一実施形態では、二本鎖切断は、HNH様ドメインに関連した切断活性と、例えば、N
末端RuvC様ドメインなどのRuvC様ドメインに関連した切断活性とを有する、例え
ば、野性型Cas9などのCas9分子によってもたらされる。このような実施形態では
、単一gRNAのみが必要である。
一実施形態では、2つの一本鎖切断、またはニックは、例えば、HNH様ドメインに関
連した切断活性またはN末端RuvC様ドメインに関連した切断活性などのニッカーゼ活
性を有する、Cas9分子によってもたらされる。このような実施形態は、各一本鎖切断
の配置のために、2つのgRNAを必要とする。一実施形態では、ニッカーゼ活性を有す
るCas9分子は、それにgRNAがハイブリダイズする鎖を切断するが、それにgRN
Aハイブリダイズする鎖と相補的な鎖は切断しない。一実施形態では、ニッカーゼ活性を
有するCas9分子は、それにgRNAがハイブリダイズする鎖を切断せず、むしろそれ
にgRNAがハイブリダイズする鎖と相補的な鎖を切断する。
s9分子、例えば、D10A変異などの変異をD10に有するCas9分子が、不活性化
される。D10AはRuvCを不活性化し;したがって、Cas9ニッカーゼはHNH活
性(のみ)を有して、それにgRNAがハイブリダイズする鎖(例えば、その上にNGG
PAMを有しない相補鎖)を切断する。一実施形態では、例えば、H840AなどのH
840変異を有するCas9分子が、ニッカーゼとして使用され得る。H840AはHN
Hを不活性化し;したがって、Cas9ニッカーゼはRuvC活性(のみ)を有して、非
相補鎖(例えば、NGG PAMを有して、その配列がgRNAと同一である鎖)を切断
する。
施形態では、1つのニックは標的核酸の+鎖上に、もう1つのニックは-鎖上に配置され
る。PAMは、外側を向く。gRNAは、gRNAが、約0~50、0~100、または
0~200ヌクレオチドによって隔てられるように、選択され得る。一実施形態では、2
つのgRNAの標的化ドメインと相補的な標的配列間には、重複がない。一実施形態では
、gRNAは重複せず、50、100、または200個程度のヌクレオチドによって隔て
られる。一実施形態では、2つのgRNAの使用は、例えば、オフターゲット結合を低下
させることで、特異性を増大させ得る(Ran et al.,CELL 2013)。
て、所与の切断部位におけるHRとNHEJとの比率が増大され得ることが、本明細書で
検討される。
鎖の1つ中の二本鎖切断または一本鎖切断は、修正が起こるように、標的位置と十分に
近くあるべきである。一実施形態では、距離は、50、100、200、300、350
または400ヌクレオチド以下である。理論による拘束は望まないが、切断は、末端切除
中にエキソヌクレアーゼ媒介性除去を受ける領内にあるように、標的位置と十分に近くあ
るべきであると考えられる。ドナー配列は末端切除領域内の配列を修正するのみに使用さ
れてもよいので、標的位置と切断の間の距離が大きすぎると、変異が末端切除に含まれず
、したがって修正されないこともある。
ジュラーgRNA)およびCas9ヌクレアーゼが二本鎖切断を誘導する一実施形態では
、切断部位は、標的位置から0~200bp(例えば、0~175、0~150、0~1
25、0~100、0~75、0~50、0~25、25~200、25~175、25
~150、25~125、25~100、25~75、25~50、50~200、50
~175、50~150、50~125、50~100、50~75、75~200、7
5~175、75~150、75~125、75~100bp)離れている。一実施形態
では、切断部位は、標的位置から0~100bp(例えば、0~75、0~50、0~2
5、25~100、25~75、25~50、50~100、50~75または75~1
00bp)離れている。
RNA(独立して、単分子(またはキメラ)またはモジュラーgRNA)が、2つの一本
鎖切断を誘導する一実施形態では、より近いニックは、標的位置から0~200bp(例
えば、0~175、0~150、0~125、0~100、0~75、0~50、0~2
5、25~200、25~175、25~150、25~125、25~100、25~
75、25~50、50~200、50~175、50~150、50~125、50~
100、50~75、75~200、75~175、75~150、75~125、75
~100bp)離れており、2つのニックは、理想的には、互いに25~55bp(例え
ば、25~50、25~45、25~40、25~35、25~30、30~55、30
~50、30~45、30~40、30~35、35~55、35~50、35~45、
35~40、40~55、40~50、40~45bp)以内にあり、互いに100bp
以下離れている(例えば、互いに90、80、70、60、50、40、30、20、1
0または5bp以下離れている)。一実施形態では、切断部位は、標的位置から0~10
0bp(例えば、0~75、0~50、0~25、25~100、25~75、25~5
0、50~100、50~75または75~100bp)離れている。
Aである2つのgRNAは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置させるように構成される
。交互の実施形態では、例えば、独立して、単分子(またはキメラ)またはモジュラーg
RNAである3つのgRNAは、二本鎖切断(すなわち、1つのgRNAがcas9ヌク
レアーゼと複合体形成する)と、2つの一本鎖切断または対での一本鎖切断(すなわち、
2つのgRNAがCas9ニッカーゼと複合体形成する)とが、標的位置の両側に配置さ
れるように構成される(例えば、第1のgRNAが使用されて標的位置の上流(すなわち
、5’)が標的化され、第2のgRNAが使用されて標的位置の下流(すなわち、3’)
が標的化される)。別の実施形態では、例えば、独立して、単分子(またはキメラ)また
はモジュラーgRNAである4つのgRNAは、2つの対の一本鎖切断(すなわち、2対
の2つのgRNAがCas9ニッカーゼと複合体形成する)が、標的位置の両側に生じる
ように構成される(例えば、第1のgRNAが使用されて標的位置の上流(すなわち、5
’)が標的化され、第2のgRNAが使用されて標的位置の下流(すなわち、3’)が標
的化される)。二本鎖切断、または対の2つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には
、標的位置の0~500bp以内(例えば、標的位置から450、400、350、30
0、250、200、150、100、50または25bp以下)にある。ニッカーゼが
使用される場合、対の2つのニックは、互いに25~55bp以内(例えば、25~50
、25~45、25~40、25~35、25~30、50~55、45~55、40~
55、35~55、30~55、30~50、35~50、40~50、45~50、3
5~45、または40~45bpの間)であり、互いに100bp以下(例えば、90、
80、70、60、50、40、30、20または10bp以下)離れている。
Aである2つのgRNAは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置させるように構成される
。交互の実施形態では、例えば、独立して、単分子(またはキメラ)またはモジュラーg
RNAである3つのgRNAは、二本鎖切断(すなわち、1つのgRNAがcas9ヌク
レアーゼと複合体形成する)と、2つの一本鎖切断または対の一本鎖切断(すなわち、2
つのgRNAがCas9ニッカーゼと複合体形成する)とが、標的位置の両側に配置され
るように構成される(例えば、第1のgRNAが使用されて、例えば、セクションVII
Bで、例えば、表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-
17、VII-18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VI
I-23、VII-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、また
はセクションVIIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路の変異の上流(すなわ
ち、5’)が標的化され、第2のgRNAが使用されて、例えば、セクションVIIBで
、例えば、表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17
、VII-18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-
23、VII-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセ
クションVIIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路の変異の下流(すなわち、
3’)を標的化する)。別の実施形態では、例えば、独立して、単分子(またはキメラ)
またはモジュラーgRNAである4つのgRNAは、2対の一本鎖切断(すなわち、2対
の2つのgRNAがCas9ニッカーゼと複合体形成する)が、標的位置の両側に生じる
ように構成される(例えば、第1のgRNAが使用されて、本明細書に記載される遺伝子
または経路の変異の上流(すなわち、5’)が標的化され、第2のgRNAが使用されて
、本明細書に記載される遺伝子または経路の変異の下流(すなわち、3’)が標的化され
る)。二本鎖切断、または対の2つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位
置の0~500bp以内(例えば、標的位置から450、400、350、300、25
0、200、150、100、50または25bp以下)にある。ニッカーゼが使用され
る場合、対の2つのニックは、互いに25~55bp以内(例えば、25~50、25~
45、25~40、25~35、25~30、50~55、45~55、40~55、3
5~55、30~55、30~50、35~50、40~50、45~50、35~45
、または40~45bpの間)であり、互いに100bp以下(例えば、90、80、7
0、60、50、40、30、20または10bp以下)離れている。
相同性アームは、例えば、切除された一本鎖オーバーハングが、ドナーテンプレート内
に相補領域を見つけられるように、少なくとも末端切除が起こってもよい領域にまで伸び
るべきである。全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケージング限界などのパラ
メータによって制限され得る。一実施形態では、相同性アームは、例えば、ALU反復、
LINE反復などの反復要素中には及ばない。
または1000ヌクレオチドが挙げられる。
酸(例えば、染色体)上の部位を指す。例えば、標的位置は、例えば、標的位置の修正な
どの標的核酸の修飾Cas9分子切断、およびテンプレート核酸指向修飾であり得る。一
実施形態では、標的位置は、例えば、その中に1つまたは複数のヌクレオチドが付加され
る、標的核酸上の隣接するヌクレオチドなどの2ヌクレオチド間の部位であり得る。標的
位置は、テンプレート核酸によって、例えば、修正などの改変を受けた1つまたは複数の
ヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、標的位置は、標的配列(例えば、それに
gRNAが結合する配列)内にある。一実施形態では、標的位置は、標的配列(例えば、
gRNAが結合する配列)の上流または下流にある。
て、標的位置の構造が改変され得る核酸配列を指す。「テンプレート核酸」という用語は
、優先権書類および本明細書で使用される「交換核酸」という用語と同義である。「テン
プレート核酸」および「交換核酸」という用語は、全く同じ意味を有し、および同義的に
使用され得る。一実施形態では、標的核酸は、典型的に、切断部位のまたはその近くのテ
ンプレート核酸配列の一部または全部を有するように修飾される。一実施形態では、テン
プレート核酸は一本鎖である。交互の実施形態では、テンプレート核酸は二本鎖である。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、二本鎖DNAなどのDNAである。交互
の実施形態では、テンプレート核酸は一本鎖DNAである。
の構造を変化させる。一実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置の配列を変化させ
る。一実施形態では、テンプレート核酸は、標的核酸への修飾されたまたは非天然起源の
ヌクレオチドの組み込みをもたらす。
ける。一実施形態では、テンプレート核酸は、eaCas9媒介性の切断事象によって切
断される、標的配列上の部位に対応する配列を含む。一実施形態では、テンプレート核酸
は、第1のCas9媒介事象において切断される標的配列上の第1の部位と、第2のCa
s9媒介事象において切断される標的配列上の第2の部位との双方に対応する配列を含む
。
例えば、タンパク質生成物中の1つのアミノ酸の別のアミノ酸による置換をもたらすもの
、例えば、変異対立遺伝子を野性型対立遺伝子に形質転換する、野性型対立遺伝子を変異
対立遺伝子に形質転換する、および/または停止コドン、アミノ酸残基挿入、アミノ酸残
基の欠失、またはナンセンス変異を導入する配列を含み得る。
’非翻訳または非転写領域の改変などの改変を非コード配列にもたらす配列を含み得る。
このような変更としては、例えば、プロモーター、エンハンサーなどの制御要素の改変、
およびシス作用性またはトランス作用性制御要素の改変が挙げられる。
5、VII-16、VII-17、VII-18、VII-19、VII-20、VII
-21、VII-22、VII-23、VII-24、IX-1、IX-1A、IX-3
、またはXII-1で、またはセクションVIIIで、本明細書に記載される遺伝子また
は経路中の標的位置との相同性を有するテンプレート核酸を使用して、標的配列の構造が
改変され得る。テンプレート配列を使用して、例えば、望まれないまたは変異ヌクレオチ
ドなどの望まれない構造が改変され得る。
正の制御要素の活性低下、
正の制御要素の活性増大、
負の制御要素の活性低下、
負の制御要素の活性増大、
遺伝子の発現低下、
遺伝子の発現増大、
障害または疾患に対する耐性増大、
ウイルス侵入に対する耐性増大、
望まれないアミノ酸残基の変異または改変の補正、
例えば、酵素の酵素活性の増大、または遺伝子産物が別の分子と相互作用する能力の増
大などの遺伝子産物の生物学的特性の付与、増大、無効化または低下
がもたらされる配列を含み得る。
12個以上のヌクレオチド配列中の変化をもたらす配列を含み得る。
10、50+/-10、60+/-10、70+/-10、80+/-10、90+/-
10、100+/-10、110+/-10、120+/-10、130+/-10、1
40+/-10、150+/-10、160+/-10、170+/-10、180+/
-10、190+/-10、200+/-10、210+/-10、または220+/-
10ヌクレオチド長である。
20、60+/-20、70+/-20、80+/-20、90+/-20、100+/
-20、110+/-20、120+/-20、130+/-20、140+/-20、
150+/-20、160+/-20、170+/-20、180+/-20、190+
/-20、200+/-20、210+/-20、または220+/-20ヌクレオチド
長である。
0、40~700、50~600、50~500、50~400、50~300、50~
200、または50~100ヌクレオチド長である。
[5’相同性アーム]-[置換配列]-[3’相同性アーム]
などの望まれない要素を、置換配列で置換する。一実施形態では、相同性アームは、ほと
んどの遠位切断部位の隣接領域に位置する。
である。一実施形態では、5’相同性アームは、置換配列5’末端から5’に少なくとも
10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、7
00、800、900、1000、1500、または2000ヌクレオチドにわたり延長
し得る。
である。一実施形態では、3’相同性アームは、置換配列3’末端から3’に少なくとも
10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、7
00、800、900、1000、1500、または2000ヌクレオチドにわたり延長
され得る。
の特定の配列反復要素の包含が回避されてもよいことが、本明細書で検討される。例えば
、5’相同性アームが短縮されて、配列反復要素が回避されてもよい。一実施形態では、
3’相同性アームが短縮されて、配列反復要素が回避されてもよい。一実施形態では、5
’および3’相同性アームの双方が短縮されて、特定の配列反復要素の包含が回避されて
もよい。
ンプレート核酸が設計されてもよいことが、本明細書で検討される。ssODNが使用さ
れる場合、5’および3’相同性アームは、例えば、少なくとも25、50、75、10
0、125、150、175、または200bp長などの最高約200塩基対(bp)長
の範囲であってもよい。オリゴヌクレオチド合成の改善を継続するssODNのためのよ
り長い相同性アームもまた、検討される。
VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-17、VII-1
8、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VII-23、VII
-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、またはセクションVI
IIで、本明細書に記載される遺伝子または経路び変異が修正されてもよい。
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導非相同末端結合(NHEJ)を使用し
て、標的遺伝子特異的ノックアウトが実施され得る。ヌクレアーゼ誘導NHEJはまた、
対象遺伝子中の配列を除去す(例えば、欠失させ)るのにも使用され得る。
ゲノムの改変は、ヌクレアーゼ誘導NHEJと、NHEJ修復経路の誤りがちな性質とに
依存すると考えられる。NHEJは、2つの末端を共に連結することで、DNA中の二本
鎖切断を修復するが、しかし、通常、元の配列は、それらが二本鎖切断によって形成され
た真にその通りの2つの適合性末端が、完璧にライゲートされた場合に限り、復元される
。二本鎖切断のDNA末端は、しばしば酵素的プロセッシングの対象であり、末端の再結
合に先だって、片方または双方の鎖に、ヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。
これは、NHEJ修復部位におけるDNA配列の挿入および/または欠失(インデル)変
異の存在をもたらす。これらの変異の3分の2は、典型的に、読み枠を改変し、したがっ
て、非機能性タンパク質が生じる。それに加えて、読み枠を維持するが、顕著な量の配列
を挿入または欠失させる変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。タンパク質の重要な
機能ドメインの変異は、重要でない領域の変異よりもおそらく許容性が低いので、これは
遺伝子座依存性である。
、所与の切断部位では、おそらく小規模なマイクロホモロジー領域のために、特定のイン
デル配列が好まれ、母集団中で大きな比率を占める。欠失の長さは、幅広く変動し得て、
最も一般的には、1~50bpの範囲であるが、それらは100~200bpを超える範
囲に容易に達し得る。挿入はより短い傾向があり、多くの場合、切断部位に隣接して取り
囲む、短い配列重複を含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合
、挿入配列は、多くの場合、ゲノムのその他の領域に、または細胞内に存在するプラスミ
ドDNAにトレースされている。
はまた小規模な配列モチーフを欠失させるのにも使用され得る。二本鎖切断が、短い標的
配列の近くで標的化される場合、NHEJによって引き起こされる修復欠失変異は、頻繁
に望まれないヌクレオチドに及び、したがってそれを除去する。より大型のDNA断片の
欠失では、配列の両側に1つずつ2つの二本鎖切断が導入されて、介在配列全体が除去さ
れ、末端の間にNHEJがもたらされ得る。これらのアプローチの双方を使用して、特定
のDNA配列が欠失され得るが、しかし、NHEJの誤りがちな性質は、修復部位に、イ
ンデル変異をなおも生成してもよい。
分子を、本明細書に記載される方法および組成物で使用して、NHEJ媒介性インデルが
生成され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域のようなコード領域などの遺伝子に
標的化されるNHEJ媒介性インデルを使用して、対象遺伝子がノックアウト(すなわち
発現排除)され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第1のエク
ソン内の、または転写開始部位の500bp以内(例えば、500、450、400、3
50、300、250、200、150、100または50bp未満)の転写開始部位直
後の配列を含む。
NHEJ媒介性インデルを誘導する目的で、gRNAおよびCas9ヌクレアーゼが二
本鎖切断を生じる一実施形態では、例えば、単分子(またはキメラ)またはモジュラーg
RNA分子などのgRNAが、1つの二本鎖切断を標的位置のヌクレオチド近傍に配置さ
せるように構成される。一実施形態では、切断部位は、標的位置から0~500bp(例
えば、標的位置から500、400、300、200、100、50、40、30、25
、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1bp未満)離れている。
gRNAが、2つの一本鎖切断を誘導する一実施形態では、例えば、独立して、単分子(
またはキメラ)またはモジュラーgRNAである2つのgRNAが、標的位置のヌクレオ
チドにNHEJ修復を提供するように、2つの一本鎖切断を配置させるように構成される
。一実施形態では、gRNAは、切断を異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌ
クレオチド以内に、配置させるように構成されて、二本鎖切断が本質的に模倣される。一
実施形態では、より近いニックは、標的位置から0~30bp(例えば、標的位置から3
0、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1bp未満)離れ
ており、2つのニックは、互いに25~55bp以内(例えば、25~50、25~45
、25~40、25~35、25~30、50~55、45~55、40~55、35~
55、30~55、30~50、35~50、40~50、45~50、35~45、ま
たは40~45bp)であり、互いに100bp以下(例えば、90、80、70、60
、50、40、30、20または10bp以下)離れている。一実施形態では、gRNA
は、一本鎖切断を標的位置のヌクレオチドのどちらかの側に配置させるように構成される
。
分子を、本明細書に記載される方法および組成物で使用して、標的位置の両側に切断が生
成され得る。二本鎖または対形成一本鎖切断は、標的位置の(例えば、セクションVII
Bで、例えば、表VII-13、VII-14、VII-15、VII-16、VII-
17、VII-18、VII-19、VII-20、VII-21、VII-22、VI
I-23、VII-24、IX-1、IX-1A、IX-3、またはXII-1で、また
はセクションVIIIで、本明細書に記載される遺伝子または経路の、両側に生成されて
、2つの切断で核酸配列が除去されてもよい(例えば、2つの切断間の領域が欠失される
)。一実施形態では、例えば、独立して、単分子(またはキメラ)またはモジュラーgR
NAである2つのgRNAは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置させるように構成され
る(例えば、第1のgRNAが使用されて、本明細書に記載される遺伝子または経路の変
異の上流(すなわち、5’)が標的化され、第2のgRNAが使用されて、本明細書に記
載される遺伝子または経路の変異の下流(すなわち、3’)が標的化される)。交互の実
施形態では、例えば、独立して、単分子(またはキメラ)またはモジュラーgRNAであ
る3つのgRNAは、二本鎖切断(すなわち、1つのgRNAがcas9ヌクレアーゼと
複合体形成する)と、2つの一本鎖切断または対の一本鎖切断(すなわち、2つのgRN
AがCas9ニッカーゼと複合体形成する)とが、標的位置の両側に配置されるように構
成される(例えば、第1のgRNAが使用されて、本明細書に記載される遺伝子または経
路の変異の上流(すなわち、5’)が標的化され、第2のgRNAが使用されて、本明細
書に記載される遺伝子または経路の変異の下流(すなわち、3’)が標的化される)。別
の実施形態では、例えば、独立して、単分子(またはキメラ)またはモジュラーgRNA
である4つのgRNAは、2対の一本鎖切断(すなわち、2対の2つのgRNAがCas
9ニッカーゼと複合体形成する)が、標的位置の両側に生じるように構成される(例えば
、第1のgRNAが使用されて、本明細書に記載される遺伝子または経路の変異の上流(
すなわち、5’)が標的化され、第2のgRNAが使用されて、本明細書に記載される遺
伝子または経路の変異の下流(すなわち、3’)が標的化される)。二本鎖切断、または
対の2つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位置の0~500bp以内(
例えば、標的位置から450、400、350、300、250、200、150、10
0、50または25bp以下)にある。ニッカーゼが使用される場合、対の2つのニック
は、互いに25~55bp以内(例えば、25~50、25~45、25~40、25~
35、25~30、50~55、45~55、40~55、35~55、30~55、3
0~50、35~50、40~50、45~50、35~45、または40~45bpの
間)であり、互いに100bp以下(例えば、90、80、70、60、50、40、3
0、20または10bp以下)離れている。
遺伝子をDNAレベルで変異させることで発現を恒久的に排除するCRISPR/Ca
s媒介性の遺伝子ノックアウトとは異なり、CRISPR/Casノックダウンは、人工
転写因子の使用を通じて、一時的な遺伝子発現の低下を可能にする。Cas9タンパク質
の双方のDNA切断ドメインで重要な残基を変異させることは(例えば、D10Aおよび
H840A変異)、触媒能のないCas9(eiCas9、死滅Cas9またはdCas
9としてもまた知られている)の生成をもたらす。触媒能のないCas9はgRNAと複
合体形成して、gRNAの標的化ドメインによって特定化されたDNA配列に局在するが
、それは標的DNAを切断しない。dCas9と、例えば、転写抑制ドメインなどのエフ
ェクタードメインとの融合は、gRNAによって特定化された任意のDNA部位へのエフ
ェクターの動員を可能にする。eiCas9それ自体は、コード配列中の早期領域に動員
された場合に、転写を妨げ得ることが示されている一方で、より堅固な抑制は、転写抑制
ドメイン(例えばKRAB、SIDまたはERD)をCas9に融合させて、それを遺伝
子のプロモーター領域に動員することで達成され得る。プロモーターのDNAseI高感
受性領域は、Cas9タンパク質にアクセスできる可能性が高く、また内在性転写因子の
ための部位を保有する可能性も高いので、これらの領域を標的化することで、おそらくよ
り効率的な遺伝子抑制または活性化がもたらされてもよい。特に遺伝子抑制については、
内在性転写因子の結合部位をブロックすることで、遺伝子発現の下方制御を助けることが
、本明細書で検討される。別の実施形態では、eiCas9は、クロマチン改変タンパク
質に融合され得る。改変クロマチン状態は、標的遺伝子の発現低下をもたらし得る。
ハンサーなど)に、既知の上流活性化配列(UAS)に、および/または標的DNAの発
現を調節できることが疑われる未知のまたは既知の機能がある配列に、標的化され得る。
または転写物の発現を低下させ得る。本明細書で検討されるのは、遺伝子の恒久的な破壊
が、理想的でない筋書きである。これらの筋書きでは、部位特異的抑制を使用して、発現
が一時的に低下または排除されてもよい。ヌクレアーゼが任意のDNA配列を切断して変
異を引き起こし得るのに対し、Casリプレッサーは、活発に転写される遺伝子のプロモ
ーター領域に標的化された場合にのみ効果を有してもよいので、Casリプレッサーのオ
フターゲット効果が、Casヌクレアーゼのものよりも重篤性が低いこともまた本明細書
で検討される。しかし、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトが恒久的である一方で、抑制は、
Casリプレッサーが細胞内に存在する場合に限り持続してもよい。リプレッサーがもは
や存在しなくなると、内在性転写因子および遺伝子制御要素は、発現をその天然状態に復
元する可能性が高い。
本明細書に記載されるようなgRNA分子を二本鎖切断または一本鎖切断を生成するC
as9分子と共に使用して、例えば、標的位置または標的遺伝子シグネチャなどの標的核
酸の配列が改変され得る。これらの方法で有用なgRNA分子は、以下に記載される。
または複数を含むように構成される。
a)それは、例えば、二本鎖切断を生じるCas9分子の標的化に際して、二本鎖切断
が、(i)標的位置の50、100、150または200ヌクレオチド以内にあるように
、または(ii)標的位置が末端切除領域内にあるように十分に密接して配置され得る、
b)それは、例えば、(i)17、(ii)18、または(iii)20ヌクレオチド
の標的化ドメインなどの少なくとも15、16、17、18、19または20ヌクレオチ
ドの標的化ドメインを有する、
c)(i)隣接およびテールドメインは、両者あわせて、例えば、天然起源のS.ピオ
ゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus
)、S.アウレウス(S.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.meni
ngitidis)テールおよび隣接ドメインからの少なくとも15、18、20、25
、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの少な
くとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または5
3個のヌクレオチドを含み、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または
10個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、
(ii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源のS
.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophi
lus)、S.アウレウス(S.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.m
eningitidis)gRNAの対応する配列からの少なくとも15、18、20、
25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの
少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、また
は53個のヌクレオチドがあり、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9ま
たは10個以下のヌクレオチドが異なる配列がある、
(iii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源の
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermoph
ilus)、S.アウレウス(S.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.
meningitidis)gRNAの対応する配列からの少なくとも16、19、21
、26、31、32、36、41、46、50、51、または54個のヌクレオチドなど
の第1の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも16、19
、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54個のヌクレオチ
ドがあり、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌク
レオチドが異なる配列がある、
(iv)テールドメインが、少なくとも10、15、20、25、30、35または4
0ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源のS.ピオゲネス(S.pyoge
nes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.アウレウス(S
.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.meningitidis)テー
ルドメインからの少なくとも10、15、20、25、30、35または40個のヌクレ
オチドを含み;またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下の
ヌクレオチドが異なる配列を含み、または
(v)テールドメインが、例えば、天然起源のS.ピオゲネス(S.pyogenes
)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.アウレウス(S.au
reus)、またはN.メニンジチディス(N.meningitidis)テールドメ
インなどの天然起源のテールドメインの15、20、25、30、35、40ヌクレオチ
ド、または全ての対応する部分を含む。
に構成される。
うに構成される。
ように構成される。
むように構成される。
または複数を含むように構成される。
a)それは、例えば、一本鎖切断を生じるCas9分子の標的化に際して、一本鎖切断
が、(i)標的位置の50、100、150または200ヌクレオチド以内にあるように
、または(ii)標的位置が末端切除領域内にあるように十分に密接して配置され得る、
b)それは、例えば、(i)17、(ii)18、または(iii)20ヌクレオチド
の標的化ドメインなどの少なくとも15、16、17、18、19または20ヌクレオチ
ドの標的化ドメインを有する、
c)(i)隣接およびテールドメインは、両者あわせて、例えば、天然起源のS.ピオ
ゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus
)、S.アウレウス(S.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.meni
ngitidis)テールおよび隣接ドメインからの少なくとも15、18、20、25
、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの少な
くとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または5
3個のヌクレオチドを含み、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または
10個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、
(ii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源のS
.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophi
lus)、S.アウレウス(S.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.m
eningitidis)gRNAの対応する配列からの少なくとも15、18、20、
25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの
少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、また
は53個のヌクレオチドがあり、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9ま
たは10個以下のヌクレオチドが異なる配列がある、
(iii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源の
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermoph
ilus)、S.アウレウス(S.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.
meningitidis)gRNAの対応する配列からの少なくとも16、19、21
、26、31、32、36、41、46、50、51、または54個のヌクレオチドなど
の第1の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも16、19
、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドが
あり、またはそれと、1、2、3、4、5;6、7、8、9または10個以下のヌクレオ
チドが異なる配列がある、
(iv)テールドメインが、少なくとも10、15、20、25、30、35または4
0ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源のS.ピオゲネス(S.pyoge
nes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.アウレウス(S
.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.meningitidis)テー
ルドメインからの少なくとも10、15、20、25、30、35または40個のヌクレ
オチドを含み、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下の
ヌクレオチドが異なる配列を含み、または
(v)テールドメインが、例えば、天然起源のS.ピオゲネス(S.pyogenes
)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.アウレウス(S.au
reus)、またはN.メニンジチディス(N.meningitidis)テールドメ
インなどの天然起源のテールドメインの15、20、25、30、35、40ヌクレオチ
ド、または全ての対応する部分を含む。
に構成される。
うに構成される。
ように構成される。
むように構成される。
s9分子のような、RuvC活性が不活性化されているCas9分子などのHNH活性を
有するCas9ニッカーゼ分子と共に使用される。
s9分子のような、HNH活性が不活性化されているCas9分子などのRuvC活性を
有するCas9ニッカーゼ分子と共に使用される。
の1対のgRNAは、それらが、以下の特性の1つまたは複数を含むように構成される。
a)gRNAの片方または双方が、例えば、一本鎖切断を生じるCas9分子の標的化
に際して、一本鎖切断が、(i)標的位置の50、100、150または200ヌクレオ
チド以内にあるように、または(ii)標的位置が末端切除領域内にあるように十分に密
接して位置し得る、
b)片方または双方が、例えば、(i)17または(ii)18ヌクレオチドの標的化
ドメインなどの少なくとも17ヌクレオチドの標的化ドメインを有する、
c)以下の片方または双方:
(i)隣接およびテールドメインは、両者あわせて、例えば、天然起源のS.ピオゲネ
ス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、
S.アウレウス(S.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.mening
itidis)テールおよび隣接ドメインからの少なくとも15、18、20、25、3
0、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの少なくと
も15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個
のヌクレオチドを含み、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10
個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、
(ii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源のS
.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophi
lus)、S.アウレウス(S.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.m
eningitidis)gRNAの対応する配列からの少なくとも15、18、20、
25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの
少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、また
は53個のヌクレオチドがあり、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9ま
たは10個以下のヌクレオチドが異なる配列がある、
(iii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源の
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermoph
ilus)、S.アウレウス(S.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.
meningitidis)gRNAの対応する配列からの少なくとも16、19、21
、26、31、32、36、41、46、50、51、または54個のヌクレオチドなど
の第1の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも16、19
、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドが
あり、またはそれと、1、2、3、4、5;6、7、8、9または10個以下のヌクレオ
チドが異なる配列がある、
(iv)テールドメインが、少なくとも10、15、20、25、30、35または4
0ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源のS.ピオゲネス(S.pyoge
nes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.アウレウス(S
.aureus)、またはN.メニンジチディス(N.meningitidis)テー
ルドメインからの少なくとも10、15、20、25、30、35または40個のヌクレ
オチドを含み;または(or,or)それと、1、2、3、4、5、6、7、8、9また
は10個以下のヌクレオチドが異なる配列を含み、または
(v)テールドメインが、例えば、天然起源のS.ピオゲネス(S.pyogenes
)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.アウレウス(S.au
reus)、またはN.メニンジチディス(N.meningitidis)テールドメ
インなどの天然起源のテールドメインの15、20、25、30、35、40個のヌクレ
オチド、または全ての対応する部分を含む、
d)gRNAが、標的核酸とハイブリダイズする際に、それらが、0~50、0~10
0、0~200、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30または少なくとも5
0ヌクレオチドによって隔てられるように構成される、
e)第1のgRNAおよび第2のgRNAによって生成される切断が、異なる鎖上にあ
る、
f)PAMが外側を向く。
構成される。
に構成される。
うに構成される。
れる。
構成される。
の特性を含むように構成される。
)の特性を含むように構成される。
特性を含むように構成される。
特性を含むように構成される。
eの特性を含むように構成される。
i)の特性を含むように構成される。
ii)の特性を含むように構成される。
dの特性を含むように構成される。
eの特性を含むように構成される。
よびeの特性を含むように構成される。
s9分子のような、RuvC活性が不活性化されているCas9分子などのHNH活性を
有するCas9ニッカーゼ分子と共に使用される。
s9分子のような、HNH活性が不活性化されているCas9分子などのRuvC活性を
有するCas9ニッカーゼ分子と共に使用される。
例えば、Cas9分子またはgRNA分子、またはその双方などの構成要素は、多様な
形式で送達、調合、または投与されることができ、例えば、表V-1aおよび表V-1b
を参照されたい。構成要素がDNAにコードされて送達される場合、DNAは、典型的に
制御領域を含み、例えば、プロモーターを含み、発現をもたらす。Cas9分子配列のた
めの有用なプロモーターとしては、CMV、EF-1a、MSCV、PGK、CAG調節
プロモーターが挙げられる。gRNAのための有用なプロモーターとしては、H1、EF
-1a、およびU6プロモーターが挙げられる。同様のまたは異なる強度があるプロモー
ターを選択して、構成要素の発現が調整され得る。Cas9分子をコードする配列は、例
えば、SV40NLSなどの核局在化シグナル(NLS)を含み得る。一実施形態では、
Cas9分子またはgRNA分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、ま
たは細胞特異的であり得る。
るかという例を提供する。
使用してインビボで送達される。別の実施形態では、Casシステムの構成要素は、例え
ば、本明細書に記載される方法を使用して、インビトロで送達される。
as9分子構成要素およびgRNA分子構成要素は、例えば、表V-2で本明細書に記載
される。
Cas9分子(例えば、eaCas9分子またはeiCas9分子)をコードするDN
A、gRNA分子、および/またはテンプレート核酸は、当該技術分野で周知の方法によ
って、または本明細書に記載されるようにして、対象に投与されまたは細胞内に送達され
得る。例えば、Cas9をコードするおよび/またはgRNAをコードするDNAは、例
えば、ベクター(例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター)、非ベクターベースの方
法(例えば、むきだしのDNAまたはDNA複合体を使用して)、またはそれらの組み合
わせによって、送達され得る。
分子は、Cas9分子と複合体形成して、例えば、Cas9分子をコードする核酸または
gRNA分子をコードする核酸などのシステムの構成要素を不活性化し、またはサイレン
シングし得る。どちらの状況でも、例えば、Cas9標的化gRNA分子、またはgRN
A標的化gRNA分子などの支配gRNAは、Cas9/gRNA複合体媒介遺伝子ター
ゲッティングの効果を制限して、活性に時間的制限を課し、またはオフターゲット活性を
低下させ得る。
NAは、ベクター(例えば、ウイルスベクター/ウイルスまたはプラスミド)によって送
達される。
ベクターはまた、例えば、Cas9分子配列と融合した、(例えば、核局在化、核小体局
在化、ミトコンドリア局在化のための)シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。
例えば、ベクターは、Cas9分子をコードする配列に融合された、(例えば、SV40
からの)核局在化配列を含み得る。
クコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位(IRES)、2A配列、およびスプライ
ス受容体またはドナーなどの1つまたは複数の調節的/制御要素が、ベクターに包含され
得る。一実施形態では、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIによって認識される(
例えば、CMVプロモーター)。一実施形態では、プロモーターは、RNAポリメラーゼ
IIIによって認識される(例えば、U6プロモーター)。一実施形態では、プロモータ
ーは、調節プロモーター(例えば、誘導性プロモーター)である。一実施形態では、プロ
モーターは、構成的プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、組織特異的
プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。
一実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。
めの)ウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスは、DNAウイルス(例えば
、dsDNAまたはssDNAウイルス)である。一実施形態では、ウイルスは、RNA
ウイルス(例えば、ssRNAウイルス)である。代表的なウイルスベクター/ウイルス
としては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイ
ルス(AAV)、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルス
が挙げられる。一実施形態では、例えば、AAVなどのウイルスベクターは、例えば、C
as9標的化gRNA分子またはgRNA標的化gRNA分子などの支配gRNA分子を
コードする配列を含む。
る。例えば、ウイルスベクターは、異種/代替ウイルス外被糖タンパク質によるシュード
タイプであり得て;細胞型特異的受容体(例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、成長
因子などの標的化リガンドを組み込むためのウイルス外被糖タンパク質の遺伝的修飾)に
よって改変され;および/または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識して、
もう一方の末端が標的細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有する
(例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン-ビオチン、および化学的結
合)。
異的プロモーターが構築されて、標的細胞のみで導入遺伝子(Cas9およびgRNA)
の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロRNA依存
性の調節によって媒介され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクタ
ーと標的細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素(H
A)などの融合タンパク質が組み込みまれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得
る。一実施形態では、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、(細胞分裂
中に)細胞壁の分解を要する特定のウイルスは、非分裂細胞には感染しない。ウイルスの
マトリックスタンパク質に組み込まれた核局在化ペプチドは、非増殖性細胞への形質導入
を可能にする。
分裂細胞に感染する。一実施形態では、ウイルスは、分裂および非分裂細胞の双方に感染
する。一実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。一実施形態では、ウ
イルスは、例えば、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。一実施形態では、
ウイルスは、複製能力がある。一実施形態では、ウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビ
リオン複製および/またはパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための1
つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。一実施形態
では、ウイルスは、Cas9分子および/またはgRNA分子の一過性の発現を引き起こ
す。一実施形態では、ウイルスは、Cas9分子および/またはgRNA分子の例えば、
少なくとも1週間、2週間、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間、9ヶ月間、1年
間、2年間、または恒久的などの持続性の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング
容量は、例えば、少なくとも約4kb~少なくとも約30kb、例えば、少なくとも約5
kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45
kb、または50kbなどで変動してもよい。
NAは、組換えレトロウイルスによって送達される。一実施形態では、レトロウイルス(
例えば、モロニーマウス白血病ウイルス)は、例えば、宿主ゲノムへの組み込みを可能に
するものなどの逆転写酵素を含む。一実施形態では、レトロウイルスは、複製能力がある
。一実施形態では、レトロウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製およびパッ
ケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための1つまたは複数のコード領域が、
その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。
NAは、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、例えば
、ウイルス複製に必要な1つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
NAは、組換えアデノウイルスによって送達される。一実施形態では、アデノウイルスは
、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。
NAは、組換えAAVによって送達される。一実施形態では、AAVは、例えば、本明細
書に記載されるような標的細胞などの宿主細胞に、そのゲノムを組み込むことができる。
一実施形態では、AAVは、例えば、共にアニールされて二本鎖DNAを形成する双方の
鎖をパッケージするscAAVなどの、自己相補的アデノ随伴ウイルス(scAAV)で
ある。例えば、AAV1、AAV2、修飾AAV2(例えば、Y444F、Y500F、
Y730Fおよび/またはS662Vにおける修飾)、AAV3、修飾AAV3(例えば
、Y705F、Y731Fおよび/またはT492Vにおける修飾)、AAV4、AAV
5、AAV6、修飾AAV6(例えば、S663Vおよび/またはT492Vにおける修
飾)、AAV8、AAV8.2、AAV9、AAV rh10、そしてAAV2/8、A
AV2/5、およびAAV2/6などのシュードタイプAAVをはじめとする、開示され
る方法で使用されてもよいAAV血清型はまた、開示される方法で使用され得る。
NAは、例えば、本明細書に記載されるウイルスの1つまたは複数のハイブリッドなどの
ハイブリッドウイルスによって送達される。
ス粒子が形成される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージし得る29
3細胞、およびレトロウイルスをパッケージし得るψ2細胞またはPA317細胞が挙げ
られる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス
粒子内にパッケージする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケ
ージングと(妥当な場合)引き続く宿主または標的細胞への組み込みに必要な最小のウイ
ルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カ
セットによって置換される。例えば、遺伝子治療で使用されるAAVベクターは、典型的
に、パッケージングおよび宿主または標的細胞内の遺伝子発現に必要なAAVゲノムから
の逆方向末端反復(ITR)配列のみを有する。欠損しているウイルス機能は、パッケー
ジング細胞株によってトランスに提供される。この後、ウイルスDNAは、他のAAV遺
伝子、すなわちrepおよびcapをコードするが、ITR配列が欠如しているヘルパー
プラスミドを含有する、細胞株内にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしての
アデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからのAAVベク
ター複製とAAV遺伝子発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠如のた
めに、顕著な量でパッケージされない。アデノウイルスの混入は、例えば、それに対して
アデノウイルスがAAVよりも感受性が高い、加熱処理によって低下させ得る。
る。例えば、ウイルスベクターは、異なる/代案のウイルス外被糖タンパク質によるシュ
ードタイプであり得て;細胞型特異的受容体によって改変され(例えば、ペプチドリガン
ド、一本鎖抗体、成長因子などの標的化リガンドに組み込むためのウイルス外被糖タンパ
ク質の遺伝子修飾);および/または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識し
て、もう一方の末端が標的細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有
する(例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン-ビオチン、および化学
的結合)。
異的プロモーターが構築されて、標的細胞のみで導入遺伝子(Cas9およびgRNA)
の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロRNA依存
性調節によって媒介され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクター
と標的細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素(HA
)などのが組み込みまれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得る。一実施形態で
は、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、(細胞分裂中に)細胞壁の分
解を要し、したがって非分裂細胞に感染しない特定のウイルスは、ウイルスのマトリック
スタンパク質に核局在化ペプチドを組み込むように改変されることができ、それによって
非増殖性細胞への形質導入が可能になる。一実施形態では、Cas9をコードするDNA
および/またはgRNAをコードするDNAは、(例えば、むきだしのDNAまたはDN
A複合体を使用して)非ウイルスベクターまたは非ベクターベースの方法によって送達さ
れる。例えば、DNAは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩(Ormosil)、
電気穿孔、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介形質移入、デ
ンドリマー、無機ナノ粒子、カルシウムリン酸塩、またはそれらの組み合わせによって送
達され得る。一実施形態では、DNAは、無機ナノ粒子によって送達される(例えば、ナ
ノ粒子表面へのペイロードに付着する)。代表的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性
ナノ粒子(例えば、Fe3MnO2);シリカ(例えば、ナノ粒子の外面をペイロードお
よび内部磁性構成要素の付着(例えば、コンジュゲーションまたは捕捉)を可能にする、
正荷電ポリマー(例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン)にコンジュゲ
ートするなど、多官能価を組み込むことができる;インビトロで非ウイルスベクターの形
質移入を促進するためのクロロキンが負荷された正荷電ポリマーがある、メソ多孔質シリ
カナノ粒子;高密度リポタンパクおよび金ナノ粒子;ナノ粒子が近赤外光への曝露によっ
て温度上昇に曝露すると放出されるペイロードで被覆されている、金ナノ粒子;表面がポ
リリジンまたは別の電荷ポリマーで修飾されて、核酸カーゴを捕捉する金、鉄または銀ナ
ノ粒子が挙げられる。一実施形態では、DNAは、有機ナノ粒子によって送達される(例
えば、ナノ粒子内部のペイロード捕捉)。代表的な有機ナノ粒子としては、例えば、ポリ
エチレングリコール(PEG)で被覆されている中性ヘルパー脂質に加えてカチオン性脂
質を含有する、SNALPリポソーム;および脂質コーティングで被覆されている、プロ
タミンおよび核酸複合体が挙げられる。
は、低密度超音波である。例えば、ペイロードを含有するマイクロバブル(例えば、タン
パク質、界面活性剤、または生体適合性ポリマーまたは脂質シェルなどの生体適合性素材
からできている)が使用されることができ、微小血管通過中に超音波ビームの焦点を合わ
せることで、マイクロバブルが破壊され得る。一実施形態では、ビヒクルは電気穿孔され
る。例えば、むきだしの核酸またはタンパク質は、例えば、細胞懸濁液中にまたは、網膜
および胚組織などの組織環境内に、電気穿孔によって送達され得る。一実施形態では、ビ
ヒクルは、ニードルまたはジェット注射される。例えば、むきだしの核酸またはタンパク
質は、例えば、筋肉、肝臓、皮膚、脳または心臓組織内に注射され得る。
NAは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。例え
ば、ビロソームは、不活性化ウイルス(例えば、HIVまたはインフルエンザウイルス)
と組み合わされたリポソームを構成し、それは、ウイルス法単独またはリポソーム法単独
のいずれよりも効率的な遺伝子移入を例えば、呼吸器上皮細胞内にもたらし得る。
イルスベクターは、無機ナノ粒子である(例えば、ナノ粒子表面へのペイロードに付着す
る)。代表的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子(例えば、Fe3MnO2
)、またはシリカが挙げられる。ナノ粒子の外面は、ペイロードの付着(例えば、コンジ
ュゲーションまたは捕捉)を可能にする正荷電ポリマー(例えば、ポリエチレンイミン、
ポリリジン、ポリセリン)にコンジュゲートされ得る。一実施形態では、非ウイルスベク
ターは、有機ナノ粒子である(例えば、ナノ粒子内部のペイロード捕捉)。代表的な有機
ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)で被覆されている中性ヘ
ルパー脂質に加えてカチオン性脂質を含有する、SNALPリポソーム;および脂質コー
ティングで被覆されている、プロタミンおよび核酸複合体が挙げられる。
ローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖、および細胞透過性ペプチドなど
のナノ粒子およびリポソームの標的細胞取り込みが増大される。一実施形態では、ビヒク
ルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド/ポリマーを利用する。一実施形態で
は、ビヒクルは、酸誘発性立体構造変化を受ける(例えば、カーゴのエンドソーム漏出を
加速するために)。一実施形態では、例えば、細胞区画内の放出のために、刺激切断可能
ポリマーが使用される。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカ
チオン性ポリマーが、使用され得る。
て、例えば、血液または骨髄への送達のために、リポソームが使用される。例えば、HS
Cを得ることが困難な(例えば、HSCが不安定であり、またはHSCが稀である)病状
では、リポソームを使用する直接送達によって、長期治療が可能になり得る。これらの病
状としては、例えば、鎌状赤血球貧血、ファンコーニ貧血、および再生不良性貧血が挙げ
られる。一実施形態では、標的臓器またはその血流への静脈内送達を介してまたは局所注
射を介して、例えば、肝臓または肺などの局在性の特定組織への送達のためにリポソーム
が使用される。例えば、長期治療が可能になり得て、その特定の臓器または組織型内で効
果が濃縮される。これらの病状としては、尿素サイクル障害、α-1-抗トリプシンまた
は嚢胞性線維症が挙げられる。
態では、ビヒクルは、弱毒型細菌(例えば、侵入性であるが弱毒化されて発病を予防して
導入遺伝子を発現するように、天然にまたは人工的に改変されている(例えば、リステリ
ア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、特定のサル
モネラ属(Salmonella)株、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifido
bacterium longum)、および改変大腸菌(Escherichiaco
li);栄養および組織特異的親和性を有して特定組織を標的化する細菌;修飾表面タン
パク質を有して標的組織特異性を改変する細菌)である。一実施形態では、ビヒクルは、
遺伝子修飾されたバクテリオファージである(例えば、改変ファージは、大きなパッケー
ジング容量を有し、免疫原性がより低く、哺乳類プラスミド維持配列を含有して、組み込
まれた標的化リガンドを有する)。一実施形態では、ビヒクルは、哺乳類ウイルス様粒子
である。例えば、修飾ウイルス粒子が生成され得る(例えば、「空の」粒子精製と、それ
に続く、所望のカーゴがあるウイルスのインビトロ構築によって)。ビヒクルはまた改変
されて、標的化リガンドが組み込まれ、標的組織特異性が改変され得る。一実施形態では
、ビヒクルは、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞(
例えば、対象に由来する球状構造に分解された赤血球である赤血球ゴーストに由来するリ
ン脂質ベースの粒子(例えば、組織標的化が、様々な組織または細胞特異的リガンドの付
着によって達成され得る);またはエンドサイトーシス起源の分泌型エキソソーム-対象
(すなわち、患者)由来膜結合ナノ小胞(30~100nm)(例えば、様々な細胞型か
ら生成されることができ、したがってリガンド標的化の必要なしに細胞に取り込まれ得る
)である。
患の治癒のためのインビボアプローチである。
分子構成要素などのCasシステムの構成要素は、ヌクレオフェクションによって送達さ
れる。例えば、Nucleofector(商標)(Lonza Cologne AG
)は、初代細胞および形質移入困難な細胞株への送達に使用され得る、形質移入技術であ
る。これは、電気的パラメータと細胞型特異的溶液との組み合わせに基づく、非ウイルス
法である。これは、(例えば、核内への核酸移入のための細胞分裂に依存することなく)
直接核に入る核酸の形質移入を可能にして、ニューロンおよび休止血液細胞などの非分裂
細胞に形質移入する能力を提供する。一実施形態では、ヌクレオフェクションが、インビ
トロ送達方法として使用される。
分子構成要素などのCasシステムの構成要素は、例えば、抗体ベースの分子Troja
n Horses(ArmaGen)などの内在性受容体媒介輸送体を使用する方法によ
って送達される。このような方法は、他の様式で到達するのが難しい、例えば、脳などの
(例えば、血液脳関門(BBB)を通過する、例えば、内在性受容体媒介性の輸送過程を
介する)部位への治療薬の非侵襲性送達を可能にし得る。
gRNA分子構成要素などの、Casシステムの構成要素以外の1つまたは複数の核酸分
子(例えば、DNA分子)が送達される。一実施形態では、核酸分子は、Casシステム
の構成要素の1つまたは複数が送達されるのと同時に、送達される。一実施形態では、核
酸分子は、Casシステムの構成要素の1つまたは複数が送達される(例えば、約30分
間、1時間、2時間、3時間、6時間、9時間、12時間、1日、2日間、3日間、1週
間、2週間、または4週間未満)前または後に送達される。一実施形態では、核酸分子は
、例えば、Cas9分子構成要素および/またはgRNA分子構成要素などのCasシス
テムの構成要素の1つまたは複数が送達されるのとは、異なる手段によって送達される。
核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達され得る。例えば、
核酸分子は、例えば、核酸(例えば、DNA)によって引き起こされる毒性が低下され得
るように、例えば、組み込み欠損レンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達さ
れることができ、Cas9分子構成要素および/またはgRNA分子構成要素は、電気穿
孔によって送達され得る。一実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載される
タンパク質などの治療用タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、例えば
、本明細書に記載されるRNA分子などのRNA分子をコードする。
Cas9分子(例えば、eaCas9分子、eiCas9分子またはeiCas9融合
タンパク質)をコードするRNAおよび/またはgRNA分子は、当該技術分野で周知の
方法によって、または本明細書に記載されるようにして、例えば、本明細書に記載される
標的細胞などの細胞内に送達され得る。例えば、Cas9-をコードするおよび/または
gRNA-をコードするRNAは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、脂質
媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
Cas9分子(例えば、eaCas9分子、eiCas9分子またはeiCas9融合
タンパク質)は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるよう
にして、細胞内に送達され得る。例えば、Cas9タンパク質分子は、例えば、マイクロ
インジェクション、電気穿孔、脂質媒介形質移入、ペプチド介形送達、またはそれらの組
み合わせによって送達され得る。送達は、gRNAをコードするDNA、またはgRNA
を伴い得る。
全身性の投与法としては、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路としては、
一例として、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が
挙げられる。全身投与される構成要素は、特定の臓器または細胞型に構成要素を標的化す
るように、修飾または調合されてもよい。
への(例えば、尾状核内へのまたは被殻内への)局在性脳実質内送達)、大脳皮質、中心
前回、海馬(例えば、歯状回またはCA3領域内)、側頭皮質、小脳扁桃、前頭皮質、視
床、小脳、毛髄質、視床下部、中脳蓋、中脳被蓋または黒質、眼内、眼窩内、結膜下、硝
子体内、結膜下または経強膜経路が挙げられる。一実施形態では、局所的に(例えば、脳
実質内または硝子体内に)投与された場合、全身投与(例えば、静脈内)と比較して、有
意により少量の構成要素(全身性のアプローチと比較して)が、効果を発揮してもよい。
局所投与法は、治療有効量の構成要素が全身投与された場合に起こることもある、潜在的
に毒性の副作用の発生を低下させまたは排除し得る。
む領域、または皮質ニューロンを含む領域をはじめとする、脳の離散領域内に、脳実質内
注射によって送達される。注射は、脳の2つ以上の領域内で、直接実施されてもよい。
膜下に送達される。結膜下注射は、例えば、黄斑下注射など、黄斑中で直接実施されても
よい。
。硝子体内注射は、網膜離脱リスクの相対的に低いリスクを有する。一実施形態では、ナ
ノ粒子またはウイルスベクター、例えば、AAVベクター、例えば、AAV2ベクター、
例えば、修飾AAV2ベクターは、硝子体内送達される。
達は脳実質内注射を介する。
与するのに使用され得る。代表的な方法としては、眼内注射(例えば、球後、結膜下、黄
斑下、硝子体内および脈絡膜内)、イオン注入、点眼薬、および眼内移植(例えば、硝子
体内、テノン下、および結膜下)が挙げられる。
部リザバーからの(例えば、眼球内または眼球外部位に配置されるインプラント(米国特
許第5,443,505号明細書および米国特許第5,766,242号明細書を参照さ
れたい)からの)または外部リザバーからの(例えば、静注バッグからの)持続注入とし
て提供されてもよい。構成要素は、例えば、眼の内壁に固定化された徐放薬物送達装置か
らの連続的放出によって、または脈絡膜内への標的化経強膜制御放出を介して、局所的に
投与されてもよい(例えば、PCT/US00/00207号明細書、PCT/US02
/14279号明細書、Ambati et al.,(2000)INVEST.OP
HTHALMOL.VIS.SCI.41:1181-1185、およびAmbati
et al.,(2000)INVEST.OPHTHALMOL.VIS.SCI.4
1:1186-1191を参照されたい)。構成要素を眼内に局所的に投与するのに好適
な多様な装置が、当該技術分野で公知である(例えば、米国特許第6,251,090号
明細書、米国特許第6,299,895号明細書、米国特許第6,416,777号明細
書、米国特許第6,413,540号明細書、およびPCT/US00/28187号明
細書を参照されたい)。
、生分解性材料、または拡散によって組み込まれた構成要素を放出する材料のマトリック
スを含み得る。構成要素は、放出系内で均一にまたは不均一に分布し得る。多様な放出系
が有用であってもよいが、適切なシステムの選択は、特定用途によって要求される放出速
度に左右される。非分解性および分解性放出系の双方が使用され得る。適切な放出系とし
ては、ポリマーおよびポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、または炭酸カル
シウムおよび砂糖(例えば、トレハロース)などであるが、これに限定されるものではな
い、無機および有機賦形剤および希釈剤が挙げられる。放出系は、天然または合成であっ
てもよい。しかし、通常、より信頼でき、より再現可であり、より限定される放出プロフ
ァイルを生じることから、合成放出系が好ましい。放出系材料は、異なる分子量を有する
構成要素が、材料を通過するまたは材料の分解による、拡散によって放出されるように選
択され得る。
チド)などのポリアミド;ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸-コ-グリ
コール酸)、およびポリ(カプロラクトン)などのポリエステル;ポリ(酸無水物);ポ
リオルトエステル;ポリカーボネート;およびその化学的誘導体(置換、例えば、アルキ
ル、アルキレンなどの化学基の付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によって慣例
的に加えられるその他の修飾)、共重合体、およびそれらの混合物が挙げられる。典型的
な合成非分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ(酸化エチレン)、ポリ(エチレングリ
コール)、およびポリ(テトラメチレンオキシド)などのポリエーテル;メチル、エチル
、その他のアルキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルおよびメタクリル酸、
およびポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、およびポリ(酢酸ビニル
)などのビニルポリマー-ポリアクリレートおよびポリメタクリレート;ポリ(ウレタン
);セルロースと、アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロ
ース、および様々な酢酸セルロースなどのその誘導体;ポリシロキサン;および任意のそ
の化学的誘導体(置換、例えば、アルキル、アルキレンなどの化学基の付加、ヒドロキシ
ル化、酸化、および当業者によって慣例的に加えられるその他の修飾)、共重合体、およ
びそれらの混合物が挙げられる。
型的に、微小球は、中空球を形成するように構造化された、乳酸およびグリコール酸ポリ
マーから構成される。球は、直径がおよそ15~30ミクロンであり得て、本明細書に記
載される構成要素が負荷され得る。
例えば、Cas9分子構成要素およびgRNA分子構成要素などのCasシステムの構
成要素の別個の送達、より特には、異なるモードによる構成要素の送達は、例えば、組織
特異性および安全性を改善することで、性能を向上させ得る。
こともある、異なる様式によって送達される。異なるまたは差別的な様式は、本明細書の
用法では、例えば、Cas9分子、gRNA分子、またはテンプレート核酸などの対象構
成要素分子に、異なる薬力学または薬物動態特性与える送達様式を指す。例えば、送達様
式は、例えば、選択された区画、組織、または臓器に、異なる組織分布、異なる半減期、
または異なる時間的分布をもたらし得る。
残留する核酸ベクターによる送達などのいくつかの送達様式は、構成要素のより持続性の
発現および存在をもたらす。例としては、例えば、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイ
ルスなどのウイルス送達が挙げられる。
減期、または身体、または特定の区画、組織または臓器に送達される構成要素の持続性に
関して、異なる様式によって送達され得る。一実施形態では、このような様式によってg
RNA分子が送達され得る。Cas9分子構成要素は、身体または特定の区画または組織
または臓器でのより低い持続性またはより少ない曝露をもたらす様式によって、送達され
得る。
達され、および第2の送達様式が使用されて、第2の構成要素が送達される。第1の送達
様式は、第1の薬力学的または薬物動態学的特性を与える。第1の薬力学的特性は、例え
ば、身体、区画、組織または臓器内における、構成要素の、または構成要素をコードする
核酸の、分布、持続性、または曝露であり得る。第2の送達様式は、第2の薬力学または
薬物動態学的特性を与える。第2の薬力学的特性は、例えば、身体、区画、組織または臓
器内における、構成要素の、または構成要素をコードする核酸の、分布、持続性、または
曝露であり得る。
態学的特性は、第2の薬力学的または薬物動態学的特性よりも限定的である。
または薬物動態学的特性を最適化する、例えば、最小化するように選択される。
または薬物動態学的特性を最大化する、例えば、最適化するように選択される。
スベクター、例えば、AAVまたはレンチウイルスなどの相対的に持続性の要素の使用を
含む。このようなベクターは比較的持続性であるので、それらから転写される生成物は、
比較的持続性になる。
過性の要素を含む。
例えば、gRNAは、例えば、AAVまたはレンチウイルスなどのプラスミドまたはウイ
ルスベクターから転写される。これらの遺伝子はタンパク質生成物をコードせず、gRN
Aは単独で作用できないため、これらの遺伝子の転写は、生理学的に重要でない。第2の
構成要素であるCas9分子は、例えば、mRNAとしてまたはタンパク質として一過性
様式で送達され、完全なCas9分子/gRNA分子複合体が、短時間のみ存在して活性
であることが確実にされる。
態で、または異なる送達ベクターで、送達され得る。
フターゲット修飾の可能性が、低下され得る。細菌由来Cas酵素からのペプチドは、M
HC分子によって細胞表面に提示されるので、例えば、Cas9分子などの免疫原性構成
要素のより低持続性様式による送達は、免疫原性を低下させ得る。二部送達系は、これら
の欠点を軽減し得る。
成活性複合体は、標的領域の重なりの外で最小化される。したがって、一実施形態では、
例えば、gRNA分子などの第1の構成要素は、第1の送達様式によって送達され、例え
ば、組織分布などの第1の空間的分布がもたらされる。例えば、Cas9分子などの第2
の構成要素は、第2の送達様式によって送達され、例えば、組織分布などの第2の空間的
分布がもたらされる。一実施形態では、第1の様式は、リポソーム、例えば、ポリマーナ
ノ粒子などのナノ粒子、および例えば、ウイルスベクターなどの核酸から選択される、第
1の要素を含む。第2の様式は、群から選択される、第2の要素を含む。一実施形態では
、第1の送達様式は、例えば、細胞特異的受容体または抗体などの第1の標的化要素を含
み、および第2の送達様式は、その要素を含まない。一実施形態では、第2の送達様式は
、例えば、第2の細胞特異的受容体または第2の抗体などの第2の標的化要素を含む。
達される場合、単一組織のみを標的化することが望ましくあってもよい場合に、複数組織
への送達とその中での治療活性の可能性がある。二部送達系は、この難題を解決して、組
織特異性を高め得る。gRNA分子およびCas9分子が、別個であるが重複する組織向
性がある分離した送達ビヒクルにパッケージされれば、完全に機能的な複合体は、双方の
ベクターによって標的化される組織内のみに形成される。
例えば、eiCas9分子/gRNA分子複合体などの典型的にeiCas9分子およ
びgRNA分子であるCas9分子を使用して、多種多様なペイロードが送達され得る。
一実施形態では、ペイロードは、標的核酸またはクロマチンまたは標的核酸の近くにある
またはそれと結合するその他の構成要素に送達される。
の配列特異性が標的配列との特異的相互作用に寄与し、それによって、Cas9分子/g
RNA分子複合体と結合する、例えば、共有結合または非共有結合するペイロードの送達
がもたらされると、考えられる。
または非共有結合する。一実施形態では、ペイロードは、gRNA分子と、共有結合また
は非共有結合する。一実施形態では、ペイロードは、例えば、生理的条件下で切断可能な
結合を含むリンカーなどのリンカーによって、Cas9分子またはgRNA分子と連結す
る。一実施形態では、結合は、生理的条件下で切断可能でなく、または不十分にのみ切断
可能である。一実施形態では、「共有結合する」は、融合タンパク質の一部として、Ca
s9分子を含有することを意味する。
一実施形態では、第1のペイロード分子は第1のCas9分子によって送達され、第2
のペイロード分子は第2のCas9分子によって送達される。一実施形態では、第1およ
び第2のペイロードは同一である。一実施形態では、第1および第2のCas9分子は同
一であり、例えば、同一生物種に由来し、同一PAMを有し、かつ/または同一配列を有
する。一実施形態では、第1および第2のCas9分子は異なり、例えば、異なる生物種
に由来し、異なるPAMを有し、かつ/または異なる配列を有する。構成の例は、表VI
-1に提供される。典型的に、表VI-1のCas9分子はeiCas9分子である。一
実施形態では、Cas9分子は、ペイロード送達および切断の双方がもたらされるように
選択される。一実施形態では、単一Cas9分子によって、例えば、2つのペイロードな
どの複数ペイロードが送達される。
ンカーによって第1のCas9分子に結合する薬剤などの第1のペイロードと、例えば、
第2のリンカーによって第2のCas9分子に結合する薬剤などの第2のペイロードとが
送達される。一実施形態では、第1および第2のペイロードは同一であり、一実施形態で
は、例えば、異なる放出動態を有する異なるリンカーによって、それぞれのCas9分子
と結合する。一実施形態では、第1および第2のペイロードは異なり、一実施形態では、
同一リンカーによってそれぞれのCas9分子と結合する。一実施形態では、第1および
第2のペイロードは相互作用する。例えば、第1および第2のペイロードは、例えば、二
量体タンパク質のような、二量体または多量体複合体などの複合体を形成する。一実施形
態では、第1のペイロードは第2のペイロードを活性化し得て、例えば、第1のペイロー
ドは第2のペイロードを修飾し得て、例えば、切断しまたはリン酸化する。一実施形態で
は第1のペイロードは第2のペイロードと相互作用して、第2のペイロードの活性を修飾
し、例えば増大または低下させる。
ペイロードは、大分子または生物製剤(例えば、抗体分子);融合タンパク質;例えば
、eiCas9分子などのCas9分子に融合パートナーとして融合したアミノ酸配列;
酵素;小分子(例えば、HDACおよびその他のクロマチン修飾因子/阻害剤、エクソン
スキッピング分子、転写阻害剤);マイクロサテライト伸長阻害剤;炭水化物;およびD
NA分解因子(例えば、感染症または「外来性」DNA状況における);例えば、DNA
、RNA、mRNA、siRNA、RNAiなどの核酸;またはアンチセンスオリゴヌク
レオチドを含み得る。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、タンパク質、核酸、または炭水化物のような
生物学的ポリマーなどのポリマーを含む。
わち、少なくとも、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、
または100kDの分子量を有する分子)を含む。一実施形態では、ペイロードは、例え
ば、タンパク質、核酸、または炭水化物のような生物学的ポリマーなどのポリマーを含む
。ポリマーは、天然起源または非天然起源ポリマーであり得る。一実施形態では、ペイロ
ードは、天然物である。例えば、天然物は、大分子または小分子であり得る。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、Cas9分子と共有結合または非共有結合す
る、タンパク質またはポリペプチドなどのタンパク質またはポリペプチドを含む。
ユニットはCas9分子によって送達される。一実施形態では、第1のタンパク質および
第2のタンパク質は、1つまたは複数のCas9分子によって送達され、例えば、それぞ
れ別個のCas9分子によって送達され、またはどちらも同一Cas9分子によって送達
される。
な結合を構成するリンカーなどのリンカーによって、Cas9分子と連結する。一実施形
態では、リンカーは、本明細書のセクションXIからのリンカーである。一実施形態では
、結合は、生理的条件下で切断可能でない。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、カウンターリガンドに対する特異的親和性を
有する、タンパク質などのリガンドを含む。一実施形態では、リガンドは、受容体(また
は受容体に対するリガンド)、または抗体であり得る。
、少なくとも1つの免疫グロブリン可変領域を含む、タンパク質またはポリペプチドが挙
げられる。例えば、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書でVHと略記される)、およ
び軽(L)鎖可変領域(本明細書でVLと略記される)を含み得る。別の実施例では、抗
体は、2つの重(H)鎖可変領域および2つの軽(L)鎖可変領域を含む。「抗体」とい
う用語は、抗体の抗原結合断片(例えば、一本鎖抗体、FabおよびsFab断片、F(
ab’)2、Fd断片、Fv断片、scFv、およびドメイン抗体(dAb)断片(de
Wildt et al.,EUR J IMMUNOL.1996;26(3):6
29-639))を包含する。例えば、抗体の抗原結合断片は、例えば、(i)VL、V
H、CL、およびCH1ドメインからなる一価の断片であるFab断片;(ii)ヒンジ
領域のジスルフィド架橋によって連結する2つのFab断片を含む二価の断片である、F
(ab’)2断片;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗
体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片;(v)VH領域からなるd
Ab断片(Ward et al.,(1989)NATURE 341:544-54
6);および(vi)機能性を保つ単離された相補性決定領域(CDR)を含み得る。さ
らに、Fv断片であるVLとVHの2つのドメインは、別個の遺伝子によってコードされ
るが、それらは、組換え法を使用して、その中でVLおよびVH領域が対合して、その中
で一本鎖Fv(scFv)として知られている一価の分子を形成する単一タンパク質鎖に
なるようにする、合成リンカーによって連結され得る。例えば、米国特許第5,260,
203号明細書、米国特許第4,946,778号明細書、および米国特許第4,881
,175号明細書;Bird et al.,(1988)SCIENCE 242:4
23-426;およびHuston et al.,(1988)PROC.NATL.
ACAD.SCI.USA 85:5879-5883を参照されたい。抗体は、IgA
、IgG、IgE、IgD、IgM(ならびにそれらのサブタイプ)の構造的特徴を有し
得る。抗体は、任意の起源に由来してもよいが、霊長類(ヒトおよび非ヒト霊長類)およ
び霊長類化起源が好ましい。一実施形態では、抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である
。
などの単一ドメイン抗体(例えば、sdAb、例えば、ナノボディ)である。一実施形態
では、単一ドメイン抗体の分子量は、約12~15kDaである。例えば、単一ドメイン
抗体は、ラクダ科動物に見られる重鎖抗体(例えば、VHH断片)から改変され得る。軟
骨魚もまた、それから、VNAR断片と称される単一ドメイン抗体が得られ得る、重鎖抗
体(IgNAR、「免疫グロブリン新規抗原受容体」)を有する。代案のアプローチは、
例えば、ヒトまたはマウス由来などの通常の免疫グロブリンG(IgG)からの二量体可
変領域を単量体に分割することである。標的エピトープに特異的に結合する、重鎖または
軽鎖のどちらかに由来する単一ドメイン抗体が得られ得る。例えば、単一ドメイン抗体は
、重鎖抗体の、または通常のIgGの可変領域(VH)を含む、約110アミノ酸長のペ
プチド鎖であり得る。
、より耐熱性でありおよび/または洗剤および高濃度の尿素に対して安定であり得る。例
えば、ラクダ科動物および魚類抗体に由来するものは、常態では軽鎖と結合する親油性部
位を覆う、伸展したループを形成するそれらの相補性決定領域3(CDR3)のために、
より低親油性かつより水溶性であり得る。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、例えば
、Fc領域を欠くために、補体系誘発性細胞傷害性を示さない。例えば、ラクダ科動物お
よび魚類由来sdAbなどの単一ドメイン抗体は、例えば、酵素の活性部位などの全抗体
がアクセスできなくてもよい、隠された抗原に結合し得る。この性質は、このような部位
を透過できる、それらの伸展したCDR3ループに起因し得る。
所望の抗原で免疫化し、引き続いて重鎖抗体をコードするmRNAを単離することで、得
られ得る。逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応によって、数百万個のクローンを含有する
単一ドメイン抗体の遺伝子ライブラリーが生成される。ファージディスプレイおよびリボ
ソームディスプレイのようなスクリーニング技術が、抗原に結合するクローンを同定する
のを助ける。
利用される。このような未感作ライブラリーは、通常は、所望の抗原に対する親和性が低
い抗体のみを含有し、追加的なステップとして、ランダム変異誘発によって親和性成熟さ
せることが、必要になる。
ために、それらのDNA配列が最適化され得る。別の目的は、抗体に対するヒト生物の免
疫学的反応を阻止するためのヒト化である。最終ステップは、大腸菌(E.coli)、
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ま
たはその他の適切な生物中における、最適化単一ドメイン抗体の翻訳である。
ら作成され得る。工程は同様であり、免疫化または未感作ドナーからの遺伝子ライブラリ
ーと、最も特異的な抗原を同定するための提示技術とを含む。単量体化は、通常は、親水
性アミノ酸で親油性アミノ酸を置換することで達成される。親和性が保持されれば、単一
ドメイン抗体も同様に、大腸菌(E.coli)、S.セレビシエ(S.cerevis
iae)またはその他の生物中で生成され得る。
転写リプレッサータンパク質またはドメインなどの転写アクチベータータンパク質または
ドメインを含む。
一実施形態では、ペイロードは、融合タンパク質を含む。代表的な融合タンパク質とし
ては、異なる機能的性質を有し得る、または異なるタンパク質に由来し得る、第1および
第2の融合パートナーが挙げられる。一実施形態では、融合タンパク質は、酵素活性を含
む、または遺伝子発現を促進または阻害する、核酸および第2の融合パートナーに結合す
る第1の融合パートナーを含み得る。一実施形態では、ペイロードそれ自体が融合タンパ
ク質である。一実施形態では、ペイロードは、Cas9分子に融合される。
断片を含有し得る。一実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリン断片(例えば、
Fc断片)に融合された本明細書に記載されるタンパク質(例えば、受容体);輸送タン
パク質;または例えば、アルブミンなどの血漿タンパク質であり得る。融合タンパク質は
また、融合タンパク質に、(例えば、毒素、酵素またはサイトカインによって運ばれる)
毒性を付加する断片を含有し得る。融合タンパク質はまた、(例えば、HIV-1 TA
Tタンパク質によって)送達および/または経路標的化を可能にするために、使用され得
る。その他の例としては、例えば、ストレプトアビジン融合物などの多価を可能にする融
合物、または(例えば、その間に切断可能なリンカーがあるまたはない)2つの活性成分
の融合物が挙げられる。
Cas9分子との融合パートナーである。
転写リプレッサータンパク質またはドメインなどの転写アクチベータータンパク質または
ドメインを含むCas9分子との融合パートナーを含む。
一実施形態では、ペイロードは、酵素を含む。代表的な酵素としては、例えば、酸化還
元酵素(例えば、酸化/還元反応を触媒する)、トランスフェラーゼ(例えば、官能基(
例えば、メチルまたはリン酸基)を移動させる)、ヒドロラーゼ(例えば、様々な結合の
加水分解を触媒する)、リアーゼ(例えば、加水分解および酸化以外の手段によって様々
な結合を切断する)、イソメラーゼ(単一分子中の異性化変化を触媒する)、およびリガ
ーゼ(例えば、共有結合によって2つの分子を連結する)が挙げられる。一実施形態では
酵素は、例えば、DNA合成、転写、DNAおよびヒストンのエピジェネティックな修飾
、RNA転写後修飾、細胞周期制御、DNA損傷修復、またはゲノム不安定性などの細胞
核内の1つまたは複数の機能を媒介し、またはそれと関連する。
一実施形態では、ペイロードは、小分子化合物を含む。
ば、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、または核酸のような生体高分子などの第2の
分子と結合し得て、一実施形態では、第2の分子の構造、分布、活性、または機能の1つ
または複数を改変する。一実施形態では、小分子のサイズは、10-9m程度である。一
実施形態では、小分子の分子量は、例えば、200amu~500amu、300amu
~700amu、500amu~700amu、700amu~900amu、または5
00amu~900amuである。
ロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)、またはロミデプシン)、ヒストンメチルト
ランスフェラーゼ阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば、アザシチジ
ン(または5-アザシチジン)、デシタビン(または5-アザ-2’-デオキシシチジン
)、またはDNA複製阻害剤が挙げられる。小分子はまた、例えば、小型核酸分子(塩基
次第で、例えば、2kD未満などの1~4個の塩基)およびペプチドも含み得る。
一実施形態では、ペイロードは、マイクロサテライト伸長阻害剤を含む。一実施形態で
は、マイクロサテライト伸長阻害剤は、DNAミスマッチ修復タンパク質である。本明細
書に記載される分子および方法によって送達され得る代表的なDNAミスマッチ修復タン
パク質としては、例えば、MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、MLH3、PMS
1、PMS2が挙げられる。
一実施形態では、ペイロードは、シグナルを生じる分子を含む。このようなペイロード
は、例えば、研究、治療(例えば、がん治療)、および診断用途において、有用である。
一実施形態では、シグナルは、例えば、赤外線、可視、または紫外線領域における電磁放
射;例えば、α、β、またはγ粒子のような放射性崩壊生成物などの粒子;例えば、有色
基質などの検出可能基質;例えば、酵素反応生成物などの反応生成物;または例えば、抗
体などの特異的結合因子によって検出可能なリガンド;または色素を含む。一実施形態で
は、シグナルは、例えば、蛍光タンパク質による蛍光放射を含む。代表的な蛍光タンパク
質としては、Blue/UVタンパク質(例えば、TagBFP、mTagBFP、Az
urite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-S
apphire)、シアンブルータンパク質(例えば、ECFP、Cerulean、S
CFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、monomericMi
doriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1)、緑色タンパク質(例えば、
EGFP、Emerald、SuperfolderGFP、MonomericAza
miGreen、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeo
nGreen)、黄色タンパク質(例えば、EYFP、Citrine、Venus、S
YFP2、TagYFP)、橙色タンパク質(例えば、MonomericKusabi
ra-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange、mOrange2)、赤色
タンパク質(mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTa
ngerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、
mRuby、mRuby2)、遠赤色タンパク質(例えば、mPlum、HcRed-T
andem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IF
P1.4、iRFP)、ロングストークスシフトタンパク質(例えば、mKeimaRe
d、LSS-mKate1、LSS-mKate2、mBeRFP)、光活性化可能タン
パク質(例えば、PA-GFP、PAmCherry1、PATagRFP)、Phot
oconvertibleタンパク質(例えば、Kaede(緑色)、Kaede(赤色
)、KikGR1(緑色)、KikGR1(赤色)、PS-CFP2、mEos2(緑色
)、mEos2(赤色)、mEos3.2(緑色)、mEos3.2(赤色)、PSmO
range)、光切り替え可能タンパク質(例えば、Dronpa)が挙げられる。
の融合パートナーとして提供される。
、インジウム(111In)、ヨウ素(131Iまたは125I)、イットリウム(90
Y)、ルテチウム(177Lu)、アクチニウム(225Ac)、ビスマス(212Bi
または213Bi)、イオウ(35S)、炭素(14C)、トリチウム(3H)、ロジウ
ム(188RH)、テクネチウム(99mTc)、プラセオジム、または亜リン酸(32
P)または例えば、炭素-11(11C)、カリウム-40(40K)、窒素-13(1
3N)、酸素-15(15O)、フッ素-18(18F)、およびヨウ素-121(12
1I)などの陽電子放出放射性核種)、蛍光標識(例えば、FITC、ローダミン、ラン
タニドリン光体)、酵素的標識(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシ
ダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光、(例えば、光学的また
は熱量測定方法によって検出され得る、ストレプトアビジン部分と蛍光マーカーまたは酵
素活性とを含有する分子などの標識されたアビジンによって検出され得る)ビオチニル基
、および二次レポーター(例えば、ロイシンジッパー対合配列、二次抗体の結合部位、金
属結合ドメイン、エピトープタグ)によって認識される所定のポリペプチドエピトープを
はじめとするが、これに限定されるものではないポリペプチドを標識するために有用であ
る。一実施形態では、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって付着して、可能な
立体障害を軽減する。
as9分子、またはペイロード分子に組み込まれ得る。代表的な放射性核種としては、例
えば、β放射体、α放射体またはγ放射体が挙げられる。一実施形態では放射性核種は、
例えば131Iまたは125Iなどのヨウ素、例えば90Yなどのイットリウム、例えば
177Luなどのルテチウム、例えば225Acなどのアクチニウム、例えば212Bi
または213Biなどのビスマス、例えば35Sなどのイオウ、例えば14Cなどの炭素
、トリチウム、3H、例えば188RHなどのロジウム、例えば、99Tcなどのテクネ
チウム、プラセオジム、または例えば32Pなどの亜リン酸である。
一実施形態では、ペイロードは、DNA構造の内在性または外来性修飾物質を含む。ペ
イロードの典型例である修飾物質は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで送達さ
れ得る。
物質を含む。一実施形態では、エピジェネティックな状態または特性は、障害を治療する
ように、または細胞の発達またはその他の状態に影響を与えるように、改変され得る。
えば、本明細書に記載されるペイロードはDNAへのメチル基の付加を調節し、例えば、
CpG部位で、例えば、シトシンを5-メチルシトシンに変換し得る。
チル化)は、例えば、がんなどの様々な疾患および病状に関連する。本明細書に記載され
る修飾物質を使用して、例えば、がんなどの疾患を治療するために、転写が消失した遺伝
子が再活性化され、または転写的機能亢進遺伝子が阻害され得る。
域に高レベルの5-メチルシトシンがある遺伝子は、転写的により低活性またはサイレン
トであり得る。したがって、本明細書に記載される方法を使用して、例えば、本明細書に
記載される遺伝子の転写活性が標的化され抑制され得る。
、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)活性を有し、またはDNMT活性を調節
し得て、例えば、DNA複製後に、例えば、DNAメチル化を維持しまたは受動的DNA
脱メチル化を低下させる。
載される修飾物質は、新規DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)(例えば、DN
MT3a、DNMT3b、DNMT3L)活性を有し、または新規DNMT(例えばDN
MT3a、DNMT3b、DNMT3L)活性を調節し得て、例えば、発達初期において
DNAメチル化パターンを生じる。
法によって、または本明細書に記載されるようにして評価され得る。DNAメチル化の代
表的な検出方法としては、例えば、メチル化特異的PCR(MSP)、全ゲノム亜硫酸水
素塩配列決定(BS-Seq)、HELP(ライゲーション媒介PCRによるHpaII
極小断片濃縮)アッセイ、チップ-オンチップアッセイ、制限ランドマークゲノムスキャ
ン、メチル化DNA免疫沈降法(MeDIP)、亜硫酸水素塩処理DNAのピロシーケン
ス、DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ活性のための分子ブレーク光アッセイ、メ
チル感受性サザンブロット法、MethylCpG結合タンパク質(MBP)とメチル結
合領域(MBD)のみを含有する融合タンパク質とを使用した、天然DNAのメチル化お
よび非メチル化画分への分離が挙げられる。
のリン酸ジエステル結合の加水開裂を触媒し得る。一実施形態では、修飾物質(例えば、
DNaseI)は、ピリミジンヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合で優先的に
DNAを切断して、3’位に遊離ヒドロキシル基がある5’-リン酸末端ポリヌクレオチ
ドを生じる。一実施形態では、修飾物質(例えば、DNaseII)は、DNA中のデオ
キシリボヌクレオチド結合を加水分解して、3’-リン酸塩がある生成物を生じる。一実
施形態では、修飾物質は、エンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を含む。一実施形態では
、修飾物質は、エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性を含む(例えば、3’から5’方向
または5’から3’方向のエキソデオキシリボヌクレアーゼ活性を有する)。一実施形態
では、修飾物質は、特定のDNA配列を認識する(例えば、制限酵素)。一実施形態では
、修飾物質は、配列特異的様式中のDNAを切断しない。修飾物質は、一本鎖DNA(例
えば、ニッカーゼ活性を有する)、二本鎖DNA、またはその双方を切断し得る。
化させまたは維持する。例えば、本明細書に記載される修飾物質は、例えば、左右像(右
または左)、らせんターン長、ターンあたりの塩基対数、および/または主溝と副溝間の
サイズの差異などの三次構造を調節し得る。一実施形態では、修飾物質は、B-DNA、
A-DNA、および/またはZ-DNAの形成を媒介する。本明細書に記載される修飾物
質はまた、例えば、DNAと、例えば、クロマチンの形態その他の分子(例えば、ヒスト
ンなどのDNAまたは非DNA分子)との相互作用などの四次構造を調節し得る。一実施
形態では、三次的または四次DNA構造を媒介または修飾する修飾物質は、DNAヘリカ
ーゼ活性を含み、またはDNAヘリカーゼ活性を調節する。
る。例えば、修飾物質は、例えば、直接回復、塩基切除修復(BER)、ヌクレオチド切
除修復(NER)(例えば、ゲノム全体の修復(GG-NER)、転写共役修復(TC-
NER))、不一致修復(MMR)、非相同末端結合(NHEJ)、マイクロホモロジー
媒介末端結合(MMEJ)、相同組換え、および/または損傷乗り越え(TLS)などの
1つまたは複数のDNA損傷反応および修復機構を促進し得る。一実施形態では、修飾物
質は、障害認識ステップを促進する。一実施形態では、修飾物質は、DNA修復ステップ
を促進する。
々な疾患および病状に関連する。例えば、がんリスクを増大させ得るDNA修復遺伝子変
異としては、例えば、BRCA1およびBRCA2(例えば、乳がんおよび卵巣がんにお
いて、例えば、二本鎖切断および娘鎖ギャップの相同組換え修復(HRR)に関与する)
;ATM(例えば、白血病、リンパ腫、および乳がんにおいて、例えば、異なる変異は、
HRR、一本鎖アニーリング(SSA)、NHEJまたは相同性指向DSBR(HDR)
を低下させる);NBS(例えば、リンパ系悪性腫瘍において、例えば、NHEJに関与
する);MRE11(例えば、乳がんにおいて、例えば、HRRに関与する);BLM(
例えば、白血病、リンパ腫、結腸、乳房、皮膚、内耳道、舌、食道、胃、扁桃、喉頭、肺
、および子宮がんにおいて、例えば、HRRに関与する);WRN(例えば、軟部組織肉
腫、結腸直腸、皮膚、甲状腺、および膵臓がんにおいて、例えば、HRR、NHEJ、ロ
ングパッチBERに関与する);RECQ4(RECQL4)(例えば、HRRに関与し
、例えば、ロートムンド・トムソン症候群(RTS)、ラパデリノ症候群またはバラー・
ゲロルト症候群、そして基底細胞がん、扁平上皮がん、およびボーエン病をはじめとする
皮膚がんなどを引き起こす);FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、F
ANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANC
L、FANCM、およびFANCN(例えば、白血病、肝臓腫瘍、多数の部位の固形腫瘍
において、例えば、HRRおよびTLSに関与する);XPCおよびXPE(DDB2)
(例えば、皮膚がん(メラノーマおよび非メラノーマ)において、例えば、NER(GG
R型)に関与する);XPA、XPB、XPD、XPF、およびXPG(例えば、皮膚が
ん(メラノーマおよび非メラノーマ)、および中枢神経系において、例えば、NER(G
GR型およびTCR型の双方)に関与する);XPV(POLH)(例えば、皮膚がん(
メラノーマおよび非メラノーマ)において、例えば、TLSに関与する);hMSH2、
hMSH6、hMLH1、およびhPMS2(例えば、結腸直腸、子宮内膜、および卵巣
がんにおいて、MMRに関与する);MUTYH(例えば、結腸がんにおいて、例えば、
8OH-dGと誤対合し、ならびにG、FapydG、およびCと誤対合するAのBER
に関与する)が挙げられる。
機構を調節することで、異常なDNA損傷修復に関連する疾患または病状が治療され得る
。
GMT)などの、直接回復に関与する1つまたは複数のタンパク質から選択され、または
それを調節する。
ゼ、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼなどの、BERに関与する1つまたは複数のタ
ンパク質から選択され、またはそれを調節する。
PA、RPA、XPG、XPF、ERCC1、TFIIH、PCNA、RFC、ADN
Pol、およびリガーゼIなどの、GG-NERに関与する1つまたは複数のタンパク質
から選択され、またはそれを調節する。
RCC1、CSA-CNS、TFIIH、CAK、PCNA、RFC、リガーゼI、およ
びRNAポリメラーゼIIなどの、TC-NERに関与する1つまたは複数のタンパク質
から選択され、またはそれを調節する。
選択され、またはそれを調節する。
ーゼIV、XRCC4、XLF、Artemis、DNAポリメラーゼmu、DNAポリ
メラーゼλ、PNKP、Aprataxin、およびAPLFなどの、NHEJに関与す
る1つまたは複数のタンパク質から選択され、またはそれを調節する。
与する1つまたは複数のタンパク質から選択され、またはそれを調節する。
よびPCNAなどの、TLSに関与する1つまたは複数のタンパク質から選択され、また
はそれを調節する。
NA損傷に対する転写応答などの、DNA損傷に対する包括的反応を調節し得る。例えば
、DNA損傷チェックポイントは、G1/SおよびG2/M境界で起こり得る。S内チェ
ックポイントもまた、存在し得る。チェックポイント活性化は、ATMおよびATRの2
つのマスターキナーゼによって調節され得る。ATMは、クロマチン構造中のDNA二本
鎖切断および破壊に応答し得て、ATRは、停止複製フォークに応答し得る。これらのキ
ナーゼは、シグナルトランスダクションカスケード中の下流標的をリン酸化し得て、例え
ば、細胞周期停止をもたらす。チェックポイント活性化シグナルを下流タンパク質に伝送
する、チェックポイント媒介タンパク質のクラス(例えば、BRCA1、MDC1、およ
び53BP1)は、調節され得る。調節され得る代表的な下流タンパク質としては、例え
ば、p53、p21、およびサイクリン/サイクリン依存性キナーゼ複合体が挙げられる
。
は、修飾物質は、ミトコンドリアDNA損傷反応および修復を調節する。
、例えば、開始(例えば、複製前複合体および/または開始複合体のアセンブリー)、伸
長(例えば、複製フォークの形成)、および終結(例えば、複製フォーク関門の形成)な
どの、DNA複製の1つまたは複数の段階を促進または阻害し得る。一実施形態では、修
飾物質は、例えば、起点認識複合体(ORC)、CDC6、CDT1、ミニ染色体維持タ
ンパク質(例えば、MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、お
よびMCM10)、CDC45、CDK、DDK、CDC101、CDC102、CDC
103、およびCDC105などの、開始に関与する1つまたは複数のタンパク質から選
択され、またはそれを調節する。一実施形態では、修飾物質は、例えば、DNAヘリカー
ゼ、DNAポリメラーゼ、PCNA、CDC45-MCM-GINSヘリカーゼ複合体、
および複製因子C複合体などの、伸長に関与する1つまたは複数のタンパク質から選択さ
れ、またはそれを調節する。
どの、終結に関与する1つまたは複数のタンパク質から選択されまたはそれを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、例えば、ATM、ATR、ATRIP、TOPBP1、R
AD9、HUS1、Rad1、およびCHK1などの、1つまたは複数の複製チェックポ
イントタンパク質から選択され、またはそれを調節する。
飾物質は、ミトコンドリアDNA複製を促進または阻害する。
などの様々な疾患および病状に関連し得る。ミトコンドリアDNA複製の欠陥はまた、例
えば、mtDNA枯渇症候群(例えば、アルパーズ病または早期幼児肝脳症候群)および
mtDNA欠失障害(例えば、進行性外眼筋麻痺(PEO)、運動失調神経障害、または
ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症(MNGIE))などの疾患および病状に関連し得
る。修飾物質を使用して、例えば、本明細書に記載されるようにDNA複製を調節するこ
とで、異常なDNA複製に関連する疾患または病状が治療され得る。
書に記載される。
などのクロマチンの構成要素のエピジェネティックな状態または特性の修飾物質を含む。
例えば、エピジェネティックな状態または特性は、ヒストンアセチル化、脱アセチル化、
メチル化(例えば、モノ、ジ、またはトリメチル化)、脱メチル化、リン酸化、脱リン酸
化、ユビキチン化(例えば、モノまたはポリユビキチン化)、脱ユビキチン化、SUMO
化、ADP-リボース化、脱イミノ化、またはそれらの組み合わせを含み得る。
はそれを調節する。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、ヒストンメチルトランスフェ
ラーゼ(HMT)である。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、ヒストンデメチルトラ
ンスフェラーゼ(HDMT)である。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、ヒストンア
セチルトランスフェラーゼ(HAT)である。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、ヒ
ストンデアセチラーゼ(HDAC)である。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、キナ
ーゼである。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、ホスファターゼである。一実施形態
では、ヒストン修飾酵素は、ユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2
)、またはユビキチンリガーゼ(E3)である。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、
脱ユビキチン化(DUB)酵素である。
K4、H3K9、H3K27、H3K79、H4K20、H2BK5のモノメチル化、H
3K79のジメチル化、H3K4、H3K79、H3K36のトリメチル化、およびH3
K9、H3K14、H3K27のアセチル化が、転写活性化に関連し得る。別の例として
、H3K9、H3K27のジメチル化、およびH3K9、H3K27、H3K79、H2
BK5のトリメチル化が、転写抑制に関連し得る。一実施形態では、修飾物質は、例えば
、活性遺伝子中で、H3リジン4(H3K4Me3)のトリメチル化および/またはH3
リジン36(H3K36Me3)トリメチル化を調節する。一実施形態では、修飾物質は
、例えば、抑制された遺伝子中で、H3リジン27(H3K27Me3)のトリメチル化
、H3リジン9(H3K9Me2/3)のジおよびトリメチル化、および/またはH4リ
ジン20(H4K20Me3)のトリメチル化を調節する。一実施形態では、修飾物質は
、例えば、幹細胞内で、活性化(例えば、H3K4Me3)および抑制(例えば、H3K
27Me3)標識の双方を調節する。
えば、本明細書に記載される修飾物質は、セリン139におけるH2AXのリン酸化およ
び/またはH3リジン56のアセチル化(H3K56Ac)を調節し得る。
疾患および病状に関連する。本明細書に記載される修飾物質を使用して、例えば、本明細
書に記載されるように1つまたは複数のヒストン修飾を調節することで、本明細書に記載
される疾患または病状が治療され得る。
本明細書に記載されるようにして評価され得る。ヒストン修飾検出する代表的な方法とし
ては、例えば、定量PCRがそれに続く、修飾ヒストンに対する抗体を使用するクロマチ
ン免疫沈降法(ChIP)が挙げられる。
明細書に記載される。
一実施形態では、ペイロードは、遺伝子発現の修飾物質を含む。遺伝子発現の修飾物質
は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで送達され得る。
子に隣接する、特定のDNA配列(例えば、エンハンサーまたはプロモーター領域)に結
合し得る。例えば、転写因子は、RNAポリメラーゼとDNAの結合を安定化または阻害
し、(例えば、直接、またはこのような触媒活性があるその他のタンパク質を動員するこ
とで)ヒストンタンパク質びアセチル化または脱アセチル化を触媒し、または活性化補助
因子またはコリプレッサータンパク質を転写因子/DNA複合体に動員し得る。遺伝子発
現の修飾物質はまた、例えば、転写因子と直接または間接的に相互作用する、任意のタン
パク質も含む。
多数のまたは全てのクラスII遺伝子の転写開始部位周囲のコアプロモーター領域と相互
作用する。代表的な基本転写因子としては、例えば、TFIIA、TFIIB、TFII
D、TFIIE、TFIIF、およびTFIIHが挙げられる。一実施形態では、転写因
子は上流転写因子であり、例えば、開始部位上流に結合して、転写を刺激または抑制する
。一実施形態では、転写因子は、例えば、遺伝子近くに存在する認識配列に依存する転写
因子などの、特定の転写因子である。代表的な特定の転写因子としては、例えば、SP1
、AP-1、C/EBP、熱ショック因子、ATF/CREB、-Myc、OCT-1、
およびNF-1が挙げられる。
NF-1、またはCCAATである。一実施形態では、転写因子は条件的活性であり、例
えば、それは、発達(例えば、GATA、HNF、PIT-1、MyoD、Myf5、H
ox、翼状らせん)、シグナル依存性(例えば、細胞外リガンド(内分泌またはパラクリ
ン)依存性、細胞内リガンド(自己分泌)依存性(例えば、SREBP、p53、オーフ
ァン核受容体)、細胞膜受容体依存性(例えば、常在核因子(例えば、CREB、AP-
1、Mef2)または潜在細胞質因子(例えば、STAT、R-SMAD、NF-κB、
Notch、TUBBY、NFAT)の活性化を必要とする。
一実施形態では、遺伝子発現の修飾物質は、スプライシングを調節する。例えば、修飾
物質は、相互に排他的なエクソンであるエクソンスキッピングまたはカセットエクソン、
代案のドナー部位、代案の受容体部位、イントロン保持、またはそれらの組み合わせを調
節し得る。一実施形態では、修飾物質は、例えば、ASF1などの、1つまたは複数の一
般的または選択的スプライシング因子から選択されまたはそれを調節する。一実施形態で
は、修飾物質は、濃度依存様式で、選択的スプライシングを調節する(例えば、スプライ
ス部位選択に影響を及ぼす)。
一実施形態では、遺伝子発現の修飾物質は、転写後修飾を調節する。例えば、本明細書
に記載される修飾物質は、5’キャッピング、3’ポリアデニル化、およびRNAスプラ
イシングを促進または阻害し得る。一実施形態では、修飾物質は、例えば、ホスファター
ゼおよびグアノシルトランスフェラーゼなどの、5’キャッピングに関与する1つまたは
複数の要素から選択され、またはそれを調節する。一実施形態では、修飾物質は、例えば
、ポリアデニル化ポリメラーゼ、切断・ポリアデニル化特異性因子(CPSF)、および
ポリ(A)結合タンパク質などの、3’ポリアデニル化に関与する1つまたは複数の要素
から選択され、またはそれを調節する。一実施形態では、修飾物質は、例えば、一般的ま
たは選択的スプライシング要素などの、RNAスプライシングに関与する1つまたは複数
の要素から選択され、またはそれを調節する。
書に記載される。
一実施形態では、ペイロードは、例えば酵素転写因子の阻害剤などの上に記載されるペ
イロードの阻害剤を含む。一実施形態では、ペイロードは、前述のペイロード分子、過程
、機能または機構のいずれかの阻害剤を含む。一実施形態では、阻害剤は、本明細書に記
載されるペイロード分子の1つに対して特異的な抗体分子(例えば、完全抗体またはその
抗原結合断片)である。一実施形態では、阻害剤は、小分子化合物である。一実施形態で
は、阻害剤は、核酸(例えば、siRNA、shRNA、リボザイム、アンチセンス-オ
リゴヌクレオチド、およびアプタマー)である。例えば、ペイロードは、例えば、転写因
子、翻訳後修飾酵素、転写後修飾酵素など標的の阻害剤、または前述のいずれかをコード
する核酸配列である。
非ヒト遺伝子またはタンパク質が本明細書で列挙される場合、本発明はまた、ヒト対応
物またはオルソログおよびその使用も含むものと理解される。
例えば、Cas9分子/gRNA分子複合体などのCas9分子およびgRNA分子を
使用して、細胞(例えば、動物細胞または植物細胞)が操作されることができ、例えば、
多種多様な細胞内でペイロードが送達されまたは標的核酸が編集される。典型的に、ei
Cas9分子/gRNA分子複合体を使用してペイロードが送達され、eaCas9分子
/gRNA複合体を使用して標的核酸の構造が編集または改変される。送達または編集は
、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施され得る。
遺伝子を編集する(例えば、変異を導入または修正する)ことで操作される。一実施形態
では、細胞は、(例えば、本明細書に記載されるような)1つまたは複数の修飾物質を含
むペイロードを、細胞、例えば、細胞ゲノム内の標的配列などに送達することで操作され
る。一実施形態では、1つまたは複数の標的遺伝子(例えば、本明細書に記載される1つ
または複数の標的遺伝子)の発現が、例えば、インビボで調節される。一実施形態では、
1つまたは複数の標的遺伝子(例えば、本明細書に記載される1つまたは複数の標的遺伝
子)の発現が、例えば、エクスビボで調節される。
たは分化される)。一実施形態では、膵臓細胞を操作してβ膵島細胞にする。一実施形態
では、線維芽細胞を操作してiPS細胞にする。一実施形態では、前脂肪細胞を操作して
褐色脂肪細胞にする。その他の代表的な細胞としては、例えば、筋肉細胞、神経細胞、白
血球、およびリンパ球が挙げられる。
、疾患が治療され、例えば、変異が修正され、または細胞表現型が改変され、例えばがん
細胞の増殖が阻害され得る。例えば、細胞は、本明細書に記載される1つまたは複数の疾
患または病状に関連する。一実施形態では、細胞は、がん幹細胞である。例えば、がん幹
細胞は、TWIST(TF)、HIF-1α、HER2/neu、Snail(TF)、
またはWntから選択される1つまたは複数の遺伝子の発現を調節することで、操作され
得る。
造血性、脂肪、生殖細胞系、肺、または神経性幹または前駆細胞)である。
例えば、細胞は、CHO細胞または線維芽細胞であり得る。一実施形態では、操作される
細胞は、タンパク質を発現するように操作されている細胞である。
膵前駆細胞臓、内分泌前駆細胞臓、肝芽細胞、筋芽細胞、または前脂肪細胞から選択され
る。一実施形態では、細胞は操作されて(例えば、変換または分化されて)、筋肉細胞、
赤血球系-巨核球細胞、好酸球、iPS細胞、マクロファージ、T細胞、膵島β細胞、ニ
ューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆細胞臓、外分泌前駆細胞臓、乳管細胞、腺房
細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞、肝実質細胞、胆管細胞、または褐色脂肪細胞
になる。
クロファージ、T細胞、膵島β-細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆細
胞、外分泌前駆細胞、乳管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞、肝実質
細胞、胆管細胞、または白色または褐色脂肪細胞である。
施形態では、標的細胞は、正常細胞である。
、脂肪、生殖細胞系、肺、または神経性幹または前駆細胞)である。
胞臓、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、または前脂肪細胞である。
、マクロファージ、T細胞、膵島β-細胞、ニューロン(例えば、脳内のニューロン、例
えば、線条体内のニューロン(例えば、中型有棘ニューロン)、大脳皮質、中心前回、海
馬(例えば、海馬の歯状回またはCA3領域内のニューロン)、側頭皮質、小脳扁桃、前
頭皮質、視床、小脳、毛髄質、被殻、視床下部、中脳蓋、中脳被蓋または黒質)、心筋細
胞、血液細胞、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、乳管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞
、δ細胞、PP細胞、肝実質細胞、胆管細胞、または褐色脂肪細胞である。
を導入または修正する)および/または1つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節するこ
とで、インビトロで操作されて、対象に投与される。
載される。
13で、本明細書に記載される。
使用して、細胞(例えば、本明細書に記載される細胞)が操作されることができ、例えば
、ペイロードが送達され、または標的核酸が編集され、例えば、細胞生着が増大され、例
えば、天然微小環境内の細胞の安定した生着が達成される。生着細胞、天然微小環境内の
細胞、またはその双方が操作され得る。典型的に、eiCas9分子/gRNA分子複合
体を使用してペイロードが送達され、eaCas9分子/gRNA複合体を使用して標的
核酸の構造が編集または改変される。
増殖性遺伝子、免疫逃避遺伝子、および/または細胞保護遺伝子などの本明細書に記載さ
れる遺伝子の1つまたは複数の発現を増大させることで、および/または例えば、休止遺
伝子、死滅/アポトーシス遺伝子、および/または免疫認識遺伝子などの本明細書に記載
される遺伝子の発現の1つまたは複数を低下させることで達成され得る。
性サイトカインに富んだ領域への細胞遊走の誘導に関与する、自動誘導受容体または接着
分子をコードする。一実施形態では、自動誘導受容体または接着分子は、例えば、リンパ
球または造血幹細胞などの白血球上で発現される。一実施形態では、組織は、例えば、細
胞外マトリックスまたは間質細胞などの骨髄である。一実施形態では、自動誘導受容体ま
たは接着分子は、C-X-Cケモカイン受容体型4(CXCR4;フーシンまたはCD1
84としてもまた知られている)である。例えば、造血幹細胞上のCXCR4の発現は、
上方制御されている。一実施形態では、リガンドは、間質由来因子-1(SDF-1;C
XCL12としてもまた知られているである)。一実施形態では、自動誘導受容体または
接着分子は、CD34である。一実施形態では、リガンドは、アドレシン(粘膜血管アド
レシン細胞接着分子1(MAdCAM-1)としてもまた知られている)である。
結合する、幹細胞または前駆細胞上で発現される受容体をコードする。例えば、受容体は
、細胞の幹細胞性と関連しおよび/または細胞を所望の微小環境に誘引し得る。一実施形
態では、受容体は、造血幹細胞上で発現される。一実施形態では、受容体は、神経幹細胞
上で発現される。一実施形態では、受容体はマスト/幹細胞成長因子受容体(SCFR;
プロトオンコジーンc-キットまたはチロシン-タンパク質キナーゼキットまたはCD1
17としてもまた知られている)である。一実施形態では、リガンドは幹細胞因子(SC
F;スティール因子またはc-キットリガンドとしてもまた知られている)である。一実
施形態では、受容体は、骨髄増殖性白血病ウイルス発がん遺伝子(MPL;CD110と
してもまた知られている)である。一実施形態では、リガンドは、トロンボポエチン(T
PO)である。
促進し、またはそのマーカーを発現する細胞が免疫応答を逃避できるようにし、または例
えば、細胞死をもたらす有害な環境から保護されるようにする、マーカーをコードする。
例えば、CD47(インテグリン関連タンパク質(IAP)としてもまた知られているを
発現する細胞は、例えば、細胞移動中に食作用を回避し得る。別の例として、BCL2を
発現する細胞は、アポトーシスから保護され得る。一実施形態では、細胞は、例えば、赤
血球または白血球などの血液細胞である。一実施形態では、細胞は、造血幹細胞または前
駆細胞である。
おいて、CXCR4、SDF1、CD117、MPL、CD47、またはBCL2の1つ
または複数の発現が上方制御される。
使用して、細胞(例えば、本明細書に記載される細胞)が操作されることができ、例えば
、ペイロードが送達され、または標的核酸が編集され、例えば、関心のあるより良い標的
特異性細胞型に、および/または自殺機序として、標的細胞の運命が操作される(例えば
、決定される)。典型的に、eiCas9分子/gRNA分子複合体を使用してペイロー
ドが送達され、および/またはeaCas9分子/gRNA複合体を使用して標的核酸の
構造が編集または改変される。調節され得る代表的な遺伝子としては、例えば、本明細書
に記載されるような、化学療法耐性遺伝子、化学療法感受性遺伝子、抗生物質耐性遺伝子
、抗生物質感受性遺伝子、および細胞表面受容体遺伝子の1つまたは複数が挙げられる。
および/または抗生物質感受性遺伝子は、例えば、修飾されたまたは望ましくない細胞(
例えば、骨髄中の例えば、修飾されたまたは望ましくない造血幹細胞(HSC))が、例
えば、化学療法薬または抗生剤治療によって、減少しまたは除去され得るように調節され
る。
または遺伝子産物が、細胞内に送達され得る。化学療法または抗生物質耐性遺伝子または
遺伝子産物によって修飾された細胞は、化学療法薬または抗生剤治療後に、このような修
飾がない細胞よりも高い(例えば、少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10
、25、50、75、または100倍高い)生存率を有し得る。一実施形態では、化学療
法薬または抗生剤治療は、インビボで実施される。一実施形態では、化学療法薬または抗
生剤治療は、インビトロまたはエクスビボで実施される。一実施形態では、化学療法耐性
遺伝子は、O6-アルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼ(MGMT)をコ
ードする遺伝子である。一実施形態では、化学療法は、テモゾロマイドを含む。
遺伝子または遺伝子産物が、細胞内に送達され得る。化学療法感受性または抗生物質感受
性を与える遺伝子または遺伝子産物は、例えば、細胞のアポトーシスを引き起こす、自殺
シグナルとして使用され得る。化学療法または抗生物質感受性遺伝子または遺伝子産物に
よって修飾された細胞は、化学療法薬または抗生剤治療後に、このような修飾がない細胞
よりも低い(例えば、少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50
、75、または100倍低い)生存率を有し得る。一実施形態では、化学療法薬または抗
生剤治療は、インビボで実施される。一実施形態では、化学療法薬または抗生剤治療は、
インビトロまたはエクスビボで実施される。
耐性などの修飾されたまたは所望の表現型を有する細胞が、選択または濃縮され得る。本
明細書に記載される方法はまた、例えば、化学療法感受性および/または抗生物質感受性
を有する、修飾されまたは望まれない表現型を有する細胞数を除去しまたは減少させるた
めに使用され得る。例えば、望まれないゲノムの部位または細胞型における核酸の編集に
よって引き起こされる、例えば、オフターゲット効果などの望まれない効果、またはがん
表現型を示す細胞が除去され得る。
増大または低下を有する細胞が標的化(例えば、細胞を殺滅)され得るように、細胞表面
受容体遺伝子が調節される(例えば、細胞表面受容体の発現が増大または低下される)。
一実施形態では、細胞表面受容体は、CD20である。一実施形態では、治療用抗体は、
リツキシマブである。
FR、CD33、またはErbB2から選択される。一実施形態では、治療用抗体は、例
えば、アレムツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、パニツマブ、ゲムツズマブ、およ
びトラスツズマブから選択される。一実施形態では、細胞表面受容体はCD52であり、
治療用抗体はアレムツズマブである。一実施形態では、遺伝子はVEGFをコードし、治
療用抗体はリツキシマブである。一実施形態では、細胞表面受容体はEGFRであり、治
療用抗体はセツキシマブまたはパニツマブである。一実施形態では、細胞表面受容体はC
D33であり、治療用抗体はゲムツズマブである。一実施形態では、細胞表面受容体はE
rbB2であり、治療用抗体はトラスツズマブである。
で処理された場合に、Cas9分子および/またはgRNA分子発現または活性が、誘導
または抑制される。例えば、Cas9分子および/またはgRNA分子の発現または活性
の誘導または抑制を利用して、例えば、特定の組織内で、毒性および/またはオフターゲ
ット効果を低下させ得る。一実施形態では、Cas9分子、gRNA分子、またはその双
方の発現は、誘導性プロモーターによって駆動される。一実施形態では、薬剤(例えば、
抗生物質)のCas9分子および/またはgRNA分子への結合は、Cas9分子および
/またはgRNA分子の活性を活性化しまたは阻害する。一実施形態では、薬剤(例えば
、抗生物質)は、局所的に投与される。一実施形態では、薬剤(例えば、抗生物質)で処
理される細胞は、眼、耳、鼻、口、または皮膚の中に位置する。
使用して、細胞(例えば、本明細書に記載される細胞)が操作されることができ、例えば
、指向性酵素プロドラッグ療法(DEPT)において、例えば、ペイロードが送達され、
または標的核酸が編集される。典型的に、eiCas9分子/gRNA分子複合体を使用
してペイロードが送達され、eaCas9分子/gRNA複合体を使用して標的核酸の構
造が編集または改変される。
て、生物学的活性が皆無でありまたは乏しいプロドラッグを体内所望の部位で活性形態に
変換する。例えば、指向性酵素プロドラッグ療法を使用して、所望の部位のみで、活性薬
剤の高レベルを達成することで、薬剤の全身毒性を低下させ得る。
遺伝子が、例えば、がん細胞などの標的細胞に送達される。例えば、酵素または遺伝子が
、本明細書に記載される方法によって送達され得る。一実施形態では、プロドラッグ変換
に必要な酵素をコードする遺伝子は、ウイルスベクターによって送達される。
使用して、細胞(例えば、本明細書に記載される細胞)が操作されることができ、例えば
、ペイロードが送達され、または標的核酸が編集されて、例えば、がん免疫療法などの免
疫療法が改善される。典型的に、eiCas9分子/gRNA分子複合体を使用してペイ
ロードが送達され、eaCas9分子/gRNA複合体を使用して標的核酸の構造が編集
または改変される。調節され得る代表的な遺伝子としては、例えば、PD-L1および/
またはPD-L2遺伝子などの本明細書に記載される遺伝子の1つまたは複数が挙げられ
る。
例えば、Cas9分子/gRNA分子複合体などのCas9分子およびgRNA分子を
使用して、例えば、経路のRNAまたはタンパク質をコードする配列、または経路のRN
Aまたはタンパク質の発現を調節する配列を標的化することで、1、2、3つ以上の要素
または経路が操作され得る。一実施形態では、第1の経路の要素および第2の経路の要素
が操作される。一実施形態では、操作は、標的核酸へのペイロードの送達または標的核酸
の編集を含む。典型的に、eiCas9分子/gRNA分子複合体を使用してペイロード
が送達され、eaCas9分子/gRNA複合体を使用して標的核酸の構造が編集または
改変される。送達または編集は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施され得
る。
ドする遺伝子の発現は増大または低下させ得る。増大または低下は、ペイロード(例えば
、転写因子または転写因子阻害剤)の送達によって、または標的核酸の編集によって(例
えば、調節またはコード領域内に、例えば、変異を修正または導入することで、配列を改
変するテンプレート核酸の使用)、もたらされ得る。
嫌気呼吸;膜貫通シグナルトランスダクション、血管新生、DNA複製または修復、また
は疼痛に関連する経路を含む。
は生命体の機能の1つまたは複数の態様に関連し得るものと理解され、例えば、経路また
は遺伝子は、がんおよびエネルギー代謝の双方に関与し得る。経路または遺伝子の操作は
、下に列挙される代表的な細胞または生命体の機能に限定されない。一実施形態では、経
路は、1つまたは複数の疾患または病状に関連する。
し、増殖抑制因子を回避し、細胞死に抵抗し、複製不死/老化を可能にし、血管新生を誘
導し、浸潤および転移、エネルギー代謝を活性化し、およびがん幹細胞、サイトカイン受
容体相互作用、または腫瘍抑制因子を回避する。一実施形態では、経路は、細胞周期制御
に関連する。一実施形態では、経路は、血管新生に関連する。
。本明細書で開示される代表的な代謝標的は、本明細書に記載されるようにCRISPR
/Cas9を使用して調節されてもよい。調節を使用して、対象遺伝子がノックダウンさ
れ、遺伝子中の欠陥または変異が修正され、または対象遺伝子が活性化されてもよい。
はまた、糖尿病、肥満症、および/またはコレステロールおよび脂質にも関連する。
供される。
れる。
21に提供される、以下のメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチル化、ヘリカーゼ活
性、ヌクレオチド切除修復、組換え修復、または不一致修復が挙げられる。表VI-22
もまた参照されたい。
またはペイロード送達によって標的化され得る。疼痛に関連する経路および遺伝子は、例
えば、以下の表VII-23中のものをはじめとして、本明細書に記載される。
例えば、eiCas9分子/gRNA分子複合体、例えば、eaCas9分子/gRN
A分子複合体などの、典型的にeiCas9分子またはeaCas9分子であるCas9
分子とgRNA分子とを使用して、疾患を引き起こす生物に関連する疾患が治療または制
御されることができ、例えば、伝染性疾患が治療される。一実施形態では、感染症は、例
えば、生物または対象の標的遺伝子の1つまたは複数を編集(例えば、修正)することで
治療される。一実施形態では、感染症は、例えば、標的遺伝子などの疾患を引き起こす生
物の細胞に、または対象の感染細胞に、(例えば、本明細書に記載されるような)1つま
たは複数のペイロードを送達することで治療される。一実施形態では、標的遺伝子は、伝
染性病原体内にある。代表的な伝染性病原体としては、例えば、ウイルス、細菌、真菌、
原虫、または多細胞寄生生物が挙げられる。
の調節は、伝染性病原体に対する抵抗性をもたらし得る。伝染性病原体の生活環の任意の
段階(例えば、侵入、複製、潜伏期)に関与する宿主遺伝子が、調節され得る。一実施形
態では、標的遺伝子は、伝染性病原体のための細胞受容体または共受容体をコードする。
一実施形態では、伝染性病原体は、例えば、HIVのような、本明細書に記載されるウイ
ルスなどのウイルスである。一実施形態では、標的遺伝子は、例えば、CCR5またはC
XCR4などのHIVの共受容体をコードする。
は、例えば、AIDS、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、単純ヘルペス、HPV感染症、
またはインフルエンザが挙げられる。
れる。
<HIVゲノムの構造要素>
長鎖末端反復配列(Long Terminal Repeat:LTR)は、プロウ
イルスに組み込まれたゲノム隣接領域に位置するDNA配列を指す。それは、特に転写開
始およびポリアデニル化に重要な、調節領域を含有する。
ンパク質のための結合部位は、HIV-1中のウイルスmRNAの最初のおよそ45ヌク
レオチド(またはHIV-2およびSIV中の最初の100ヌクレオチド)からなる。T
AR-RNAは、サイドバルジがあるヘアピンステムループ構造を形成し;バルジはTa
t結合および機能に必要である。
を指す。それは、およそ200ヌクレオチドからなる(HIV-1の転写開始部位から7
327~7530位、gp120およびgp41の境界に及ぶ)。RREは、Rev機能
に必要であり;それは、Revに対する高親和性部位を含有し;合計、およそ7個のRe
v結合部位が、RRE RNA内に存在する。その他のレンチウイルス(HIV-2、S
IV、visna、CAEV)が、env内の同様の部位に同様のRRE要素を有する一
方で、HTLVは、それらのLTR内で同一目的を果たす、相似性のRNA要素(RXR
E)を有し;RREがRevタンパク質の結合部位である一方で、RXREは、Rexタ
ンパク質の結合部位である。RRE(およびRXRE)は、特異的タンパク質結合に必要
な複合体二次構造を形成する。
Gag開始コドンに先行して重なる、4つのステムループ構造の組であり、Gag p7
MCタンパク質内に存在する、正順配列CysX2CysX4HisX4Cys(配列番
号41)がある保存モチーフである。Psi要素は、スプライシングされていないゲノム
の転写物中に存在するが、スプライスされたウイルスmRNAには存在しない。
は、Gag読み枠からPol読み枠への-1リボソームフレームシフトの制御に関与する
。
想定された。このような1つの部位が、HIV-1のpol領域内にマッピングされた。
正確な機能は確定されておらず;スプライス部位は、CRS配列の機能を果たすことが想
定されている。
ルスの構造遺伝子内に見られる。複数のINS要素がゲノム中に存在し、独立して機能す
ることができ;最も良く特徴付けられる要素の1つは、HIV-1のgag領域のヌクレ
オチド414から631に及ぶ。INS要素は、機能アッセイによって、転写後に発現を
阻害する要素として定義される。RNA要素の変異は、INS不活性化と遺伝子発現の上
方制御とを引き起こすことが示された。
ゲノム領域(GAG)は、キャプシドタンパク質(群特異的抗原)をコードする。前駆
体は、p55ミリストイル化タンパク質であり、それは、ウイルスプロテアーゼによって
、p17(マトリックス)、p24(キャプシド)、p7(ヌクレオカプシド)、および
p6タンパク質にプロセシングされる。Gagは、ウイルス構築がそこで起きる、原形質
膜と結合する。55kDaのGag前駆体はアセンブリンと称されて、ウイルス構築にお
けるその役割が示唆される。
ンテグラーゼをコードする。これらの酵素は、Gag-Pol前駆体ポリタンパク質とし
て生成され、それはウイルスプロテアーゼによってプロセシングされ;Gag-Pol前
駆体は、gag末端近くのリボソームフレームシフトによって生成される。
それはプロセシングされて、外部糖タンパク質gp120と膜貫通糖タンパク質gp41
との非共有結合複合体を与える。成熟gp120-gp41タンパク質は、非共有結合相
互作用によって結合され、細胞表面上の三量体として結合される。かなりの量のgp12
0が、培地中に放出されるのが見られ得る。gp120は、CD4受容体の結合部位と、
HIV-1共受容体の役割を果たす7回膜貫通ドメインケモカイン受容体とを含有する。
の必須ウイルス調節要素(TatおよびRev)の1つである。72個のアミノ酸のTa
t-1エクソン(マイナー形態)、および86個のアミノ酸のTat-2エクソン(主要
形態)の2つの形態が知られている。双方のタンパク質の低レベルが、持続性感染細胞に
見られる。Tatは、免疫蛍光によって、主に核小体/核内に局在化されている。それは
、TAR-RNA要素に結合することで機能し、LTRプロモーターからの転写開始およ
び伸長を活性化して、LTRのAATAAAポリアデニル化シグナルが、転写およびポリ
アデニル化の早期終結を引き起こすのを妨げる。それは、DNAでなくRNAと相互作用
することが知られた最初の真核生物転写因子であり、原核生物抗終結因子との類似性を有
してもよい。細胞外Tatは、培養中の細胞に見られ、それに取り込まれ得る。
性の19kDaのリンタンパク質であるRevは、RREに結合することで機能し、RR
Eを含有するスプライシングされていないウイルスmRNAの核外搬出、安定化、および
利用促進する。Revは、レンチウイルスの最も機能的に保存された調節タンパク質と見
なされる。Revは、核と細胞質との間で迅速にサイクルする。
ウイルス感染因子(VIF)は、典型的に23kDaの塩基性タンパク質である。感染
性を促進するが、ウイルス粒子の生成は促進しない。Vif不在下で生成されたウイルス
粒子は、欠陥がある一方で、ウイルスの細胞間感染は、顕著に影響を受けない。ほぼ全て
のレンチウイルスに見られるVifは、細胞質内タンパク質であり、可溶性細胞質形態お
よび膜結合形態の双方で存在する。後者の形態のVifは、細胞膜の細胞質側と密接に結
合する辺縁膜タンパク質である。2003年に、Vifは、細胞質内でDNA:RNAヘ
テロ二本鎖を脱アミノ化する細胞APOBEC-3Gタンパク質の作用を妨げることが発
見された。
4kDa)のタンパク質である。それは、Pr55 Gag前駆体のp6 Gag部分と
相互作用する。細胞内で検出されるVprは、核局在性である。Vprに提案された機能
としては、組込み前複合体の核内搬入標的化、細胞成長停止、細胞遺伝子のトランス活性
化、および細胞分化の誘導が挙げられる。HIV-2、SIV-SMM、SIV-RCM
、SIV-MND-2、およびSIV-DRLでは、Vpx遺伝子は、おそらくは組換え
によるVpr遺伝子重複事象の結果のようである。
近いSIV近縁種)、SIV-GSN、SIV-MUS、SIV-MON、およびSIV
-DENに特有である。HIV-2、SIV-SMMまたはその他のSIVには、同様の
遺伝子はない。Vpuは、(a)小胞体内におけるCD4分解、および(b)HIV-1
-感染細胞の原形質膜からのビリオン放出亢進の少なくとも2つの異なる生物学的機能が
ある、16kDa(81個のアミノ酸)のI型内在性膜タンパク質である。Envおよび
Vpuは、バイシストロニックmRNAから発現される。Vpuは、恐らくは、N末端疎
水性膜アンカーと親水性部分とを有する。それは、Ser52およびSer56の位置で
、カゼインキナーゼIIによってリン酸化される。VpuはEnv成熟に関与し、ビリオ
ンには見られない。Vpuは、Fas死滅に対するHIV-1感染細胞の感受性を増大さ
せることが分かっている。
機能27-kDaミリストイル化タンパク質である。非ミリストイル化変異型をはじめと
する、Nefのその他の形態が知られている。Nefは、主に細胞質内にあり、保存され
た第2のアミノ酸(Gly)と連結するミリスチル残基を介して、原形質膜と結合する。
Nefは、いくつかの実験において、核内で同定され、細胞骨格と結合することが分かっ
ている。それは、感染細胞内で産生される最初のHIVタンパク質の1つであり、アクセ
サリータンパク質中で最も免疫原性である。HIVおよびSIVのnef遺伝子は、イン
ビトロでは不必要であるが、インビボの効率的なウイルス拡散および疾患進行には必須で
ある。Nefは、マカクにおける高ウイルス負荷の維持とAIDS進行に必要であり、い
くらかのHIV-1感染長期生存者では、Nefに欠陥のあるウイルスが検出されている
。Nefは、一次ウイルス受容体であるCD4、およびMHCクラスI分子を下方制御し
、これらの機能は、タンパク質の異なる部分にマッピングされる。Nefは、宿主細胞シ
グナルトランスダクションおよびクラスリン依存性タンパク質選別経路の構成要素と、相
互作用する。それは、ウイルス感染性を高める。Nefは、Srcキナーゼのサブセット
のSH3ドメインと結合するPxxPモチーフを含有し、HIVの増殖促進に必要である
が、CD4の下方制御には必要ない。
SIV-DRLに見られるが、HIV-1またはその他のSIVには見られない、12k
Daのビリオンタンパク質である。このアクセサリー遺伝子はHIV-1 vprのホモ
ログであり、Vpxがあるウイルスは、vprおよびvpxの双方を保有する。Vprと
の関連でVpx機能は、完全に解明されておらず、どちらもGag p6との相互作用を
通じてGagタンパク質と比較できるレベルで、ビリオンに組み込まれる。Vpxは、P
BMC中のSIV-SMMの効率的複製に必要である。SIV感染動物におけるAIDS
の進行および死亡は、VprまたはVpxの不在下で起こり得る。vprおよびvpxの
双方を欠く二重変異体ウイルスが弱毒化された一方で、単一変異体は弱毒化されず、ウイ
ルス病原性に関連があるVprおよびVpxの機能の重複性が示唆された。
5’非翻訳領域は、IRES-配列内リボソーム進入部位を含有する。
VP1
VP2
VP3
VP4
2A
2B
2C
3A
3B
3C-ウイルスプロテアーゼ
3D-RNAポリメラーゼ
全てのHCVタンパク質をコードする前駆体ポリペプチドが生成され、次に機能的タン
パク質にスプライスされた。以下は、コードされるタンパク質(コード領域)である。
C-プレ-Cおよびコアコード領域からなるコアタンパク質コード領域
X-機能は不明確であるが、ウイルス転写過程活性化における役割を有することが疑われ
る
P-RNAポリメラーゼ
S-Pre-S1、Pre-S2、および表面抗原コード領域からなる、表面抗原コード
領域
全てのHCVタンパク質をコードする前駆体ポリペプチドが生成され、次に機能的タン
パク質にスプライスされた。以下は、コードされるタンパク質(コード領域)である。
RES-非コード配列内リボソーム進入部位(ポリタンパク質コード配列に対して5’)
3’非コード配列
C領域-ヌクレオカプシドタンパク質であるp22をコードする
E1領域-細胞侵入に重要なgp35外被糖タンパク質をコードする
E2領域-細胞侵入に重要なgp70外被糖タンパク質をコードする
NS1-複製には必要でないが、ウイルス形態形成に重要なp7をコードする
NS2-プロテアーゼ活性があある膜貫通タンパク質であるp23をコードする
NS3-セリンプロテアーゼおよびRNAヘリカーゼ活性の双方を有するp70をコード
する
NS4A-p8補因子をコードする
NS4B-その他のウイルスタンパク質動員に重要なp27補助因子をコードする
NS5A-ウイルス複製に重要なp56/58インターフェロン耐性タンパク質をコード
する
NS5B-RNAポリメラーゼをコードする
A型インフルエンザは、ヒトに感染する最も一般的な流感ウイルスである。A型インフ
ルエンザビリオンは、11~14個のタンパク質をコードする、8つの異なる一本鎖RN
A部分で構成される。これらの部分は、順に変動し得て、ほとんどの多様性は、赤血球凝
集素(HまたはHA)表面タンパク質およびノイラミニダーゼ(NAまたはN)中に起き
る。8つのRNA部分(およびそれらをコードするタンパク質)は、次のとおり:
HA-赤血球凝集素をコードする(1個のビリオンを生成するためには、約500個の赤
血球凝集素分子が必要である)。
NA-ノイラミニダーゼをコードする(1個のビリオンを生成するためには、約100個
のノイラミニダーゼ分子が必要である)。
NPは、核タンパク質をコードする。
Mが、同一RNA断片からの異なる読み枠を使用して、2つのマトリックスタンパク質(
M1およびM2)をコードする(1個のビリオンを生成するためには、約3000個のマ
トリックスタンパク質分子が必要である)。M42は、選択的スプライシングによって作
成され、M2を部分的に置換し得る。
NSは、同一RNA断片からの異なる読み枠を使用して、2つの別個の非構造的タンパク
質(NS1およびNEP)をコードする。
PAは、RNAポリメラーゼをコードし;次の停止コドンまで読み取る、+1フレームシ
フトがあるリボソームスキップを通じて、交互の形態が生成されることもある。
PB1は、同一RNA断片からの異なる読み枠を使用して、RNAポリメラーゼに加えて
、交互の開始部位から読み取られ、PB1-N40およびPB1-F2タンパク質(アポ
トーシスを誘導する)と命名された2つのその他の転写物をコードする。
PB2は、RNAポリメラーゼをコードする。
本明細書に記載される方法および組成物を使用して、M.ツベルクローシス(M.tu
berculosis)が標的化され、M.ツベルクローシス(M.tuberculo
sis)感染症に罹患している対象が治療され得る。
一実施形態では、標的遺伝子は、例えば、細菌感染症における多剤耐性(MDR)に関
連する。伝染性病原体は、多剤耐性を獲得する上で、例えば、もはや糖タンパク質細胞壁
に依存することなく、抗生物質の酵素的不活性化、抗生物質に対する細胞壁透過性の低下
、抗生物質標的部位の改変、抗生物質を除去する排出ポンプ、ストレス応答としての変異
速度の増大、またはそれらの組み合わせなどのいくつかの機構を利用し得る。
候補Cas9分子、候補gRNA分子、および/または候補Cas9分子/gRNA分
子複合体を使用して、疾患の原因である遺伝子(例えば、変異遺伝子)が調節され得る。
一実施形態では、遺伝子は、例えば、本明細書に記載されるようにして、標的遺伝子を編
集または修正することで調節される。一実施形態では、ヒト遺伝子は、細胞内で、(例え
ば、本明細書に記載されるようにして)1つまたは複数の調節因子/エフェクターの標的
遺伝子への送達によって調節される。例えば、本明細書に記載される遺伝子は、インビト
ロ、エクスビボ、またはインビボで調節され得る。
伸長障害、トリプレットリピート伸長障害、またはコドン反復障害としてもまた知られて
いる)は、トリヌクレオチドリピート伸長によって引き起こされる、遺伝障害のセットで
あり、例えば、特定遺伝子中のトリヌクレオチド反復が、正常なおよび/または安定な閾
値を超える変異の一種である。変異は、複数のまたは全てのゲノム配列に生じる、不安定
マイクロサテライト反復のサブセットであり得る。変異は、反復数を増大させ得て(例え
ば、追加のまたは伸長した反復をもたらし)、例えば、異常なタンパク質を生じる、欠陥
遺伝子をもたらす。トリヌクレオチドリピートは、挿入変異、または別のクラスの変異に
分類され得る。候補Cas9分子、候補gRNA分子、および/または候補Cas9分子
/gRNA分子複合体を使用して、例えば、正常なまたは野生型遺伝子産物(例えば、タ
ンパク質)が、生成され得るように、追加のまたは伸長された反復の数を低下させる(例
えば、除去する)ことで、トリヌクレオチドリピート病に関連する1つまたは複数の遺伝
子(例えば、変異型遺伝子)が調節され得る。
的遺伝子は、表IX-1Aに示される。
嚢胞性線維症(例えば、CFTR)、色盲、ヘモクロマトーシス、血友病、フェニルケト
ン尿症、多発性嚢胞腎、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、シデリウスX連鎖精神遅滞症
候群、リソソーム貯蔵障害(例えば、α-ガラクトシダーゼA欠乏症)、アンダーソン・
ファブリー病、びまん性体部被角血管腫、CADASIL症候群、多発晩発性カルボキシ
ラーゼ欠乏症、家族性小脳網膜血管腫症、皮質下梗塞および白質脳症を伴う脳動脈障害、
皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症脳、セレブロシドリピドーシス症
候群、舞踏病アテトーゼ自傷高尿酸血症症候群、古典的ガラクトース血症、クローン病、
線維性狭窄、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠乏性疾患、ファブリー病、遺伝性コプ
ロポルフィリン症、色素失調症、小頭症、多発性嚢胞腎、レット(Rett’s)、α1
アンチトリプシン欠損症、ウィルソン病、チロシン血症、フレームシフト関連疾患、およ
びトリプレットリピート疾患などの様々な疾患または病状に関与する遺伝子が挙げられる
。
-Najjer)症候群、グリコーゲン蓄積症IV型(GSD IV型)、家族性血球貪
食性リンパ組織球症(FHL-パーフォリン欠損症)、オルニチントランスカルバミラー
ゼ欠損症(OTC欠損症)またはその他の尿素サイクル障害、原発性高シュウ酸尿症、レ
ーバー先天黒内障(LCA)、バッテン病、慢性肉芽腫症、ウィスコット・アルドリッチ
症候群、アッシャー症候群、および異常ヘモグロビン症(hemoglobinoapt
hies)をはじめとする疾患に関連する遺伝子が挙げられる。
ー(Crigler-Najjer)症候群は、高レベルの血中ビリルビン(高ビリルビ
ン血症)によって特徴付けられる重篤な病状である。ビリルビンは、赤血球が分解される
際に生じる。この物質は、肝臓内で、有毒形態のビリルビン(非結合ビリルビン)を無毒
形態(抱合型ビリルビン)に変換する化学反応を経て、初めて身体から除去される。クリ
グラー・ナジャー症候群がある人々は、血中に非結合ビリルビンの蓄積(非結合高ビリル
ビン血症)を有する。クリグラー・ナジャー症候群は、2つの型に分類される。1型(C
N1)は非常に重篤であり、2型(CN2)は重篤性がより低い。
伝子は、主に肝細胞内にあり、身体からのビリルビン除去に必要であることが分かった、
ビリルビンウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ(ビリルビン-UGT)
酵素を産生する指令を提供する。ビリルビン-UGT酵素は、酵素がグルクロン酸を非結
合ビリルビンに転移して、それを抱合型ビリルビンに変換する、グルクロン酸抱合に関与
する。グルクロン酸抱合は、ビリルビンが身体から除去され得るように、それを水溶性に
する。
UGT酵素機能の低下または不在をもたらす。CN1がある人々は、酵素機能を有しない
一方で、CN2がある人々は、通常の機能の20パーセント未満を有し得る。ビリルビン
-UGT機能の喪失は、非結合ビリルビンのグルクロン酸抱合を低下させる。次にこの毒
性物質は、体内で蓄積し、非結合高ビリルビン血症および黄疸を引き起こす。
型、グリコーゲン分枝酵素欠損症(GBED)、ポリグルコサン小体病、またはアミロペ
クチン症としてもまた知られている)は、体の細胞内のグリコーゲンと称される複合糖類
の蓄積によって引き起こされる、遺伝性疾患である。蓄積したグリコーゲンは、構造的に
異常であり、特定の臓器および組織、特に肝臓および筋肉の機能を損なう。
ン分枝酵素を産生する指令を提供する。この酵素は、体内の貯蔵エネルギーの大きな供給
源である、グリコーゲンの生成に関与する。GSD IVを引き起こすGBE1遺伝子変
異は、グリコーゲン分枝酵素の不足(欠乏)をもたらす。その結果、グリコーゲンは、適
切に形成されない。ポリグルコサン小体と称される異常なグリコーゲン分子は、細胞内に
蓄積して障害と細胞死をもたらす。細胞内のポリグルコサン小体蓄積は全身体に及ぶが、
GSD IVでは肝細胞および筋肉細胞が、最も激しく影響を受ける。肝臓内のグリコー
ゲン蓄積は、肝腫大をもたらし肝臓機能を妨害する。筋肉細胞が、エネルギーのためにグ
リコーゲンを分解できないことで、筋力低下および衰弱がもたらされる。
命的な周産期神経筋型がある個人は、5パーセント未満の利用可能な酵素を生じる傾向が
ある一方で、小児期神経筋型がある個人は、酵素機能の20パーセント前後を有してもよ
い。GSD IVの他のタイプは、通常は、5~20パーセントの機能性酵素に随伴する
。しかしこれらの推定値は、異なるタイプ間で変動する。
疫系が、例えば、T細胞、ナチュラルキラー細胞、B細胞、およびマクロファージ(組織
球)などの活性化免疫細胞(リンパ球)を過剰に産生する障害である。過剰な量のサイト
カインもまた、産生される。この免疫系の過剰活性化は、発熱を引き起こして肝臓および
脾臓を損傷し、これらの臓器の腫脹がもたらされる。
生細胞も破壊する。脳もまた、家族性血球貪食性リンパ組織球症において、影響を受ける
こともある。神経学的問題に加えて、家族性血球貪食性リンパ組織球症は、心臓、腎臓、
およびその他の臓器、そして組織の異常を引き起こし得る。罹患した個人はまた、造血細
胞のがん(白血病およびリンパ腫)を発症するリスクの増大も有する。
起こされてもよい。これらの遺伝子は、もはや必要ないリンパ球の破壊または不活性化を
助けるタンパク質を産生する指令を提供する。活性化リンパ球の数を制御することで、こ
れらの遺伝子は、免疫系機能を調節するのを助ける。
たはUNC13D遺伝子の変異によって引き起こされる。より少数の症例は、STX11
またはSTXBP2などのその他の公知の遺伝子の変異によって引き起こされる。家族性
血球貪食性リンパ組織球症を引き起こす遺伝子変異は、免疫系を調節する身体の能力を損
ない得る。これらの変更は、この病状の誇張された免疫応答特性をもたらす。
(OTC)は血中のアンモニア蓄積を引き起こす遺伝性疾患である。
のクラスに属する。尿素サイクルは、肝細胞内で起こる一連の反応である。それは、身体
によってタンパク質が使用される際に生じる過剰な窒素を処理して、尿素と称される化合
物を産生し、それは腎臓によって排出される。
る酵素が損傷を受け、または欠損している。尿素サイクルは、正常に進行し得ず、血流内
にアンモニアの形態で窒素が蓄積する。
損症は、神経学的問題ならびに最終的な肝臓障害を引き起こす。
ンシンターゼ欠損症(NAGS)、カルバモイルリン酸シンセターゼI欠損症(CPS1
)、「AS欠損症」またはシトルリン血症(ASS)、「AL欠損症」またはアルギニノ
コハク酸尿症(ASL)、および「アルギナーゼ欠損症」またはアルギニン血症(ARG
)が挙げられる。
シュウ酸尿症は、稀な常染色体性劣性遺伝性の遺伝的病状であり、肝臓内のグリオキシル
酸代謝経路の誤りがシュウ酸塩の過剰産生をもたらして、それが、腎臓、骨髄、および眼
をはじめとする軟組織内で結晶化する。疾患は、腎臓の進行性劣化として現れ、治療法は
、腎臓(損傷を受けた臓器)と肝臓(病的臓器)の複雑な二重移植である。
き起こされる。欠損している酵素によって区別される、2つの型の原発性高シュウ酸尿症
がある。1型原発性高シュウ酸尿症がある人々には、アラニン-グリオキシル酸アミノト
ランスフェラーゼ(AGXT)と称される肝臓酵素が不足している。2型原発性高シュウ
酸尿症は、グリオキシル酸還元酵素/ヒドロキシピルビン酸還元酵素(GRHPR)と称
される酵素の不足によって特徴付けられる。
の糖およびアミノ酸の分解およびプロセッシングは、グリオキシル酸を生成する。常態で
は、グリオキシル酸は、2つの酵素、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラー
ゼおよびグリオキシル酸還元酵素/ヒドロキシピルビン酸還元酵素作用を通じて、アミノ
酸グリシンに、またはグリコール酸にそれぞれ変換される。AGXTまたはGRHPR遺
伝子の変異は、これらの酵素不足を引き起こし、それは、グリオキシル酸からグリシンへ
のまたはグリコール酸への変換妨げる。グリオキシル酸レベルが増大すると、それはシュ
ウ酸塩に変換される。シュウ酸塩は、カルシウムと組み合わせさってシュウ酸カルシウム
沈着を形成し、それは腎臓およびその他の臓器を損傷し得る。
分子およびgRNA分子を使用して、相同組換えによって修正される。例えば、修正され
たAGXT遺伝子によってコードされた機能性酵素が、その適切な細胞内細胞小器官に再
誘導され得る。>50個の変異が遺伝子中で同定されているが、最も頻度が高い(白人で
は40%)のは、ミスセンスG170R変異である。この変異は、AGT酵素が機能を実
行するためにその中に存在すべきであるペルオキシソームでなく、ミトコンドリアにAG
T酵素を局在化させる。その他の一般的変異としては、例えば、I244T(カナリア諸
島)、F152I、G41R、G630A(イタリア)、およびG588A(イタリア)
が挙げられる。
の遺伝子が、本明細書に記載されるCas9分子およびgRNA分子を使用して標的化さ
れる。代表的な標的としては、例えば、グリコール酸オキシダーゼ(遺伝子HAO1、O
MIM ID 605023)が挙げられる。グリコール酸オキシダーゼは、AGTの基
質であるグリコール酸をグリオキシル酸に変換する。グリコール酸オキシダーゼは、肝臓
でのみ発現されて、ペルオキシソームに局在することから、この代謝経路内の適切な標的
になる。一実施形態では、HAO1遺伝子に二本鎖切断が導入されて、NHEJによる修
復時に、フレームシフトがトランケート型タンパク質をもたらす。一実施形態では、転写
リプレッサー(例えば、本明細書に記載される転写リプレッサー)が、HAO1遺伝子へ
のペイロードとして送達されて、HAO1の発現を低下させる。
障害である。この障害がある人々は、典型的に、乳児期に開始する重度の視力障害を有す
る。視力障害は、安定する傾向があるが、それは経時的に非常に緩慢に悪化することもあ
る。少なくとも13種類のレーバー先天黒内障が記載されている。種類は、それらの遺伝
性原因、失明パターン、および関連する眼の異常によって区別される。
伝子の変異に起因し得る。これらの遺伝子は、網膜の発達と機能において、多様な役割を
果たす。例えば、この障害に関連するいくつかの遺伝子は、光受容体の正常な発達に必要
である。その他遺伝子は、光情報伝達に関与する。なおも別の遺伝子は、視覚をはじめと
する数種類の感覚入力の知覚に必要である繊毛機能において、役割を有する。
、CRX、GUCY2D、IMPDH1、LCA5、LRAT、RD3、RDH12、R
PE65、RPGRIP1、SPATA7、TULP1)のいずれかの変異は、網膜の発
達と機能を妨害し得て、早期失明をもたらす。CEP290、CRB1、GUCY2D、
およびRPE65遺伝子の変異は、最も頻度の高い障害原因である一方で、その他の遺伝
子の変異は、一般に、症例のより小さな割合を占める。
疾患である。わずか数年間の正常な発達の後、この病状がある小児は、進行性失明、知的
および運動機能障害、および痙攣を発症する。
の障害の1つである。これらの障害は全て神経系に影響を及ぼし、典型的に、視覚、動作
、および思考能力に関する進行性問題を引き起こす。一部の人々がバッテン病としてNC
Lのグループ全体を指す一方で、その他の人々は、名称を若年性形態の障害に限定する。
異なるタイプのNCLは、徴候および症状が、最初に出現した年齢によって区別される。
これらの変異は、リソソームと称される細胞構造の機能を妨害し得る。リソソーム機能障
害は、これらの細胞構造内に脂肪色素の蓄積をもたらす。これらの蓄積は、全身体に及ぶ
細胞内で起こるが、脳内ニューロンは、脂肪色素によって引き起こされる障害に対して、
特に易損性のようである。特に脳内における、細胞の進行性死滅は、若年性バッテン病が
ある人々に、失明、痙攣、および知性低下をもたらす。
N5、PPT1、TPP1)の変異によって引き起こされる。これらの遺伝子の多くはリ
ソソーム機能に関与して、変異すると、この形態またはその他の形態のNCLを引き起こ
し得る。
症の一形態がもたらされる。慢性肉芽腫症がある個人は、再発性細菌および真菌感染症を
有する。この病状がある人々は、様々な組織に、それらの組織を損傷し得る炎症領域(肉
芽腫)を有することが多い。慢性肉芽腫症の特徴は、通常は、最初に小児期い出現するこ
とであるが、いくらかの個人は、後年まで症状を示さない。
腫症を引き起こし得る。この病状には、関与する遺伝子によって区別される5つのタイプ
がある。影響を受けた遺伝子から生じるタンパク質は、免疫系で重要な役割を果たすNA
DPHオキシダーゼのサブユニットである。特に、NADPHオキシダーゼは、主に貪食
細胞内で活性である。貪食細胞内では、NADPHオキシダーゼは、外来性侵入者を死滅
させてそれらが体内で繁殖し病気を引き起こすのを防止する役割を果たす、超酸化物の生
成に関与する。NADPHオキシダーゼはまた、治癒最適化と身体損傷低下のために炎症
応答を調節する役割を有する、好中球の活性も調節する。
ずかまたは皆無であるタンパク質の生成をもたらし、またはタンパク質の生成を全くもた
らさない。そのサブユニットタンパク質のいずれか1つがなければ、NADPHオキシダ
ーゼは、適切に構築されまたは機能し得ない。その結果、貪食細胞は、外来性侵入者を殺
滅できず、好中球活性は調節されない。NADPHオキシダーゼの欠如は、罹患した個人
を多くのタイプの感染症および過剰な炎症に対して易損性にする。
疫系機能(免疫不全)および血餅形成能力の低下によって特徴付けられる。この病状は、
主に男性に影響を及ぼす。ウィスコット・アルドリッチ症候群がある個人は、凝固に関与
する血液細胞(血小板)の数およびサイズの低下であるマイクロ血小板減少症を有し、そ
れは、容易な挫傷、または軽微な外傷に続く長時間の出血の出現をもたらし得る。ウィス
コット・アルドリッチ症候群は、白血球細胞の多くのタイプに異常または非機能性を引き
起こし、いくつかの免疫および炎症性疾患のリスク増大をもたらす。この病状がある多く
の人々は、炎症を起こした皮膚の異常なパッチによって特徴付けられる炎症性皮膚疾患で
ある、湿疹を発症する。罹患した個人はまた、感染症に対する感受性増大も有する。ウィ
スコット・アルドリッチ症候群がある人々には自己免疫障害を発症する、より大きなリス
クがある。免疫系細胞のがん(リンパ腫)などのいくつかのタイプのがんを発症する見込
みもまた、ウィスコット・アルドリッチ症候群がある人々ではより大きい。
子は、全ての血液細胞に見られるWASPタンパク質を産生する指令を提供する。WAS
Pは、f血液細胞表面からアクチン細胞骨格へのシグナル中継に関与する。WASPシグ
ナル伝達は、必要な場合に細胞を活性化して、その他の細胞および組織への移動と付着(
癒着)を引き起こす。白血球細胞内では、このシグナル伝達は、アクチン細胞骨格が、細
胞とそれらが標的化する外来性侵入者の間の相互作用を確立できるようにする(免疫シナ
プス)。
ASPの欠如を引き起こす。WASPシグナル伝達の損失は、発達中の血液細胞内のアク
チン細胞骨格機能を妨害する。WASPを欠く白血球細胞は、それらの環境に応答して、
免疫シナプスを形成する能力の低下を有する。その結果、白血球細胞は、外来性侵入者に
応答できなくなり、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する免疫問題の多くを引き
起こす。同様に、内血小板の機能的WASPの欠如は、それらの発達を損い、サイズ低下
および早期細胞死をもたらす。
よって特徴付けられる病状である。視力喪失は、眼の背後の感光性組織層(網膜)に影響
を及ぼす、色素性網膜炎(RP)によって引き起こされる。失明は、網膜の光検出細胞が
、徐々に劣化するにつれて起こる。
I型と称されるアッシャー症候群の3つの主要な型が同定されている。これらの型は、そ
れらの重症度と、徴候および症状が出現した年齢とによって区別される。
H1G、およびUSH2A遺伝子の変異は、アッシャー症候群を引き起こし得る。アッシ
ャー症候群に関連する遺伝子は、正常な聴力、均衡、および視覚に重要な役割を果たすタ
ンパク質を産生する指令を提供する。それらは、音および運動シグナルを脳に伝達するの
を助ける、内耳中の感覚細胞である有毛細胞の発達および維持において機能する。網膜内
では、これらの遺伝子はまた、桿体および錐体と称される光検出細胞の構造および機能決
定にも関与する。場合によっては、聴力および視覚におけるこれらの遺伝子の正確な役割
は、知られていない。アッシャー症候群に関与するほとんどの変異は、内耳の有毛細胞の
損失と、網膜内の桿体および錐体の漸進的損失とを引き起こす。これらの感覚細胞の変性
は、この病状に特徴的な、聴力損失、平衡を保つ困難さ、および失明を引き起こす。
はUSH1G遺伝子の変異に起因し得る。アッシャー症候群II型は、例えば、USH2
AまたはGPR98(VLGR1とも称される)遺伝子の変異によって引き起こされ得る
。アッシャー症候群III型は、例えば、CLRN1の変異によって引き起こされ得る。
異常な構造をもたらす、一群の遺伝的欠陥である。代表的な異常ヘモグロビン症としては
、例えば、鎌状赤血球症、αサラセミア、およびβサラセミアが挙げられる
換えによって、本明細書に記載されるCas9分子およびgRNA分子を使用して修正さ
れる。
子およびgRNA分子を使用して標的化される。代表的な標的としては、例えば、γ-グ
ロビン遺伝子の調節に関連する遺伝子が挙げられる。一実施形態では、標的は、BCL1
1Aである。
成人α-グロビンポリペプチドと、2つの胎児β様γ-グロビンポリペプチドとの四量体
である。HbFは、ヒト胎児では子宮内発達の最後の7ヶ月間の、新生児ではほぼ6ヶ月
間齢までの主要酸素輸送タンパク質である。機能的に、胎児ヘモグロビンは、成人形態よ
りも大きな親和力で酸素と結合できることで、成人ヘモグロビンと最も異なり、母親の血
流中の酸素へのより良いアクセスを発達中の胎児に与える。
でほぼ完全に置き換えられる。成人では、胎児ヘモグロビン産生が薬理学的に再活性化さ
れ得で、それは異常ヘモグロビン症などの疾患の治療において有用である。例えば、異常
ヘモグロビン症がある特定の患者では、より高レベルのγ-グロビン発現が、欠陥または
障害のあるβ-グロビン遺伝子産生を部分的に代償し得て、それは、これらの疾患の臨床
的重症度を改善し得る。HbFレベルまたはF細胞(HbF含有赤血球)数の増大は、例
えば、β重症型サラセミアおよび鎌状赤血球貧血などの異常ヘモグロビン症の疾患重症度
を改善し得る。
。BCL11A遺伝子は、マルチジンクフィンガー転写因子をコードする。一実施形態で
は、BCL11Aの発現は調節され、例えば、下方制御される。一実施形態では、BCL
11A遺伝子は、編集される。一実施形態では、細胞は、造血幹細胞または前駆細胞であ
る。
鎌状赤血球症は、ヘモグロビンに影響を及ぼす一群の障害である。この障害がある人々
は、異型ヘモグロビン分子(ヘモグロビンS)を有して、それは、赤血球をintoa鎌
状または三日月状に歪め得る。この障害の特性としては、低赤血球数(貧血)、反復性感
染症、および周期的疼痛発作が挙げられる。
産生する指令を提供する。β-グロビンの様々なバージョンが、HBB遺伝子の異なる変
異から得られる。1つの特定のHBB遺伝子変異が、ヘモグロビンS(HbS)として知
られている、β-グロビンの異常なバージョンを生成する。HBB遺伝子のその他の変異
は、ヘモグロビンC(HbC)およびヘモグロビンE(HbE)などのβ-グロビンの追
加的な異常なバージョンをもたらす。HBB遺伝子変異はまた、異常に低いβ-グロビン
レベル、すなわち、βサラセミアをもたらし得る。
も1つがヘモグロビンSで置き換えられている。で鎌状赤血球症の一般的形態である鎌状
赤血球貧血では、ヘモグロビンSが、ヘモグロビン中の双方のβ-グロビンサブユニット
を置き換える。その他の各種鎌状赤血球症では、ヘモグロビン中の1つのβ-グロビンサ
ブユニットのみがヘモグロビンSで置き換えられる。もう一方のβ-グロビンサブユニッ
トは、ヘモグロビンCなどの異なる異常な変異型で置き換えられる。例えば、鎌状ヘモグ
ロビンC(HbSC)病がある人々は、β-グロビンの代わりにヘモグロビンSおよびヘ
モグロビンCがある、ヘモグロビン分子を有する。ヘモグロビンSおよびβサラセミアを
生じる変異が同時に発生した場合、個人は、ヘモグロビンS-βサラセミア(HbSBe
taThal)病を有する。
αサラセミアは、ヘモグロビンの生成を低下させる血液障害である。αサラセミアの特
性がある人々では、ヘモグロビン量の低下が、身体の組織に十分な酸素が到達するのを妨
げる。罹患した個人はまた、赤血球不足(貧血)も有して、それは、蒼白な皮膚、脱力感
、疲労、およびさらに重篤な合併症を引き起こし得る。
ンBart胎児水腫症候群またはHb Bart症候群である。より穏やかな形態は、H
bH疾患である。Hb Bart症候群は、例えば、出生前に過剰な体液が体内に蓄積す
る病状である、胎児水腫によって特徴付けられる。HbH疾患は、例えば、軽度から中等
度の貧血、肝脾腫大、および眼と皮膚の黄変(黄疸)を引き起こし得る。
。これらのどちらの遺伝子も、ヘモグロビンのサブユニットであるα-グロビンを産生す
る指令を提供する。異なる型のαサラセミアは、これらの対立遺伝子のいくつかのまたは
全ての欠損に起因する。
HbH疾患は、4つのα-グロビン対立遺伝子の3つの欠損によって引き起こされ得る。
これらの2つの病状では、α-グロビンの不足が、細胞が正常なヘモグロビンを産生する
のを妨げる。それに代えて、細胞は、身体の組織に効果的に酸素を輸送し得ない異常な形
態のヘモグロビン、すなわち、ヘモグロビンBart(HbBart)またはヘモグロビ
ンH(HbH)を産生する。HbBartまたはHbHによる正常なヘモグロビンの置き
換えは、αサラセミアに関連する貧血およびその他の深刻な健康問題を引き起こし得る。
-グロビン対立遺伝子の2つの欠損は、αサラセミア体質をもたらし得る。αサラセミア
体質がある人々は、異常に小さく淡赤色の血球および軽度の貧血を有することもある。α
-グロビン対立遺伝子の1つの欠損は、αサラセミア無症状キャリアに見られる。
βサラセミアは、ヘモグロビンの生成を低下させる血液障害である。βサラセミアがあ
る人々では、低レベルのヘモグロビンが、多くの身体部分における酸素の欠如を引き起こ
す。罹患した個人はまた、赤血球不足(貧血)も有して、それは、蒼白な皮膚、脱力感、
疲労、およびさらに重篤な合併症を引き起こし得る。βサラセミアがある人々は、異常な
血餅を発生するリスクの増大を有する。
た知られている)および中間型サラセミアの2つの型に分類される。2つの型の内、重症
型サラセミアがより重篤である。
産生する指令を提供する。HBB遺伝子のいくつかの変異は、任意のβ-グロビンの生成
を妨げる。β-グロビンの不在は、βゼロ(B0)サラセミアと称される。その他のHB
B遺伝子の変異は、いくつかのβ-グロビンの生成を許すが、量は低下し、すなわち、β
プラス(B+)サラセミアである。双方の型がある人々は、重症型サラセミアおよび中間
型サラセミアと診断されている。
されて、例えば、第2の遺伝子中の変異などの第2の遺伝子によって特徴付けられる障害
が治療される。一例として、例えば、編集またはペイロード送達による第1の遺伝子の標
的化は、例えば、変異した第2の遺伝子などの第2の遺伝子の影響からのさらなる障害を
代償し、または阻害し得る。一実施形態では、対象によって保有される第1の遺伝子の対
立遺伝子は、障害の原因でない。
A分子複合体を使用して、RBC生成を駆動するためのEpoの上方制御など、成長因子
を制御する遺伝子を活性化し得る。
A分子複合体を使用して、例えば、鎌状赤血球貧血およびサラセミアの治療のためなど、
胎児ヘモグロビンの上方制御のために、例えば、BCL11AおよびKLF1などの重要
な転写因子のプロモーターが標的化されることができ、その抑制、ノックアウト、または
改変がもたらされる。
補Cas9分子/gRNA分子複合体を使用して、例えば、本明細書に記載されるように
して、標的遺伝子が編集/修正されることができ、または調節物質/エフェクターが、様
々な細胞内部位で細胞内に送達される。一実施形態では、部位は、核内にある。一実施形
態では、部位は、例えば、染色体領域染色体、核小体、核スペックル、カハール体、Ge
ms(カハール体の対)、または前骨髄球性白血病(PML)核小体などの核内のドメイ
ンにある。一実施形態では、部位は、ミトコンドリア内にある。
補Cas9分子/gRNA分子複合体を使用して、本明細書に記載されるようにして、標
的遺伝子が編集/修正されることができ、または調節物質/エフェクターが、様々な時点
で細胞内に送達される。
2期)、またはM期などの細胞周期の異なる段階で実施され得る。別の例として、編集/
修正または送達は、例えば、障害(例えば、ウイルス感染症)の潜伏期または活性期など
の疾患進行の異なる病期で、または障害(例えば、がん)の任意の病期または細分類で、
実施され得る。
治療できるようにする。一実施形態では、がん細胞が操作されて、治療または内在性免疫
監視の影響をより受け易くなる。一実施形態では、がん細胞が調節されて、治療薬に対す
る感受性がより高くなる。一実施形態では、免疫系ががん細胞を認識または殺滅する能力
を高める遺伝子の発現が増大されるように、がん細胞が操作される。例えば、がん細胞が
下方制御された抗原の発現を有する場合、抗原の発現が増大されるように、Cas9分子
/gRNA分子複合体を使用して、ペイロードが送達され、または標的核酸が編集され得
る。一実施形態では、例えば、転写因子またはその他の発現アクチベーターを含むペイロ
ードなどのペイロードが、がん細胞に送達される。一実施形態では、発現の増大は、例え
ば、テンプレート核酸による標的核酸の切断などの標的核酸の切断と、修正または改変と
によってもたらされる。一実施形態では、例えば、メチル化の修飾物質などの、エピジェ
ネティックなサイレンシングを無効化するペイロードが送達される。
療法などの第2の抗がん療法を投与するステップをさらに含む。
に記載される方法を使用して、Cas9分子/gRNA分子ががん細胞に標的化され得る
。
本明細書に記載される方法を使用して、抗原が免疫応答を促進するように、例えば、血液
細胞などの細胞からの抗原の発現を促進するステップを含む。一実施形態では、細胞はイ
ンビトロで操作されて、次に対象に戻されまたは導入される。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、例えば、特にgRNAなどの核酸中に存
在し得るが、例えば、mRNA、RNAi、またはsiRNAなどのその他の形態のRN
Aにもまた存在し得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、5つの炭素砂糖分子
(ペントースまたはリボース)またはその誘導体と、1つの有機塩基、プリンまたはピリ
ミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌ
クレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。
(i)例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および
/または結合リン酸酸素の1つまたは複数の置換などの改変;
(ii)例えば、リボース糖上の2’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換な
どの改変;
(iii)リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる全面的な置換;
(iv)天然起源の核酸塩基の修飾または置換;
(v)リボースリン酸骨格の置換または修飾;
(vi)例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーション
などのオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾;および
(vii)糖の修飾。
ドおよびヌクレオチドが提供され得る。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは
、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。一実施形態では、gRNAまたはテンプレート
核酸の各ヌクレオチドは修飾され、例えば、全てのヌクレオチドが、例えば、全てホスホ
ロチオエート基であるなど、修飾リン酸基を有する。一実施形態では、単分子またはモジ
ュラーgRNA分子またはテンプレート核酸の全ての、または実質的に全てのリン酸基は
、ホスホロチオエート基で置換される。
の修飾ヌクレオチドが、例えば、「修飾核酸」などの核酸に組み込まれ得る。一実施形態
では、修飾核酸は、1、2、3つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、修飾
核酸内の位置の少なくとも5%(例えば、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少な
くとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少な
くとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少な
くとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少な
くとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少な
くとも約95%、または約100%)は、修飾ヌクレオチドである。
、ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様で
は、本明細書に記載される修飾核酸は、1つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレ
オチドを含有することができ、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性が導入される。
修飾核酸は、インビボおよびインビトロの双方で細胞集団内に導入されると、先天性免疫
応答の低下を示し得る。「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌
起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、
具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内
包する。一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、
および修飾核酸は、主溝相互作用パートナーの核酸との結合を妨害し得る。一実施形態で
は、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、イ
ンビボおよびインビトロの双方で、細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を
示して、そしてまた主溝相互作用パートナーの核酸との結合も妨害し得る。
、骨格修飾、およびその他の修飾などの修飾を含む。
チド、骨格修飾、およびその他の修飾などの修飾を含む。一実施形態では、修飾は、例え
ば、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ耐性を増大させることで、テ
ンプレート核酸の安定性を改善する。
Aである。このような実施形態では、全ての修飾は、1本の鎖に限定される。一実施形態
では、修飾は双方の鎖上に存在する。修飾は、5’相同性アーム、3’相同性アーム、ま
たは置換配列、またはそれらの任意の組み合わせに存在してもよい。一実施形態では、修
飾は、相同性アームの片方または双方に存在するが、置換配列には存在しない。
Aである。
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すこと
が意図される。アルキル基の例としては、メチル(Me)、エチル(Et)、プロピル(
例えば、n-プロピルおよびイソプロピル)、ブチル(例えば、n-ブチル、イソブチル
、t-ブチル)、ペンチル(例えば、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル)など
が挙げられる。アルキル基は、1~約20個、2~約20個、1~約12個、1~約8個
、1~約6個、1~約4個、または1~約3個の炭素原子を含有し得る。
、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどの単環または多環(例えば、2、3ま
たは4つの融合環を有する)芳香族炭化水素を指す。一実施形態では、アリール基は、6
~約20個の炭素原子を有する。
基を指す。
複数の三重結合を有することで特徴付けられる、直鎖または分枝炭化水素鎖を指す。アル
キニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、および3-ヘキシニルが挙げられるが
、これに限定されるものではない。
子がアリール基で置換された、アルキル部分を指す。アラルキルは、2つ以上の水素原子
がアリール基で置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の
例としては、ベンジル、2-フェニルエチル、3-フェニルプロピル、9-フルオレニル
、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、
シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられるが、これに限定さ
れるものではない。
テロシクリルとしては、制限なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピ
ロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、
ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモルホリニルが
挙げられる。
ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾ
リル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジ
ニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノ
リル、およびプテリジニルが挙げられる、が、これに限定されるものではない。
<リン酸基>
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、1つまたは複
数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌク
レオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、
未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。一実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非
荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含
み得る。
、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリー
ルホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。一実施形態では、リン酸骨格部
分中の非架橋リン酸酸素原子の1つが、以下の基のいずれかによって置換され得る:イオ
ウ(S)、セレン(Se)、BR3(式中、Rは、例えば、水素、アルキル、またはアリ
ールであり得る)、C(例えば、アルキル基、アリール基など)、H、NR2(式中、R
は、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る)、またはOR(式中、Rは、
例えば、アルキルまたはアリールであり得る)。未修飾リン酸基中の亜リン酸原子は、ア
キラルである。しかし、上の原子または原子群の1つによる非架橋酸素の1つの置換は、
亜リン酸原子をキラルにし得て;すなわち、このようにして修飾されたリン酸基中の亜リ
ン酸原子が、立体中心である。ステレオジェン亜リン酸原子は、「R」構造(本明細書の
Rp)または「S」構造(本明細書のSp)のどちらかを有し得る。
オエートのリン中心はアキラルであり、それは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマ
ーの形成を排除する。一実施形態では、非架橋酸素の片方または双方の修飾はまた、S、
Se、B、C、H、N、およびOR(Rは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る
)から独立して選択される基による、非架橋酸素の置換も含み得る。
オエート)、および炭素(架橋メチレンホスホネート)による、架橋酸素(すなわち、リ
ン酸をヌクレオシドに連結する酸素)の置換によって修飾され得る。置換は、どちらかの
連結酸素で、または双方の連結酸素で起こり得る。
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。一実施形態では、荷電リン
酸基は、中性部分によって置換され得る。
ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、
チオエーテル、酸化エチレンリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセ
タール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレ
ンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられ
る。
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築されることができ、その中では、リン酸
リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲ
ートによって置換される。一実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留さ
れ得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプ
チド核酸(PNA)ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に1つまたは複数の修飾を含み得る
。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキ
シ」置換基で、修飾または置換され得る。一実施形態では、2’ヒドロキシル基の修飾は
核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、2’-
アルコキシドイオンを形成し得ないためである。2’-アルコキシドは、リンカーリン原
子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
(OR、式中、「R」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、
ヘテロアリールまたは糖であり得る);ポリエチレングリコール(PEG)、O(CH2
CH2O)nCH2CH2OR(式中、Rは、例えば、Hまたは任意選択的に置換された
アルキルであり得て、nは、0~20(例えば、0~4、0~8、0~10、0~16、
1~4、1~8、1~10、1~16、1~20、2~4、2~8、2~10、2~16
、2~20、4~8、4~10、4~16、および4~20)の整数であり得る)が挙げ
られる。一実施形態では、「オキシ」-2’ヒドロキシル基修飾は、「ロックド」核酸(
LNA)を含むことができ、その中では、2’ヒドロキシルが、例えば、C1~6アルキ
レンまたはC1~6ヘテロアルキレン架橋によって同一リボース糖の4’炭素に連結され
ることができ、代表的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ
架橋;O-アミノ(式中、アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミ
ノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、また
はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る)、および
アミノアルコキシ、O(CH2)n-アミノ、(式中、アミノは、例えば、NH2;アル
キルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、
ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリ
アミノであり得る)が挙げられる。一実施形態では、「オキシ」-2’ヒドロキシル基修
飾としては、メトキシエチル基(MOE)、(OCH2CH2OCH3、例えば、PEG
誘導体)が挙げられる。
ング部分のデオキシリボース糖);ハロ(例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨ
ード);アミノ(式中、アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ
、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテ
ロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る);NH(CH2CH2NH)nCH2C
H2-アミノ(式中、アミノは、例えば、本明細書に記載されるようであり得る)、-N
HC(O)R(式中、Rは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル
、ヘテロアリールまたは糖であり得る)、シアノ;メルカプト;アルキル-チオ-アルキ
ル;チオアルコキシ;および本明細書に記載されるようなアミノで任意選択的に置換され
てもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げ
られる。
炭素もまた含有し得る。したがって、修飾核酸としては、例えば、糖としてアラビノース
を含有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチド「単量体」は、例えば、αヌクレオ
シドなど、糖の1’位にα結合を有し得る。修飾核酸としては、C-1’の核酸塩基を欠
失している「脱塩基」糖もまた挙げられる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の1つ
または複数でさらに修飾され得る。修飾核酸はとしてはまた、例えばL-ヌクレオシドな
どのL形態の1つまたは複数の糖も挙げられる。
レオシドおよび修飾ヌクレオチドとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換(例え
ば、イオウ(S)、セレン(Se)、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアル
キレンによる);二重結合の付加(例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘ
キセニルで置換する);リボース環縮小(例えば、シクロブタンまたはオキセタンの4員
環を形成する);リボース環拡大(例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、
マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、ホスホロアミダート骨格もまた有
するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する6または7員環を形成する
)が挙げられる。一実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、多環形態(例えば、トリ
シクロ;および(例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で
置換されるR-GNAまたはS-GNAなどの)グリコール核酸(GNA)などの「アン
ロックド」形態、トレオース核酸(TNA、リボースがα-L-トレオフラノシル-(3
’→2’)で置換される)が挙げられる。
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレ
オチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン(A)、グアニン
(G)、シトシン(C)、およびウラシル(U)が挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得
る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は
、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。一
実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられ
る。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的
な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、シュードウリジン(ψ)、ピリジ
ン-4-オンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、6-アザ-ウリジン、2-チオ-
5-アザ-ウリジン、2-チオ-ウリジン(s2U)、4-チオ-ウリジン(s4U)、
4-チオ-シュードウリジン、2-チオ-シュードウリジン、5-ヒドロキシ-ウリジン
(ho5U)、5-アミノアリル-ウリジン、5-ハロ-ウリジン(例えば、5-ヨード
-ウリジンまたは5-ブロモ-ウリジン)、3-メチル-ウリジン(m3U)、5-メト
キシ-ウリジン(mo5U)、ウリジン5-オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5-オ
キシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5-カルボキシメチル-ウリジン(cm5U
)、1-カルボキシメチル-シュードウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリ
ジン(chm5U)、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジンメチルエステル(mc
hm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-ウリジン(mcm5U)、5-メトキシカ
ルボニルメチル-2-チオ-ウリジン(mcm5s2U)、5-アミノメチル-2-チオ
-ウリジン(nm5s2U)、5-メチルアミノメチル-ウリジン(mnm5U)、5-
メチルアミノメチル-2-チオ-ウリジン(mnm5s2U)、5-メチルアミノメチル
-2-セレン含有-ウリジン(mnm5se2U)、5-カルバモイルメチル-ウリジン
(ncm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-ウリジン(cmnm5U)、5-
カルボキシメチルアミノメチル-2-チオ-ウリジン(cmnm5s2U)、5-プロピ
ニル-ウリジン、1-プロピニル-シュードウリジン、5-タウリノメチル-ウリジン(
τcm5U)、1-タウリノメチル-シュードウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ
-ウリジン(τm5s2U)、1-タウリノメチル-4-チオ-シュードウリジン、5-
メチル-ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン(deoxythym
ine)を有する)、1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)、5-メチル-2-チオ
-ウリジン(m5s2U)、1-メチル-4-チオ-シュードウリジン(m1s4ψ)、
4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、3-メチル-シュードウリジン(m3ψ)、
2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン
、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジ
ヒドロシュードウリジン、5,6-ジヒドロウリジン、5-メチル-ジヒドロウリジン(
m5D)、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-メ
トキシ-ウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-シュードウリジ
ン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、N1-メチル-シュードウリジン、3
-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1-メチル-3-
(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュードウリジン(acp3ψ)、5-(イソ
ペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5-(イソペンテニルアミノメチル
)-2-チオ-ウリジン(inm5s2U)、α-チオ-ウリジン、2’-O-メチル-
ウリジン(Um)、5,2’-O-ジメチル-ウリジン(m5Um)、2’-O-メチル
-シュードウリジン(ψm)、2-チオ-2’-O-メチル-ウリジン(s2Um)、5
-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチル-ウリジン(mcm5Um)、5-カル
バモイルメチル-2’-O-メチル-ウリジン(ncm5Um)、5-カルボキシメチル
アミノメチル-2’-O-メチル-ウリジン(cmnm5Um)、3,2’-O-ジメチ
ル-ウリジン(m3Um)、5-(イソペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチル-
ウリジン(inm5Um)、1-チオ-ウリジン、デオキシチミジン、2’-F-アラ-
ウリジン、2’-F-ウリジン、2’-OH-アラ-ウリジン、5-(2-カルボメトキ
シビニル)ウリジン、5-[3-(1-E-プロペニルアミノ)ウリジン、ピラゾロ[3
,4-d]ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的
な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、5-アザ-シチジン、6-アザ-
シチジン、シュードイソシチジン、3-メチル-シチジン(m3C)、N4-アセチル-
シチジン(act)、5-ホルミル-シチジン(f5C)、N4-メチル-シチジン(m
4C)、5-メチル-シチジン(m5C)、5-ハロ-シチジン(例えば、5-ヨード-
シチジン)、5-ヒドロキシメチル-シチジン(hm5C)、1-メチル-シュードイソ
シチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-シュードイソシチジン、2-チオ-シチジン(s
2C)、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-シュードイソシチジン、4-チオ
-1-メチル-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードイ
ソシチジン、1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-
ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼ
ブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキ
シ-シュードイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-シュードイソシチジン、リシジ
ン(k2C)、α-チオ-シチジン、2’-O-メチル-シチジン(Cm)、5,2’-
O-ジメチル-シチジン(m5Cm)、N4-アセチル-2’-O-メチル-シチジン(
ac4Cm)、N4,2’-O-ジメチル-シチジン(m4Cm)、5-ホルミル-2’
-O-メチル-シチジン(f5Cm)、N4,N4,2’-O-トリメチル-シチジン(
m4 2Cm)、1-チオ-シチジン、2’-F-アラ-シチジン、2’-F-シチジン、
および2’-OH-アラ-シチジンが挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的
な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、2-アミノ-プリン、2,6-ジ
アミノプリン、2-アミノ-6-ハロ-プリン(例えば、2-アミノ-6-クロロ-プリ
ン)、6-ハロ-プリン(例えば、6-クロロ-プリン)、2-アミノ-6-メチル-プ
リン、8-アジド-アデノシン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニ
ン、7-デアザ-2-アミノ-プリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノ-プリン、7
-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、
1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデニン(m2A)、N6-メチル-
アデノシン(m6A)、2-メチルチオ-N6-メチル-アデノシン(ms2m6A)、
N6-イソペンテニル-アデノシン(i6A)、2-メチルチオ-N6-イソペンテニル
-アデノシン(ms2i6A)、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン
(io6A)、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン
(ms2io6A)、N6-グリシジルカルバモイル(glycinylcarbamo
yl)-アデノシン(g6A)、N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(t6A)
、N6-メチル-N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(m6t6A)、2-メチ
ルチオ-N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(ms2g6A)、N6,N6-ジ
メチル-アデノシン(m6 2A)、N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイル-アデノシ
ン(hn6A)、2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイル-アデノシ
ン(ms2hn6A)、N6-アセチル-アデノシン(ac6A)、7-メチル-アデニ
ン、2-メチルチオ-アデニン、2-メトキシ-アデニン、α-チオ-アデノシン、2’
-O-メチル-アデノシン(Am)、N6,2’-O-ジメチル-アデノシン(m6Am
)、N6-メチル-2’-デオキシアデノシン、N6,N6,2’-O-トリメチル-ア
デノシン(m6 2Am)、1,2’-O-ジメチル-アデノシン(m1Am)、2’-O
-リボシルアデノシン(リン酸塩)(Ar(p))、2-アミノ-N6-メチル-プリン
、1-チオ-アデノシン、8-アジド-アデノシン、2’-F-アラ-アデノシン、2’
-F-アデノシン、2’-OH-アラ-アデノシン、およびN6-(19-アミノ-ペン
タオキサノンアデシル)-アデノシンが挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的
な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン(I)、1-メチル-イ
ノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、4-デメチ
ル-ワイオシン(imG-14)、イソワイオシン(imG2)、ウィブトシン(yW)
、ペルオキシウィブトシン(o2yW)、ヒドロキシウィブトシン(OHyW)、低修飾
ヒドロキシウィブトシン(OHyW*)、7-デアザ-グアノシン、クエオシン(Q)、
エポキシクエオシン(oQ)、ガラクトシル-クエオシン(galQ)、マンノシル-ク
エオシン(manQ)、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミ
ノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、アルカエオシン(G+)、7-デア
ザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン
、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン(m7G)、
6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチル-イノシン、6-メトキシ-グアノシン
、1-メチル-グアノシン(m’G)、N2-メチル-グアノシン(m2G)、N2,N
2-ジメチル-グアノシン(m2 2G)、N2,7-ジメチル-グアノシン(m2,7G
)、N2、N2,7-ジメチル-グアノシン(m2,2,7G)、8-オキソ-グアノシ
ン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-metHチオ-グアノシン、N2-メチ
ル-6-チオ-グアノシン、N2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、α-チオ-
グアノシン、2’-O-メチル-グアノシン(Gm)、N2-メチル-2’-O-メチル
-グアノシン(m2Gm)、N2,N2-ジメチル-2’-O-メチル-グアノシン(m
2 2Gm)、1-メチル-2’-O-メチル-グアノシン(m’Gm)、N2,7-ジメ
チル-2’-O-メチル-グアノシン(m2,7Gm)、2’-O-メチル-イノシン(
Im)、1,2’-O-ジメチル-イノシン(m’Im)、O6-フェニル-2’-デオ
キシイノシン、2’-O-リボシルグアノシン(リン酸塩)(Gr(p))、1-チオ-
グアノシン、O6-メチル-グアノシン、O6-メチル-2’-デオキシグアノシン、2
’-F-アラ-グアノシン、および2’-F-グアノシンが挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸は、修飾gRNAであり得る。一実施形態では、gRNAは
、3’末端で修飾され得る。この実施形態では、gRNAは、3’末端Uリボースで修飾
され得る。例えば、Uリボースの2つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され
ることができ、同時のリボース環の開環が、下に示される修飾ヌクレオシドをもたらす:
式中、「U」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。
1つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、3’ヌクレオチドを含
有してもよい。この実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、5-(2-アミノ)プ
ロピルウリジン、および5-ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジ
ンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換されることができ;アデノシンおよびグアノシン
は、例えば、8-ブロモグアノシンなどの例えば、8位の修飾によって、修飾アデノシン
およびグアノシンで、または本明細書に記載される修飾アデノシンまたはグアノシンのい
ずれかによって、置換され得る。一実施形態では、例えば、7-デアザ-アデノシンなど
のデアザヌクレオチドが、gRNAに組み込まれ得る。一実施形態では、例えば、N6-
メチルアデノシン(andenosine)などのO-およびN-アルキル化ヌクレオチ
ドが、gRNAに組み込まれ得る。一実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドが組み込ま
れることができ、例えば、2’OH基が、H、-OR、-R(式中、Rは、例えば、アル
キル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る)、
ハロ、-SH、-SR(式中、Rは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、ア
ラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る)、アミノ(式中、アミノは、例えば、N
H2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリー
ルアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る
);またはシアノ(-CN)から選択される基によって置換される。一実施形態では、リ
ン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート(phosphothioate)基で、本明
細書に記載されるように修飾され得る。一実施形態では、gRNAのオーバーハング領域
内のヌクレオチドは、それぞれ独立して、2-F2’-O-メチル、チミジン(T)、2
’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン(Teo)、2’-O-メトキシエチルア
デノシン(Aeo)、2’-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン(m5Ceo)、
およびそれらの任意の組み合わせなどの修飾2’-糖をはじめとするが、これに限定され
るものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。
1つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、共有結合リンカーによって、Cas9分子ま
たはgRNAと結合し得る。このリンカーは、切断可能または切断不能であってもよい。
一実施形態では、切断可能なリンカーが使用されて、所望の標的への輸送後にペイロード
が放出されてもよい。
NR-(式中、Rは、水素またはアルキルである)、-C(O)-、-C(O)O-、-
C(O)NH-、SO、SO2、-SO2NH-などの単位;または置換または非置換ア
ルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル
、ヘテロアリールアルキルなどの原子鎖を含み得る。一実施形態では、原子鎖中の1つま
たは複数のメチレンは、の1つまたは複数O、S、S(O)、SO2、-SO2NH-、
-NR-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、a切断可能連結基、置換
または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換複素
環で置換され得る。
一実施形態では、ペイロードは、アルキレン鎖などのそれ自体が生理的条件下で安定し
ているリンカーを介して、Cas9分子またはgRNAに付着し、対象に投与されると、
少なくとも2、3、4、5、10、15、24または48時間にわたり、または少なくと
も1、2、3、4、5、または10日間にわたり、Cas9分子および/またはgRNA
からのペイロードの放出をもたらさない。一実施形態では、ペイロードおよびCas9分
子および/またはgRNAは、それを通じて、ペイロードと、Cas9分子またはgRN
Aとの反応および連結が得られた官能基残基を含む。一実施形態では、同一であってもま
たは異なっていてもよく、末端または内部であってもよい、ペイロードまたはCas9分
子および/またはgRNAの官能基は、アミノ、酸、イミダゾール、ヒドロキシル、チオ
、アシルハロゲン化物、-HC=CH-、-C≡C-基、またはその誘導体を含む。一実
施形態では、リンカーは、1つまたは複数のメチレン基が、(Y基のいずれもが互いに隣
接しないという条件で)Y基によって任意選択的に置き換えられるヒドロカルビレン基を
含み、各Yは、各出現についてそれぞれ独立して、置換または非置換アリール、ヘテロア
リール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、または-O-、-C(=X)-(式中
、Xは、NR1、OまたはSである)、-NR1-、-NR1C(O)-、-C(O)N
R1-、-S(O)n-、-NR1S(O)n-、-S(O)nNR1-、-NR1C(
O)-NR1-;および各出現についてそれぞれ独立して、Hまたは低級アルキルに相当
するR1から選択され、式中、nは0、1、または2である。
エチレングリコールなどのアルキレングリコール部分)を含む。一実施形態では、リンカ
ーは、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ乳酸、ポリ(エチレンイミン)、オリゴ糖、アミノ
酸(例えば、グリシン)、アミノ酸鎖、または任意のその他の適切な連結を含む。リンカ
ー基は、PEG、ポリグリコール酸、またはポリ乳酸鎖などのように、生物学的に不活性
であり得る。一実施形態では、リンカー基は、誘導体化または非誘導体化アミノ酸(例え
ば、グリシン)に相当する。
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて
、リンカーがつなぎ止めている2つの部分を放出するものである。一実施形態では、切断
可能連結基は、対象の血中または(例えば、血中のまたは血清中に見られる条件を模倣し
またはに相当するように選択され得る)第2の標準状態下よりも、標的細胞内または(例
えば、細胞内条件を模倣しまたはに相当するように選択され得る)第1の標準状態下で、
少なくとも10倍以上、または少なくとも100倍より迅速に切断される。
剤に対する感受性が高い。このような分解剤の例としては、例えば、酸化または還元酵素
、または還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞内に存在するメルカプ
タンなどの還元剤をはじめとする、特定基質のために選択される、または基質特異性を有
さない酸化還元剤;エステラーゼ;例えば、5以下のpHをもたらすものなどの酸性環境
を生成し得る、エンドソームまたは作用因子;一般酸として作用することで酸切断可能連
結基を加水分解または分解し得る酵素、ペプチダーゼ(基質特異性であり得る)、および
ホスファターゼが挙げられる。
場合がある。ヒト血清のpHが7.4である一方で、平均細胞内pHは、わずかにより低
く、約7.1~7.3の範囲である。エンドソームは5.5~6.0の範囲のより酸性の
pHを有し、リソソームは、5.0前後のさらにより酸性のpHを有する。いくつかのリ
ンカーは、好適なpHで切断される、切断可能連結基を有する。リンカーは、特定の酵素
によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。
る能力を試験することで、評価され得る。候補切断可能連結基はまた、血中における、ま
たはその他の非標的組織と接触した際における、切断に抵抗する能力についても試験され
得る。したがって、第1および第2の条件間の切断に対する相対感受性が判定されること
ができ、第1の条件は、標的細胞内の切断の指標となるように選択され、第2の条件は、
例えば、血液または血清などのその他の組織または生体液における切断の指標となるよう
に選択される。評価は、無細胞系内で、細胞内で、細胞培養物内で、臓器または組織培養
物内で、または動物の全身で、実施され得る。それは、無細胞条件または培養条件におい
て最初の評価をする上で、および動物の全身でのさらなる評価によって確認する上で、有
用であってもよい。
化還元切断可能リンカーや、例えば、-O-P(O)(OR)-O-、-O-P(S)(
OR)-O-、-O-P(S)(SR)-O-、-S-P(O)(OR)-O-、-O-
P(O)(OR)-S-、-S-P(O)(OR)-S-、-O-P(S)(OR)-S
-、-S-P(S)(OR)-O-、-O-P(O)(R)-O-、-O-P(S)(R
)-O-、-S-P(O)(R)-O-、-S-P(S)(R)-O-、-S-P(O)
(R)-S-、-OP(S)(R)-S-(式中、Rは、水素またはアルキルである)な
どのリン酸切断可能リンカーが挙げられる。
酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。一実施形態では、酸切断
可能連結基は、pH約6.5以下(例えば、約6.0、5.5、5.0以下)の酸性環境
内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。酸
切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げら
れるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式-C(=N-)N-、
-C(O)O-、または-OC(O)-を有し得る。
エステルベースの切断可能連結基は、細胞内で、エステラーゼおよびアミダーゼなどの
酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、
アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。エステル切断可能連結基は、一般式-C(O)O-または-OC(O)-を有
する。
Cas9分子、gRNA分子、そして特に、Cas9分子/gRNA分子複合体を使用
して、選択されたゲノムシグネチャを含む標的核酸との配列特異的相互作用によって、細
胞を標的化し得る。これは、選択されたゲノムシグネチャを有する細胞の標的破壊を提供
する。本明細書で開示される方法および組成物を使用して、例えば、生殖細胞系内に存在
するゲノムシグネチャ、または例えば、がん細胞内における生殖細胞系または後天性変異
、ウイルス感染症、またはその他の生殖細胞系または後天性のゲノム変化など、ゲノム内
の散発性変化または体細胞変化の結果として生じる、ゲノムシグネチャなどの選択された
ゲノムシグネチャによって特徴付けられる、障害が治療され得る。
間の相補性が、Cas9分子/gRNA分子複合体と標的配列との標的配列特異的相互作
用を媒介すると考えられる。これは、例えば、転座、挿入、欠失、および反転、およびそ
の他の変異などの再配置によって、特異的配列またはゲノムシグネチャを標的化できるよ
うにする。Cas9分子/gRNA分子複合体を使用して、例えば、生殖細胞系、ミトコ
ンドリア、または体細胞の変異などの特定の配列を標的化し得る。使用されるCas9分
子/gRNA分子複合体次第で、特定の編集、ペイロード送達、またはその双方が実施さ
れ得る。一実施形態では、切断およびペイロード送達の双方が実施される。
して、細胞死を促進する。一実施形態では、eaCas9分子/gRNA分子複合体は、
標的核酸を切断する。一実施形態では、それは、ペイロードを送達しない。理論による拘
束は望まないが、これらの実施形態では、例えば、DNA損傷アポトーシスシグナル伝達
カスケードの要素などの内在性細胞要素が、アポトーシスを促進すると考えられる。
イロードを送達する。ペイロードは、増殖または細胞分裂を阻害する化合物、または例え
ば、DNA損傷アポトーシスシグナル伝達カスケードの要素などのアポトーシスを促進す
る化合物を含み得る。一実施形態では、第2のCas9分子/gRNA分子複合体を使用
して、増殖または細胞分裂を阻害する第2の化合物、または例えば、DNA損傷アポトー
シスシグナル伝達カスケードの要素などのアポトーシスを促進する第2の化合物を含むペ
イロードが送達される。第2のペイロードを送達するCas9分子/gRNA分子複合体
は、eiCas9分子またはeaCas9分子を含み得る。追加的な、例えば、第3のま
たは第4のCas9分子/gRNA分子複合体を使用して、例えば、増殖または細胞分裂
を阻害する追加的な化合物、または例えば、DNA損傷アポトーシスシグナル伝達カスケ
ード促進の追加的な要素などのアポトーシスを促進する追加的な化合物などの追加的なペ
イロードが送達され得る。
る化合物、または例えば、DNA損傷アポトーシスシグナル伝達カスケードの要素などの
アポトーシスを促進する化合物を含むペイロードを送達するが、標的核酸を切断しない。
理論による拘束は望まないが、これらの実施形態では、例えば、DNA損傷アポトーシス
シグナル伝達カスケードの要素などの内在性細胞要素が、アポトーシスを促進すると考え
られる。
スシグナル伝達カスケードの要素などのアポトーシスを促進する代表的な化合物は、例え
ば、表XII-1で本明細書に記載される。
または欠失などの再配置の切断点を含む、またはその近くにある配列を標的化する。一実
施形態では、再配置は、細胞に、例えば、望まれない増殖などの望まれない特性を与える
。一実施形態では、再配置を保有する細胞は、がん細胞である。一実施形態では、再配置
は、キナーゼ遺伝子を含み、キナーゼ活性の望まれない増大または構成的発現がもたらさ
れる。一実施形態では、再配置は、腫瘍抑制因子の発現を妨害する。
例えば、再配置の切断点または接合部などの変異を標的化することで、再配置を含む細
胞のゲノムを特異的に標的化して、例えば、切断し;または
例えば、切断またはペイロード送達のために、例えば、再配置切断点などの変異から2
00、100、150、100、50、25、10、または5ヌクレオチド以内のヌクレ
オチド配列を標的化する。
投与するステップと、それによって前記細胞を操作するステップとを含む、ゲノムシグネ
チャを含む細胞を操作する方法を含む。
を死滅させるステップを含む。
る。
ャを有する細胞によって特徴付けられる障害のために、例えば、ヒト対象などの対象を治
療するステップを含む。
らの停止コドンの導入によって再配置を妨害し、例えば、停止コドンが融合タンパク質中
に挿入され、例えば、融合タンパク質がキナーゼ活性を含む。
含む、キナーゼドメインを非キナーゼ遺伝子制御領域の制御下に置く、キナーゼ遺伝子か
ら非キナーゼ遺伝子への転座を有する、がんを治療する方法を含む。一実施形態では、例
えば、キナーゼ転座のプロモーターなどの制御領域、またはそのコード配列が編集されて
、発現が低下れる。
Cas9分子、gRNA分子、そして特に、Cas9分子/gRNA分子複合体は、例
えば、抗がん剤などの第2の治療薬と組み合わせて使用され得る。一実施形態では、第2
の治療薬(例えば、抗がん剤)およびCas9分子、gRNA分子、そして特に、Cas
9分子/gRNA分子複合体は、異なる(例えば。非重複)経路を標的化する。一実施形
態では、第2の治療薬(例えば、抗がん剤)およびCas9分子、gRNA分子、そして
特に、Cas9分子/gRNA分子複合体は、同一または重複経路を標的化する。
-AKT特異的Cas9/gRNA分子と合わせた、mTOR阻害剤(例えば、テムシ
ロリムス(Torisel(登録商標))またはエベロリムス(Afinitor(登録
商標)));
-HDAC特異的Cas9/gRNA分子と合わせた、イマチニブメシレート(グリベ
ック(登録商標));ダサチニブ(スプリセル(登録商標));ボスチニブ(ボシュリフ
(登録商標));トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標));ペルツズマブ(パージ
ェタ(商標));ラパチニブ(タイケルブ(登録商標));ゲフィチニブ(イレッサ(登
録商標));エルロチニブ(タルセバ(登録商標))などのチロシンキナーゼ阻害剤;お
よび
-MDR1遺伝子などの多剤耐性遺伝子に対する1つまたは複数のCas9/gRNA
と合わせた、任意の化学療法剤。
別の態様では、本発明は、例えば、早期停止コドンのような停止コドンなどの遺伝子シ
グネチャの効果を低下させるまたは無効化するなど、細胞を改変する方法を特徴とする。
この方法は、例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャで、またはその上流で切断
する、Cas9分子/gRNA分子複合体に、前記細胞を接触させるステップと、それに
よって細胞を改変するステップとを含む。
ゼ作用、および非相同末端結合が、改変された配列をもたらすと考えられ、その中では、
例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャが例えば、異なるフレーム内に配置され
ることで、除去される。一実施形態では、同じ一連の事象が、例えば、早期停止コドンな
どのシグネチャに続く配列に、適切な読み枠を回復させる。
る場合、修復は、DNAの様々な部位で実施され得る。変異で直接切断がなされてもよく
、それによってフレームシフトが完全に修正されて、タンパク質がその野生型(またはほ
ぼ野生型)配列に戻される。また、修復が実施される、コドンのタンパク質C末端の全て
の(またはほぼ全ての)アミノ酸が野生型になるように、早期停止コドンで、またはその
近くで、直接切断がなされてもよい。後者の場合、得られたタンパク質は、変異と修復部
位の間に、1つまたは複数のフレームシフトされたアミノ酸を有することもあるが、しか
しタンパク質は完全長であり、大部分の長さ全体にわたり野生型配列を有するので、それ
はなおも機能性であってもよい。
ムの特別な部分の特別なDNA配列である。例えば、遺伝子シグネチャは、タンパク質発
現を妨げる早期停止コドンであってもよい。この筋書きでは、早期停止コドンは、停止コ
ドンを直接作り出す変異から、または早期停止コドンが下流で形成されるようにする、フ
レームシフトを引き起こす変異から生じ得る。遺伝子シグネチャはまた、タンパク質中の
重要なアミノ酸の同一性を変化させ、タンパク質の機能を妨害する、点変異であってもよ
い。
を媒介する。
欠失、または再配置によって生じる。一実施形態では、変異は、フレームシフトを引き起
こして、例えば、変異の下流に早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャをもたらす。
、早期停止コドンの上流にある。変異は、標的核酸上流、標的核酸内、または標的核酸下
流であってもよい。
10、5、または2ヌクレオチド以内である。一実施形態では、二本鎖切断は、例えば、
早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャの500、200、100、50、30、20、
10、5、または2ヌクレオチド以内にある。
ゼ消化を媒介する。一実施形態では、Cas9分子/gRNA分子複合体は、二本鎖切断
で、1、2、3、4、または5ヌクレオチドを除去する。
は、ジストロフィン遺伝子中にあり、例えば、エクソン51中、またはエクソン51に先
行しまたは続くイントロン中にある。早期停止コドンはまた、コドン54、645、77
3、3335、および3340の1つまたは複数における、ジストロフィン遺伝子の変異
によって引き起こされてもよい。一実施形態では、ジストロフィン遺伝子の早期停止コド
ンは、コドン2305~2366の欠失に起因する。
細胞をCas9分子をコードする核酸に接触させるステップを含む。一実施形態では、細
胞をCas9分子/gRNA分子複合体に接触させるステップは、細胞を例えば、プラス
ミドなどの核酸で、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)などのウイルスベクターを使用
して、形質移入するステップを含む。
あらかじめ位置する、タンパク質のレベル増大をもたらす。例えば、タンパク質レベル(
例えば、ジストロフィンレベル)は、細胞内または組織内で、少なくとも3%、4%、5
%、10%、15%、20%、25%、または30%増大してもよい。一実施形態では、
方法は、例えば、mRNAがナンセンス媒介mRNA分解を受けるのを妨げることで、そ
の中に早期停止コドンがあらかじめ位置するmRNAのレベル増大をもたらす。
異の1つまたは複数は、(DMDにおいて変異する)ジストロフィン遺伝子に位置する。
標的核酸、例えば早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャ、および変異の1つまたは複数
はまた、COL7A1遺伝子(において変異するVII型関連ジストロフィー型表皮水疱
症)、FKTN遺伝子(福山型先天性筋ジストロフィーにおいて変異する)、ジスフェリ
遺伝子肢帯型筋ジストロフィー2B型において変異する)、CFTR遺伝子(嚢胞性線維
症において変異する)、HEXA(テイ・サックス病において変異する)、IDS遺伝子
(ハンター症候群において変異する)、FVIII遺伝子(血友病において変異する)、
IDUA遺伝子(ハーラー症候群において変異する)、PPT1遺伝子(小児神経性セロ
イドリポフスチン症において変異する)、ATM遺伝子などの腫瘍抑制因子(がん様神経
膠腫およびB細胞慢性リンパ球性白血病において変異する)、RP2(X連鎖色素性網膜
炎において変異する)、CTNS遺伝子(腎障害シスチン症において変異する)、および
AVPR2遺伝子(先天性腎性尿崩症において変異する)に位置してもよい。
胞を患者に投与するステップをさらに含む。細胞は、例えば、誘導多能性幹細胞、骨髄由
来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、CD133+細胞、中胚葉性血管芽細胞、またはMyoD
-形質導入皮膚線維芽細胞であってもよい。
うにする条件下で、細胞をテンプレート核酸に接触させて、変異または早期停止コドンを
修正するステップを含む。
1)早期停止コドンでまたはその上流で切断するCas9分子/gRNA分子複合体、
または、
2)このような複合体に接触されている細胞をヒト対象に提供して、
それによって対象を治療するステップを含む、例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグ
ネチャに関連する、例えば、DMDのなどの障害を有するヒト対象を治療する方法を特徴
とする。
を媒介する。
欠失、または再配置によって生じる。一実施形態では、変異は、フレームシフトを引き起
こし、変異の下流に早期停止コドンをもたらす。
10、5、または2ヌクレオチド以内である。一実施形態では、二本鎖切断は、早期停止
コドンの500、200、100、50、30、20、10、5、または2ヌクレオチド
以内である。
gRNA分子の複合体標的核酸内にある。一実施形態では、標的核酸は、例えば、早期停
止コドンなどの遺伝子シグネチャの上流にある。変異は、標的核酸上流、標的核酸内、ま
たは標的核酸下流であってもよい。
ゼ消化を媒介する。一実施形態では、Cas9分子/gRNA分子複合体は、二本鎖切断
で、1、2、3、4、または5ヌクレオチドを除去する。
は、ジストロフィン遺伝子中にあり、例えば、エクソン51中、またはエクソン51に先
行しまたは続くイントロン中にある。早期停止コドンはまた、コドン54、645、77
3、3335、および3340の1つまたは複数における、ジストロフィン遺伝子の変異
によって引き起こされてもよい。一実施形態では、ジストロフィン遺伝子の早期停止コド
ンは、コドン2305~2366の欠失に起因する。
細胞をCas9分子をコードする核酸に接触させるステップを含む。一実施形態では、細
胞をCas9分子/gRNA分子複合体に接触させるステップは、細胞を例えば、プラス
ミドなどの核酸で、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)などのウイルスベクターを使用
して、形質移入するステップを含む。
あらかじめ位置する、タンパク質のレベル増大をもたらす。例えば、タンパク質レベル(
例えば、ジストロフィンレベル)は、細胞内または組織内で、少なくとも3%、4%、5
%、10%、15%、20%、25%、または30%増大してもよい。一実施形態では、
方法は、例えば、mRNAがナンセンス媒介mRNA分解を受けるのを妨げることで、そ
の中に早期停止コドンがあらかじめ位置するmRNAのレベル増大をもたらす。
異の1つまたは複数は、(DMDにおいて変異する)ジストロフィン遺伝子に位置する。
標的核酸、例えば早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャ、および変異の1つまたは複数
はまた、COL7A1遺伝子(において変異するVII型関連ジストロフィー型表皮水疱
症)、FKTN遺伝子(福山型先天性筋ジストロフィーにおいて変異する)、ジスフェリ
遺伝子肢帯型筋ジストロフィー2B型において変異する)、CFTR遺伝子(嚢胞性線維
症において変異する)、HEXA(テイ・サックス病において変異する)、IDS遺伝子
(ハンター症候群において変異する)、FVIII遺伝子(血友病において変異する)、
IDUA遺伝子(ハーラー症候群において変異する)、PPT1遺伝子(小児神経性セロ
イドリポフスチン症において変異する)、ATM遺伝子などの腫瘍抑制因子(がん様神経
膠腫およびB細胞慢性リンパ球性白血病において変異する)、RP2(X連鎖色素性網膜
炎において変異する)、CTNS遺伝子(腎障害シスチン症において変異する)、および
AVPR2遺伝子(先天性腎性尿崩症において変異する)に位置してもよい。
患者に投与するステップをさらに含む。細胞は、例えば、誘導多能性幹細胞、骨髄由来前
駆細胞、骨格筋前駆細胞、CD133+細胞、中胚葉性血管芽細胞、またはMyoD-形
質導入皮膚線維芽細胞であってもよい。
うにする条件下で、細胞をテンプレート核酸に接触させて、変異または早期停止コドンを
修正するステップを含む。
II型関連ジストロフィー型表皮水疱症、福山型先天性筋ジストロフィー、および肢帯型
筋ジストロフィー型の2B、嚢胞性線維症、リソソーム貯蔵障害(テイ・サックス病、ハ
ンター症候群、および腎障害シスチン症など)、血友病、ハーラー症候群、小児神経性セ
ロイドリポフスチン症、X連鎖色素性網膜炎(RP2)、がん(神経膠腫およびB細胞慢
性リンパ球性白血病など)、および先天性腎性尿崩症から選択される障害を有する。
障害;またはβ膵島細胞の損失がある糖尿病などの成熟特殊化細胞の欠如によって特徴付
けられる障害の治療]
別の態様では、本発明は、細胞を改変する方法を特徴とし、例えば、再生療法において
、例えば、その他の成熟特殊化細胞の発達が促進される。例えば、増殖遺伝子が上方制御
されることができおよび/またはチェックポイント阻害剤が阻害されることができ、例え
ば、1つまたは複数の分化経路が抑制される。
を促進する遺伝子を上方制御しまたは有毛細胞発達を阻害する遺伝子を下方制御するCa
s9分子/gRNA分子複合体に、前記細胞を接触させるステップと、それによって細胞
を改変するステップとを含む。
方制御するペイロードを送達する。
御するペイロードを送達する。
髪成長を促進する遺伝子を上方制御する。一実施形態では、テンプレート核酸を使用して
、毛髪成長を促進する遺伝子を上方制御するゲノムに、Cas9分子/gRNA分子複合
体改変がもたらされる。
髪成長を阻害する遺伝子を下方制御する。一実施形態では、テンプレート核酸を使用して
、毛髪成長を促進する遺伝子を下方制御するゲノムに、Cas9分子/gRNA分子複合
体改変がもたらされる。
胞である。
とで(例えば、ゲノムを編集することで)、または遺伝子を調節するペイロードの送達に
よって、遺伝子の発現を修飾する。一実施形態では、遺伝子は、転写因子またはその他の
調節遺伝子である。
または複数のまたは全てを含む:
細胞増殖のために、細胞をCas9分子/gRNA分子複合体に接触させて、c-My
c、GATA3、Oct4、Sox2、Wnt、TCF3の上方制御の1つまたは複数が
もたらされるステップと;
チェックポイントのために、細胞をCas9分子/gRNA分子複合体に接触させて、
BCL2、BMP、Hes1、Hes5、Notch、p27、Prox1、TGFβの
下方制御の1つまたは複数がもたらされるステップと;および
細胞をCas9分子/gRNA分子複合体に接触させて、成熟経路の活性化がもたらさ
れるステップ。有毛細胞では、これは、Atoh1(Math1)、Barhl1、Gf
i1、Myo7a、p63、PAX2、PAX8、Pou4f3の1つまたは複数を含み
、ニューロンでは、これは、NEFH、Neurod1、Neurog1、POU4F1
の1つまたは複数を含む。
よび耳支持細胞を生成するステップを含む。
御され、例えば、血小板生成のためにTPOが上方制御されることができ、好中球生成の
ためにGCSFが上方制御され得る。
細胞提供する。
のセクションXVで本明細書に記載される改変細胞を前記対象に投与するステップを含む
。一実施形態では、細胞は自己細胞である。一実施形態では、細胞は同種異系である。一
実施形態では、細胞は異種である。
る。この方法は、毛髪の増殖を促進する遺伝子を上方制御し、または毛髪の増殖を阻害す
る遺伝子を下方制御するCas9分子/gRNA分子複合体を前記対象に投与し、それに
よって細胞を改変するステップを含む。
御するペイロードを送達する。
御するペイロードを送達する。
髪成長を促進する遺伝子を上方制御する。一実施形態では、テンプレート核酸を使用して
、毛髪成長を促進する遺伝子を上方制御するゲノムに、Cas9分子/gRNA分子複合
体改変がもたらされる。
髪成長を阻害する遺伝子を下方制御する。一実施形態では、テンプレート核酸を使用して
、毛髪成長を促進する遺伝子を下方制御するゲノムに、Cas9分子/gRNA分子複合
体改変がもたらされる。
とで(例えば、ゲノムを編集することで)、または遺伝子を調節するペイロードの送達に
よって、遺伝子の発現を修飾する。一実施形態では、遺伝子は、転写因子またはその他の
調節遺伝子である。
c-Myc、GATA3、Oct4、Sox2、Wnt、またはTCF3の1つまたは複
数の上方制御をもたらす、Cas9分子/gRNA分子複合体を投与するステップと;
成熟経路活性化をもたらす、Cas9分子/gRNA分子複合体を投与するステップ。有
毛細胞では、これは、Atoh1(Math1)、Barhl1、Gfi1、Myo7a
、p63、PAX2、PAX8、またはPou4f3の1つまたは複数を含み、ニューロ
ンでは、これは、NEFH、Neurod1、Neurog1、またはPOU4F1の1
つまたは複数を含む。
使用]
本明細書で考察されるように、例えば、Cas9分子またはgRNA分子をコードする
DNAなどの核酸を使用しまたはそれを含む、方法および組成物は、支配gRNA分子を
さらに使用しまたはそれを含み得る。支配gRNA分子は、Cas9分子と複合体形成し
て、例えば、Cas9分子をコードする核酸またはgRNA分子をコードする核酸などの
システムの構成要素を不活性化し、またはサイレンシングさせ得る。どちらの状況でも、
例えば、Cas9標的化gRNA分子、またはgRNA標的化gRNA分子などの支配g
RNAは、Cas9/gRNA複合体媒介遺伝子ターゲッティングの効果を制限して、活
性に時間的制限を課し、またはオフターゲット活性を低下させ得る。支配gRNA分子は
、阻害するように作用しえて、例えば、Cas9システムの構成要素の生成を完全にまた
は実質的に阻害し、それによってその活性を制限し、またはそれに影響を与える。
核酸配列は、例えば、Cas9分子をコードする核酸などのそれが負に調節する構成要素
とは異なる、例えば、プロモーターなどの制御領域の制御下にある。一実施形態では、異
なるは、単に、例えば、調節される双方の配列と機能的に連結するプロモーターなどの1
つの制御領域の制御下にないことを指す。一実施形態では、異なるは、種類またはタイプ
が異なることを指す。例えば、Cas9標的化gRNA分子などの支配gRNA分子をコ
ードする配列は、例えば、Cas9分子をコードする核酸などのそれが負に調節する構成
要素をコードする配列よりも低い発現レベルを有し、またはそれよりも後に発現される、
例えば、プロモーターなどの制御領域の制御下にある。
る配列は、例えば、ヒトU6核内低分子プロモーター、またはヒトH1プロモーターなど
の本明細書に記載される制御領域(例えば、プロモーター)の制御下にあり得る。一実施
形態では、例えば、Cas9分子をコードする核酸などのそれが負に制御する構成要素を
コードする配列は、例えば、ヒトU6核内低分子プロモーター、ヒトH1プロモーター、
またはPolIIプロモーター、例えば、CMVプロモーター、CAGGSプロモーター
、またはCBプロモーターなどの本明細書に記載される制御領域(例えば、プロモーター
)の御下にあり得る。
とは意図されない。
reus)Cas9を標的化する支配gRNA配列のコンピュータシミュレーションによ
る設計>
S.ピオゲネス(S.pyogenes)およびS.アウレウス(S.aureus)
Cas9を標的化する支配ガイドRNA(gRNA)が、DNA配列探すアルゴリズムを
使用して同定された。PAM配列に隣接する可能なgRNA部位を同定するのに加えて、
ソフトウェアはまた、ヒトゲノム中の選択されたgRNA部位から、1、2、3つ以上の
ヌクレオチドが異なる、全てのPAM隣接配列も同定する。各Cas9遺伝子のゲノムの
DNA配列は、UCSCゲノムブラウザから得られ、配列は、一般に利用可能なRepe
atMaskerプログラムを使用して、反復要素についてスクリーニングされる。Re
peatMaskerは、反復要素および低複雑度領域について、インプットDNA配列
を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
直交性および5’Gの存在(PAMを含有するヒトゲノム中の近いマッチの同定に基づく
)に基づいて、階層に格付けされた。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを
含有するヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「優れた直交性」は
、例えば、ヒトゲノム中に意図される標的以外の同一配列を有さず、または標的配列中に
1つまたは2つのミスマッチを含有する任意の配列を有さない、20量体gRNAを指し
てもよい。優れた直交性がある標的化ドメインが選択されて、オフターゲットDNA切断
が最小化される。
交性を有し、5’Gで開始する全てのgRNAを含む。階層2は、Cas9のコード配列
の最初の500ヌクレオチドqを標的化して、優れた直交性を有するが、5’Gで開始し
ない全てのgRNAを含む。階層3は、Cas9のコード配列の最初の500ヌクレオチ
ドを標的化して、直交性に劣り、5’Gで開始する全てのgRNAを含む。階層4は、C
as9のコード配列の最初の500ヌクレオチドqを標的化して、直交性に劣るが、5’
Gで開始しない全てのgRNAを含む。階層5は、残りのコード配列を標的化する全ての
gRNAを含む。S.アウレウス(S.aureus)の場合、それらの標的がNNGR
RVの非最適PAMを有する全てのgRNAを含む、第6の階層がある。
RNAが設計された。全てのS.アウレウス(S.aureus)標的で、20量体gR
NAが設計された。単一gRNAヌクレアーゼ切断および二重gRNA対形成「ニッカー
ゼ」ストラテジーの双方で、gRNAが同定された。設計された支配gRNAは、表E-
1~E-12に収載されている。
入されたCas9を標的化する支配gRNAの有効性>
この試験では、293T細胞(24ウェルプレート内のウェルあたり120,000個
の細胞)が、VEGF遺伝子(gRNA配列GGTGAGUGAGUGUGUGCGUG
(配列番号1510)を標的化するgRNAを発現する125ngのコンストラクト共に
、エピトープ標識(3×フラグ標識)S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9
を発現する750ngのプラスミドで形質移入され、Fu et al,Improvi
ng CIRSPR-Cas nuclease specificity using
truncated guide RNAs.Nat Biotechnol,32,
279-284(2014))の図1dからのVEGFA部位3(標的部位3)の20量
体を参照されたい。同時に、細胞は、(対照としての)CCR5遺伝子を標的化するgR
NAを発現するコンストラクト、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9を標
的化する支配gRNA抗SPCas9-175(実施例1を参照されたい)を発現するコ
ンストラクト、またはS.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9を標的化する支
配gRNA抗SPCas9-1(実施例1を参照されたい)を発現するコンストラクトの
3つのgRNA発現コンストラクトの1つ(125ng)で形質移入された。細胞は、形
質移入の1日、2日、3日、6日および9日後に、分析のために収集された。
全ゲノムDNAが各時点で単離され、配列を標的化するVEGF gRNAおよびCas
9支配gRNAを包含する領域が、PCRによって増幅された。増幅PCR産物は、変性
および再アニールされ、T7E1ヌクレアーゼによる処理がそれに続いた。変異率(イン
デル頻度)は、Reyon,D.et al,FLASH assembly of T
ALENs for high-throughput genome editing
.Nat Biotechnol 30,460-465(2012)に記載されるよう
にして、キャピラリー電気泳動法装置を使用して測定された。3つの処置群のVEGFお
よびCas9の変異頻度(%インデル±標準偏差)は、表E-13に示される。これらの
結果は、同時形質移入Cas9標的化支配gRNAの存在または不在下で、Cas9標的
化支配gRNAの双方がCas9遺伝子の変異を誘導し、内在性VEGF遺伝子座が同程
度に変異されることを立証する。
物が、各処置群から各時点で調製された。タンパク質サンプル(15μg)がSDS-P
AGEによって分離されて、PVDF膜にブロットされ、3×Flagエピトープタグに
対して特異的な抗体によってプローブされた。細胞骨格アクチンに対して特異的な抗体が
、ローディング対照として使用された。図7に示されるように、Cas9標的化される支
配gRNAのそれぞれによる同時形質移入は、特に、形質移入後6日および9日目に、C
as9タンパク質のレベル低下をもたらす。
この試験では、GFPを安定して発現するHEK-293T細胞が、S.アウレウス(
S.aureus)Cas9を発現するコンストラクトと共に、様々な長さ(15~20
ヌクレオチド)の標的ドメインがあるgRNAを発現するコンストラクトで、同時形質移
入された。gRNAは、VEGF(合計22gRNA)、CCR5(合計15gRNA)
、およびGFP(合計10gRNA)のいくつかの異なる遺伝子を標的化した。試験され
た全てのgRNAの標的ドメインはGヌクレオチドで開始され、全てのgRNA標的部位
は、NNGRRT PAM配列と結合した。
2日目に、細胞から全ゲノムDNAが単離され、VEGFおよびCCR5 gRNA標的
部位を包含する領域が、PCRによって増幅された。増幅PCR産物は、変性および再ア
ニールされ、T7E1ヌクレアーゼによる処理がそれに続いた。変異率(インデル頻度)
は、Reyon,D.et al.,FLASH assembly of TALEN
s for high-throughput genome editing.Nat
Biotechnol,30,460-465(2012)に記載されるようにして、
キャピラリー電気泳動法装置を使用して測定された。GFP標的化gRNAの活性を定量
化するために、形質移入に続いて3日目に細胞が収集されて、GFP陰性細胞(GFP遺
伝子の変異を示す)の百分率が、フローサイトメトリーによって測定された。各標的化ド
メイン長の全てのgRNAの平均活性が計算され、20ヌクレオチド標的化ドメインがあ
るgRNAの平均活性と比較された。表E-14に示されるように、より短い標的化ドメ
インがあるgRNAは、20ヌクレオチド標的化ドメインがあるものよりも、低い平均活
性を有する。
全本明細書で言及される全ての文献、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物
、特許または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかの
ように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書の任
意の定義をはじめとして、本出願が優先される。
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形
態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。本発明は、特定の態
様を参照して開示された一方で、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、他
の当業者によって、本発明のその他の態様および多様性が考案されてもよいことは明らか
である。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような外観および同等の多様性を含むもの
と解釈されることが意図される。
Claims (30)
- (a)Cas9分子をコードする核酸および第1のガイドRNA(gRNA)分子をコードする核酸、ならびに、
(b)前記Cas9分子をコードする前記核酸を標的とするヌクレオチド配列標的化ドメインを含む支配gRNA分子であって、前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが15~30ヌクレオチド長である、支配gRNA分子
を含む組成物であって、
(i)前記第1のgRNA分子が、標的核酸を標的化する配列を含み、
(ii)前記支配gRNA分子が、前記Cas9分子をコードする前記核酸を標的とする配列を含み、かつ、
(iii)前記支配gRNA分子の前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが:
前記第1のgRNA分子をコードする前記核酸において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記核酸配列の前記Cas9分子-アミノ酸コード配列中において、または前記第1のgRNA分子をコードする前記核酸のgRNA分子コード配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記Cas9分子をコードする前記核酸の非コード配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記Cas9分子をコードする前記核酸の非翻訳配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域の5’において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域の3’において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域のプロモーター領域中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメインであって、前記プロモーター領域が、前記Cas9分子アミノ酸コード領域と機能的に連結されているヌクレオチド配列標的化ドメイン;および
前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域のイントロン配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン
からなる群から選択される、組成物。 - 前記支配gRNA分子の前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが、前記核酸配列の前記Cas9分子-アミノ酸コード配列中において、または前記第1のgRNA分子をコードする前記核酸のgRNA分子コード配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメインである、請求項1に記載の組成物。
- 前記支配gRNA分子の前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが、前記Cas9分子をコードする前記核酸の非コード配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメインである、請求項1に記載の組成物。
- 前記支配gRNA分子の前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが、前記Cas9分子をコードする前記核酸の非翻訳配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメインである、請求項1に記載の組成物。
- 前記支配gRNA分子の前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが、前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域の5’において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメインである、請求項1に記載の組成物。
- 前記支配gRNA分子の前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが、前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域の3’において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメインである、請求項1に記載の組成物。
- 前記支配gRNA分子の前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが、前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域のプロモーター領域中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメインであって、前記プロモーター領域が、前記Cas9分子アミノ酸コード領域と機能的に連結されているヌクレオチド配列標的化ドメインである、請求項1に記載の組成物。
- 前記支配gRNA分子の前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが、前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域のイントロン配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメインである、請求項1に記載の組成物。
- 前記支配gRNAが、前記Cas9分子をコードする前記核酸中の天然起源の配列を標的とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1のgRNA分子がキメラgRNAである、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1のgRNA分子がモジュラーgRNAである、請求項1に記載の組成物。
- 前記Cas9分子をコードする前記核酸が、第1のベクターによって送達される、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1のgRNA分子をコードする前記核酸が、第2のベクターによって送達される、請求項12に記載の組成物。
- Cas9分子をコードする第1の核酸、ならびに、
前記Cas9分子をコードする前記第1の核酸を標的とするヌクレオチド配列標的化ドメインを含む支配gRNA分子であって、前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが15~30ヌクレオチド長である支配gRNA分子をコードする第2の核酸
を含み、
前記支配gRNA分子の前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが:
前記核酸配列の前記Cas9分子-アミノ酸コード配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記Cas9分子をコードする前記核酸の非コード配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記Cas9分子をコードする前記核酸の非翻訳配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域の5’において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域の3’において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン;
前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域のプロモーター領域中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメインであって、前記プロモーター領域が、前記Cas9分子アミノ酸コード領域と機能的に連結されているヌクレオチド配列標的化ドメイン;および
前記Cas9分子をコードする前記核酸のCas9分子コード領域のイントロン配列中において、Cas9分子が媒介する切断事象を提供するヌクレオチド配列標的化ドメイン
からなる群から選択される、組成物。 - 前記細胞または対象のゲノム中の配列を標的化するgRNA分子、および、前記細胞のゲノム中の配列を標的化するgRNA分子をコードする核酸の少なくとも1つをさらに含む、請求項14に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが、Cas9分子をコードする前記第1の核酸に組み込まれた核酸配列を標的とする、請求項14に記載の組成物。
- Cas9をコードする第1の核酸、
ゲノム中の配列に標的化された第1のガイドRNA(gRNA)をコードする第2の核酸、および、
前記Cas9をコードする前記核酸に標的化された支配gRNAをコードする第3の核酸であって、前記支配gRNAが15~30ヌクレオチド長のヌクレオチド配列標的化ドメインを含む、第3の核酸
を含む組成物。 - 前記第1の核酸が、第1のベクターによって送達される、請求項17に記載の組成物。
- 前記第2の核酸が、第2のベクターによって送達される、請求項18に記載の組成物。
- 前記Cas9をコードする前記核酸と支配gRNAをコードする前記核酸とが同一ベクターによって送達される、請求項17に記載の組成物。
- (a)真核細胞の核酸を標的とする第1のガイドRNA(gRNA)分子をコードする核酸、ならびに、
(b)Cas9分子および支配gRNA分子をコードする核酸
を含む組成物であって、前記支配gRNA分子が、
(i)前記Cas9分子をコードする前記核酸、または、
(ii)前記第1のgRNA分子をコードする前記核酸
を標的とするヌクレオチド配列標的化ドメインを含み、ここで、前記支配gRNAが(i)または(ii)を標的とする配列を有し、前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが15~30ヌクレオチド長である、組成物。 - 前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが、(i)または(ii)に組み込まれた核酸配列を標的とする、請求項21に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが17~30ヌクレオチド長である、請求項1に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが17~30ヌクレオチド長である、請求項14に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが17~30ヌクレオチド長である、請求項17に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが17~30ヌクレオチド長である、請求項21に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが20~30ヌクレオチド長である、請求項1に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが20~30ヌクレオチド長である、請求項14に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが20~30ヌクレオチド長である、請求項17に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが20~30ヌクレオチド長である、請求項21に記載の組成物。
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