JP2021192615A - ＣＲＩＳＰＲ関連方法および支配ｇＲＮＡのある組成物 - Google Patents

ＣＲＩＳＰＲ関連方法および支配ｇＲＮＡのある組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】標的核酸にペイロードを標的化しまたは標的核酸を編集するのに有用な方法および組成物を提供する。【解決手段】（ａ）Ｃａｓ９分子をコードする核酸および第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をコードする核酸、ならびに、（ｂ）前記第１のｇＲＮＡ分子をコードする前記核酸を標的とするヌクレオチド配列標的化ドメインを含む支配ｇＲＮＡ分子であって、前記ヌクレオチド配列標的化ドメインが１５〜３０ヌクレオチド長である、支配ｇＲＮＡ分子を含む組成物を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、その内容全体を参照により本明細書に援用する、２０１３年１１月７日に出
願された、米国仮特許出願第６１／９０１，２１５号明細書の優先権を主張する。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連方法と、標的核酸配列へのペイロードの送達、または標的
核酸配列の編集のための構成要素とに関する。
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ
Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ：規則的な間隔をもってクラスタ
ー化された短鎖反復回文配列）は細菌中で発達し、ウイルスの攻撃から防御する適応性免
疫系である。ウイルスへの曝露に際して、ウイルスＤＮＡの短い断片がＣＲＩＳＰＲ遺伝
子座に組み込まれる。ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の部分から、ＲＮＡが転
写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含有するＲＮＡは、ウイルスゲノム中の標的
配列へのＣａｓ９タンパク質の標的化を媒介する。Ｃａｓ９タンパク質は、ウイルス標的
を切断することで、その発現を消失させる。
最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、真核細胞内のゲノム編集のために応用されて
いる。部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入は、非相同末端結合非（ＮＨＥＪ）または
相同指向修復（ＨＤＲ）のどちらかの２つの内在性ＤＮＡ修復機構の１つを通じた、標的
配列改変を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはまた、標的配列を改変しない、
転写の抑制および活性化をはじめとする遺伝子制御のために利用されている。ＣＲＩＳＰ
Ｒ／Ｃａｓシステムに基づく標的化遺伝子制御は、酵素的に不活性なＣａｓ９（触媒不活
性型Ｃａｓ９としてもまた知られている）を使用する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを真核細胞内のゲノム編集に応用する最近の進歩にもか
かわらず、真核細胞での利用のために、これらのシステムの改善された制御および調節に
対する必要性がなおも存在する。
本明細書では、特定位置の標的ＤＮＡを標的化するのに使用し得る方法と、例えば、ｇ
ＲＮＡ分子と複合体形成したＣａｓ９分子などの組成物とが開示される。開示される方法
および組成物で使用されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に応じて、標的核酸の特定
の編集またはペイロードの送達が実施され得る。
例えば、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡなどの核酸を使用しまた
はそれを含む、方法および組成物は、「支配（ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ）ｇＲＮＡ分子」をさ
らに使用し、またはそれを含み得る。支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子と複合体形成し
て、Ｃａｓ９システムの構成要素を不活性化またはサイレンシングすることができる。一
態様では、本開示は、Ｃａｓ９システムの構成要素を標的とする標的化ドメインを含む、
本明細書で支配ｇＲＮＡ分子と称されるｇＲＮＡ分子を特徴とする。一実施形態では、支
配ｇＲＮＡ分子は、以下を標的化してサイレンシングする。（１）Ｃａｓ９分子をコード
する核酸（すなわち、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子）、（２）ｇＲＮＡ分子をコードする
核酸（すなわち、ｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子）、または（３）細胞内のその他の核酸配
列に対する相同性が最小でオフターゲット切断を最小化するように設計された、Ｃａｓ９
構成要素に組み込まれた核酸配列（すなわち、操作された制御配列標的化ｇＲＮＡ分子）
。
支配ｇＲＮＡの標的化配列は、Ｃａｓ９システムの制御または調節を増大させ、および
／またはオフターゲット効果を低下させまたは最小化するように選択され得る。例えば、
支配ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子をコードする核酸を不活性化（例えば、切断）することで
、例えば、標的核酸のＣａｓ９媒介改変後の「再切断」、またはＣａｓ９のオフターゲッ
ト切断などの望ましくない切断を最小化し得る。一実施形態では、支配ｇＲＮＡは、Ｃａ
ｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の発現または活性レベルに、時間的制限またはその他の制
限を設ける。一実施形態では、支配ｇＲＮＡは、オフターゲットまたはその他の望まれな
い作用を低下させる。
支配ｇＲＮＡの標的配列は、Ｃａｓ９コード配列の調節領域またはコード領域に配置さ
れ得る。これは、例えば、低下または最小化されたオフターゲット効果のために選択され
、またはそれをもたらす配列などのＣａｓ９配列または非Ｃａｓ９配列であり得る。サイ
レンシングまたは不活性化は、標的核酸配列を切断することにより、または標的核酸配列
にＣａｓ９分子／支配ｇＲＮＡ分子複合体を結合させることにより、もたらされ得る。
一態様では、本開示は、Ｃａｓ９分子を標的化して、任意選択的に不活性化するｇＲＮ
Ａ分子を特徴とする。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子をコードする核酸
配列を標的化する。例えば、Ｃａｓ９分子をコードする配列は、Ｃａｓ９分子のアミノ酸
配列をコードする配列、非翻訳配列を含むＣａｓ９分子のアミノ酸配列をコードする配列
、または非転写配列を含むＣａｓ９分子のアミノ酸配列をコードする配列の１つまたは複
数を含み得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子はｅａＣａｓ９分子である。別の実施形態では、Ｃａｓ
９分子はｅｉＣａｓ９分子である。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列中におけるＣａｓ９
分子が媒介する切断事象を提供するように構成される。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は
、Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列中における、Ｃａｓ９分子が媒介する切断事象を提
供するように構成される標的化ドメインを含む。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、
核酸配列のＣａｓ９分子−アミノ酸コード配列を標的化する、
核酸配列のＣａｓ９分子−アミノ酸コード配列中においてＣａｓ９分子が媒介する切断
事象を提供するように構成される、または
核酸配列のＣａｓ９分子−アミノ酸コード配列中においてＣａｓ９分子が媒介する切断
事象を提供するように構成される標的化ドメインを含む。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、
核酸配列の非コード配列を標的化する、
核酸配列の非コード配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するように
構成される、または
核酸配列の非コード配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するように
構成される標的化ドメインを含む。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、
核酸配列の非翻訳配列を標的化する、
核酸配列の非翻訳配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するように構
成される、または
核酸配列の非翻訳配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するように構
成される標的化ドメインを含む。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、
Ｃａｓ９分子−アミノ酸コード領域の５’核酸配列を標的化する、
Ｃａｓ９分子−コード領域の５’核酸配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象
を提供するように構成される、または
Ｃａｓ９分子−コード領域の５’ 核酸配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事
象を提供するように構成される標的化ドメインを含む。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、
Ｃａｓ９分子−コード領域の３’のＣａｓ９分子をコードする核酸配列を標的化する、
Ｃａｓ９分子−コード領域の３’核酸配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象
を提供するように構成される、または
Ｃａｓ９分子−コード領域の３’ 核酸配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事
象を提供するように構成される標的化ドメインを含む。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、
核酸配列のプロモーター領域を標的化する、
核酸配列のプロモーター領域中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するよ
うに構成される、または
核酸配列のプロモーター領域中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するよ
うに構成される標的化ドメインを含み、
ここでプロモーター領域は、Ｃａｓ９分子アミノ酸コード領域と機能的に連結する。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、
核酸配列のＣａｓ９分子イントロン配列を標的化する、
核酸配列のＣａｓ９分子イントロン配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を
提供するように構成される、または
核酸配列のＣａｓ９分子イントロン配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を
提供するように構成される標的化ドメインを含む。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９
分子である。別の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）
のＣａｓ９分子である。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、表Ｅ１〜Ｅ６から選択される。別の実施形態では、
ｇＲＮＡ分子は、表Ｅ７〜Ｅ１２から選択される。
一実施形態では、ｇＲＮＡはキメラｇＲＮＡである。別の実施形態では、ｇＲＮＡはモ
ジュラーｇＲＮＡである。
一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９システム構成要素を負制御するために
、コード配列、または例えば、プロモーターなどの制御領域を標的化する。例えば、ｇＲ
ＮＡは、Ｃａｓ９のコード配列を、または例えば、Ｃａｓ９コード配列の発現を制御する
プロモーターなどの制御領域を標的化し得る。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化
ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸は、例えば、Ｃａｓ９分子
またはそれをコードする核酸よりも後に、別途導入される。例えば、ＡＡＶベクターのよ
うなウイルスベクターなどの第１のベクターが、Ｃａｓ９と１つまたは複数のｇＲＮＡと
をコードする核酸を導入し得、例えば、ＡＡＶベクターのようなウイルスベクターなどの
第２のベクターが、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコー
ドする核酸を導入し得る。第２のベクターは、第１のベクターの後に導入され得る。一実
施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡまたはそれをコー
ドする核酸は、例えば、同時にまたは同一ベクター内で、Ｃａｓ９分子またはそれをコー
ドする核酸と共に導入され得るが、それは、例えば、しばらくするとＣａｓ９の転写が停
止されるように、例えば、後から活性化されるプロモーターまたはエンハンサーなどの転
写制御要素下にある。一実施形態では、転写制御因子は、内因的に活性化される。一実施
形態では、転写要素は、外部トリガーの導入を通じて活性化される。
一態様では、本開示は、支配ｇＲＮＡ分子をコードする配列を含む核酸を特徴とする。
一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子を含む。一実施
形態では、核酸は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子をコードする配列を含む。一実施
形態では、核酸は精製される。
別の態様では、本開示は、
ａ）例えば、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子標的化ｇＲＮＡ分子
などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする、第１の核酸配列、および
ｂ）例えば、ｅａＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子をコードする第
２の核酸配列
を含む、１つまたは複数のＡＡＶベクターのような１つまたは複数のウイルスベクターな
どの１つまたは複数のベクターなどの核酸を特徴とする。
一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子を含む。別の
実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子標的化ｇＲＮＡ分子を含む。
一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子を含み、Ｃａ
ｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子をコードする第２の核酸配列を標的化する
。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子はｅａＣａｓ９分子である。別の実施形態では、Ｃａｓ
９分子はｅｉＣａｓ９分子である。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、第２の核酸配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する
切断事象を提供するように構成される。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、第２の核酸配
列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するように構成される標的化ドメイ
ンを含む。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子であり
、第２の核酸配列を標的化する。
一実施形態では、核酸は精製される。
一実施形態では、例えば、同一ＡＡＶベクターのような同一ウイルスベクターなどの同
一ベクターである、同一核酸上に、構成要素ａ）および構成要素ｂ）が提供される。別の
実施形態では、例えば、異なるＡＡＶベクターのような異なるウイルスベクターなどの異
なるベクターである、異なる核酸上に、構成要素ａ）および構成要素ｂ）が提供される。
一実施形態では、核酸は、前記核酸から転写されるＣａｓ９分子標的化ｇＲＮＡが、前
記核酸から生成されたＣａｓ９分子と複合体を形成するように構成される。
一実施形態では、前記複合体は、例えば、前記Ｃａｓ９分子配列を含むまたはコードす
る核酸配列を切断することで、不活性化またはサイレンシングする能力がある。一実施形
態では、不活性化するステップが、切断するステップを含む。
一実施形態では、前記第１の核酸配列は、例えば、プロモーターなどの第１の制御領域
の制御下にあり、前記第２の核酸配列は、例えば、プロモーターなどの第２の制御領域の
制御下にあり、例えば、プロモーターなどの前記第１および第２の制御領域は異なり、例
えば、１つは構成的プロモーターであり、１つは誘導性プロモーターである。
一実施形態では、前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列は、差次的に発現され
て、例えば、発現レベルに関してまたは時間的に差次的に発現され、例えば、第１の配列
は、前記第２の配列よりも遅く発現され、または第１の配列は前記第２の配列よりも低い
レベルで発現される。
一実施形態では、核酸は、
ｃ）例えば、第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子をコードし、標的核酸と相補的な標
的化ドメインを含む第３の核酸配列をさらに含み、例えば、その中で第２のｇＲＮＡはｂ
）を標的化しない。
一実施形態では、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−
１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩ
Ｉ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ
−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩＩで、本明細書に記載
される遺伝子または経路からの配列などの標的核酸が、本明細書で開示される。
一実施形態では、前記第１の核酸配列は、例えば、プロモーターなどの第１の制御領域
の制御下にあり、
前記第２の核酸配列は、例えば、プロモーターなどの前記第２の制御領域、または例え
ば、プロモーターなどの第３の制御領域の制御下にあり、
前記第３の核酸配列は、例えば、プロモーターなどの前記第２の制御領域、または例えば
、プロモーターなどの前記第３の制御領域の制御下にあり、
例えば、プロモーターなどの前記第１の制御領域は、例えば、プロモーターなどの前記第
２および／または前記第３の制御領域と異なる。
一実施形態では、前記第１の核酸配列および前記第３の核酸配列は差次的に発現され、
例えば、発現レベルに関してまたは時間的に差次的に発現されて、例えば、第１の配列は
、前記第３の配列よりも遅く発現され、または第１の配列は前記第３の配列よりも低いレ
ベルで発現される。
一実施形態では、核酸は、例えば、１つまたは複数の支配ｇＲＮＡによって認識される
５’および３’隣接領域配列を有する、テンプレート核酸（本明細書で同義的に交換核酸
配列と称される）をさらに含む。
一実施形態では、（例えば、本明細書に記載されるように支配ｇＲＮＡによって標的化
される）Ｃａｓ９分子配列またはｇＲＮＡ分子配列を含むまたはそれをコードする核酸配
列は、例えばＣａｓ９分子配列またはｇＲＮＡ分子配列を含むまたはそれをコードする核
酸配列から、（例えば、本明細書に記載される方法によって）切断または切除された後に
、例えば相同組換えのためのドナーＤＮＡとして、テンプレート核酸として利用されるこ
とができる核酸配列をさらに含む。一実施形態では、第１の支配ｇＲＮＡ分子は、テンプ
レート核酸配列を含む核酸配列の領域５’を標的化し、第２の支配ｇＲＮＡ分子は、テン
プレート核酸配列を含む核酸配列の領域３’を標的化する。例えば、少なくとも２つの（
例えば、２、３、４、５つ以上の）支配ｇＲＮＡを使用して、１つまたは複数の（例えば
、２、３、４つ以上の）テンプレート核酸が作成され得る。別の実施形態では、単一支配
ｇＲＮＡ分子は、テンプレート核酸配列を含む核酸配列の５’ 領域および３’ 領域の双
方を標的化する。例えば、テンプレート核酸配列を含む核酸配列の５’領域（例えば、支
配ｇＲＮＡ分子によって標的化される）は、テンプレート核酸配列を含む核酸配列の３’
領域（例えば、支配ｇＲＮＡ分子によって標的化される）と同一または実質的に同一であ
り得る。一実施形態では、テンプレート核酸配列を構成する核酸配列は、例えば、本明細
書に記載されるベクターなどのベクター内にある。一実施形態では、ベクターは、例えば
、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターである。
一態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸を含むベクターを特徴とする。一実
施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは
、ＡＡＶベクターである。
一態様では、本開示は、
ａ）例えば、本明細書に記載される支配ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子、または例
えば、本明細書に記載される核酸などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含む、医薬
組成物などの組成物を特徴とする。
一実施形態では、組成物は、
ｂ）例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子、または例えば、
本明細書に記載される核酸配列などのＣａｓ９分子をコードする核酸配列、
ｃ）第２のｇＲＮＡ分子または第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、または
ｄ）テンプレート核酸
の１つまたは複数（例えば、２つまたは全て）を含む。
一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子を含む。一実
施形態では、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子を含む
。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列中におけるＣａ
ｓ９分子が媒介する切断事象を提供するように構成される。
一実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９分子をコー
ドする核酸とを含む。別の実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子と
、Ｃａｓ９分子とを含む。
一実施形態では、組成物は、
ｃ）第２のｇＲＮＡ分子または第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸をさらに含む。
一実施形態では、第２のｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子を標的核酸に標的化する。
一実施形態では、組成物は、
ｄ）テンプレート核酸をさらに含む。
一実施形態では、組成物は、第２のｇＲＮＡまたは第２のｇＲＮＡをコードする核酸を
含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、第２のｇＲＮＡによって配置された切断の修復
を媒介するように構成される。
一実施形態では、ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）のそれぞれは、核酸として存在し、同
一核酸分子上でコードされる。一実施形態では、第１の配列は、ａ）、ｂ）、ｃ）、およ
びｄ）から選択され、第１の核酸分子上でコードされ、第２の配列は、ａ）、ｂ）、ｃ）
、およびｄ）から選択され、第２の核酸分子上でコードされる。
別の態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される核酸を含む医薬組成物などの
組成物を特徴とする。例えば、１つまたは複数のＡＡＶベクターのような１つまたは複数
のウイルスベクターなどの１つまたは複数のベクターなどの核酸は、
ａ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支
配ｇＲＮＡ分子をコードする第１の核酸配列、および
ｂ）例えば、ｅａＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子をコードする第
２の核酸配列
を含み得る。
一実施形態では、前記核酸は、ＡＡＶベクターを含む。
一態様では、本開示は、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇ
ＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡなどの核酸配列と、
ａ）Ｃａｓ９分子、
ｂ）第２のＣａｓ９分子、
ｃ）ｇＲＮＡ分子、および
ｄ）第２のｇＲＮＡ分子
の１つまたは複数とを含む、医薬組成物などの組成物を特徴とする。
一実施形態では、存在するａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）のそれぞれは、同一核酸分子
上でコードされる。一実施形態では、第１の配列は、ａ、ｂ、ｃ、およびｄから選択され
、第１の核酸分子上でコードされ、第２の配列は、ａ、ｂ、ｃ、およびｄから選択され、
第２の核酸分子上でコードされる。一実施形態では、前記核酸は、ｃ、ａ、ｃ、およびｄ
；またはａ、ｂ、ｃ、およびｄをコードする。
一態様では、本開示は、
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
を含む医薬品を特徴とする。
一態様では、本開示は、
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
を含む細胞を特徴とする。
一実施形態では、細胞は、
Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列と、ここで、前記Ｃａｓ９分子をコードする配列は
、Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列をコードする配列、非翻訳配列を含むＣａｓ９分子のアミ
ノ酸配列をコードする配列、および非転写配列を含むＣａｓ９分子のアミノ酸配列をコー
ドする配列の１つまたは複数を含んでよく、
支配ｇＲＮＡ分子と
を含み得る。
一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列を標的化す
るｇＲＮＡ分子を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるｇＲＮ
Ａ分子である。
一実施形態では、細胞は、Ｃａｓ９分子をさらに含む。
一実施形態では、細胞は、第２のｇＲＮＡ分子または第２のｇＲＮＡをコードする核酸
分子をさらに含む。一実施形態では、第２のｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子を標的核酸に標的
化する。
一実施形態では、細胞は、テンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプレ
ート核酸は、第２のｇＲＮＡ分子によって配置された標的核酸中の切断の修復を媒介する
ように構成される。
一実施形態では、細胞は、第２のｇＲＮＡ分子により媒介されたＣａｓ９分子の標的化
によって切断された、標的核酸を含む。
一実施形態では、細胞は、切断され修復された標的核酸を含む。一実施形態では、修復
は、テンプレート核酸により媒介された修復を含む。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列は、切断されていない。一実施形
態では、Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列は、Ｃａｓ９分子を発現し得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列は、Ｃａｓ９分子のｇＲＮＡによ
り媒介された標的化によって切断されている。一実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードす
る切断された核酸配列は、切断されていない同一分子と比較して、Ｃａｓ９分子を発現す
る能力が低下している。一実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする切断された核酸配列
は、Ｃａｓ９分子を実質的に発現できない。
一実施形態では、細胞は、
Ｃａｓ９分子をコードする切断された核酸配列、または
Ｃａｓ９分子が媒介する切断事象が修復されている標的核酸
の片方または双方を含む。
一実施形態では、細胞は、脊椎動物、哺乳類、齧歯類、ヤギ、ブタ、鳥類、ニワトリ、
シチメンチョウ、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、霊長類、またはヒト細胞である。
別の実施形態では、細胞は植物細胞である。一実施形態では、植物細胞は、単子葉植物
または双子葉植物である。
一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、体細胞、胚芽細胞
、または出生前細胞である。一実施形態では、細胞は、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、
幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コンピテント細胞である。
一態様では、本開示は、前記細胞を本明細書に記載される核酸に接触させるステップを
含む、細胞を改変する方法を特徴とし、例えば、細胞の標的核酸配列などの構造が改変さ
れる。例えば、１つまたは複数のＡＡＶベクターのような１つまたは複数のウイルスベク
ターなどの１つまたは複数のベクターなどの核酸は、
ａ）例えば、Ｃａｓ９を標的化するｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡを標的化するｇＲＮＡ
分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする第１の核酸配列、および
ｂ）例えば、ｅａＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子をコードする第
２の核酸配列
を含み得る。
一実施形態では、細胞は、哺乳類、霊長類、またはヒト細胞である。一実施形態では、
細胞は、例えば、セクションＶＩＩＡで、本明細書に記載される細胞などのヒト細胞であ
る。一実施形態では、細胞は、例えば、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、幹細胞、有糸分
裂コンピテント細胞、または減数分裂コンピテント細胞などの体細胞、胚芽細胞、出生前
細胞である。一実施形態では、標的核酸は染色体核酸である。
別の態様では、本開示は、細胞を
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
の有効量に接触させるステップを含む、細胞を改変する方法を特徴とし、例えば、細胞の
標的核酸配列などの構造が改変される。
一実施形態では、細胞は、脊椎動物、哺乳類、齧歯類、ヤギ、ブタ、鳥類、ニワトリ、
シチメンチョウ、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、霊長類、またはヒト細胞である。
別の実施形態では、細胞は植物細胞である。一実施形態では、植物細胞は、単子葉植物
または双子葉植物である。
一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、体細胞、胚芽細胞
、または出生前細胞である。一実施形態では、細胞は、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、
幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コンピテント細胞である。
一実施形態では、対象は、哺乳類、霊長類、またはヒトである。
一実施形態では、標的核酸は染色体核酸である。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸の有効量を対象に投与するステッ
プを含む、例えば標的核酸の配列を改変するなど構造を改変することで、対象を治療する
方法を特徴とする。例えば、１つまたは複数のＡＡＶベクターのような１つまたは複数の
ウイルスベクターなどの１つまたは複数のベクターなどの核酸は、
ａ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支
配ｇＲＮＡ分子をコードする第１の核酸配列、および
ｂ）例えば、ｅａＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子をコードする第
２の核酸配列
を含み得る。
一実施形態では、対象は、哺乳類、霊長類、またはヒトである。一実施形態では、標的
核酸は、例えば、セクションＶＩＩＡで、本明細書に記載される細胞などのヒト細胞の核
酸である。一実施形態では、標的核酸は、例えば、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、幹細
胞、有糸分裂コンピテント細胞、または減数分裂コンピテント細胞などの体細胞、胚芽細
胞、出生前細胞の核酸である。一実施形態では、標的核酸は染色体核酸である。
別の態様では、本開示は、細胞または対象を
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
の有効量に接触させるステップを含む、例えば、対象の細胞内で、標的核酸の構造を改変
するなど配列を改変することで、対象を治療する方法を特徴とする。
一実施形態では、細胞は、脊椎動物、哺乳類、齧歯類、ヤギ、ブタ、鳥類、ニワトリ、
シチメンチョウ、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、霊長類、またはヒト細胞である。
別の実施形態では、細胞は植物細胞である。一実施形態では、植物細胞は、単子葉植物
または双子葉植物である。
一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、体細胞、胚芽細胞
、または出生前細胞である。一実施形態では、細胞は、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、
幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コンピテント細胞である。
一実施形態では、対象は、哺乳類、霊長類、またはヒトである。
一実施形態では、標的核酸は染色体核酸である。
一態様では、本開示は、細胞と、
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
とを含む反応混合物を特徴とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される組成物と、例えば、本明細書に記載さ
れる細胞などの細胞とを含む反応混合物を特徴とする。
一態様では、本開示は、
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、
本明細書に記載される核酸、
本明細書に記載されるベクター、または
本明細書に記載される組成物
を含むキットを特徴とする。
一実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法における、ｇＲＮＡ分子、核酸
、ベクター、または組成物の使用説明書を含む。
別の態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される支配ｇＲＮＡ分子を含む医薬
組成物などの組成物を特徴とする。
一実施形態では、組成物は、例えば、ｅａＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａ
ｓ９分子をさらに含む。一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子はｅａＣａｓ９分子である。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子はｅｉＣａｓ９分子である。
一実施形態では、組成物は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩＩ−１３
、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−
１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ
−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩＩで、本明
細書に記載される遺伝子または経路からの配列などの本明細書で開示される標的核酸から
の標的配列と相補的な標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子をさらに含む。
別の態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子を含む医薬組成
物などの組成物を特徴とする。
一実施形態では、組成物は、例えば、ｅａＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａ
ｓ９分子をさらに含む。一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子はｅａＣａｓ９分子である。
別の実施形態では、前記Ｃａｓ９分子はｅｉＣａｓ９分子である。
一実施形態では、前記組成物は、例えば、セクションＶＩ中で、例えば、表ＶＩ−１、
ＶＩ−２、ＶＩ−３、ＶＩ−４、ＶＩ−５、またはＶＩ−６で、本明細書に記載されるペ
イロードなどのペイロードを含む。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、ＤＮＡまたはクロマチンを修飾する分子など
のエピジェネティックな修飾因子；例えば、セクションＶＩで、本明細書に記載されるエ
ピジェネティックな修飾因子のようなヒストンを修飾する分子などの構成要素；例えば、
セクションＶＩで、本明細書に記載される転写因子などの転写因子；転写活性化因子ドメ
イン；例えば、抗転写因子抗体、またはその他の阻害剤などの転写因子の阻害剤；小分子
；抗体；酵素；例えば、ヘリカーゼ、制限酵素、リガーゼ、またはポリメラーゼなどのＤ
ＮＡと相互作用する酵素；および／または例えば、リボザイム、またはｍＲＮＡ、ｓｉＲ
ＮＡのような酵素的に活性な核酸などのアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸を含む。
一実施形態では、組成物は、例えば、ｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子をさらに含む
。
一実施形態では、前記ペイロードは、例えば、ｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子と
、例えば、共有結合または非共有結合する。一実施形態では、前記ペイロードは、リンカ
ーによって前記Ｃａｓ９分子と結合する。一実施形態では、前記リンカーは、例えば、細
胞核条件などの生理学的条件下で切断可能な結合であり、またはそれを含む。一実施形態
では、前記リンカーは、例えば、セクションＸＩで、本明細書に記載される結合であり、
またはそれを含む。一実施形態では、前記リンカーは、エステル結合であり、またはそれ
を含む。一実施形態では、前記ペイロードは、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａ
ｓ９分子などのＣａｓ９分子に融合した、融合パートナーを含む。
一実施形態では、前記ペイロードは、ｇＲＮＡ分子と、例えば、共有結合または非共有
結合的する。一実施形態では、前記ペイロードは、リンカーによって前記ｇＲＮＡ分子と
結合する。一実施形態では、前記リンカーは、例えば、細胞核条件などの生理学的条件下
で切断可能な結合であり、またはそれを含む。一実施形態では、前記リンカーは、例えば
、セクションＸＩで、本明細書に記載される結合であり、またはそれを含む。一実施形態
では、前記リンカーは、エステル結合であり、またはそれを含む。
一実施形態では、組成物は、ｅａＣａｓ９分子を含む。一実施形態では、組成物は、標
的核酸中で二本鎖切断を形成するｅａＣａｓ９分子を含む。
一実施形態では、組成物は、標的核酸中で一本鎖切断を形成するｅａＣａｓ９分子を含
む。一実施形態では、前記一本鎖切断は、標的核酸の相補鎖中に形成される。一実施形態
では、前記一本鎖切断は、標的核酸の相補鎖でない鎖中に形成される。
一実施形態では、組成物は、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含むが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ド
メイン切断活性は有さず、または顕著に有しない。一実施形態では、組成物はＮ末端Ｒｕ
ｖＣ様ドメイン切断活性を含むが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性は有さず、または顕著に有
しない。
一実施形態では、前記二本鎖切断は、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０、４
０、５０、１００、１５０または２００ヌクレオチド以内である。一実施形態では、前記
一本鎖切断は、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５
０または２００ヌクレオチド以内である。
一実施形態では、組成物は、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプ
レート核酸などのテンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプレート核酸は
、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、
表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−
１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩ
Ｉ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶ
ＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、
１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも１ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと５、１０、２０または３０％以下が異
なる、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
一実施形態では、組成物は、例えば、本明細書に記載される第２のｇＲＮＡ分子などの
第２のｇＲＮＡ分子をさらに含む。
一実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、例えば、標的位
置の隣接領域などの、標的核酸中の異なる部位における切断を媒介する。一実施形態では
、前記ｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、同一標的鎖と相補的である。一実
施形態では、前記ｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、異なる標的鎖と相補的
である。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子は、二本鎖切断を媒介する。
一実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子に
よって生成される第１および第２の切断が、標的位置の隣接領域に位置するように構成さ
れる。一実施形態では、前記二本鎖切断は、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０
、４０、５０、１００、１５０または２００ヌクレオチド以内である。
一実施形態では、組成物は、テンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプ
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、
表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−
１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩ
Ｉ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶ
ＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、
１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片である。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも１ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと５、１０、２０または３０％以下が異
なる、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片
である。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子は、一本鎖切断を媒介する。
一実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、例えば、転写配
列の場合は、テンプレート鎖または非テンプレート鎖中などの同一標的核酸鎖中に、第１
および第２の切断が形成されるように構成される。
一実施形態では、前記第１および第２の切断は、標的位置の隣接領域に位置する。
一実施形態では、前記第１および第２の一本鎖切断の１つ、またはその双方は、独立し
て、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０または２
００ヌクレオチド以内にある。
一実施形態では、組成物は、テンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプ
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。一実施形態では
、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩＩ−１３、
ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１
９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−
１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩＩで、本明細
書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置のヌクレオチドに対
応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩ
Ｉ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、
ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、Ｉ
Ｘ−３、またはＸＩＩ−１中で、またはセクションＶＩＩＩ中で、本明細書に記載される
遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００
、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも１ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと５、１０、２０または３０％以下が異
なる、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
一実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、異なる標的鎖中
に、第１および第２の切断が形成されるように構成される。一実施形態では、前記第１お
よび第２の切断は、標的位置の隣接領域に位置する。一実施形態では、前記第１および第
２の一本鎖切断の１つ、またはその双方は、独立して、標的位置のヌクレオチドの１０、
２０、３０、４０、５０、１００、１５０または２００ヌクレオチド以内にある。
一実施形態では、組成物は、テンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプ
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、
表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−
１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩ
Ｉ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶ
ＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、
１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも１ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと５、１０、２０または３０％以下が異
なる、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
一実施形態では、組成物は、第２のＣａｓ９分子を含む。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子の片方または双方は
、ｅｉＣａｓ９分子である。一実施形態では、前記ｅｉＣａｓ９分子は、リンカーによっ
てペイロードと結合し、前記第２のｅｉＣａｓ９分子は、第２のリンカーによって第２の
ペイロードと結合する。
一実施形態では、前記ペイロードおよび前記第２のペイロードは同一である。一実施形
態では、前記ペイロードおよび前記第２のペイロードは異なる。一実施形態では、前記リ
ンカーおよび前記第２のリンカーは同一である。一実施形態では、前記リンカーおよび前
記第２のリンカーは異なり、例えば、異なる放出速度などの異なる放出特性を有する。
一実施形態では、前記ペイロードおよび前記第２のペイロードは、例えば、セクション
ＶＩで、例えば、表ＶＩ−１、ＶＩ−２、ＶＩ−３、ＶＩ−４、ＶＩ−５、またはＶＩ−
６で、それぞれ本明細書に記載される。一実施形態では、前記ペイロードおよび前記第２
のペイロードは相互作用し得て、例えば、それらはタンパク質のサブユニットである。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子の片方または双方は
、ｅａＣａｓ９分子である。
一実施形態では、前記ｅａＣａｓ９分子は第１の切断活性を含み、前記第２のｅａＣａ
ｓ９分子は第２の切断活性を含む。一実施形態では、前記切断活性および前記第２の切断
活性は同一であり、例えばどちもＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン活性であり、またはどちらも
ＨＮＨ様ドメイン活性である。一実施形態では、前記切断活性および前記第２の切断活性
は異なり、例えば、１つはＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン活性であり、１つはＨＮＨ様ドメイ
ン活性である。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は、異なるＰＡＭに
対して特異的であり、例えば、１つはＮＧＧに対して特異的であり、もう１つは例えば、
ＮＧＧＮＧ、ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）、またはＮＡＡＲ（（Ｒ）＝ＡまたはＧ
）に対して特異的である。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の前記
Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（（Ｒ）＝ＡまたはＧ）を認識して、例えば、
その配列から３〜５塩基対上流などの１〜１０塩基対上流の標的核酸配列の切断を誘導す
る。一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子の１つは、Ｓ．ア
ウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＰＡＭを認識する。一実施形態では、Ｎ．メニンジチデ
ィス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の前記Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＮＮＧ
ＡＴＴを認識して、例えば、その配列から３〜５塩基対上流などの標的核酸配列の１〜１
０塩基対上流の切断を誘導する。一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣ
ａｓ９分子の１つは、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰＡＭを
認識する。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子の双方は、二本鎖切
断を媒介する。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は、異なるＰＡＭに
対して特異的であり、例えば、１つはＮＧＧに対して特異的であり、もう１つは例えば、
本明細書に記載されるＰＡＭなどの別のＰＡＭに対して特異的である。一実施形態では、
前記ｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、第１および第２の切断が、標的位置
の隣接領域に位置するように構成される。一実施形態では、前記第１および第２の二本鎖
切断の１つ、またはその双方は、独立して、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０
、４０、５０、１００、１５０または２００ヌクレオチド以内にある。
一実施形態では、組成物は、テンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプ
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、前記テンプレート核酸は、例えばセクションＶＩＩＢで、例えば、表
ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１
８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ
−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、ＸＩＩ−１、またはセクションＶＩＩＩ中で
、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置のヌクレオ
チドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、
１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも１ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと５、１０、２０または３０％以下が異
なる、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子の１つは二本鎖切断
を媒介し、もう１つは一本鎖切断を媒介する。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は、異なるＰＡＭに
対して特異的であり、例えば、１つはＮＧＧに対して特異的であり、もう１つは例えば、
本明細書に記載されるＰＡＭなどの別のＰＡＭに対して特異的である。一実施形態では、
前記ｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、第１および第２の切断が、標的位置
の隣接領域に位置するように構成される。一実施形態では、前記第１および第２の切断は
、標的位置の隣接領域に位置する。一実施形態では、前記第１および第２の切断の１つ、
またはその双方は、独立して、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０、４０、５０
、１００、１５０または２００ヌクレオチド以内にある。
一実施形態では、組成物は、テンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプ
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、
表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−
１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩ
Ｉ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶ
ＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、
１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも１ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと５、１０、２０または３０％以下が異
なる、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子の双方は、一本鎖切
断を媒介する。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は、異なるＰＡＭに
対して特異的であり、例えば、１つはＮＧＧに対して特異的であり、もう１つは例えば、
本明細書に記載されるＰＡＭなどの別のＰＡＭに対して特異的である。一実施形態では、
前記第１および第２の切断は、標的位置の隣接領域に位置する。
一実施形態では、前記第１および第２の一本鎖切断の１つ、またはその双方は、独立し
て、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０または２
００ヌクレオチド以内にある。
一実施形態では、組成物は、テンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプ
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、
表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−
１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩ
Ｉ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶ
ＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、
１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも１ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと５、１０、２０または３０％以下が異
なる、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
一実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子は、第１および第２の切
断が、同一鎖中にあるように構成される。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は、異なるＰＡＭに
対して特異的であり、例えば、１つはＮＧＧに対して特異的であり、もう１つは例えば、
本明細書に記載されるＰＡＭなどの別のＰＡＭに対して特異的である。一実施形態では、
前記ｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子は、第１および第２の切断が、標的位置の隣
接領域に位置するように構成される。一実施形態では、前記第１および第２の一本鎖切断
の１つ、またはその双方は、独立して、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０、４
０、５０、１００、１５０または２００ヌクレオチド以内にある。
一実施形態では、組成物は、テンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプ
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、
表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−
１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩ
Ｉ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶ
ＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、
１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なく
とも１ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと５、１０、２０または３０％以下が異
なる、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片
であり、またはそれを含む。
一実施形態では、前記第１および第２の切断は、異なる鎖上にある。
一実施形態では、前記Ｃａｓ９分子および前記第２のＣａｓ９分子は、異なるＰＡＭに
対して特異的であり、例えば、１つはＮＧＧに対して特異的であり、もう１つは例えば、
本明細書に記載されるＰＡＭなどの別のＰＡＭに対して特異的である。一実施形態では、
前記ｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子は、第１および第２の切断が、異なる鎖上に
あるように構成される。
一実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子は、第１および第２の切
断が、標的位置の隣接領域に位置するように構成される。一実施形態では、前記第１およ
び第２の切断は、標的位置の隣接領域に位置する。
一実施形態では、前記第１および第２の一本鎖切断の１つ、またはその双方は、独立し
て、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０または２
００ヌクレオチド以内にある。
一実施形態では、組成物は、テンプレート核酸をさらに含む。一実施形態では、テンプ
レート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、
表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−
１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩ
Ｉ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶ
ＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、
１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えばセクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩ
Ｉ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、
ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２
４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１、またはセクションＶＩＩＩ中
で、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なくと
も１ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと５、１０、２０または３０％以下が異な
る、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片で
あり、またはそれを含む。
さらに別の態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Ｃａｓ９標的化ｇＲ
ＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子、ｇＲＮＡ分子、および第２のｇＲＮＡ分子
などの支配ｇＲＮＡ分子を含む、医薬組成物などの組成物を特徴とする。
一実施形態では、組成物は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子をコードする
、ＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの核酸をさらに含む。一実施形態では、組成物は、例えば、
本明細書に記載される第２のＣａｓ９分子をコードする、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸
をさらに含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるテンプレート核酸をさ
らに含む。
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子
またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子、および１つまたは複数のｇＲＮＡ分子のような支配
ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡなどの核酸配列を含む、医薬組成物などの組成物を特徴
とする。
一実施形態では、前記核酸は、本明細書に記載されるプロモーターなどのｇＲＮＡ分子
をコードする配列と作動可能に連結する、プロモーターを含む。
一実施形態では、前記核酸は、本明細書に記載される第２のプロモーターなどのｇＲＮ
Ａ分子をコードする配列と作動可能に連結する、第２のプロモーターを含む。一実施形態
では、プロモーターおよび第２のプロモーターは、異なるプロモーターである。一実施形
態では、プロモーターおよび第２のプロモーターは同一である。
一実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子をさらにコードする。一
実施形態では、核酸は、本明細書に記載される第２のＣａｓ９分子をさらにコードする。
一実施形態では、前記核酸は、本明細書に記載されるプロモーターなどのＣａｓ９分子
をコードする配列と作動可能に連結する、プロモーターを含む。
一実施形態では、前記核酸は、本明細書に記載されるプロモーターなどのＣａｓ９分子
をコードする配列と作動可能に連結する、第２のプロモーターを含む。一実施形態では、
プロモーターおよび第２のプロモーターは、異なるプロモーターである。一実施形態では
、プロモーターおよび第２のプロモーターは同一である。
一実施形態では、組成物は、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプ
レート核酸などのテンプレート核酸をさらに含む。
別の態様では、本開示は、例えば、ａ）Ｃａｓ９分子、ｂ）第２のＣａｓ９分子、ｃ）
ｇＲＮＡ分子、ｄ）第２のｇＲＮＡ分子、およびｅ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分
子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列の１
つまたは複数を含む、医薬組成物などの組成物を特徴とする。
一実施形態では、存在するａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、およびｅ）のそれぞれは、同一核
酸分子上でコードされる。
一実施形態では、第１の配列は、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、およびｅ）から選択され、
第１の核酸分子上でコードされ、第２の配列は、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、およびｅ）か
ら選択され、第２の核酸分子上でコードされる。
一実施形態では、前記核酸は、ａ）、ｃ）、およびｅ）；ａ）、ｃ）、ｄ）、およびｅ
）；またはａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、およびｅ）をコードする。
一実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９分子をさらに含み、例えば、Ｃａｓ９分子の１つ
または複数を含み、前記核酸はＣａｓ９分子をコードしない。
一実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９分子をコードするｍＲＮＡをさらに含み、例えば
、Ｃａｓ９分子の１つまたは複数をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含み、前記核
酸はＣａｓ９分子をコードしない。
一実施形態では、組成物は、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプ
レート核酸などのテンプレート核酸をさらに含む。
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸を特徴とする。
一態様では、本開示は、ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲ
ＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）；ｂ）ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅ
ａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａｓ９分子などのｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）；およ
びｃ）任意選択的に、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート核
酸などのテンプレート核酸を含む組成物を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇ
ＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）；ｂ）例えば、ｅａＣａｓ９分子（または
例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａｓ９分子などのｅａＣａｓ９分子の組み合わ
せ）をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの核酸；ｃ）任意選択的に、例えば、セクシ
ョンＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート核酸などのテンプレート核酸；およびｄ
）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子を含む組成物を特徴とす
る。
別の態様では、本開示は、ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と
第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの核酸；
ｂ）ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａｓ９分子など
のｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）；ｃ）任意選択的に、例えば、セクションＩＶで、本
明細書に記載されるテンプレート核酸などのテンプレート核酸；およびｄ）例えば、ｇＲ
ＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。
なおも別の態様では、本開示は、ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ
分子と第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの
核酸；ｂ）例えば、ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣ
ａｓ９分子などのｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡな
どの核酸（ここでｇＲＮＡ分子をコードする核酸およびｅａＣａｓ９分子をコードする核
酸は、同一であるかまたは異なる分子であり得る）；ｃ）任意選択的に、例えば、セクシ
ョンＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート核酸などのテンプレート核酸；およびｄ
）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇ
ＲＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。
一態様では、本開示は、
１）ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲ
ＮＡ分子の組み合わせ）、
ｂ）ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａｓ９分子
などのｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）、および
ｃ）任意選択的に、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸
を含む組成物；
２）ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲ
ＮＡ分子の組み合わせ）、
ｂ）例えば、ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａ
ｓ９分子などのｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡなど
の核酸、および
ｃ）任意選択的に、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸、および
ｄ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子
を含む組成物；
３）ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子な
どのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの核酸、
ｂ）ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａｓ９分子
などのｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）、および
ｃ）任意選択的に、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸、および
ｄ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの
支配ｇＲＮＡ分子
を含む組成物；および／または
４）ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子な
どのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの核酸、
ｂ）例えば、ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａ
ｓ９分子などのｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡなど
の核酸（ここでｇＲＮＡ分子をコードする核酸およびｅａＣａｓ９分子をコードする核酸
は、同一であるかまたは異なる分子であり得る）、および
ｃ）任意選択的に、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸、および
ｄ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの
支配ｇＲＮＡ分子
を含む組成物
に、前記細胞を接触させるステップを含む、例えば、細胞の標的核酸配列などの構造を改
変することで、細胞改変する方法を特徴とする。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびｅａＣａ
ｓ９分子またはｅａＣａｓ９分子をコードする核酸は、１つの剤形、送達様式、または製
剤中で、またはそれによって送達される。
一実施形態では、ａ）ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸は、第１の剤
形、第１の送達様式、または第１の製剤中で、またはそれによって送達され；ｂ）ｅａＣ
ａｓ９分子、またはｅａＣａｓ９分子をコードする核酸は、第２の剤形、第２の送達様式
、または第２の製剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、Ｃ
ａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子（
またはそれをコードする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、また
は別の剤形、送達様式、または製剤中で提供される。
一実施形態では、細胞は、動物または植物細胞である。一実施形態では、細胞は、哺乳
類、霊長類、またはヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、例えば、セクションＶＩ
ＩＡで、本明細書に記載されるものからの細胞などのヒト細胞である。一実施形態では、
細胞は、例えば、接合体、胚盤胞または胎芽、胚盤胞細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテン
ト細胞、減数分裂コンピテント細胞などの体細胞、胚芽細胞、出生前細胞である。一実施
形態では、細胞は、例えば、疾患または障害によって特徴付けられる、がん細胞またはそ
の他の細胞などのヒト細胞である。
一実施形態では、標的核酸は、染色体の核酸である。一実施形態では、標的核酸は、細
胞小器官核酸である。一実施形態では、標的核酸は、ミトコンドリア核酸である。一実施
形態では、標的核酸は、葉緑体核酸である。
一実施形態では、細胞は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫、または寄生生物など
の疾患を引き起こす生物の細胞である。
一実施形態では、標的核酸は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫、または寄生生物
などの疾患を引き起こす生物の核酸である。
一実施形態では、前記方法は、遺伝子の発現を調節するステップまたは疾患生物を不活
性化するステップを含む。
一実施形態では、前記細胞は、例えば、がん細胞などの望まれない増殖によって特徴付
けられる細胞である。一実施形態では、前記細胞は、例えば、ウイルス性ゲノムの構成要
素などの望まれないゲノムの構成要素によって特徴付けられる細胞である。一実施形態で
は、細胞は、例えば、セクションＩＩＡで、本明細書に記載される細胞である。一実施形
態では、少なくとも、２、３、４、５または６つ以上の遺伝子の制御または構造的配列が
改変される。
一実施形態では、標的核酸は、再配置、キナーゼ遺伝子を含む再配置、または腫瘍抑制
遺伝子を含む再配置である。一実施形態では、標的核酸は、キナーゼ遺伝子または腫瘍抑
制遺伝子を含む。
一実施形態では、方法は、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０、４０、５０、
１００、１５０または２００ヌクレオチド以内で標的核酸を切断するステップを含む。一
実施形態では、前記組成物は、テンプレート核酸を含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチ
ドを含む。
一実施形態では、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、
表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−
１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩ
Ｉ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶ
ＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えばセクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩ
Ｉ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、
ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２
４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩＩ
で、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、１
０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを含
む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えばセクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩ
Ｉ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、
ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２
４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩＩ
で、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子中の対応する配列と、少なくと
も１ヌクレオチド異なるが、そのヌクレオチドと５、１０、２０または３０％以下が異な
る、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片で
あり、またはそれを含む。
一実施形態では、
ａ）例えば、シス作用性または、トランス作用性制御領域などの遺伝子の制御領域が切
断され、
ｂ）例えば、制御領域の制御下にある遺伝子の発現が調節され、例えば、増大または低
下などの改変によって、シス作用性またはトランス作用性制御領域などの遺伝子の制御領
域の配列が改変され、例えば、制御配列が妨害され、または新規制御配列が挿入され、
ｃ）遺伝子のコード配列が切断され、
ｄ）例えば、遺伝子のコード配列などの転写領域の配列が改変され、例えば、変異が修
正または導入され、遺伝子産物の発現または活性を高める改変がもたらされ、例えば、変
異が修正され、および／または
ｅ）例えば、遺伝子のコード配列などの転写領域の配列が改変され、例えば、変異が修
正または導入され、遺伝子産物の発現または活性を低下させる改変がもたらされ、例えば
、変異が挿入され、例えば、停止コドンが挿入されるように１つまたは複数のヌクレオチ
ドの配列が改変される。
一実施形態では、例えば、少なくとも２、３、４、５、または６つ以上の遺伝子のコー
ド配列などの制御領域または転写領域が改変される。
別の態様では、本開示は、
１）ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲ
ＮＡ分子の組み合わせ）、
ｂ）ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａｓ９分子
などのｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）、および
ｃ）任意選択的に、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸
を含む組成物；
２）ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲ
ＮＡ分子の組み合わせ）、
ｂ）例えば、ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａ
ｓ９分子などのｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡなど
の核酸、
ｃ）任意選択的に、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸、および
ｄ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子
を含む組成物；
３）ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子な
どのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの核酸、
ｂ）ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａｓ９分子
などのｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）、および
ｃ）任意選択的に、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸；および
ｄ）例えば、ｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子
を含む組成物；および／または
４）ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子な
どのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの核酸、
ｂ）例えば、ｅａＣａｓ９分子（または例えば、ｅａＣａｓ９分子と第２のｅａＣａ
ｓ９分子などのｅａＣａｓ９分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡなど
の核酸（ここでｇＲＮＡ分子をコードする核酸およびｅａＣａｓ９分子をコードする核酸
は、同一であるかまたは異なる分子であり得る）、および
ｃ）任意選択的に、例えば、セクションＩＶで、本明細書に記載されるテンプレート
核酸などのテンプレート核酸、および
ｄ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの
支配ｇＲＮＡ分子を含む組成物
の有効量を対象に投与するステップを含む、標的核酸の構造を改変することで、例えば、
配列を改変することで、対象を治療する方法を特徴とする。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびｅａＣａ
ｓ９分子またはｅａＣａｓ９分子をコードする核酸は、１つの剤形、送達様式、または製
剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲ
ＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子（またはそれをコー
ドする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、または別の剤形、送達
様式、または製剤中で提供される。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸は、第１の剤形、
第１の送達様式で、または第１の製剤中で、またはそれによって送達され；およびｅａＣ
ａｓ９分子、またはｅａＣａｓ９分子をコードする核酸は、第２の剤形、第２の送達様式
、または第２の製剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、Ｃ
ａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子（
またはそれをコードする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、また
は別の剤形、送達様式、または製剤中で提供され得る。
一実施形態では、対象は、動物または植物である。一実施形態では、対象は、哺乳類、
霊長類、またはヒトである。
一実施形態では、標的核酸は、例えば、セクションＶＩＩＡで、本明細書に記載される
細胞などのヒト細胞の核酸である。一実施形態では、標的核酸は、例えば、接合体、胚盤
胞または胎芽、胚盤胞細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コンピテント
細胞などの体細胞、胚芽細胞、出生前細胞の核酸である。
一実施形態では、標的核酸は、染色体の核酸である。一実施形態では、標的核酸は、細
胞小器官核酸である。一実施形態では、核酸は、ミトコンドリア核酸である。一実施形態
では、核酸は、葉緑体核酸である。
一実施形態では、標的核酸は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫、または寄生生物
などの疾患を引き起こす生物の核酸である。一実施形態では、前記方法は、遺伝子の発現
を調節するステップまたは疾患生物を不活性化するステップを含む。
一実施形態では、標的核酸は、例えば、がん細胞などの望まれない増殖によって特徴付
けられる細胞の核酸である。一実施形態では、前記標的核酸は、例えば、ウイルスゲノム
構成要素などの望まれないゲノムの構成要素を含む。一実施形態では、少なくとも、２、
３、４、５または６つ以上の遺伝子の制御または構造的配列が改変される。一実施形態で
は、標的核酸は、再配置、キナーゼ遺伝子を含む再配置、または腫瘍抑制遺伝子を含む再
配置である。一実施形態では、標的核酸は、キナーゼ遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を含む
。
一実施形態では、方法は、標的位置のヌクレオチドの１０、２０、３０、４０、５０、
１００、１５０または２００ヌクレオチド以内で標的核酸を切断するステップを含む。
一実施形態では、前記組成物は、テンプレート核酸を含む。一実施形態では、テンプレ
ート核酸は、標的位置のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、前記テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、
表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−
１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩ
Ｉ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶ
ＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの標的位置の
ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表Ｖ
ＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８
、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−
２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩ
Ｉで、本明細書に記載される遺伝子または経路からの遺伝子の配列からの１０〜５００、
１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを
含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、少なくとも１ヌクレオチド異なるが、そのヌク
レオチドと５、１０、２０または３０％以下が異なる、１０〜５００、１０〜４００、１
０〜３００、１０〜２００ヌクレオチド長の断片であり、またはそれを含む。
一実施形態では、
ａ）例えば、シス作用性または、トランス作用性制御領域などの遺伝子の制御領域が切
断され、
ｂ）例えば、制御領域の制御下にある遺伝子の発現が調節され、例えば、増大または低
下などの改変によって、シス作用性またはトランス作用性制御領域などの遺伝子の制御領
域の配列が改変され、例えば、制御配列が妨害され、または新規制御配列が挿入され、
ｃ）遺伝子のコード配列が切断され、
ｄ）例えば、遺伝子のコード配列などの転写領域の配列が改変され、例えば、変異が修
正または導入され、遺伝子産物の発現または活性を高める改変がもたらされ、例えば、変
異が修正され、
ｅ）遺伝子の非コード配列または遺伝子の間の遺伝子間領域が切断され、および／また
は
ｆ）例えば、遺伝子のコード配列などの転写領域の配列が改変され、例えば、変異が修
正または導入され、遺伝子産物の発現または活性を低下させる改変がもたらされ、例えば
、変異が挿入され、例えば、停止コドンが挿入されるように１つまたは複数のヌクレオチ
ドの配列が改変される。
一実施形態では、例えば、少なくとも２、３、４、５、または６つ以上の遺伝子のコー
ド配列などの制御領域または転写領域が改変される。
一態様では、本開示は、ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲ
ＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）；ｂ）例えば、ｅｉＣａｓ９分子（または例
えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）な
どのＣａｓ９分子；およびｃ）ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子の複合体と共有結合また
は非共有結合する、例えば、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子と結合するペイロードを含
む組成物を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇ
ＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）；ｂ）例えば、ｅｉＣａｓ９分子（または
例えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）
などのＣａｓ９分子をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの核酸；およびｃ）ｇＲＮＡ
分子と共有結合または非共有結合的しまたはＣａｓ９分子の融合パートナーであるペイロ
ードを含む組成物を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と
第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの核酸；
ｂ）例えば、ｅｉＣａｓ９分子（または例えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａｓ９
分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）などのＣａｓ９分子；ｃ）Ｃａｓ９分子と共有結
合または非共有結合するペイロード；およびｄ）例えば、ｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子な
どの支配ｇＲＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。
なおも別の態様では、本開示は、ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ
分子と第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの
核酸；ｂ）例えば、その中でｇＲＮＡ分子をコードする核酸およびｅａＣａｓ９分子をコ
ードする核酸が、同一であるかまたは異なる分子であり得る、ｅｉＣａｓ９分子（または
例えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）
などのＣａｓ９分子をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの核酸）；ｃ）Ｃａｓ９分子
の融合パートナーであるペイロード；およびｄ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子ま
たはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。
一態様では、本開示は、
１）ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲ
ＮＡ分子の組み合わせ）、
ｂ）例えば、ｅｉＣａｓ９分子（または例えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａ
ｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）などのＣａｓ９分子；および
ｃ）ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子複合体と共有結合または非共有結合する、例え
ば、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子と結合するペイロード
を含む組成物；
２）ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲ
ＮＡ分子の組み合わせ）、
ｂ）例えば、ｅｉＣａｓ９分子（または例えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａ
ｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）などのＣａｓ９分子をコードするＤＮＡまた
はｍＲＮＡなどの核酸、
ｃ）ｇＲＮＡ分子と共有結合または非共有結合的し、またはＣａｓ９分子の融合パー
トナーであるペイロード
を含む組成物と、
３）ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子な
どのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの核酸、
ｂ）例えば、ｅｉＣａｓ９分子（または例えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａ
ｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）などのＣａｓ９分子、
ｃ）Ｃａｓ９分子と共有結合または非共有結合するペイロード、および
ｄ）例えば、ｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子
を含む組成物；および／または
４）ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子な
どのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの核酸、
ｂ）例えば、その中でｇＲＮＡ分子をコードする核酸およびｅａＣａｓ９分子をコー
ドする核酸が、同一であるかまたは異なる分子であり得る、ｅｉＣａｓ９分子（または例
えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）な
どのＣａｓ９分子をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの核酸）、
ｃ）Ｃａｓ９分子の融合パートナーであるペイロード、および
ｄ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの
支配ｇＲＮＡ分子
を含む組成物に、前記細胞を接触させるステップを含む、例えば、標的核酸にペイロード
を標的化することで、細胞にペイロードを送達する方法を特徴とする。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびｅａＣａ
ｓ９分子またはｅａＣａｓ９分子をコードする核酸は、１つの剤形、送達様式、または製
剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲ
ＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子（またはそれをコー
ドする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、または別の剤形、送達
様式、または製剤中で提供される。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸は、第１の剤形、
第１の送達様式、または第１の製剤中で、またはそれによって送達され；Ｃａｓ９分子、
またはＣａｓ９分子をコードする核酸は、第２の剤形、第２の送達様式、または第２の製
剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲ
ＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子（またはそれをコー
ドする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、または別の剤形、送達
様式、または製剤中で提供される。
一実施形態では、細胞は、動物または植物細胞である。一実施形態では、細胞は、哺乳
類、霊長類、またはヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、例えば、セクションＶＩ
ＩＡで、本明細書に記載されるヒト細胞などのヒト細胞である。一実施形態では、細胞は
、例えば、接合体、胚盤胞または胎芽、胚盤胞細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞
、減数分裂コンピテント細胞などの体細胞、胚芽細胞、出生前細胞である。一実施形態で
は、細胞は、例えば、がん細胞や、例えば、ウイルスゲノムの全部または一部のような望
まれない遺伝要素を含む細胞などのヒト細胞である。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体核酸の標的化を媒介する。一実施形態では、ｇＲ
ＮＡは、選択されたゲノムシグネチャの標的化を媒介する。一実施形態では、ｇＲＮＡは
、細胞小器官核酸の標的化を媒介する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、ミトコンドリア核
酸の標的化を媒介する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、葉緑体核酸の標的化を媒介する。
一実施形態では、細胞は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫、または寄生生物など
の疾患を引き起こす生物の細胞である。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫、または寄生生物
などの疾患を引き起こす生物の核酸の標的化を媒介する。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、セクションＶＩで、本明細書に記載されるペ
イロードを含む。
一実施形態では、前記細胞は、例えば、がん細胞などの望まれない増殖によって特徴付
けられる細胞である。一実施形態では、前記細胞は、例えば、ウイルス性ゲノムの構成要
素などの望まれないゲノムの構成要素によって特徴付けられる。
一実施形態では、少なくとも、２、３、４、５または６つ以上の遺伝子の制御または構
造的配列が改変される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば生殖細胞系変異または後天性体細胞変異のような
変異などの選択されたゲノムシグネチャを標的化する。一実施形態では、標的核酸は、再
配置、キナーゼ遺伝子を含む再配置、または腫瘍抑制遺伝子を含む再配置である。一実施
形態では、標的核酸は、キナーゼ遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を含む。一実施形態では、
ｇＲＮＡは、例えば、セクションＶＩＩＡで、本明細書で開示されるがん細胞などのがん
細胞を標的化する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、ウイルスに感染している細胞を標的化
する。
別の態様では、本開示は、例えば、
１）ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲ
ＮＡ分子の組み合わせ）、
ｂ）例えば、ｅｉＣａｓ９分子（または例えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａ
ｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）などのＣａｓ９分子、および
ｃ）ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子複合体と共有結合または非共有結合する、例え
ば、Ｃａｓ９分子と結合するペイロード
を含む組成物；
２）ａ）ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子などのｇＲ
ＮＡ分子の組み合わせ）、
ｂ）例えば、ｅｉＣａｓ９分子（または例えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａ
ｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）などのＣａｓ９分子をコードするＤＮＡまた
はｍＲＮＡなどの核酸、
ｃ）ｇＲＮＡ分子と共有結合または非共有結合的し、またはＣａｓ９分子の融合パー
トナーであるペイロード、
ｄ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子
を含む組成物；
３）ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子な
どのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの核酸、
ｂ）例えば、ｅｉＣａｓ９分子（または例えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａ
ｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）などのＣａｓ９分子、および
ｃ）Ｃａｓ９分子と共有結合または非共有結合するペイロード、および
ｄ）例えば、ｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子
を含む組成物、；および／または
４）ａ）例えば、ｇＲＮＡ分子（または例えば、ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子な
どのｇＲＮＡ分子の組み合わせ）をコードするＤＮＡなどの核酸、
ｂ）例えば、ｅｉＣａｓ９分子（または例えば、ｅｉＣａｓ９分子と第２のｅｉＣａ
ｓ９分子などのＣａｓ９分子の組み合わせ）などのＣａｓ９分子をコードするＤＮＡまた
はｍＲＮＡなどの核酸）（ここでｇＲＮＡ分子をコードする核酸およびｅａＣａｓ９分子
をコードする核酸が、同一であるかまたは異なる分子であり得る）、
ｃ）Ｃａｓ９分子の融合パートナーであるペイロード、および
ｄ）例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの
支配ｇＲＮＡ分子
を含む組成物の有効量を対象に投与するステップを含む、標的核酸にペイロードを標的化
することで、対象を治療する方法を特徴とする。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびｅａＣａ
ｓ９分子またはｅａＣａｓ９分子をコードする核酸は、１つの剤形、送達様式、または製
剤中で、またはそれによって送達される。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲ
ＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子（またはそれをコー
ドする核酸は、それが不活性化する構成要素を含有する剤形中で、または別の剤形、送達
様式、または製剤中で提供され得る。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸は、第１の用量、
送達様式形態または製剤中で、またはそれによって送達され；Ｃａｓ９分子、またはＣａ
ｓ９分子をコードする核酸は、第２の剤形、送達様式、または製剤中で、またはそれによ
って送達される。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ
標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子（またはそれをコードする核酸は、それが不
活性化する構成要素を含有する剤形中で、または別の剤形、送達様式、または製剤中で提
供され得る。
一実施形態では、対象は、動物または植物細胞である。一実施形態では、対象は、哺乳
類、霊長類、またはヒト細胞である。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、セクションＶＩＩＡで、本明細書に記載される
ヒト細胞などのヒト細胞の標的化を媒介する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、接
合体、胚盤胞または胎芽、胚盤胞細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コ
ンピテント細胞などの体細胞、胚芽細胞、出生前細胞の標的化を媒介する。一実施形態で
は、ｇＲＮＡは、がん細胞または例えば、ウイルスゲノムの全部または一部などの望まれ
ないゲノム要素を含む細胞の標的化を媒介する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体核
酸の標的化を媒介する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、選択されたゲノムシグネチャの標
的化を媒介する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、細胞小器官核酸の標的化を媒介する。一
実施形態では、ｇＲＮＡは、ミトコンドリア核酸の標的化を媒介する。一実施形態では、
ｇＲＮＡは、葉緑体核酸の標的化を媒介する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、ウ
イルス、細菌、真菌、原虫、または寄生生物などの疾患を引き起こす生物の核酸の標的化
を媒介する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、セクションＶＩＩＡからの、例えば
、表ＶＩＩ−１１からのがん細胞のようながん細胞などの望まれない増殖によって特徴付
けられる細胞を標的化する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、ウイルスゲノム構成
要素などの望まれないゲノム構成要素によって特徴付けられる細胞を標的化する。
一実施形態では、例えば、プロモーターまたはエンハンサーなどの制御要素が標的化さ
れる。一実施形態では、標的核酸は、再配置、キナーゼ遺伝子を含む再配置、または腫瘍
抑制遺伝子を含む再配置である。一実施形態では、標的核酸は、キナーゼ遺伝子または腫
瘍抑制遺伝子を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば生殖細胞系変異または後天性
体細胞変異のような変異などの選択されたゲノムシグネチャを標的化する。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、がん細胞を標的化する。一実施形態では、ｇＲＮＡは、
ウイルスに感染している細胞を標的化する。
一実施形態では、少なくとも１つのｅａＣａｓ９分子およびペイロードが投与される。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、セクションＶＩで、本明細書に記載されるペイ
ロードを含む。
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明
が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に
記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料が、本発明でまたは本発明の試験で
使用され得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、
全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照により
援用する。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図
されない。
数字およびアルファベットの見出しおよび小見出しをはじめとする見出しは、組織化と
提示を目的とし、制限は意図されない。
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らか
になるであろう。
合わせて図面を構成する下に記載される図は、例証のみを目的とし、制限は意図されな
い。
代表的なｇＲＮＡの描写である。部分的にストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する（または部分的に配列をモデルにしている）、モジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号４２および４３）； 代表的なｇＲＮＡの描写である。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４４）； 代表的なｇＲＮＡの描写である。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４５）； 代表的なｇＲＮＡの描写である。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４６）； 代表的なｇＲＮＡの描写である。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４７）； 代表的なｇＲＮＡの描写である。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に部分的に由来するモジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号４８および４９）； 代表的なｇＲＮＡの描写である。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のモジュラーｇＲＮＡ分子のアライメントを描写する（それぞれ出現順に配列番号５０〜５３）。 Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ＢＩＯＬ．２０１３；１０（５）：７２６−７３７からのＣａｓ９配列のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号３）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号４）。モチーフ：これは４つの配列に基づくモチーフである：全ての４つの配列中で保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、例えば、２０の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸を示す。 Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．で開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号５４〜１０３）。図３Ａの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。 配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．で開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号１０４〜１７７）。図３Ｂの最後の行は、４つの高度に保存された残基を特定する。 Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．で開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号１７８〜２５２）。図４Ａの最後行は、保存残基を特定する。 配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．で開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号２５３〜３０２）。図４Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。 Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびナイセリア・メニンジチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＣａｓ９配列のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）；Ｎｍ：Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）。モチーフ：これは２つの配列に基づくモチーフである：双方の配列で保存される残基は、単一アミノ酸名称によって示される；「＊」は、２つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、例えば、２０の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸を示し、「−」は、例えば、２０の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸または不在を示す。 Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９をコードする核酸配列を示す（配列番号３０３）。「Ｒ」によって示される配列はＳＶ４０ ＮＬＳであり；「Ｇ」として示される配列はＨＡタグであり；「Ｏ」によって示される配列は、合成ＮＬＳ配列である。残りの（印のない）配列は、読み取り枠（ＯＲＦ）である。 形質移入の１、２、３、６および９日後における、Ｃａｓ９標的化支配ｇＲＮＡでそれぞれ形質移入された細胞のＣａｓ９タンパク質発現のレベルを描写する。
［定義］
「支配ｇＲＮＡ分子」は、本明細書の用法では、Ｃａｓ９分子と複合体を形成して、Ｃ
ａｓ９システムの構成要素を不活性化またはサイレンシングし得るｇＲＮＡ分子を指す。
一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子をコードする配列を含む核酸を不活
性化またはサイレンシングする。一実施形態では、それは、ｇＲＮＡ分子をコードする配
列を含む核酸を不活性化またはサイレンシングする。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９
標的化ｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡは、Ｃａｓ
９分子／ｇＲＮＡ分子複合体−媒介遺伝子ターゲッティングの効果を制限する。一実施形
態では、それは、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性に、時間的制限、発現レベル
制限、またはその他の制限を課す。一実施形態では、それは、オフターゲットまたはその
他の望まれない活性を低下させる。支配ｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｃａｓ９分子などのＣ
ａｓ９システムの構成要素の生成を例えば、完全に阻害しまたは実質的に阻害するように
作用し得て、それによってその活性を制限し、またはそれに影響を与える。
支配ｇＲＮＡ分子は、構成要素の生成が低下さえすれば、構成要素の転写または翻訳さ
れる領域内または領域外の、負制御されるべき構成要素をコードする配列を含む核酸の任
意の領域を標的化し得る。
一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、負制御されるべき構成要素をコードする配列が
存在する核酸上の標的配列と相補的な標的化配列を含む。
一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、負制御されるべき構成要素配列と相補的な標的
配列を含む。
一実施形態では、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子は、その上にＣａｓ９分子をコードする
配列がある、核酸を標的化する標的配列を含み得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子配列を標的化する標的
配列を含み得る。
一実施形態では、ｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードする配列が存在
する核酸を標的化する標的配列を含み得る。
一実施形態では、ｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子配列を標的化する標的
配列を含み得る。
「ドメイン」は、本明細書の用法では、タンパク質または核酸部分を記述するために使
用される。特に断りのない限り、ドメインは、任意の特定の機能特性を有する必要はない
。
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（用語は本明細書で同義的に使用され
る）の計算は、次のようにして実施される。配列は、最適な比較目的で整列され（例えば
、最適アライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の片方または双
方にギャップが装入されることができ、非相同配列は比較目的で無視され得る）。最適ア
ライメントは、Ｂｌｏｓｕｍ６２重み行列による、ギャップペナルティ１２、ギャップ延
長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で、ＧＣＧソフトウェアパ
ッケージのＧＡＰプログラムを使用して、最高スコアとして評価される。次に対応するア
ミノ酸位置またはヌクレオチド配列部位にある、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較
する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基または
ヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一である。（本明細
書の用法では、一実施形態では、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸
「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性百分率は、配列によって共有される同
一の位置数の関数である。
「修飾物質」は、本明細書の用法では、例えば、対象分子または遺伝子配列の活性（例
えば、酵素活性、転写活性、または翻訳活性）、量、分布、または構造を改変し得る薬剤
などの実体を指す。一実施形態では、調節は、例えば、共有結合または非共有結合の破壊
などの切断、または例えば、部分の対象分子への付着などの共有結合または非共有結合の
形成を含む。一実施形態では、修飾物質は、対象分子の三次元、二次、三次、または四次
構造を変化させる。修飾物質は、対象活性を増大させ、低下させ、開始し、または排除し
得る。
「大分子」は、本明細書の用法では、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、４０
、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｋＤの分子量を有する分子を指す。大分
子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、生物製剤、および炭水化物が挙げられる
。
「ポリペプチド」は、本明細書の用法では、１００個未満のアミノ酸残基を有するアミ
ノ酸のポリマーを指す。一実施形態では、それは５０、２０、または１０個未満のアミノ
酸残基を有する。
例えば、参照Ｃａｓ９分子または参照ｇＲＮＡなどの「参照分子」は、本明細書の用法
では、例えば、修飾または候補Ｃａｓ９分子などである対象Ｃａｓ９分子または対象ｇＲ
ＮＡ分子などの対象分子が、それに対して比較される分子を指す。例えば、Ｃａｓ９分子
は、参照Ｃａｓ９分子のヌクレアーゼ活性の１０％以下を有するとして特徴付けられ得る
。参照Ｃａｓ９分子の例としては、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、
またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子などである
、天然起源のＣａｓ９分子などの天然起源の未修飾Ｃａｓ９分子が挙げられる。一実施形
態では、参照Ｃａｓ９分子は、それが比較されるＣａｓ９分子と、最も近い配列同一性ま
たは相同性を有する天然起源のＣａｓ９分子である。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子
は、例えば、変異などの変化がその上で起こった親形態である、天然起源または既知の配
列などの配列である。
「置換」または「交換された」は、分子修飾に関連した本明細書の用法では、プロセス
の制限は必要でなく、置換実体が存在することのみを示す。
「小分子」は、本明細書の用法では、例えば、約２ｋＤ未満、約１．５ｋＤ未満、約１
ｋＤ未満、または約０．７５ｋＤ未満などの約２ｋＤ未満の分子量を有する化合物を指す
。
「対象」は、本明細書の用法では、ヒトまたは非ヒト動物のどちらを意味してもよい。
用語は、哺乳類（例えば、ヒト、その他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えば、マウスおよび
ラットまたはハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、お
よびヤギ）を含むが、これに限定されるものではない。一実施形態では、対象はヒトであ
る。一実施形態では、対象は家禽である。
「治療する（Ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔ
ｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書の用法では、例えば、（ａ）疾患を阻害し、すなわち
、その進行を抑止または予防し；（ｂ）疾患を緩和し、すなわち、疾病状態の退縮を引き
起こし；または（ｃ）疾患を治癒させることをはじめとする、例えば、ヒトなどの哺乳類
の疾患の治療を意味する。
「Ｘ」は、アミノ酸配列の文脈で、本明細書の用法では、特に断りのない限り、任意の
アミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸のいずれか）を指す。
［Ｉ．ｇＲＮＡ分子］
ｇＲＮＡ分子は、本明細書での用法では、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の標的核
酸への特定の標的化または自動誘導を促進する核酸を指す。ｇＲＮＡ分子は、本明細書で
「キメラ」ｇＲＮＡと称されることもある単分子（単一ＲＮＡ分子を有する）、またはモ
ジュラー（２つ以上、典型的に２つの別々のＲＮＡ分子を含む）であり得る。ｇＲＮＡ分
子は、いくつかのドメインを含む。ｇＲＮＡ分子ドメインは、下で詳述される。典型的に
、ｇＲＮＡは、例えば、プロセシングされたまたは成熟ｃｒＲＮＡおよびプロセシングさ
れたまたは成熟ｔｒａｃｒＲＮＡの機能などのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの双方
の機能または構造を取り入れる。キメラまたは単分子ｇＲＮＡ分子は、単一ＲＮＡ分子を
有することができ、例えば、それは、ｃｒＲＮＡの機能または構造およびｔｒａｃｒＲＮ
Ａの機能または構造の双方を取り入れる。モジュラーｇＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ機能ま
たは構造を取り入れたＲＮＡ分子と、ｔｒａｃｒＲＮＡ機能または構造を取り入れた別の
ＲＮＡ分子を含み得る。その上にドメインが示されるいくつかの代表的なｇＲＮＡ構造は
、図１に提供される。ｇＲＮＡの活性形態の三次元形態、または鎖内または鎖間相互作用
に関する理論による拘束は望まないが、高度相補性領域は、図１で時に二本鎖として示さ
れ、その他の描写は、本明細書で提供される。
一実施形態では、単分子ｇＲＮＡまたはキメラｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’
方向に、
例えば、（標的核酸と相補的な）１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオ
チドなどを含む、標的化ドメイン、
第１の相補的ドメイン、
連結ドメイン、
（第１の相補的ドメインと相補的な）第２の相補的ドメイン、
隣接ドメイン、および
任意選択的に、テールドメイン
を含む。
一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’方向に、
標的化ドメイン（例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−
１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩ
Ｉ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ
−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩＩで、本明細書に記載
される遺伝子または経路からの配列などの本明細書で開示される標的核酸からの標的配列
と相補的な）、および
第１の相補的ドメインを含む第１の鎖、および
好ましくは、５’から３’方向に、
任意選択的に、５’伸長ドメイン、
第２の相補的ドメイン、および
隣接ドメイン、および
任意選択的に、テールドメインを含む第２の鎖
を含む。
ドメインは、下で簡単に考察される。
１）標的化ドメイン：
図１Ａ〜１Ｇは、標的化ドメインの配置の例を提供する。
標的化ドメインは、標的核酸の標的配列と、例えば、少なくとも８０、８５、９０、ま
たは９５％相補的であり、例えば、完全に相補的である、相補的なヌクレオチド配列を含
む。標的化ドメインはＲＮＡ分子の一部であり、したがって塩基ウラシル（Ｕ）を含む一
方で、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは、塩基チミン（Ｔ）を含む。理論による
拘束は望まないが、標的配列と標的化ドメインとの相補性は、標的核酸とｇＲＮＡ分子／
Ｃａｓ９分子複合体との相互作用の特異性に寄与すると考えられる。標的化ドメインおよ
び標的配列対合中では、標的化ドメイン中のウラシル塩基が、標的配列中のアデニン塩基
と対合するものと理解される。一実施形態では、標的ドメインそれ自体が、５’から３’
方向に、任意選択の二次ドメイン、およびコアドメインを含む。一実施形態では、コアド
メインは、標的配列と完全に相補的である。一実施形態では、標的化ドメインは、例えば
、１０〜４０、例えば、１０〜３０、例えば、１５〜３０、例えば、１５〜２５など、５
〜５０ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。
標的化ドメインがそれと相補的である標的核酸の鎖は、本明細書で相補鎖と称される。ド
メインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＸに見られる
修飾などの修飾を有し得る。
一実施形態では、標的化ドメインは、１５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１５ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチドを含む。
標的化ドメインは、下でより詳細に考察される。
２）第１の相補的ドメイン：
図１Ａ〜１Ｇは、第１の相補的ドメインの例を提供する。
第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメインと相補的であり、一実施形態では、第
２の相補的ドメインと、少なくともいくつかの生理的条件下で二重鎖領域を形成するのに
十分な相補性を有する。一実施形態では、第１の相補的ドメインは、５〜３０ヌクレオチ
ド長である。一実施形態では、第１の相補的ドメインは、５〜２５ヌクレオチド長である
。一実施形態では、第１の相補的ドメインは、７〜２５ヌクレオチド長である。一実施形
態では、第１の相補的ドメインは、７〜２２ヌクレオチド長である。一実施形態では、第
１の相補的ドメインは、７〜１８ヌクレオチド長である。一実施形態では、第１の相補的
ドメインは、７〜１５ヌクレオチド長である。一実施形態では、第１の相補的ドメインは
、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９
、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、第１の相補的ドメインは、５’から３’方向に、５’サブドメイン、
中心サブドメイン、および３’サブドメインの、３つのサブドメインを含む。一実施形態
では、５’サブドメインは、例えば、４、５、６、７、８または９など、４〜９ヌクレオ
チド長である。一実施形態では、中心サブドメインは、例えば、１など、１、２、または
３ヌクレオチド長である。一実施形態では、３’サブドメインは、例えば、４〜２２、４
〜１８、または４〜１０、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５な
ど、３〜２５ヌクレオチド長である。
第１の相補的ドメインは、天然起源の第１の相補的ドメインとの相同性を共有し、また
はそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第１の相補
的ドメインなどの本明細書で開示される第１の相補的ドメインと、少なくとも５０％の相
同性を有する。
ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＸに見ら
れる修飾などの修飾を有し得る。
第１の相補的ドメインは、下でより詳細に考察される。
３）連結ドメイン
図１Ｂ〜１Ｅは、連結ドメインの例を提供する。
連結ドメインは、単分子ｇＲＮＡの第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインとを
連結するのに役立つ。連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインを共有結合的に
または非共有結合的に連結し得る。一実施形態では、連結は、共有結合である。一実施形
態では、連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインと共有結合的に連結し、例え
ば、図１Ｂ〜１Ｅを参照されたい。一実施形態では、連結ドメインは、第１の相補的ドメ
インと第２の相補的ドメインの間に挿入された共有結合であり、またはそれを含む。典型
的に、連結ドメインは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０などの１
つまたは複数のヌクレオチドを含む。
モジュラーｇＲＮＡ分子中では、相補的ドメインのハイブリダイゼーションによって、
２つの分子が結合されることができ、例えば、図１Ａを参照されたい。
多種多様な連結ドメインが、単分子ｇＲＮＡ分子中で使用するのに適する。連結ドメイ
ンは、共有結合からなり得て、または例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長
などの１つまたは少数のヌクレオチド程度に短くあり得る。
一実施形態では、連結ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２
０、または２５ヌクレオチド長以上である。一実施形態では、連結ドメインは、２〜５０
、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、または２〜５ヌクレオチド長である。一実
施形態では、連結ドメインは、例えば、第２の相補的ドメインに対して５’であるｔｒａ
ｃｒＲＮＡの配列などの天然起源の配列と相同性を共有し、またはそれに由来する。一実
施形態では、連結ドメインは、本明細書で開示される連結ドメインと、少なくとも５０％
の相同性を有する。
ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＸに見ら
れる修飾などの修飾を有し得る。
連結ドメインは、下でより詳細に考察される。
４）５’伸長ドメイン
一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、本明細書で５’伸長ドメインと称される、第
２の相補的ドメインに対して５’の追加的な配列を含むことができ、例えば、図１Ａを参
照されたい。一実施形態では、５’伸長ドメインは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７
、２〜６、２〜５、２〜４ヌクレオチド長である。一実施形態では、５’伸長ドメインは
、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長以上である。
５）第２の相補的ドメイン：
図１Ａ〜１Ｆは、第２の相補的ドメインの例を提供する。
第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインと相補的であり、一実施形態では、第
２の相補的ドメインと、少なくともいくつかの生理的条件下で二重鎖領域を形成するのに
十分な相補性を有する。例えば、図１Ａまたは図１Ｂに示されるように、一実施形態では
、第２の相補的ドメインは、例えば、二重鎖領域からループアウトする配列などの第１の
相補的ドメインとの相補性を欠く配列を含み得る。
一実施形態では、第２の相補的ドメインは、５〜２７ヌクレオチド長である。一実施形
態では、それは、第１の相補性領域より長い。
一実施形態では、第２の相補的ドメインは、７〜２７ヌクレオチド長である。一実施形
態では、第２の相補的ドメインは、７〜２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、第
２の相補的ドメインは、７〜２０ヌクレオチド長である。一実施形態では、第２の相補的
ドメインは、７〜１７ヌクレオチド長である。一実施形態では、相補的ドメインは、５、
６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、第２の相補的ドメインは、５’から３’方向に、５’サブドメイン、
中心サブドメイン、および３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。一実施
形態では、５’サブドメインは、例えば、４〜２２、４〜１８、または４〜１０、または
３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８
、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５など、３〜２５ヌクレオチド長であ
る。一実施形態では、中心サブドメインは、例えば、３など、１、２、３、４または５ヌ
クレオチド長である。一実施形態では、３’サブドメインは、例えば、４、５、６、７、
８または９など、４〜９ヌクレオチド長である。
一実施形態では、第１の相補的ドメインの５’サブドメインおよび３’サブドメインは
、第２の相補的ドメインの３’サブドメインおよび５’サブドメインとそれぞれ相補的で
あり、例えば、完全に相補的である。
第２の相補的ドメインは、天然起源の第２の相補的ドメインとの相同性を共有し、また
はそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第１の相補
的ドメインなどの本明細書で開示される第２の相補的ドメインと、少なくとも５０％の相
同性を有する。
ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＸに見ら
れる修飾などの修飾を有し得る。
６）隣接ドメイン：
図１Ａ〜１Ｆは、隣接ドメインの例を提供する。
一実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長である。一実施形態では、
隣接ドメインは、天然起源の隣接ドメインと相同性を共有し、またはそれに由来し得る。
一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ
．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）隣接ドメインなどの本明細書で開示
される隣接ドメインと、少なくとも５０％の相同性を有する。
ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＸに見ら
れる修飾などの修飾を有し得る。
７）テールドメイン：
図１Ａおよび図１Ｃ〜１Ｆは、テールドメインの例を提供する。
図１Ａおよび図１Ｃ〜１Ｆのテールドメインの検査によって見られるように、広範囲の
テールドメインが、ｇＲＮＡ分子として使用するのに適する。一実施形態では、テールド
メインは、０（不在）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド
長である。一実施形態では、テールドメインヌクレオチドは、天然起源のテールドメイン
の５’末端からの配列に由来し、またはそれと相同性を共有し、例えば、図１Ｄまたは図
１Ｅを参照されたい。一実施形態では、テールドメインは、互いに相補的で、少なくとも
いくつかの生理的条件下では、二重鎖領域を形成する配列を含む。
一実施形態では、テールドメインは、不在であり、または１〜５０ヌクレオチド長であ
る。一実施形態では、テールドメインは、天然起源の隣接テールドメインと相同性を共有
し、またはそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．
ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）テー
ルドメインなどの本明細書で開示されるテールドメインと、少なくとも５０％の相同性を
有する。
ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＸに見ら
れる修飾などの修飾を有し得る。
一実施形態では、テールドメインは、インビトロ（生体外）またはインビボ（生体内）
転写法に関連する、３’末端のヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡのインビトロ転写のために
Ｔ７プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＤＮＡテンプレートの３
’末端より上流に存在する、任意のヌクレオチドであってもよい。インビボ転写のために
Ｕ６プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＵＵＵＵＵＵ配列であっ
てもよい。交互のｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが利用される場合、これらのヌクレオチド
は、様々な数であってもまたはウラシル塩基であってもよく、または交互の塩基を含んで
もよい。
ｇＲＮＡ分子のドメインは、下で詳述される。
＜標的化ドメイン＞
ｇＲＮＡの「標的化ドメイン」は、標的核酸上の「標的ドメイン」と相補的である。ｇ
ＲＮＡのコアドメインと相補的なヌクレオチド配列を含む標的核酸の鎖は、本明細書で、
標的核酸の「相補鎖」と称される。標的化ドメインの選択の指標は、例えば、Ｆｕ Ｙ
ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎ
ｂｔ．２８０８）、およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ ＳＨ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ２
０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３０１１）にある。
一実施形態では、標的化ドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２
２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２
２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長を構成する。
一実施形態では、標的化ドメインは、１５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１５ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、１０＋／−５、２０＋／−５、３０＋／−５、４
０＋／−５、５０＋／−５、６０＋／−５、７０＋／−５、８０＋／−５、９０＋／−５
、または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２０＋／−５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、２０＋／−１０、３０＋／−１０、４０＋／−１
０、５０＋／−１０、６０＋／−１０、７０＋／−１０、８０＋／−１０、９０＋／−１
０、または１００＋／−１０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、３０＋／−１０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜
７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０または１０〜１５
ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、２０〜１００、２０〜９０
、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０４０、２０〜３０、または２
０〜２５ヌクレオチド長である。
典型的に標的化ドメインは、標的配列との完全相補性を有する。一実施形態では標的化
ドメインは、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３、４、
５、６、７または８ヌクレオチドを有し、またはそれを含む。
一実施形態では、標的ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化
ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な１、２、３、４または５ヌクレオチドを含む
。一実施形態では、標的ドメインは、その３’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化
ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な１、２、３、４または５ヌクレオチドを含む
。
一実施形態では、標的ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化
ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３または４ヌクレオチドを含
む。一実施形態では、標的ドメインは、その３’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的
化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３または４ヌクレオチドを
含む。
一実施形態では、相補性の程度は、ｇＲＮＡのその他の性質と合わせて、Ｃａｓ９分子
の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
一実施形態では、標的化ドメインは、例えば、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオ
チド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化
ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた、２つの連続する非
相補的ヌクレオチドなどの標的ドメインと相補的でない２連続ヌクレオチド（「非相補的
ヌクレオチド」）を含む。
一実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメ
インの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の
末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある２連続ヌクレオチドは、いずれも標
的化ドメインと相補的でない。
一実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内、標的化ドメインの
３’末端の５ヌクレオチド以内、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌ
クレオチドを超えて離れた領域内に、非相補的ヌクレオチドはない。
一実施形態では、標的化ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＸで提供される
タイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、標的化ドメインは、例え
ば、分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生
体適合性にするための修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、標的化ドメ
インの骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションＸからのその他の修飾に
より、修飾され得る。一実施形態では、標的化ドメインのヌクレオチドは、例えば、２’
アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＸからのその他の修飾などの２’
修飾（例えば、リボース上の２’位における修飾）を含み得る。
一実施形態では、標的化ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８つ以上の修
飾を含む。一実施形態では、標的化ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内にあ
る、１、２、３、または４つの修飾を含む。一実施形態では、標的化ドメインは、その３
’末端の５ヌクレオチド以内にある、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、例えば、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオ
チド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化
ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチド
などの２連続ヌクレオチドの修飾を含む。
一実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメ
インの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の
末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある２連続ヌクレオチドは、いずれも修
飾されていない。一実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあ
り、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片
方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にあるヌクレオチドは、い
ずれも修飾されていない。
標的化ドメイン中の修飾は、セクションＩＩＩに記載されるシステム中で候補修飾を試
験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ
、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補標的化ドメインを有するｇＲＮＡは、
セクションＩＩＩのシステム中で評価され得る。候補標的化ドメインは、選択された標的
について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単
独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得
る。
一実施形態では、全ての修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌク
レオチドと相補的であり、ハイブリダイズできる。一実施形態では、１、２、３、４、５
、６、７または８つ以上の修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌク
レオチドと相補的でなくまたはハイブリダイズできない。
一実施形態では、標的化ドメインは、好ましくは、５’→３’方向に、二次ドメインお
よびコアドメインを含む。これらのドメインは、下でより詳細に考察される。
＜標的化ドメインのコアドメインおよび二次ドメイン＞
標的化ドメインの「コアドメイン」は、標的核酸上の「コアドメイン標的」と相補的で
ある。一実施形態では、コアドメインは、標的化ドメインの３’末端から約８〜約１３ヌ
クレオチド（例えば、標的化ドメインの最も３’側の８〜１３ヌクレオチド）を含む。
一実施形態では、コアドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２
、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／
−２、または１６＋／−２ヌクレオチド長である。
一実施形態では、コアドメインは、１０＋／−２ヌクレオチド長である。
一実施形態では、コアドメインは、１０＋／−４ヌクレオチド長である。
一実施形態では、コアドメインは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
１５、または１６ヌクレオチド長である。
一実施形態では、コアドメインは、例えば、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、
９〜１３、９〜１２、９〜１１、または９〜１０などの８〜１３ヌクレオチド長である。
一実施形態では、コアドメインは、例えば、６〜１５、６〜１４、６〜１３、７〜１４
、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１
、８〜１０、または８〜９など、６〜１６ヌクレオチド長である。
コアドメインは、コアドメイン標的と相補的である。典型的に、コアドメインは、コア
ドメイン標的との正確な相補性を有する。一実施形態では、コアドメインは、コアドメイ
ンの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３、４または５ヌクレオチドを有し
得る。一実施形態では、相補性の程度は、ｇＲＮＡのその他の性質と合わせて、Ｃａｓ９
分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
ｇＲＮＡの標的化ドメインの「二次ドメイン」は、標的核酸の「二次ドメイン標的」と
相補的である。
一実施形態では、二次ドメインは、コアドメインに対して５’に配置される。
一実施形態では、二次ドメインは不在であり、または任意選択である。
一実施形態では、標的化ドメインが、２６ヌクレオチド長であり、または少なくとも２
６ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、１２〜１７ヌクレオチド長である
。
一実施形態では、標的化ドメインが、２５ヌクレオチド長であり、または少なくとも２
５ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、１２〜１７ヌクレオチド長である
。
一実施形態では、標的化ドメインが、２４ヌクレオチド長であり、または少なくとも２
４ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、１１〜１６ヌクレオチド長である
。
一実施形態では、標的化ドメインが、２３ヌクレオチド長であり、または少なくとも２
３ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、１０〜１５ヌクレオチド長である
。
一実施形態では、標的化ドメインが、２２ヌクレオチド長であり、または少なくとも２
２ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、９〜１４ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインが、２１ヌクレオチド長であり、または少なくとも２
１ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、８〜１３ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインが、２０ヌクレオチド長であり、または少なくとも２
０ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、７〜１２ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインが、１９ヌクレオチド長であり、または少なくとも１
９ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、６〜１１ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインが、１８ヌクレオチド長であり、または少なくとも１
８ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、５〜１０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインが、１７ヌクレオチド長であり、または少なくとも１
７ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、４〜９ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインが、１６ヌクレオチド長であり、または少なくとも１
６ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が
、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、３〜８ヌクレオチド長である。
一実施形態では、二次ドメインは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。
二次ドメインは、二次ドメイン標的と相補的である。典型的に、二次ドメインは、二次
ドメイン標的との正確な相補性を有する。一実施形態では、二次ドメインは、二次ドメイ
ンの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３、４または５ヌクレオチドを有し
得る。一実施形態では、相補性の程度は、ｇＲＮＡのその他の性質と合わせて、Ｃａｓ９
分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
一実施形態では、コアドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＸで提供されるタ
イプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、コアドメインは、例えば、
分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生体適
合性にするための修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、コアドメインの
骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションＸからのその他の修飾により、
修飾され得る。一実施形態では、コアドメインのヌクレオチドは、例えば、２’アセチル
化、例えば、２’メチル化、または、セクションＸからのその他の修飾などの２’修飾（
例えば、リボース上の２’位における修飾）を含み得る。典型的に、コアドメインは、１
、２、または３つ以下の修飾を含有する。
コアドメイン中の修飾は、セクションＩＩＩに記載されるシステム中で候補修飾を試験
することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、
配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補コアドメインを有するｇＲＮＡは、セク
ションＩＩＩに記載されるシステム中で評価され得る。候補コアドメインは、選択された
標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に
、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価さ
れ得る。
一実施形態では、二次ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＸで提供されるタ
イプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、二次ドメインは、例えば、
分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生体適
合性にするための修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、二次ドメインの
骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションＸからのその他の修飾により、
修飾され得る。一実施形態では、二次ドメインのヌクレオチドは、例えば、２’アセチル
化、例えば、２’メチル化、またはセクションＸからのその他の修飾などの２’修飾（例
えば、リボース上の２’位における修飾）を含み得る。典型的に、二次ドメインは、１、
２、または３つ以下の修飾を含有する。
二次ドメイン中の修飾は、セクションＩＩＩに記載されるシステム中で候補修飾を試験
することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、
配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補二次ドメインを有するｇＲＮＡは、セク
ションＩＩＩに記載されるシステム中で評価され得る。候補二次ドメインは、選択された
標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に
、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価さ
れ得る。
一実施形態では、（１）コアドメインとその標的の間の相補性程度、および（２）二次
ドメインとその標的の間の相補性程度は、異なってもよい。一実施形態では、（１）が、
（２）を上回ってもよい。一実施形態では、（１）が、（２）を下回ってもよい。一実施
形態では、（１）および（２）が同一であってもよく、例えば、それぞれが、その標的と
完全に相補的であってもよい。
一実施形態では、（１）コアドメインのヌクレオチドの修飾数（例えば、セクションＸ
からの修飾）、および（２）二次ドメインのヌクレオチドの修飾数（例えば、セクション
Ｘからの修飾）は、異なってもよい。一実施形態では、（１）が、（２）を下回ってもよ
い。一実施形態では、（１）が、（２）を上回ってもよい。一実施形態では、（１）およ
び（２）が同一であってもよく、例えば、それぞれが、修飾を含まなくてもよい。
＜第１および第２の相補的ドメイン＞
第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメインと相補的である。
典型的に第１のドメインは、第２の相補的ドメイン標的との正確な相補性を有しない。
一実施形態では、第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメインの対応するヌクレオチ
ドと相補的でない１、２、３、４または５ヌクレオチドを有し得る。一実施形態では、例
えば、３ヌクレオチドなどの１、２、３、４、５または６ヌクレオチドは、二本鎖中で対
合せず、例えば、非二重鎖領域またはループアウト領域を形成する。一実施形態では、例
えば、３ヌクレオチドのループアウトなどの不対またはループアウト領域が、第２の相補
的ドメイン上に存在する。一実施形態では、不対領域は、第２の相補的ドメインの５’末
端から例えば、４番目などの１、２、３、４、５、または６番目のヌクレオチドで開始す
る。
一実施形態では、相補性の程度は、ｇＲＮＡのその他の性質と合わせて、Ｃａｓ９分子
の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、
独立して、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋
／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、１６＋／−２、１
７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、もしくは２０＋／−２、２１＋／−２、２２
＋／−２、２３＋／−２、もしくは２４＋／−２ヌクレオチド長；
独立して、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９
、２０、２１、２２、２３、２４、２５、もしくは２６ヌクレオチド長；または
独立して、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、７〜１８、９〜１６
、もしくは１０〜１４ヌクレオチド長
である。
一実施形態では、第２の相補的ドメインは、例えば、第１の相補的ドメインよりもヌク
レオチドが６個分より長いなど、例えば、２、３、４、５、または６個分より長い。
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、例えば、セクション
Ｘで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、例えば、ドメインが
分解の影響を受けにくくする、または例えば、それをより低い免疫原性などより生体適合
性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、ドメインの骨格は、ホス
ホロチオエートにより、または、セクションＸからのその他の修飾により、修飾され得る
。一実施形態では、ドメインのヌクレオチドは、例えば、２’アセチル化、例えば、２’
メチル化、またはセクションＸからのその他の修飾などの２’修飾（例えば、リボース上
の２’位における修飾）を含み得る。
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、１、２、３、４、５
、６、７または８つ以上の修飾を含む。一実施形態では、第１および第２の相補的ドメイ
ンは、独立して、その５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４つの修飾
を含む。一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、その３’末端
の２ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、例えば、ドメインの
５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり
、またはドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌク
レオチドなどの２連続ヌクレオチドに、修飾を含む。一実施形態では、第１および第２の
相補的ドメインは、独立して、ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、ドメイ
ンの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、またはドメインの片方または双方の末端から
５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある修飾された２連続ヌクレオチドを含まない。
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、ドメインの５’末端の
５ヌクレオチド以内にあり、ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、またはド
メインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある、修飾さ
れたヌクレオチドを含まない。
相補的ドメイン中の修飾は、セクションＩＩＩに記載されるシステム中で候補修飾を試
験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ
、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補相補的ドメインを有するｇＲＮＡは、
セクションＩＩＩに記載されるシステム中で評価され得る。候補相補的ドメインは、選択
された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システ
ム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、
評価され得る。
一実施形態では、第１の相補的ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源
の第１の相補的ドメイン、または例えば、図１Ａ〜１Ｆなどで本明細書に記載される第１
の相補的ドメインなどの、参照の第１の相補的ドメインと、少なくとも６０、７０、８０
、８５％、９０％、または９５％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５、ま
たは６個以下のヌクレオチドが異なる。
一実施形態では、第２の相補的ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源
の第２の相補的ドメイン、または例えば、図１Ａ〜１Ｆなどで本明細書に記載される第２
の相補的ドメインなどの、参照の第２の相補的ドメインと、少なくとも６０、７０、８０
、８５％、９０％、または９５％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５、ま
たは６個以下のヌクレオチドが異なる。
第１および第２の相補的ドメインによって形成される二重鎖領域は、典型的に６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１ま
たは２２塩基対長である（任意のループアウトまたは不対ヌクレオチドを除いて）。
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇ
ＲＮＡ配列中の１１の対形成ヌクレオチドを含む（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太
字）。
Figure 2021192615
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇ
ＲＮＡ配列の１５の対形成ヌクレオチドを含む（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太字
）。
Figure 2021192615
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇ
ＲＮＡ配列中の１６の対形成ヌクレオチドを含む（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太
字）。
Figure 2021192615
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇ
ＲＮＡ配列中の２１の対形成ヌクレオチドを含む（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太
字）。
Figure 2021192615
一実施形態では、ヌクレオチドは、交換されて、例えばｇＲＮＡ配列中のポリＵ配列が
除去される（交換ヌクレオチドは下線付き）。
Figure 2021192615
＜５’伸長ドメイン＞
一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、第２の相補的ドメインに対して５’の追加的
な配列を含み得る。一実施形態では、５’伸長ドメインは、２〜１０、２〜９、２〜８、
２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４ヌクレオチド長である。一実施形態では、５’伸
長ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長以上である
。
一実施形態では、５’伸長ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＸで提供され
るタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、５’伸長ドメインは、
例えば、分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などによ
り生体適合性にするための修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、５’伸
長ドメインの骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションＸからのその他の
修飾により、、修飾され得る。一実施形態では、５’伸長ドメインのヌクレオチドは、例
えば、２’アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＸからのその他の修飾
などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位における修飾）を含み得る。
一実施形態では、５’伸長ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数
の修飾を含み得る。一実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ
分子中などのその５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修
飾を含む。一実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中な
どのその３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む
。
一実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌク
レオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または
５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌク
レオチドなどの２連続ヌクレオチドに、修飾を含む。一実施形態では、５’伸長ドメイン
の５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド
以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超え
て離れた２連続ヌクレオチドは、修飾されていない。一実施形態では、５’伸長ドメイン
の５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド
以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超え
て離れたクレオチドは、修飾されていない。
５’伸長ドメイン中の修飾は、セクションＩＩＩに記載されるシステム中で候補修飾を
試験することで評価されるｇＲＮＡ分子効率を妨げないように、選択され得る。選択され
た長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補５’伸長ドメインを有するｇＲ
ＮＡは、セクションＩＩＩに記載されるシステム中で評価され得る。候補５’伸長ドメイ
ンは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９
分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配
置されて、評価され得る。
一実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の５
’伸長ドメインと、例えば、図１Ａおよび図１Ｆで本明細書に記載される５’伸長ドメイ
ンなどの参照５’伸長ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０または９５
％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが
異なる。
＜連結ドメイン＞
単分子ｇＲＮＡ分子中では、連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインの間に
配置される。モジュラーｇＲＮＡ分子中では、２つの分子は、互いに相補的ドメインによ
って結合する。
一実施形態では、連結ドメインは、１０＋／−５、２０＋／−５、３０＋／−５、４０
＋／−５、５０＋／−５、６０＋／−５、７０＋／−５、８０＋／−５、９０＋／−５、
または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、連結ドメインは、２０＋／−１０、３０＋／−１０、４０＋／−１０
、５０＋／−１０、６０＋／−１０、７０＋／−１０、８０＋／−１０、９０＋／−１０
、または１００＋／−１０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、連結ドメインは、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７
０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０または１０〜１５ヌ
クレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、２０〜１００、２０〜９０、
２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、または２
０〜２５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、連結ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である
。
一実施形態では、連結ドメインは、共有結合である。
一実施形態では、連結ドメインは、典型的に、第１の相補的ドメインの３’末端および
／または第２の相補的ドメインの５’末端に隣接するもしくは末端から１、２もしくは３
ヌクレオチド以内である、二重鎖領域を含む。一実施形態では、二重鎖領域は、２０＋／
−１０、３０＋／−１０、４０、＋／−１０または５０＋／−１０塩基対の長さであり得
る。一実施形態では、二重鎖領域は、１０＋／−５、１５＋／−５、２０＋／−５、また
は３０＋／−５塩基対の長さであり得る。一実施形態では、二重鎖領域は、１、２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５塩基対の長さであ
り得る。
典型的に、二重鎖領域を形成する配列は、互いに正確な相補性を有するが、一実施形態
では１、２、３、４、５、６、７または８個程度の数のヌクレオチドが、対応するヌクレ
オチドと相補的でない。
一実施形態では、連結ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＸで提供されるタ
イプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、連結ドメインは、例えば、
分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生体適
合性にするための修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、連結ドメインの
骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションＸからのその他の修飾により、
、修飾され得る。一実施形態では、連結ドメインのヌクレオチドは、例えば、２’アセチ
ル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＸからのその他の修飾などの２’修飾（
例えば、リボース上の２’位における修飾）を含み得る。
一実施形態では、連結ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の修
飾を含み得る。
連結ドメイン中の修飾は、セクションＩＩＩに記載されるシステム中で候補修飾を試験
することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、
配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補連結ドメインを有するｇＲＮＡは、セク
ションＩＩＩに記載されるシステム中で評価され得る。候補連結ドメインは、選択された
標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に
、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価さ
れ得る。
一実施形態では、連結ドメインは、例えば、図１Ｂ〜１Ｅで本明細書に記載される連結
ドメインなどの参照連結ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０または９
５％の相同性を有し、またそれと１、２、３、４、５，または６個以下のヌクレオチドが
異なる。
＜隣接ドメイン＞
一実施形態では、隣接ドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２
、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１４＋／
−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、または２０＋／−２
ヌクレオチド長である。
一実施形態では、隣接ドメインは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
１４、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０、７〜１８、９〜１６、または１０〜１４
ヌクレオチド長である。
一実施形態では、隣接ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＸで提供されるタ
イプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、隣接ドメインは、例えば、
分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生体適
合性にするための修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、隣接ドメインの
骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションＸからのその他の修飾により、
、修飾され得る。一実施形態では、隣接ドメインのヌクレオチドは、例えば、２’アセチ
ル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＸからのその他の修飾などの２’修飾（
例えば、リボース上の２’位における修飾）を含み得る。
一実施形態では、隣接ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の修
飾を含み得る。一実施形態では、隣接ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中な
どのその５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む
。一実施形態では、標的ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその３’
末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。
一実施形態では、隣接ドメインは、例えば、隣接ドメインの５’末端の５ヌクレオチド
以内にあり、隣接ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または隣接ドメイン
の片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２
連続ヌクレオチドの修飾を含む。一実施形態では、隣接ドメインの５’末端の５ヌクレオ
チド以内にあり、隣接ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または隣接ドメ
インの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドは、
修飾されていない。一実施形態では、隣接ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあ
り、隣接ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または隣接ドメインの片方ま
たは双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れたヌクレオチドは、修飾されていない。
隣接ドメイン中の修飾は、セクションＩＩＩに記載されるシステム中で候補修飾を試験
することで評価されるｇＲＮＡ分子効率を妨げないように、選択され得る。選択された長
さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補隣接ドメインを有するｇＲＮＡは、
セクションＩＩＩに記載されるシステム中で評価され得る。候補隣接ドメインは、選択さ
れた標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム
中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評
価され得る。
一実施形態では、隣接ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の隣接ド
メインと、または例えば、図１Ａ〜１Ｆで本明細書に記載される隣接ドメインなどの参照
隣接ドメインと、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の
相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５，または６個以下のヌクレオチドが異な
る。
＜テールドメイン＞
一実施形態では、テールドメインは、１０＋／−５、２０＋／−５、３０＋／−５、４
０＋／−５、５０＋／−５、６０＋／−５、７０＋／−５、８０＋／−５、９０＋／−５
、または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、テールドメインは、２０＋／−５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、テールドメインは、２０＋／−１０、３０＋／−１０、４０＋／−１
０、５０＋／−１０、６０＋／−１０、７０＋／−１０、８０＋／−１０、９０＋／−１
０、または１００＋／−１０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、テールドメインは、２５＋／−１０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、テールドメインは、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜
７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０または１０〜１５
ヌクレオチド長である。
一実施形態では、テールドメインは、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜
７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、または２０〜２５ヌクレオチ
ド長である。
一実施形態では、テールドメインは、１〜２０、１〜１、１〜１０、または１〜５ヌク
レオチド長である。
一実施形態では、テールドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＸで提供される
タイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、テールドメインは、例え
ば、分解の影響を受けにくくする修飾や、または例えば、より低い免疫原性などにより生
体適合性にするための修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、テールドメ
インの骨格は、ホスホロチオエートにより、または、セクションＸからのその他の修飾に
より、、修飾され得る。一実施形態では、テールドメインのヌクレオチドは、例えば、２
’アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＸからのその他の修飾などの２
’修飾（例えば、リボース上の２’位における修飾）を含み得る。
一実施形態では、テールドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の
修飾を有し得る。一実施形態では、標的ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内
に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。一実施形態では、標的ドメインは、そ
の３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。
一実施形態では、テールドメインは、テール二重鎖領域を形成し得る、テール二本鎖ド
メインを含む。一実施形態では、テール二重鎖領域は、３、４、５、６、７、８、９、１
０、１１、または１２塩基対の長さであり得る。一実施形態では、テール二重鎖ドメイン
に対して３’に、さらなる一本鎖ドメインが存在する。一実施形態では、このドメインは
、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長である。一実施形態では、こ
れは、４〜６ヌクレオチド長である。
一実施形態では、テールドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ
）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の天然起源のテールド
メイン、または例えば、図１Ａおよび図１Ｃ〜１Ｆで本明細書に記載されるテールドメイ
ンなどの参照テールドメインと、少なくとも６０、７０、８０、または９０％の相同性を
有し、または１、２、３、４、５，または６個以下のヌクレオチドが異なる。
一実施形態では、隣接およびテールドメインは、両者あわせて、以下の配列を構成する
。
Figure 2021192615
一実施形態では、テールドメインは、例えば、転写のためにＵ６プロモーターが使用さ
れる場合などに、３’配列ＵＵＵＵＵＵを含む。
一実施形態では、テールドメインは、例えば、転写のためにＨ１プロモーターが使用さ
れる場合などに、３’配列ＵＵＵＵを含む。
一実施形態では、テールドメインは、例えば、使用されるｐｏｌ−ＩＩＩプロモーター
の終結シグナル次第で、可変の３’Ｕの数を含む。
一実施形態では、テールドメインは、Ｔ７プロモーターが使用される場合、ＤＮＡテン
プレートに由来する可変の３’配列を含む。
一実施形態では、テールドメインは、例えば、ＲＮＡ分子を生成するためにインビトロ
転写が使用される場合などに、ＤＮＡテンプレートに由来する可変の３’配列を含む。
一実施形態では、テールドメインは、例えば、転写を駆動するためにｐｏｌ−ＩＩプロ
モーターが使用される場合などに、ＤＮＡテンプレートに由来する可変の３’配列を含む
。
テールドメイン中の修飾は、セクションＩＩＩに記載されるシステム中で候補修飾を試
験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ
、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補テールドメインを有するｇＲＮＡは、
セクションＩＩＩに記載されるシステム中で評価され得る。候補テールドメインは、選択
された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システ
ム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、
評価され得る。
一実施形態では、テールドメインは、例えば、テールドメインの５’末端の５ヌクレオ
チド以内にあり、テールドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、またはテール
ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチド
などの２連続ヌクレオチドの修飾を含む。一実施形態では、テールドメインの５’末端の
５ヌクレオチド以内にあり、テールドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、ま
たはテールドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌ
クレオチドは、修飾されていない。一実施形態では、テールドメインの５’末端の５ヌク
レオチド以内にあり、テールドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、またはテ
ールドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れたヌクレオチドは
、修飾されていない。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、
５’［標的化ドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［連結ドメイン］−［第２の相
補的ドメイン］−［隣接ドメイン］−［テールドメイン］−３’の構造を有し、
式中、
標的化ドメインは、コアドメインおよび任意選択的に二次ドメインを含み、１０〜５０
ヌクレオチド長であり、
第１の相補的ドメインは、５〜２５ヌクレオチド長であり、一実施形態では、本明細書
で開示される参照の第１の相補的ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５
、９０、または９５％の相同性を有し、
連結ドメインは、１〜５ヌクレオチド長であり、
隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長であり、一実施形態では、本明細書で開示さ
れる参照隣接相補的ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、また
は９５％の相同性を有し、
かつ、
テールドメインは不在であり、またはヌクレオチド配列は、１〜５０ヌクレオチド長で
あり、一実施形態では、本明細書で開示される参照テールドメインと、少なくとも５０、
６０、７０、８０、８５、９０または９５％の相同性を有する。
＜代表的なキメラｇＲＮＡ＞
一実施形態では、単分子ｇＲＮＡまたはキメラｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３方
向に、
例えば、（標的核酸と相補的な）１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオ
チドなどを含む標的化ドメイン、
第１の相補的ドメイン、
連結ドメイン、
（第１の相補的ドメインと相補的な）第２の相補的ドメイン、
隣接ドメイン、および
テールドメイン
を含み、
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、両者あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５
、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含み；
（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、
２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあ
り；または
（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメイ
ンの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、
３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）からの配列は、天然起源のｇＲＮＡの
対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも６０、７５、８０
、８５、９０、９５、または９９％の相同性を有する。
一実施形態では、隣接およびテールドメインは、両者あわせて、少なくとも１５、１８
、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを
含む。
一実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも
１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌク
レオチドが存在する。
一実施形態では、第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の
相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、
３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド（例えば、１６、１
７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５連続ヌクレオチド）を含み、
それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９
、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオ
チド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオ
チド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオ
チド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオ
チド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオ
チド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオ
チド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオ
チド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオ
チド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオ
チド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオ
チド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオ
チド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは
、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド
）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオ
チド長である。隣接およびテールドメインは、両者あわせて、少なくとも１５、１８、２
０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む
。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオ
チド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオ
チド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオ
チド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオ
チド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオ
チド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオ
チド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオ
チド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオ
チド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオ
チド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオ
チド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオ
チド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオ
チド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長であり、隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオ
チド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオ
チド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオ
チド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオ
チド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオ
チド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオ
チド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオ
チド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長であり；第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオ
チド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオ
チド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオ
チド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオ
チド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオ
チド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオ
チド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオ
チド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオ
チド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオ
チド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ド
メインは、２５ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３
’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５
０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオ
チド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオ
チド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオ
チド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオ
チド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
＜代表的なモジュラーｇＲＮＡ＞
一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、
好ましくは、５’から３’方向に、
例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドを含む標的化ドメイ
ン、
第１の相補的ドメイン
を含む第１の鎖と、
好ましくは、５’から３’方向に、
任意選択的に、５’伸長ドメイン、
第２の相補的ドメイン、
隣接ドメイン、および
テールドメイン
を含む第２の鎖と
を含み、
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、両者あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５
、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含み、
（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、
２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあ
り、または
（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメイ
ンの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、
３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）からの配列は、天然起源のｇＲＮＡの
対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも６０、７５、８０
、８５、９０、９５、または９９％の相同性を有する。
一実施形態では、隣接およびテールドメインは、両者あわせて、少なくとも１５、１８
、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを
含む。
一実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも
１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌク
レオチドが存在する。
一実施形態では、第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の
相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、
３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、
１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレ
オチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長で
ある。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオ
チド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオ
チド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオ
チド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオ
チド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオ
チド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオ
チド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオ
チド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオ
チド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオ
チド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ド
メインは、２４ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオ
チド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオ
チド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオ
チド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオ
チド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオ
チド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオ
チド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオ
チド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオ
チド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオ
チド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオ
チド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオ
チド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオ
チド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオ
チド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオ
チド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオ
チド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオ
チド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオ
チド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオ
チド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオ
チド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオ
チド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオ
チド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオ
チド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオ
チド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオ
チド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオ
チド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオ
チド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオ
チド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオ
チド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオ
チド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオ
チド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオ
チド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオ
チド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオ
チド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、両者
あわせて、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、
５０、または５３ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオ
チド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌク
レオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４
５、４９、５０、または５３ヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオ
チド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例え
ば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応す
るヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少な
くとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５
４ヌクレオチドが存在する。
＜ｇＲＮＡをデザインする方法＞
標的ドメインを選択し、デザインし、検証する方法をはじめとする、ｇＲＮＡをデザイ
ンする方法が本明細書に記載される。代表的な標的化ドメインもまた、本明細書で提供さ
れる。本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるｇＲＮＡに組み込
むことができる。
標的配列の選択および検証、ならびにオフターゲット分析の方法は、例えば、Ｍａｌｉ
ｅｔ ａｌ．，２０１３ ＳＣＩＥＮＣＥ ３３９（６１２１）：８２３−８２６；Ｈ
ｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３ ＮＡＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，３１（９）：８２７−
３２；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ ＮＡＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，ｄｏｉ：１０．
１０３８／ｎｂｔ．２８０８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４４６３５７４；Ｈｅｉｇｗ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４ ＮＡＴ ＭＥＴＨＯＤＳ １１（２）：１２２−３．ｄ
ｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８１２．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４４８１２
１６；Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４ ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＰｕｂＭｅｄ
ＰＭＩＤ：２４４６３１８１；Ｘｉａｏ Ａ ｅｔ ａｌ．，２０１４ ＢＩＯＩＮＦ
ＯＲＭＡＴＩＣＳ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４３８９６６２に記載される。
例えば、ソフトウェアツールが利用されて、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲ
ット活性の最小化など、使用者の標的配列内のｇＲＮＡの選択が最適化され得る。オフタ
ーゲット活性は、切断以外であってもよい。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ）Ｃａｓ９を使用して、想定される各ｇＲＮＡ選択肢について、ツールは、最大で一
定の数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のミスマッチ塩
基対を含有する、（例えば、ＮＡＧまたはＮＧＧ ＰＡＭのどちらかに先行する）ゲノム
全体にわたる全てのオフターゲット配列を同定し得る。各オフターゲット配列における切
断効率は、例えば、実験的に誘導される重みづけスキームを使用して予測され得る。次に
、想定される各ｇＲＮＡが、その総予測オフターゲット切断に従って格付けされ、最高位
のｇＲＮＡは、最大のオンターゲットと最小のオフターゲット切断を有する可能性が高い
ものに相当する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築のための自動化された試薬デザイン、オンタ
ーゲットサーベイヤーアッセイ用のプライマーデザイン、および次世代シーケンシングを
介したオフターゲット切断のハイスループット検出と定量化のためのプライマーデザイン
などのその他の機能もまた、ツールに含め得る。候補ｇＲＮＡ分子は、当該技術分野で周
知の方法によって、または本明細書のセクションＩＶに記載されたようにして、評価され
得る。
［ＩＩ．Ｃａｓ９分子］
多様な生物種のＣａｓ９分子が、本明細書に記載される方法および組成物で使用され得
る。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子が、本明細書の開示の多くの対象である一方で、本明細
書で列挙されるその他の生物種からの、それに由来する、またはそのＣａｓ９タンパク質
をベースとする、Ｃａｓ９分子もまた使用され得る。換言すれば、本明細書の記述の多く
が、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子を利用する一方で、例えば、スタフィロコッカス・アウ
レウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）およびナイセリア・メニンジチ
ディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子などのその他
の生物種からのＣａｓ９分子が、それらを置き換え得る。追加的なＣａｓ９種としては、
アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス
・プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃ
ｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｉｓ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、アリシクリフィルス・デニ
トリフィカンス（Ａｌｉｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ｃｙ
ｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（
Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バ
チルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バ
クテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔ
ｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔ
ｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌ
ｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、
カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンジダツス・プ
ニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）（Ｃａ
ｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリ
チカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム
・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバク
テリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリ
ネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ
）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕ
ｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓ
ｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕ
ｍ）、ガンマプロテオバクテリア綱（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａ
ｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃ
ｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ
ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙ
ｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチ
ルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリ
ア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネ
ス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉ
ａｃｅａｅ）細菌、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロシナス
・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビ
ルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシ
リフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネ
レア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワー
シイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏ
ｓｏｍｏｎａｓ）種、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ
ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ
ａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈ
ａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニ
ア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルスト
リス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属（Ｒｈ
ｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌ
ｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス
・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカ
ス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ス
トレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌルム属（Ｓｕｂ
ｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉ
ｌｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、またはベルミネフロバクター・エ
イセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられる。
Ｃａｓ９分子は、本明細書での用法では、ｇＲＮＡ分子と相互作用し得て、ｇＲＮＡ分
子と協調して、標的ドメインおよびＰＡＭ配列を含む部位に局在する（例えば、標的とし
または追尾する）分子を指す。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子を切断する能力がある。標的核酸分子
を切断する能力があるＣａｓ９分子は、本明細書でｅａＣａｓ９（酵素的に活性なＣａｓ
９）分子と称される。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、以下の機能の１つまたは複
数を含む。
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を
切断する能力、
一実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわ
ち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力、
エンドヌクレアーゼ活性、
エキソヌクレアーゼ活性、および
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
一実施形態では、酵素的に活性なＣａｓ９またはｅａＣａｓ９分子は、双方のＤＮＡ鎖
を切断して、二本鎖切断をもたらす。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、例えば、そ
れに対してｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖、またはｇＲＮＡとハイブリダイズする鎖と
相補的な鎖などの１本の鎖のみを切断する。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、ＨＮ
Ｈ様ドメインに関連した切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、Ｎ末端
ＲｕｖＣ様ドメインに関連した切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、
ＨＮＨ様ドメインに関連した切断活性と、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連した切断活性
とを含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、活性のまたは切断能力があるＨＮＨ様
ドメインと、不活性のまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。一実施
形態では、ｅａＣａｓ９分子は、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインと、活
性のまたは切断能力があるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。
一実施形態では、標的核酸と相互作用して切断するｅａＣａｓ９分子の能力は、ＰＡＭ
配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。一実施形態では、標的核酸
の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。異なる細菌種からのｅａＣａｓ９分子は、異なる
配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識し得る。一実施形態では、Ｓ．ピオゲネス（
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧを認識して、その配
列から、例えば、３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導
する。例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１３；３３９（６１２１
）：８２３−８２６を参照されたい。一実施形態では、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧＮＧおよびＮＮＡＧＡ
ＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識して、これらの配列の例えば、３〜５塩基対などの１〜１
０塩基対上流で、コア標的核酸配列の切断を誘導する。例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ
ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１０；３２７（５９６２）：１６７−１７０、およびＤｅ
ｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；１９０（４）：１３９０
−１４００を参照されたい。一実施形態では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の
ｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧまたはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識して
、この配列の例えば、３〜５塩基対など１〜１０塩基対上流で、コア標的核酸配列切断を
誘導する。例えば、Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；
１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認
識して、例えば、その配列から３〜５塩基対上流などの１〜１０塩基対上流の標的核酸配
列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＮＮＧＡＴＴを認識して、例えば、その配
列から３〜５塩基対上流などの標的核酸配列の１〜１０塩基対上流の切断を誘導する。例
えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＥＡＲＬＹ ＥＤＩＴＩＯＮ ２０１３，１−
６を参照されたい。Ｃａｓ９分子が、ＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、Ｊｉｎｅｋ
ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２，３３７：８１６に記載される形質転換アッ
セイを使用して判定され得る。
いくつかのＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子と相互作用する能力を有し、ｇＲＮＡ分子と
併せて、コア標的ドメインを追尾する（例えば、標的化または局在化される）が、標的核
酸を切断できず、または効率的な速度で切断できない。切断活性を有しない、または実質
的に有しないＣａｓ９分子は、本明細書でｅｉＣａｓ９（酵素的に不活性なＣａｓ９）分
子と称される。例えば、ｅｉＣａｓ９分子は、切断活性を欠如し、または本明細書に記載
されるアッセイによる測定で、例えば、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、
１または０．１％未満である、実質的により低い切断活性を有し得る。
代表的な天然起源のＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ２０１３；１０：５，７２７−７３７に記載される。このようなＣａｓ９
分子としては、クラスター１細菌科、クラスター２細菌科、クラスター３細菌科、クラス
ター４細菌科、クラスター５細菌科、クラスター６細菌科、クラスター７細菌科、クラス
ター８細菌科、クラスター９細菌科、クラスター１０細菌科、クラスター１１細菌科、ク
ラスター１２細菌科、クラスター１３細菌科、クラスター１４細菌科、クラスター１５細
菌科、クラスター１６細菌科、クラスター１７細菌科、クラスター１８細菌科、クラスタ
ー１９細菌科、クラスター２０細菌科、クラスター２１細菌科、クラスター２２細菌科、
クラスター２３細菌科、クラスター２４細菌科、クラスター２５細菌科、クラスター２６
細菌科、クラスター２７細菌科、クラスター２８細菌科、クラスター２９細菌科、クラス
ター３０細菌科、クラスター３１細菌科、クラスター３２細菌科、クラスター３３細菌科
、クラスター３４細菌科、クラスター３５細菌科、クラスター３６細菌科、クラスター３
７細菌科、クラスター３８細菌科、クラスター３９細菌科、クラスター４０細菌科、クラ
スター４１細菌科、クラスター４２細菌科、クラスター４３細菌科、クラスター４４細菌
科、クラスター４５細菌科、クラスター４６細菌科、クラスター４７細菌科、クラスター
４８細菌科、クラスター４９細菌科、クラスター５０細菌科、クラスター５１細菌科、ク
ラスター５２細菌科、クラスター５３細菌科、クラスター５４細菌科、クラスター５５細
菌科、クラスター５６細菌科、クラスター５７細菌科、クラスター５８細菌科、クラスタ
ー５９細菌科、クラスター６０細菌科、クラスター６１細菌科、クラスター６２細菌科、
クラスター６３細菌科、クラスター６４細菌科、クラスター６５細菌科、クラスター６６
細菌科、クラスター６７細菌科、クラスター６８細菌科、クラスター６９細菌科、クラス
ター７０細菌科、クラスター７１細菌科、クラスター７２細菌科、クラスター７３細菌科
、クラスター７４細菌科、クラスター７５細菌科、クラスター７６細菌科、クラスター７
７細菌科、またはクラスター７８細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。
代表的な天然起源のＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌科のＣａｓ９分子が挙げ
られる。例としては、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、ＳＦ３７０、
ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡ
Ｓ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１およびＳＳＩ−１株）、
Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ＬＭＤ−９株）、Ｓ．
シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、ＳＰＩＮ ２００
２６株）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５
株）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、Ｓ．ガ
ロリチカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣＢＡＡ−
２０６９株）、Ｓ．エクイヌス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｕｓ）（Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば
、ＡＴＣＣ９８１２、ＭＧＣＳ１２４株）、Ｓ．ディスガラクチアエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌ
ａｃｔｉａｅ）（Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＧＧＳ１２４株）、Ｓ．ボ
ビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ７００３３８株）、Ｓ．アンギノーサス（Ｓ
．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、Ｆ０２１１株）、Ｓ．アガラクチアエ（Ｓ．ａｇａｌ
ａｃｔｉａｅ）（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、リステリア・モノサイトゲネス
（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、Ｆ６８５４株）、リステ
リア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎ
ｏｃｕａ））、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、ＤＳＭ １５９５２株）、または
エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば
、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子が挙げられる。追加的な例示的Ｃａｓ９分子は
、ナイセリア・メニンジチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（
Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３，１−６）のＣ
ａｓ９分子およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子である。
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分
子は、
本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列、または例えば、本明細書で列挙され、
またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３，１０：
５，７２７−７３７；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２
０１３，１−６に記載される、生物種からのＣａｓ９分子などの天然起源のＣａｓ９分子
配列と比較すると、
６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％
、９８％、または９９％の相同性を有し、
２、５、１０、１５、２０、３０、または４０％以下のアミノ酸残基が異なり、
少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、１００、８０、７０、
６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり、または
同一である、
アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、以下の機能の１つまたは複数を含む：ニッカーゼ活
性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活
性）；ヘリカーゼ活性；またはｇＲＮＡ分子と一緒に、標的核酸に局在化する能力。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、図２のコンセンサス配列のアミノ酸配列を含み、図
中、「＊」は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、およびＬ．イノキ
ュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９分子のアミノ酸配列中の対応する位置に見られる
任意のアミノ酸を示し、「−」は、任意のアミノ酸を示す。一実施形態では、Ｃａｓ９分
子は、図２で開示されるコンセンサス配列の配列と、少なくとも１個であるが、２、３、
４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。一実施形態では、
Ｃａｓ９分子は、図５の配列番号７のアミノ酸配列を含み、図中、「＊」は、Ｓ．ピオゲ
ネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ）のＣａｓ９分子のアミノ酸配列の対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し
、「−」は、任意のアミノ酸を示し、「−」は、任意のアミノ酸または不在を示す。一実
施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号６または７の配列と、少なくとも１個であるが、
２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。
いくつかのＣａｓ９分子の配列の比較は、特定領域が保存されていることを示唆する。
これらは、次のように同定される。
領域１（残基１〜１８０、または領域１’の場合は残基１２０〜１８０）
領域２（残基３６０〜４８０）；
領域３（残基６６０〜７２０）；
領域４（残基８１７〜９００）；および
領域５（残基９００〜９６０）。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、領域１〜５を含み、十分な追加的なＣａｓ９分子配
列と共に、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの活性を有するＣａｓ９分子な
どの生物活性分子を提供する。一実施形態では、領域１〜６のそれぞれは、独立して、例
えば、図２または図５からの配列などの本明細書に記載されるＣａｓ９分子の対応する残
基と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％または９９％の相同性を有する。
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分
子は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１
８０（番号付けは図２中のモチーフ配列に従い、図２中の４つのＣａｓ９配列中の５２％
の残基は保存的である）と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏ
ｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレ
ウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と、少なくと
も１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、９０、８０、７０、６０、５０、
４０または３０個以下のアミノ酸が異なり、または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏ
ｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレ
ウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の１〜１８０と同一である、
領域１と称されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分
子は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉ
ｎｎｏｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．
アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０（
図２中の４つのＣａｓ９配列の５５％の残基は保存的である）と、５５％、６０％、６５
％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または
９９％の相同性を有し、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉ
ｎｎｏｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．
アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と
、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、しかし、３５、３０、２５、２０または１
０個以下のアミノ酸が異なり、または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏ
ｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレ
ウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の１２０〜１８０と同一である、
領域１と称されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分
子は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉ
ｎｎｏｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．
アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０（
図２中の４つのＣａｓ９配列の５２％の残基は保存的である）と、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％または９９％の相同性を有し、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉ
ｎｎｏｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．
アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と
、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、しかし、３５、３０、２５、２０または１
０個以下のアミノ酸が異なり、または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏ
ｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレ
ウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の３６０〜４８０と同一である、
領域２と称されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分
子は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉ
ｎｎｏｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．
アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０（
図２中の４つのＣａｓ９配列の５６％の残基は保存的である）と、５５％、６０％、６５
％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または
９９％の相同性を有し、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉ
ｎｎｏｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．
アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と
、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、しかし、３５、３０、２５、２０または１
０個以下のアミノ酸が異なり、または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏ
ｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレ
ウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の６６０〜７２０と同一である、
領域３と称されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分
子は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉ
ｎｎｏｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．
アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００（
図２中の４つのＣａｓ９配列の５５％の残基は保存的である）と、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％または９９％の相同性を有し、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉ
ｎｎｏｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．
アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と
、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、しかし、３５、３０、２５、２０または１
０個以下のアミノ酸が異なり、または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏ
ｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレ
ウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の８１７〜９００と同一である、
領域４と称されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分
子は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉ
ｎｎｏｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．
アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０（
図２中の４つのＣａｓ９配列の６０％の残基は保存的である）と、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％または９９％の相同性を有し、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉ
ｎｎｏｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．
アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と
、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、しかし、３５、３０、２５、２０または１
０個以下のアミノ酸が異なり、または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏ
ｃｕａ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．アウレ
ウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の９００〜９６０と同一である、
領域５と称されるアミノ酸配列を含む。
＜ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン＞
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインおよびＲｕｖＣ様ドメインを含む
。一実施形態では、切断活性は、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインに依存する
。例えば、ｅａＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子は、以下のドメイン
の１つまたは複数を含み得る：ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン。一実施形態
では、Ｃａｓ９分子はｅａＣａｓ９分子であり、ｅａＣａｓ９分子は、例えば、以下に記
載されるＲｕｖＣ様ドメインなどのＲｕｖＣ様ドメイン、および／または例えば、以下に
記載されるＨＮＨ様ドメインなどのＨＮＨ様ドメインを含む。一実施形態では、Ｃａｓ９
分子は、参照Ｃａｓ９分子と比較して、ＲｕｖＣ様ドメインおよび／またはＨＮＨ様ドメ
イン中に１つまたは複数の差異を含むｅｉＣａｓ９分子であり、ｅｉＣａｓ９分子は核酸
を切断せず、または例えば、切断アッセイで野性型と比較した場合に、野性型よりも有意
により低い効率で切断し、例えば、明細書に記載されるように、本明細書に記載されるア
ッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の５０、２５、１０、または１％未満の効率で切
断する。
＜ＲｕｖＣ様ドメイン＞
一実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本
鎖を切断する。Ｃａｓ９分子は、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、１、２、３つ
以上のＲｕｖＣ様ドメイン）を含み得る。一実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、少な
くとも５、６、７、８アミノ酸長であるが、２０、１９、１８、１７、１６または１５ア
ミノ酸長以下である。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、例えば、約１５アミノ酸長など
の約１０〜２０個のアミノ酸のＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含む。
＜Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン＞
いくつかの天然起源のＣａｓ９分子は、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメインを含み、切断は
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに依存する。したがって、Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様
ドメインを含み得る。代表的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、以下に記載される。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、
式Ｉ：
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号８）
のアミノ酸配列を含むＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択
され）、
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およ
びＩから選択され）、
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択
され、
Ｘ４は、Ｓ、Ｙ、Ｎ、およびＦ（例えば、Ｓ）から選択され、
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから
選択され）、
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され、
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）
、
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬ
から選択され）、かつ、
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されまたは不在である（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ
、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、および
Δから選択される）。
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号８の配列と、１程度であるが
、２、３、４、または５以下の数の残基が異なる。
実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がある。
実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がない。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、
式ＩＩ：
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号９）
のアミノ酸配列を含むＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択
され）、
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およ
びＩから選択され）、
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択
され、
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから
選択され）、
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され、
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）
、
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬ
から選択され）、かつ、
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されまたは不在である（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ
、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、および
Δから選択される）。
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号９の配列と、１程度であるが
、２、３、４、または５以下の数の残基が異なる。
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、
式ＩＩＩ：
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１０）
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およ
びＩから選択され）、
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択
され、
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬ
から選択され）、かつ、
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されまたは不在である（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ
、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、および
Δから選択される）。
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１０の配列と、１程度である
が、２、３、４、または５以下の数の残基が異なる。
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＩＩ：
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｖ−Ｘ（配列番号１１）
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘは、非極性アルキルアミノ酸またはヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Ｘは、Ｖ
、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される（例えば、ｅａＣａｓ９分子は、図２に示されるＮ末
端ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る（「Ｙ」として示される））。
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１１の配列と、１程度である
が、２、３、４、または５以下の数の残基が異なる。
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、本明細書の図３Ａまたは図５
で開示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１程度であるが、２、３、４、または
５以下の数の残基が異なる。一実施形態では、図３Ａまたは図５で同定される高度に保存
された残基の１つ、２つ、または３つ全てが存在する。
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、本明細書の図３Ｂで開示され
るＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１程度であるが、２、３、４、または５以下の数
の残基が異なる。一実施形態では、図３Ｂで同定される高度に保存された残基の１つ、２
つ、３つまたは４つ全てが存在する。
＜追加的なＲｕｖＣ様ドメイン＞
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに加えて、例えば、ｅａＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子は
、１つまたは複数の追加的なＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。一実施形態では、Ｃａｓ９
分子は、２つの追加的なＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。好ましくは、追加的なＲｕｖＣ
様ドメインは、例えば、１５未満のアミノ酸長、例えば、５〜１０アミノ酸長、例えば、
８アミノ酸長などの少なくとも５アミノ酸長である。
追加的なＲｕｖＣ様ドメインは、
Ｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｅ−Ｘ３−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１２）
のアミノ酸配列を含むことができ、
式中、
Ｘ１はＶまたはＨであり、
Ｘ２はＩ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）であり、かつ、
Ｘ３はＭまたはＴである。
一実施形態では、追加的なＲｕｖＣ様ドメインは、
Ｉ−Ｖ−Ｘ２−Ｅ−Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１３）
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘ２はＩ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）である（例えば、ｅａＣａｓ９分子は、
図２または図５に示される追加的なＲｕｖＣ様ドメインを含み得る（「Ｂ」として示され
る））。
追加的なＲｕｖＣ様ドメインは、
Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｘ１−Ｄ−Ａ−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１４）
のアミノ酸配列を含むことができ、
式中、
Ｘ１はＨまたはＬであり、
Ｘ２はＲまたはＶであり、かつ、
Ｘ３はＥまたはＶである。
一実施形態では、追加的なＲｕｖＣ様ドメインは、
Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｈ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｌ（配列番号１５）
のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、追加的なＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１３、１５、１２または１
４の配列と、１程度であるが、２、３、４、または５以下の数の残基が異なる。
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインの隣接領域に位置する配列は、
式Ｖ：
Ｋ−Ｘ１’−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｚ−Ｔ−Ｄ−Ｘ９’−Ｙ（配列番号１６）
の配列であり、
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＰから選択され、
Ｘ２’はＶ、Ｌ、Ｉ、およびＦ（例えばＶ、Ｉ、およびＬ）から選択され、
Ｘ３’は、Ｇ、Ａ、およびＳ（例えば、Ｇ）から選択され、
Ｘ４’はＬ、Ｉ、Ｖ、およびＦ（例えば、Ｌ）から選択され、
Ｘ９’は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱから選択され、かつ、
Ｚは、例えば、上述されるようなＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインである。
＜ＨＮＨ様ドメイン＞
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖などの一本鎖
相補的ドメインを切断する。一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、少なくとも１５、２
０、２５アミノ酸長であるが、４０、３５または３０以下のアミノ酸長であり、例えば、
２０〜３５アミノ酸長、例えば、２５〜３０アミノ酸長である。代表的なＨＮＨ様ドメイ
ンは、以下に記載される。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、
式ＶＩ：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−
Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２
１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号１７）
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、Ｑ、およびＮ（例えば、ＤおよびＥ）から選択され、
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され、
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され、
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され、
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され、
Ｘ７は、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｔ、およびＫ（例えば、ＳおよびＡ）から選択され、
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から
選択され、
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され、
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され、
Ｘ１１は、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、およびＴ（例えば、Ｄ）から選択され、
Ｘ１２は、Ｄ、Ｎ、およびＳから選択され、
Ｘ１３は、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＲ（例えば、Ｓ）から選択され、
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、お
よびＦ）から選択され、
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択
され、
Ｘ１６は、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、およびＦ（例えば、Ｌ、Ｒ、およびＫ）から選択され
、
Ｘ１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、およびＴから選択され、
Ｘ１８は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＡ（例えば、ＬおよびＩ）から選択され、
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され、
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡ
から選択され、
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され、
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され
、かつ、
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから
選択される。
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１７の配列と、少なくとも１個である
が、２、３、４、または５個以下の残基が異なる。
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がある。
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がない。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、
式ＶＩＩ：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ
−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配
列番号１８）
のアミノ酸配列を含むＨＮＨ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され、
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され、
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され、
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され、
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から
選択され、
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され、
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され、
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、お
よびＦ）から選択され、
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択
され、
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され、
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡ
から選択され、
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され、
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され
、かつ、
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから
選択される。
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１８の配列と、１、２、３、４、また
は５個の残基が異なる。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、
式ＶＩＩ：
Ｘ１−Ｖ−Ｘ３−Ｈ−Ｉ−Ｖ−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１
４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号１９
）
のアミノ酸配列を含むＨＮＨ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、およびＷから選択され、
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から
選択され、
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され、
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され、
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、お
よびＦ）から選択され、
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択
され、
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡ
から選択され、
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され、
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され
、かつ、
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから
選択される。
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１９の配列と、１、２、３、４、また
は５個の残基が異なる。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、
式ＶＩＩＩ：
Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｈ−Ｉ−Ｘ５−Ｐ−Ｑ−Ｘ７−Ｆ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｘ１２−Ｓ−Ｉ
−Ｄ−Ｎ−Ｘ１６−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｓ−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２０）
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ２は、ＩおよびＶから選択され、
Ｘ５は、ＩおよびＶから選択され、
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され、
Ｘ９は、ＩおよびＬから選択され、
Ｘ１０は、ＫおよびＴから選択され、
Ｘ１２は、ＤおよびＮから選択され、
Ｘ１６は、Ｒ、Ｋ、およびＬから選択され、
Ｘ１９は、ＴおよびＶから選択され、
Ｘ２０は、ＳおよびＲから選択され、
Ｘ２２は、Ｋ、Ｄ、およびＡから選択され、かつ、
Ｘ２３は、Ｅ、Ｋ、Ｇ、およびＮから選択される（例えば、ｅａＣａｓ９分子は、本明
細書に記載されるようなＨＮＨ様ドメインを含み得る）。
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２０の配列と、１程度であるが、２、
３、４、または５以下の数の残基が異なる。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、
式ＩＸ：
Ｌ−Ｙ−Ｙ−Ｌ−Ｑ−Ｎ−Ｇ−Ｘ１’−Ｄ−Ｍ−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｘ５’
−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｘ６’−Ｘ７’−Ｌ−Ｓ−Ｘ８’−Ｙ−Ｚ−Ｎ−Ｒ−Ｘ９’−Ｋ−Ｘ１０
’−Ｄ−Ｘ１１’−Ｖ−Ｐ（配列番号２１）
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＲから選択され、
Ｘ２’は、ＶおよびＴから選択され、
Ｘ３’は、ＧおよびＤから選択され、
Ｘ４’は、Ｅ、Ｑ、およびＤから選択され、
Ｘ５’は、ＥおよびＤから選択され、
Ｘ６’は、Ｄ、Ｎ、およびＨから選択され、
Ｘ７’は、Ｙ、Ｒ、およびＮから選択され、
Ｘ８’は、Ｑ、Ｄ、およびＮから選択され、
Ｘ９’は、ＧおよびＥから選択され、
Ｘ１０’は、ＳおよびＧから選択され、
Ｘ１１’は、ＤおよびＮから選択され、かつ、
Ｚは、例えば、上述されるようなＨＮＨ様ドメインである。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、配列番号２１の配列と、１程度であるが、２、
３、４、または５以下の数の残基が異なる、アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、本明細書の図４Ａまたは図５で開示さ
れるＨＮＨ様ドメインの配列と、１程度であるが、２、３、４、または５以下の数の残基
が異なる。
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、本明細書の図４Ｂで開示されるＨＮＨ
様ドメインの配列と、１程度であるが、２、３、４、または５以下の数の残基が異なる。
一実施形態では、図４Ｂで同定される高度に保存された残基の１つ、２つ、３つ全てが存
在する。
＜改変Ｃａｓ９分子＞
天然起源のＣａｓ９分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌク
レアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と機
能的に結合する能力；および核酸上の部位を標的化する（またはそれに局在化する）能力
（例えば、ＰＡＭ認識および特異性）をはじめとするいくつかの特性を有する。一実施形
態では、Ｃａｓ９分子は、これらの特性の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態
では、Ｃａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子と相互作用する能力を有し、ｇＲＮＡ分子と協調し
て、核酸中の部位に局在化する。例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活
性などのその他の機能は、Ｃａｓ９分子中でより幅広く変動し得る。
所望の特性があるＣａｓ９分子は、いくつかの方法で生成されることができ、例えば、
天然起源のＣａｓ９分子などの親Ｃａｓ９分子を改変して、所望の特性を有する改変Ｃａ
ｓ９分子が提供される。例えば、親Ｃａｓ９分子との比較で、１つまたは複数の変異また
は差異が導入され得る。このような変異および差異は、置換（例えば、保存的置換または
非必須アミノ酸置換）、挿入、または欠失を含む。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、参
照Ｃａｓ９分子と比較して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０
、３０、４０または５０の変異であるが、２００、１００、または８０未満の変異などの
１つまたは複数の変異または差異を含み得る。
一実施形態では、１つのの変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣ
ａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有しない。一実施形態では、１つの
変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活
性に対する実質的効果を有する。一実施形態では、代表的な機能は、ＰＡＭ特異性、切断
活性、およびヘリカーゼ活性の１つまたは複数を含む。変異は、例えば、例えば、Ｎ末端
ＲｕｖＣ様ドメインなどの１つまたは複数のＲｕｖＣ様ドメイン；ＨＮＨ様ドメイン；Ｒ
ｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン外の領域に存在し得る。一実施形態では、変異
は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン内に存在する。一実施形態では、変異は、ＨＮＨ様ドメイ
ン内に存在する。一実施形態では、変異は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ド
メインの双方に存在する。
例えば、置換などの特定の配列が、標的化活性、切断活性などの１つまたは複数の活性
に影響を及ぼしてもよいかどうかは、例えば、変異が保存的であるかどうかを評価するこ
とで、またはセクションＩＩＩに記載される方法によって、評価または予測され得る。一
実施形態では、Ｃａｓ９分子の文脈で使用されるような「非必須」アミノ酸残基は、Ｃａ
ｓ９活性（例えば、切断活性）を無効化することなく、またはより好ましくは、実質的に
改変することなく、例えば、ｅａＣａｓ９分子のような天然起源のＣａｓ９分子などのＣ
ａｓ９分子の野生型配列から改変され得る残基である一方で、「必須」アミノ酸残基の変
更は、実質的な活性（例えば、切断活性）喪失をもたらす。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、図２で開示されるコンセンサス配列に示される
、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の固定アミノ酸残基を含むｅａＣａｓ９分子
であり、図２または配列番号７で開示されるコンセンサス配列中の「−」によって表わさ
れる１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０
、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）のアミノ酸配列と異なる（例えば、置換を有する）１つまたは複数のアミノ酸を有す
る。一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子はｅｉＣａｓ９分子であり、その中で、図２で開
示されるコンセンサス配列に示されるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の固定ア
ミノ酸残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、
１００、２００アミノ酸残基）の１つまたは複数は、変異型である。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、
図２で開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２で開示されるコ
ンセンサス配列中の固定残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異
なり、
図２で開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの天然起源のＣ
ａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０
、２５、３０、３５、または４０％以下異なり、かつ、
図２で開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの天然起源のＣ
ａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２５、３０、３
５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる、
配列を含む。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、図２で開示されるコンセンサス配列に示される
、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の固定アミノ酸残基を含むｅａ
Ｃａｓ９分子であり、図２で開示されるコンセンサス配列中の「−」によって表わされる
１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８
０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）のアミノ酸配列と異なる（例えば、置換を有する）１つまたは複数のアミノ
酸を有する。一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子はｅｉＣａｓ９分子であり、その中で、
図２で開示されるコンセンサス配列に示されるＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）の固定アミノ酸残基（例えば，２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０
、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）の１つまたは複数は、変異型である
。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、
図２で開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２で開示されるコ
ンセンサス配列中の固定残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異
なり、
図２で開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子などの
天然起源のＣａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０
、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なり、かつ、
図２で開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子などの
天然起源のＣａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２
５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる、
配列を含む。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、図２で開示されるコンセンサス配列に示される
、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の固定アミノ酸残基を含むｅａＣａｓ９分子で
あり、図２で開示されるコンセンサス配列中の「−」によって表わされる１つまたは複数
の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１０
０、２００アミノ酸残基）に、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のアミノ酸配列と
異なる（例えば、置換を有する）１つまたは複数のアミノ酸を有する。一実施形態では、
改変Ｃａｓ９分子はｅｉＣａｓ９分子であり、その中で、図２で開示されるコンセンサス
配列に示されるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の固定アミノ酸残基（例えば、２
、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸
残基）の１つまたは複数は、変異型である。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、
図２で開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２で開示されるコ
ンセンサス配列中の固定残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異
なり、
図２で開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｃａｓ９分子などの天然起源のＣａ
ｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、
２５、３０、３５、または４０％以下異なり、かつ、
図２で開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｃａｓ９分子などの天然起源のＣａ
ｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５
、４０、４５、５５、または６０％以下異なる、
配列を含む。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、図２で開示されるコンセンサス配列に示される
、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕｌａ）の固定アミノ酸残基
を含むｅａＣａｓ９分子であり、図２で開示されるコンセンサス配列中の「−」によって
表わされる１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０
、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏ
ｃｕａ）（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕｌａ）のアミノ酸配列と異なる（例えば、置換を有する）１
つまたは複数のアミノ酸を有する。一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子はｅｉＣａｓ９分
子であり、その中で、図２で開示されるコンセンサス配列に示されるＬ．イノキュア（Ｌ
．ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕｌａ）の固定アミノ酸残基（例えば、２、３、５
、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）の
１つまたは複数は、変異型である。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、
図２で開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２で開示されるコ
ンセンサス配列中の固定残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異
なり、
図２で開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕｌａ）Ｃａｓ９
分子などの天然起源のＣａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４
、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なり、かつ、
図２で開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列
が、例えば、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕｌａ）Ｃａｓ９
分子などの天然起源のＣａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５
、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる、
配列を含む。
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子などの改変Ｃａｓ
９分子は、例えば、異なる生物種の２つ以上の天然起源のＣａｓ９分子などの２つ以上の
異なるＣａｓ９分子の融合物であり得る。例えば、１つの生物種の天然起源のＣａｓ９分
子断片が、第２の生物種のＣａｓ９分子断片に融合され得る。一例として、Ｎ末端Ｒｕｖ
Ｃ様ドメインを含むＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の断片が、ＨＮＨ
様ドメインを含むＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の生物種（例えば、Ｓ．
サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））のＣａｓ９の断片に融合され得る。
＜ＰＡＭ認識が改変されたまたはＰＡＭ認識がないＣａｓ９分子＞
天然起源のＣａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．
サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎ
ｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）について、上に記載されるＰＡＭ認識配列などの特定のＰＡＭ配列
を認識し得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然起源のＣａｓ９分子と同一のＰＡＭ特異性を有
する。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然起源のＣａｓ９分子と関連しないＰＡＭ特
異性を有し、またはそれが最も近い配列相同性を有する天然起源のＣａｓ９分子と関連し
ないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然起源のＣａｓ９分子は改変されることができ、
例えば、ＰＡＭ認識が改変されて、例えば、Ｃａｓ９分子が認識するＰＡＭ配列が改変さ
れて、オフターゲット部位が減少されおよび／または特異性が改善され；またはＰＡＭ認
識要求が排除される。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は改変されることができ、例えば、
ＰＡＭ認識配列の長さが伸長され、および／またはＣａｓ９特異性が高同一性レベルに改
善されて、オフターゲット部位が減少されて、特異性が増大される。一実施形態では、Ｐ
ＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長
である。異なるＰＡＭ配列を認識する、および／またはオフターゲット活性の低下を有す
るＣａｓ９分子は、指向性進化を使用して生成され得る。Ｃａｓ９分子の指向性進化のた
めに使用され得る代表的な方法およびシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．
，ＮＡＴＵＲＥ ２０１１，４７２（７３４４）：４９９−５０３に記載される。候補Ｃ
ａｓ９分子は、例えば、セクションＩＩＩに記載される方法によって評価され得る。
＜非切断および修飾切断Ｃａｓ９分子＞
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然起源のＣａｓ９分子と異なる切断特性を含み、
例えば、それは最も近い相同性を有する天然起源のＣａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａ
ｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの天然起源のＣ
ａｓ９分子と、例えば、次のように異なり得る：例えば、天然起源のＣａｓ９分子（例え
ば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子）と比較して、二本鎖切断（
エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）を調節する能力が、例えば
、低下または増大され；例えば、天然起源のＣａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ
．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の
相補鎖などの核酸の一本鎖の切断（ニッカーゼ活性）を調節する能力が、例えば、低下ま
たは増大され；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能
力が、排除され得る。
＜修飾切断ｅａＣａｓ９分子＞
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、以下の機能の１つまたは複数を含む：Ｎ末端Ｒ
ｕｖＣ様ドメインに関連した切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連した切断活性；ＨＮＨド
メインに関連した切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連した切断活性。
一実施形態ではｅａＣａｓ９分子は、活性のまたは切断能力があるＨＮＨ様ドメイン（
例えば、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１
などの本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメイン）と、不活性なまたは切断能力がないＮ末
端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。代表的な不活性のまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ
様ドメインは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン中にアスパラギン酸の変異を有することができ
、例えば、図２で開示されるコンセンサス配列の９位のアスパラギン酸、または配列番号
７の１０位のアスパラギン酸が、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅ
ａＣａｓ９は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず
、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断
活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃ
ａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフ
ィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然起源のＣａｓ９
分子などの天然起源未修飾Ｃａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子
は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然起源のＣａｓ９分子である。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメイン
と、活性のまたは切断能力がある、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、配列番号８、配
列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４ま
たは配列番号１５などの本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメイン）とを含む。代表的な不
活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインは、以下の１つまたは複数の変異を有し得
る：例えば、図２で開示されるコンセンサス配列の８５６位のヒスチジンなどのＨＮＨ様
ドメイン中のヒスチジンが、例えば、アラニンで置換され得る；例えば、図２で開示され
るコンセンサス配列の８７０位のアスパラギン、および／または図２で開示されるコンセ
ンサス配列の８７９位のアスパラギンなどのＨＮＨ様ドメイン中の１つまたは複数のアス
パラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９は、ＨＮ
Ｈ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に
記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１ま
たは０．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．
ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然起源のＣａｓ９分子などの天然起源未修飾Ｃ
ａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性また
は相同性を有する天然起源のＣａｓ９分子である。
＜非切断ｅｉＣａｓ９分子＞
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、核酸分子（二本鎖のまたは一本鎖核酸分子のい
ずれも）を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照
Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率
で核酸分子を切断する、ｅｉＣａｓ９分子である。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピ
オゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉ
ｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子のような、天然起源のＣａｓ９分子などの天然起源の
未修飾Ｃａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同
一性または相同性を有する天然起源のＣａｓ９分子である。一実施形態では、ｅｉＣａｓ
９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連した実質的な切断活性と、ＨＮＨ様ドメイン
に関連した切断活性とを欠く。
一実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子は、不活性のまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ
様ドメインを含む。代表的な不活性のまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは
、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン中にアスパラギン酸の変異を有することができ、例えば、図
２で開示されるコンセンサス配列の９位のアスパラギン酸、または配列番号７の１０位の
アスパラギン酸が、例えば、アラニンで置換され得る。
一実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子は、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメイン
（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列
番号１３、配列番号１４または配列番号１５などの本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメイ
ン）を含む。代表的な不活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインは、以下の１つま
たは複数の変異を有し得る：例えば、図２で開示されるコンセンサス配列の８５６位のヒ
スチジンなどのＨＮＨ様ドメイン中のヒスチジンが、例えば、アラニンで置換され得る；
例えば、図２で開示されるコンセンサス配列の８７０位のアスパラギン、および／または
図２で開示されるコンセンサス配列の８７９位のアスパラギンなどのＨＮＨ様ドメイン中
の１つまたは複数のアスパラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。
触媒能のないＣａｓ９分子は、転写リプレッサーと融合してもよい。ｅｉＣａｓ９融合
タンパク質は、ｇＲＮＡと複合体形成して、ｇＲＮＡの標的化ドメインによって特定化さ
れたＤＮＡ配列に局在するが、ｅａＣａｓ９とは異なり、それは標的ＤＮＡを切断しない
。ｅｉＣａｓ９への転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインの融合は、ｇＲＮＡに
よって特定化された任意のＤＮＡ部位へのエフェクターの動員を可能にする。遺伝子プロ
モーター領域へのｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質の部位特異的標的化は
、プロモーター領域、転写因子（例えば、転写アクチベーター）および／または転写エン
ハンサーに対するＲＮＡポリメラーゼ結合を妨げて、転写活性化が阻害され得る。代案と
しては、遺伝子プロモーター領域に対する転写リプレッサーへのｅｉＣａｓ９融合物の部
位特異的標的化を使用して、転写活性が低下され得る。
ｅｉＣａｓ９分子に融合されてもよい転写抑制因子または転写リプレッサードメインと
しては、Ｋｒｕｐｐｅｌ結合ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相
互作用ドメイン（ＳＩＤ）またはＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）が挙げられる。
別の実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子は、クロマチンを修飾するタンパク質と融合され
てもよい。例えば、ｅｉＣａｓ９分子は、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、ヒ
ストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、Ｇ
９Ａ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１、Ｐｒ−ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４−２０Ｈ１、ＲＩＺ１）
、ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＬＳＤ１／ＢＨＣ１１０、ＳｐＬｓｄ１／Ｓｗ
，１／Ｓａｆ１１０、Ｓｕ（ｖａｒ）３−３、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２
Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、Ｒｐｈ１、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、
ＪＡＲ１Ｄ１Ｂ／ＰＬＵ−１、ＪＡＲ１Ｄ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、
Ｌｉｄ、Ｊｈｎ２、Ｊｍｊ２）、ヒストンリジンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、
ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、Ｒｐｄ３、Ｈｏｓ１、Ｃｉｒ６、ＨＤＡＣ４、Ｈ
ＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、Ｈｄａ１、Ｃｉｒ３、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、Ｓ
ｉｒ２、Ｈｓｔ１、Ｈｓｔ２、Ｈｓｔ３、Ｈｓｔ４、ＨＤＡＣ１１）、およびＤＮＡメチ
ラーゼ（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２ａ／ＤＭＮＴ３ｂ、ＭＥＴ１）に融合されてもよい。ｅ
ｉＣａｓ９−クロマチン改変分子融合タンパク質を使用して、クロマチン状態を改変して
標的遺伝子の発現が低下され得る。
異種配列（例えば、転写リプレッサードメイン）が、ｅｉＣａｓ９タンパク質のＮまた
はＣ末端に融合されてもよい。代案の実施形態では、異種配列（例えば、転写リプレッサ
ードメイン）が、ｅｉＣａｓ９タンパク質の内部（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端以外の
部分）に融合されてもよい。
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は、例えば、
本明細書のセクションＩＩＩに記載される方法によって評価され得る。ｅａＣａｓ９また
はｅｉＣａｓ９のいずれかのＣａｓ９分子の活性はまた、単独でまたはｇＲＮＡ分子との
複合体中で、遺伝子発現アッセイおよび例えば、クロマチン免疫沈降法（ＣｈｉＰ）およ
びクロマチンインビボアッセイ（ＣｉＡ）などのクロマチンベースのアッセイをはじめと
する、当該技術分野で周知の方法によって評価されてもよい。
＜Ｃａｓ９分子をコードする核酸＞
例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子をコードする核
酸が、本明細書で提供される。
代表的なＣａｓ９分子をコードする核酸は、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ
２０１３，３９９（６１２１）：８１９−８２３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＣＥＬＬ
２０１３，１５３（４）：９１０−９１８；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ
２０１３，３９９（６１２１）：８２３−８２６；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩ
ＥＮＣＥ ２０１２，３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載される。Ｎ．メニンジ
チディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子をコードする別の代表的な核酸
は、図６に示される。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば
、合成核酸分子は、例えば、セクションＸに記載されるようにして、化学修飾され得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９のｍＲＮＡは、例えば、以下の全てなどの、以下の１つまたは
複数の特性を有する：キャッピングされ、ポリアデニル化され、５−メチルシチジンおよ
び／またはシュードウリジンで置換される。
それに加えてまたは代案としては、合成核酸配列は、コドン最適化されることができ、
例えば、少なくとも１つの一般的でないコドンまたはあまり一般的でないコドンは、一般
的コドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される
哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を
誘導し得る。
それに加えて、または代案としては、Ｃａｓ９分子をコードする核酸は、核局在化配列
（ＮＬＳ）を含んでもよい。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。
以下に提供されるのは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子をコー
ドする代表的なコドン最適化核酸配列である。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
以下に提供されるのは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の対応
するアミノ酸配列である。
Figure 2021192615
以下に提供されるのは、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａ
ｓ９分子をコードする代表的なコドン最適化核酸配列である。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
以下に提供されるのは、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａ
ｓ９分子の対応するアミノ酸配列である。
Figure 2021192615
以下に提供されるのは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子のアミノ酸
配列である。
Figure 2021192615
上のいずれかのＣａｓ９配列が、Ｃ末端のペプチドまたはポリペプチドと融合する場合
（例えば、Ｃ末端転写リプレッサーと融合するｅｉＣａｓ９）、停止コドンは除去される
ものと理解される。
＜その他のＣａｓ分子＞
本明細書で開示される発明は、様々なタイプのＣａｓ分子を使用して実施され得る。一
実施形態では、ＩＩ型ＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。一実施形態では、その
他のＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型Ｃａｓ分子
が使用されてもよい。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、例えば、Ｈａｆ
ｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ ２００５
，１（６）：ｅ６０、およびＭａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩ
ＥＷ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ２０１１，９：４６７−４７７に記載され、双方の参
考文献は、その内容全体が参照により本明細書に援用される。代表的なＣａｓ分子（およ
びＣａｓシステム）は、表ＩＩ−１にもまた示される。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
［ＩＩＩ．候補分子の機能解析］
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当
該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価され得る。例
えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性評価する代表的な方法は、例えば、Ｊｉｎ
ｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２；３３７（６０９６）：８１６−８２１
に記載される。
＜結合および切断アッセイ：Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を試験する＞
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラス
ミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成またはインビトロ転写ｇＲＮ
Ａ分子が、９５℃に加熱して緩やかに室温に冷却することで、反応に先だってプレアニー
ルされる。天然または制限消化直線化プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））が、
１０ｍＭのＭｇＣｌ２存在下または不在下において、Ｃａｓ９プラスミド切断緩衝液（２
０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍ
ＭのＥＤＴＡ）中の精製Ｃａｓ９タンパク質分子（５０〜５００ｎＭ）およびｇＲＮＡ（
５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に、３７℃で６０分間インキュベートされる。反応は、
５×ＤＮＡローディングバッファー（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭ
のＥＤＴＡ）によって停止され、０．８または１％アガロースゲル電気泳動法によって分
離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Ｃａｓ９分子
が、双方のＤＮＡ鎖を切断するか、または二本鎖の１本のみを切断するかどうかを示す。
例えば、直鎖ＤＮＡ生成物は、双方のＤＮＡ鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成
物は、二本鎖の１本のみが切断されていることを示す。
あるいは、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は
、オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、ＤＮＡオ
リゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ）が、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中
の５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび約３〜６ｐｍｏｌ（約２０〜４０ｍＣｉ
）の［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰと、５０μＬの反応物中において３７℃で３０分間インキュ
ベートされることで、放射性標識される。加熱不活性化（６５℃で２０分間）後、カラム
に通して反応物が精製され、組み込まれていない標識が除去される。標識オリゴヌクレオ
チドと、等モル量の未標識相補的オリゴヌクレオチドとの９５℃で３分間のアニーリング
によって、二本鎖基質（１００ｎＭ）が生成され、室温への緩やかな冷却がそれに続く。
切断アッセイでは、９５℃で３０秒間加熱することでｇＲＮＡ分子がアニールされ、室温
への緩やかな冷却がそれに続く。Ｃａｓ９（５００ｎＭ最終濃度）が、切断アッセイ緩衝
液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１
ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）中のアニールされたｇＲＮＡ分子（５００ｎＭ）と共
に、総容積９μｌでプレインキュベートされる。１μｌの標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の添加
によって反応が開始され、３７℃で１時間インキュベートされる。２０μｌのローディン
グ色素（ホルムアミド中の５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％ＳＤＳ、５％グリセロール）
の添加によって反応物がクエンチされ、９５℃で５分間加熱される。分解産物は、７Ｍ尿
素を含有する１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ホスホロイメージングに
よって視覚化される。得られた分解産物は、相補鎖、非相補鎖、またはその双方が切断さ
れたかどうかを示す。
これらのアッセイの片方または双方を使用して、候補ｇＲＮＡ分子または候補Ｃａｓ９
分子の適合性が評価され得る。
＜結合アッセイ：Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を試験する＞
Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を評価する代表的な方法は、例えば、Ｊｉｎｅｋ
ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２；３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載
される。
例えば、電気泳動移動度シフト解析では、脱イオン水中で各鎖（１０ｎｍｏｌ）を混合
して、９５℃で３分間加熱し、室温に緩やかに冷却することで、標的ＤＮＡ二本鎖が形成
される。全てのＤＮＡは、１×ＴＢＥを含有する８％天然ゲル上で精製される。ＤＮＡバ
ンドは、ＵＶシャドーイングによって視覚化され、切除されて、ゲル小片をＤＥＰＣ処理
Ｈ２Ｏに浸漬することで溶出される。溶出されＤＮＡは、エタノール沈殿されて、ＤＥＰ
Ｃ処理Ｈ２Ｏに溶解される。ＤＮＡサンプルは、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを使用して、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼにより３７℃で３０分間にわたり５’末端標識される。ポリ
ヌクレオチドキナーゼは、６５℃で２０分間加熱変性され、カラムを使用して、組み込ま
れていない放射性標識が除去される。結合アッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．
５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％グリセロ
ールを含有する緩衝液中で、総容積１０μｌで実施される。Ｃａｓ９タンパク質分子は、
等モル量のプレアニールｇＲＮＡ分子でプログラムされて、１００ｐＭから１μＭに滴定
される。放射性標識ＤＮＡが、２０ｐＭの最終濃度に添加される。サンプルは、３７℃で
１時間インキュベートされ、１×ＴＢＥおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する８％天然ポ
リアクリルアミドゲル上で、４℃で分離される。ゲルは乾燥されて、ＤＮＡはホスホロイ
メージングによって視覚化される。
［ＩＶ．テンプレート核酸（ゲノム編集アプローチ）］
「テンプレート核酸」および「交換核酸」という用語は、この文献およびその優先権書
類において同義的に使用され，同一の意味を有する。
例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１
５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ
−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３
、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子また
は経路の変異は、本明細書で考察されるアプローチの１つを使用して修正されてもよい。
一実施形態では、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１
４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ
−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−
１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩＩで、本明細書に記載さ
れる遺伝子または経路の変異は、テンプレート核酸を使用して、相同指向修復（ＨＤＲ）
によって修正される（セクションＩＶ．１を参照されたい）。一実施形態では、例えば、
セクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ
−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、Ｖ
ＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸ
ＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路の変
異は、テンプレート核酸を使用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復によって修正され
る（セクションＩＶ．２を参照されたい）。
［ＩＶ．１ ＨＤＲ修復およびテンプレート核酸］
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導相同指向修復（ＨＤＲ）を使用して、
標的配列が改変され、ゲノム内変異が修正（例えば、修復または編集）され得る。理論に
よる拘束は望まないが、標的配列の改変は、ドナーテンプレートまたはテンプレート核酸
による相同指向修復（ＨＤＲ）によって起きると考えられる。例えば、ドナーテンプレー
トまたはテンプレート核酸は、標的配列の改変を提供する。プラスミドドナーは、相同組
換えのためのテンプレートとして利用され得ることが検討される。一本鎖ドナーテンプレ
ートが、標的配列およびドナーテンプレート間で、交互の相同指向修復（例えば、一本鎖
アニーリング）方法による標的配列改変のためのテンプレートとして、使用され得ること
がさらに検討される。ドナーテンプレートがもたらす標的配列の改変は、Ｃａｓ９分子に
よる切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断または２つの一本鎖切断を含み
得る。
一実施形態では、変異は、単一の二本鎖切断または２つの一本鎖切断のどちらかによっ
て修正され得る。一実施形態では、変異は、（１）単一の二本鎖切断、（２）２つの一本
鎖切断、（３）切断が標的配列上の各側で起きる、２つの二本鎖切断、（４）二本鎖切断
および２つの一本鎖切断が標的配列上の各側で起きる、１つの二本鎖切断および２つの一
本鎖切断、または（５）１対の一本鎖切断が標的配列上の各側で起きる、４つの一本鎖切
断によって修正され得る。
＜二本鎖切断により媒介される修正＞
一実施形態では、二本鎖切断は、ＨＮＨ様ドメインに関連した切断活性と、例えば、Ｎ
末端ＲｕｖＣ様ドメインなどのＲｕｖＣ様ドメインに関連した切断活性とを有する、例え
ば、野性型Ｃａｓ９などのＣａｓ９分子によってもたらされる。このような実施形態では
、単一ｇＲＮＡのみが必要である。
＜一本鎖切断により媒介される修正＞
一実施形態では、２つの一本鎖切断、またはニックは、例えば、ＨＮＨ様ドメインに関
連した切断活性またはＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連した切断活性などのニッカーゼ活
性を有する、Ｃａｓ９分子によってもたらされる。このような実施形態は、各一本鎖切断
の配置のために、２つのｇＲＮＡを必要とする。一実施形態では、ニッカーゼ活性を有す
るＣａｓ９分子は、それにｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断するが、それにｇＲＮ
Ａハイブリダイズする鎖と相補的な鎖は切断しない。一実施形態では、ニッカーゼ活性を
有するＣａｓ９分子は、それにｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断せず、むしろそれ
にｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖と相補的な鎖を切断する。
一実施形態では、ニッカーゼはＨＮＨ活性を有し、例えば、ＲｕｖＣ活性を有するＣａ
ｓ９分子、例えば、Ｄ１０Ａ変異などの変異をＤ１０に有するＣａｓ９分子が、不活性化
される。Ｄ１０ＡはＲｕｖＣを不活性化し；したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼはＨＮＨ活
性（のみ）を有して、それにｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖（例えば、その上にＮＧＧ
ＰＡＭを有しない相補鎖）を切断する。一実施形態では、例えば、Ｈ８４０ＡなどのＨ
８４０変異を有するＣａｓ９分子が、ニッカーゼとして使用され得る。Ｈ８４０ＡはＨＮ
Ｈを不活性化し；したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼはＲｕｖＣ活性（のみ）を有して、非
相補鎖（例えば、ＮＧＧ ＰＡＭを有して、その配列がｇＲＮＡと同一である鎖）を切断
する。
ニッカーゼおよび２つのｇＲＮＡが使用されて、２つの一本鎖ニックが配置される一実
施形態では、１つのニックは標的核酸の＋鎖上に、もう１つのニックは−鎖上に配置され
る。ＰＡＭは、外側を向く。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが、約０〜５０、０〜１００、または
０〜２００ヌクレオチドによって隔てられるように、選択され得る。一実施形態では、２
つのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補的な標的配列間には、重複がない。一実施形態では
、ｇＲＮＡは重複せず、５０、１００、または２００個程度のヌクレオチドによって隔て
られる。一実施形態では、２つのｇＲＮＡの使用は、例えば、オフターゲット結合を低下
させることで、特異性を増大させ得る（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＥＬＬ ２０１３）。
一実施形態では、単一ニックを使用して、ＨＤＲが誘発され得る。単一ニックを使用し
て、所与の切断部位におけるＨＲとＮＨＥＪとの比率が増大され得ることが、本明細書で
検討される。
＜標的位置に対する二本鎖切断または一本鎖切断の配置＞
鎖の１つ中の二本鎖切断または一本鎖切断は、修正が起こるように、標的位置と十分に
近くあるべきである。一実施形態では、距離は、５０、１００、２００、３００、３５０
または４００ヌクレオチド以下である。理論による拘束は望まないが、切断は、末端切除
中にエキソヌクレアーゼ媒介性除去を受ける領内にあるように、標的位置と十分に近くあ
るべきであると考えられる。ドナー配列は末端切除領域内の配列を修正するのみに使用さ
れてもよいので、標的位置と切断の間の距離が大きすぎると、変異が末端切除に含まれず
、したがって修正されないこともある。
ＨＤＲ媒介性の修正を誘導する目的で、ｇＲＮＡ（単分子の（またはキメラ）またはモ
ジュラーｇＲＮＡ）およびＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を誘導する一実施形態では
、切断部位は、標的位置から０〜２００ｂｐ（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１
２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５
〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０
〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７
５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００ｂｐ）離れている。一実施形態
では、切断部位は、標的位置から０〜１００ｂｐ（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２
５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５または７５〜１
００ｂｐ）離れている。
ＨＤＲ媒介性の修正を誘導する目的で、Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体形成する２つのｇ
ＲＮＡ（独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ）が、２つの一本
鎖切断を誘導する一実施形態では、より近いニックは、標的位置から０〜２００ｂｐ（例
えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２
５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜
７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜
１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５
〜１００ｂｐ）離れており、２つのニックは、理想的には、互いに２５〜５５ｂｐ（例え
ば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜５５、３０
〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５、３５〜５５、３５〜５０、３５〜４５、
３５〜４０、４０〜５５、４０〜５０、４０〜４５ｂｐ）以内にあり、互いに１００ｂｐ
以下離れている（例えば、互いに９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１
０または５ｂｐ以下離れている）。一実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜１０
０ｂｐ（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５
０、５０〜１００、５０〜７５または７５〜１００ｂｐ）離れている。
一実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮ
Ａである２つのｇＲＮＡは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置させるように構成される
。交互の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇ
ＲＮＡである３つのｇＲＮＡは、二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがｃａｓ９ヌク
レアーゼと複合体形成する）と、２つの一本鎖切断または対での一本鎖切断（すなわち、
２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）とが、標的位置の両側に配置さ
れるように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡが使用されて標的位置の上流（すなわち
、５’）が標的化され、第２のｇＲＮＡが使用されて標的位置の下流（すなわち、３’）
が標的化される）。別の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）また
はモジュラーｇＲＮＡである４つのｇＲＮＡは、２つの対の一本鎖切断（すなわち、２対
の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）が、標的位置の両側に生じる
ように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡが使用されて標的位置の上流（すなわち、５
’）が標的化され、第２のｇＲＮＡが使用されて標的位置の下流（すなわち、３’）が標
的化される）。二本鎖切断、または対の２つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には
、標的位置の０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３０
０、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にある。ニッカーゼが
使用される場合、対の２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０
、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜
５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３
５〜４５、または４０〜４５ｂｐの間）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、
８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
一実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮ
Ａである２つのｇＲＮＡは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置させるように構成される
。交互の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇ
ＲＮＡである３つのｇＲＮＡは、二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがｃａｓ９ヌク
レアーゼと複合体形成する）と、２つの一本鎖切断または対の一本鎖切断（すなわち、２
つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）とが、標的位置の両側に配置され
るように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡが使用されて、例えば、セクションＶＩＩ
Ｂで、例えば、表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−
１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩ
Ｉ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、また
はセクションＶＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路の変異の上流（すなわ
ち、５’）が標的化され、第２のｇＲＮＡが使用されて、例えば、セクションＶＩＩＢで
、例えば、表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７
、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−
２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセ
クションＶＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路の変異の下流（すなわち、
３’）を標的化する）。別の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）
またはモジュラーｇＲＮＡである４つのｇＲＮＡは、２対の一本鎖切断（すなわち、２対
の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）が、標的位置の両側に生じる
ように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡが使用されて、本明細書に記載される遺伝子
または経路の変異の上流（すなわち、５’）が標的化され、第２のｇＲＮＡが使用されて
、本明細書に記載される遺伝子または経路の変異の下流（すなわち、３’）が標的化され
る）。二本鎖切断、または対の２つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位
置の０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５
０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にある。ニッカーゼが使用され
る場合、対の２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜
４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３
５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５
、または４０〜４５ｂｐの間）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７
０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
＜相同性アームの長さ＞
相同性アームは、例えば、切除された一本鎖オーバーハングが、ドナーテンプレート内
に相補領域を見つけられるように、少なくとも末端切除が起こってもよい領域にまで伸び
るべきである。全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケージング限界などのパラ
メータによって制限され得る。一実施形態では、相同性アームは、例えば、ＡＬＵ反復、
ＬＩＮＥ反復などの反復要素中には及ばない。
代表的な相同性アーム長としては、少なくとも５０、１００、２５０、５００、７５０
または１０００ヌクレオチドが挙げられる。
標的位置は、本明細書の用法では、Ｃａｓ９分子依存過程によって修飾される、標的核
酸（例えば、染色体）上の部位を指す。例えば、標的位置は、例えば、標的位置の修正な
どの標的核酸の修飾Ｃａｓ９分子切断、およびテンプレート核酸指向修飾であり得る。一
実施形態では、標的位置は、例えば、その中に１つまたは複数のヌクレオチドが付加され
る、標的核酸上の隣接するヌクレオチドなどの２ヌクレオチド間の部位であり得る。標的
位置は、テンプレート核酸によって、例えば、修正などの改変を受けた１つまたは複数の
ヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、標的位置は、標的配列（例えば、それに
ｇＲＮＡが結合する配列）内にある。一実施形態では、標的位置は、標的配列（例えば、
ｇＲＮＡが結合する配列）の上流または下流にある。
テンプレート核酸は、本明細書での用法では、Ｃａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを併用し
て、標的位置の構造が改変され得る核酸配列を指す。「テンプレート核酸」という用語は
、優先権書類および本明細書で使用される「交換核酸」という用語と同義である。「テン
プレート核酸」および「交換核酸」という用語は、全く同じ意味を有し、および同義的に
使用され得る。一実施形態では、標的核酸は、典型的に、切断部位のまたはその近くのテ
ンプレート核酸配列の一部または全部を有するように修飾される。一実施形態では、テン
プレート核酸は一本鎖である。交互の実施形態では、テンプレート核酸は二本鎖である。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、二本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡである。交互
の実施形態では、テンプレート核酸は一本鎖ＤＮＡである。
一実施形態では、テンプレート核酸は、相同指向修復事象に関与することで、標的位置
の構造を変化させる。一実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置の配列を変化させ
る。一実施形態では、テンプレート核酸は、標的核酸への修飾されたまたは非天然起源の
ヌクレオチドの組み込みをもたらす。
典型的に、テンプレート配列は、標的配列との切断媒介性組換えまたは触媒組換えを受
ける。一実施形態では、テンプレート核酸は、ｅａＣａｓ９媒介性の切断事象によって切
断される、標的配列上の部位に対応する配列を含む。一実施形態では、テンプレート核酸
は、第１のＣａｓ９媒介事象において切断される標的配列上の第１の部位と、第２のＣａ
ｓ９媒介事象において切断される標的配列上の第２の部位との双方に対応する配列を含む
。
一実施形態では、テンプレート核酸は、翻訳配列のコード配列に改変をもたらす配列、
例えば、タンパク質生成物中の１つのアミノ酸の別のアミノ酸による置換をもたらすもの
、例えば、変異対立遺伝子を野性型対立遺伝子に形質転換する、野性型対立遺伝子を変異
対立遺伝子に形質転換する、および／または停止コドン、アミノ酸残基挿入、アミノ酸残
基の欠失、またはナンセンス変異を導入する配列を含み得る。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、エクソンの改変、または５’または３
’非翻訳または非転写領域の改変などの改変を非コード配列にもたらす配列を含み得る。
このような変更としては、例えば、プロモーター、エンハンサーなどの制御要素の改変、
およびシス作用性またはトランス作用性制御要素の改変が挙げられる。
例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１
５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ
−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３
、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子また
は経路中の標的位置との相同性を有するテンプレート核酸を使用して、標的配列の構造が
改変され得る。テンプレート配列を使用して、例えば、望まれないまたは変異ヌクレオチ
ドなどの望まれない構造が改変され得る。
テンプレート核酸は、組み込まれると、
正の制御要素の活性低下、
正の制御要素の活性増大、
負の制御要素の活性低下、
負の制御要素の活性増大、
遺伝子の発現低下、
遺伝子の発現増大、
障害または疾患に対する耐性増大、
ウイルス侵入に対する耐性増大、
望まれないアミノ酸残基の変異または改変の補正、
例えば、酵素の酵素活性の増大、または遺伝子産物が別の分子と相互作用する能力の増
大などの遺伝子産物の生物学的特性の付与、増大、無効化または低下
がもたらされる配列を含み得る。
テンプレート核酸は、標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２個以上のヌクレオチド配列中の変化をもたらす配列を含み得る。
一実施形態では、テンプレート核酸は、２０＋／−１０、３０＋／−１０、４０＋／−
１０、５０＋／−１０、６０＋／−１０、７０＋／−１０、８０＋／−１０、９０＋／−
１０、１００＋／−１０、１１０＋／−１０、１２０＋／−１０、１３０＋／−１０、１
４０＋／−１０、１５０＋／−１０、１６０＋／−１０、１７０＋／−１０、１８０＋／
−１０、１９０＋／−１０、２００＋／−１０、２１０＋／−１０、または２２０＋／−
１０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、テンプレート核酸は、３０＋／−２０、４０＋／−２０、５０＋／−
２０、６０＋／−２０、７０＋／−２０、８０＋／−２０、９０＋／−２０、１００＋／
−２０、１１０＋／−２０、１２０＋／−２０、１３０＋／−２０、１４０＋／−２０、
１５０＋／−２０、１６０＋／−２０、１７０＋／−２０、１８０＋／−２０、１９０＋
／−２０、２００＋／−２０、２１０＋／−２０、または２２０＋／−２０ヌクレオチド
長である。
一実施形態では、テンプレート核酸は、１０〜１，０００、２０〜９００、３０〜８０
０、４０〜７００、５０〜６００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜
２００、または５０〜１００ヌクレオチド長である。
テンプレート核酸は、以下の構成要素を含む。
［５’相同性アーム］−［置換配列］−［３’相同性アーム］
相同性アームは、染色体中への組換えを提供し、したがって例えば、シグネチャの変異
などの望まれない要素を、置換配列で置換する。一実施形態では、相同性アームは、ほと
んどの遠位切断部位の隣接領域に位置する。
一実施形態では、５’相同性アームの３’末端は、置換配列の５’末端に隣接する位置
である。一実施形態では、５’相同性アームは、置換配列５’末端から５’に少なくとも
１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７
００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドにわたり延長
し得る。
一実施形態では、３’相同性アームの５’末端は、置換配列の３’末端に隣接する位置
である。一実施形態では、３’相同性アームは、置換配列３’末端から３’に少なくとも
１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７
００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドにわたり延長
され得る。
片方または双方の相同性アームが短縮されて、例えば、Ａｌｕ反復、ＬＩＮＥ要素など
の特定の配列反復要素の包含が回避されてもよいことが、本明細書で検討される。例えば
、５’相同性アームが短縮されて、配列反復要素が回避されてもよい。一実施形態では、
３’相同性アームが短縮されて、配列反復要素が回避されてもよい。一実施形態では、５
’および３’相同性アームの双方が短縮されて、特定の配列反復要素の包含が回避されて
もよい。
一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）として使用される、変異を修正するためのテ
ンプレート核酸が設計されてもよいことが、本明細書で検討される。ｓｓＯＤＮが使用さ
れる場合、５’および３’相同性アームは、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１０
０、１２５、１５０、１７５、または２００ｂｐ長などの最高約２００塩基対（ｂｐ）長
の範囲であってもよい。オリゴヌクレオチド合成の改善を継続するｓｓＯＤＮのためのよ
り長い相同性アームもまた、検討される。
一実施形態では、ｓｓＯＤＮを使用して、例えば、セクションＶＩＩＢで、例えば、表
ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−１７、ＶＩＩ−１
８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩＩ−２３、ＶＩＩ
−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、またはセクションＶＩ
ＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路び変異が修正されてもよい。
［ＩＶ．２ 遺伝子ターゲッティングのためのＮＨＥＪアプローチ］
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用し
て、標的遺伝子特異的ノックアウトが実施され得る。ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪはまた、
対象遺伝子中の配列を除去す（例えば、欠失させ）るのにも使用され得る。
理論による拘束は望まないが、一実施形態では、本明細書に記載される方法に関連する
ゲノムの改変は、ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪと、ＮＨＥＪ修復経路の誤りがちな性質とに
依存すると考えられる。ＮＨＥＪは、２つの末端を共に連結することで、ＤＮＡ中の二本
鎖切断を修復するが、しかし、通常、元の配列は、それらが二本鎖切断によって形成され
た真にその通りの２つの適合性末端が、完璧にライゲートされた場合に限り、復元される
。二本鎖切断のＤＮＡ末端は、しばしば酵素的プロセッシングの対象であり、末端の再結
合に先だって、片方または双方の鎖に、ヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。
これは、ＮＨＥＪ修復部位におけるＤＮＡ配列の挿入および／または欠失（インデル）変
異の存在をもたらす。これらの変異の３分の２は、典型的に、読み枠を改変し、したがっ
て、非機能性タンパク質が生じる。それに加えて、読み枠を維持するが、顕著な量の配列
を挿入または欠失させる変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。タンパク質の重要な
機能ドメインの変異は、重要でない領域の変異よりもおそらく許容性が低いので、これは
遺伝子座依存性である。
ＮＨＥＪによって生成されるインデル変異は、自然界では予測不可能であるが、しかし
、所与の切断部位では、おそらく小規模なマイクロホモロジー領域のために、特定のイン
デル配列が好まれ、母集団中で大きな比率を占める。欠失の長さは、幅広く変動し得て、
最も一般的には、１〜５０ｂｐの範囲であるが、それらは１００〜２００ｂｐを超える範
囲に容易に達し得る。挿入はより短い傾向があり、多くの場合、切断部位に隣接して取り
囲む、短い配列重複を含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合
、挿入配列は、多くの場合、ゲノムのその他の領域に、または細胞内に存在するプラスミ
ドＤＮＡにトレースされている。
ＮＨＥＪは変異原性過程であるので、特定の最終配列の生成が要求されない限り、それ
はまた小規模な配列モチーフを欠失させるのにも使用され得る。二本鎖切断が、短い標的
配列の近くで標的化される場合、ＮＨＥＪによって引き起こされる修復欠失変異は、頻繁
に望まれないヌクレオチドに及び、したがってそれを除去する。より大型のＤＮＡ断片の
欠失では、配列の両側に１つずつ２つの二本鎖切断が導入されて、介在配列全体が除去さ
れ、末端の間にＮＨＥＪがもたらされ得る。これらのアプローチの双方を使用して、特定
のＤＮＡ配列が欠失され得るが、しかし、ＮＨＥＪの誤りがちな性質は、修復部位に、イ
ンデル変異をなおも生成してもよい。
二本鎖を切断するｅａＣａｓ９分子と一本鎖の双方、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９
分子を、本明細書に記載される方法および組成物で使用して、ＮＨＥＪ媒介性インデルが
生成され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域のようなコード領域などの遺伝子に
標的化されるＮＨＥＪ媒介性インデルを使用して、対象遺伝子がノックアウト（すなわち
発現排除）され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第１のエク
ソン内の、または転写開始部位の５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３
５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０ｂｐ未満）の転写開始部位直
後の配列を含む。
＜標的位置に対する二本鎖または一本鎖切断の配置＞
ＮＨＥＪ媒介性インデルを誘導する目的で、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼが二
本鎖切断を生じる一実施形態では、例えば、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇ
ＲＮＡ分子などのｇＲＮＡが、１つの二本鎖切断を標的位置のヌクレオチド近傍に配置さ
せるように構成される。一実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜５００ｂｐ（例
えば、標的位置から５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２５
、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れている。
ＮＨＥＪ媒介性インデルを誘導する目的でＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する２つの
ｇＲＮＡが、２つの一本鎖切断を誘導する一実施形態では、例えば、独立して、単分子（
またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである２つのｇＲＮＡが、標的位置のヌクレオ
チドにＮＨＥＪ修復を提供するように、２つの一本鎖切断を配置させるように構成される
。一実施形態では、ｇＲＮＡは、切断を異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌ
クレオチド以内に、配置させるように構成されて、二本鎖切断が本質的に模倣される。一
実施形態では、より近いニックは、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３
０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れ
ており、２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５
、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜
５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、ま
たは４０〜４５ｂｐ）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０
、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。一実施形態では、ｇＲＮＡ
は、一本鎖切断を標的位置のヌクレオチドのどちらかの側に配置させるように構成される
。
二本鎖を切断するｅａＣａｓ９分子と一本鎖の双方、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９
分子を、本明細書に記載される方法および組成物で使用して、標的位置の両側に切断が生
成され得る。二本鎖または対形成一本鎖切断は、標的位置の（例えば、セクションＶＩＩ
Ｂで、例えば、表ＶＩＩ−１３、ＶＩＩ−１４、ＶＩＩ−１５、ＶＩＩ−１６、ＶＩＩ−
１７、ＶＩＩ−１８、ＶＩＩ−１９、ＶＩＩ−２０、ＶＩＩ−２１、ＶＩＩ−２２、ＶＩ
Ｉ−２３、ＶＩＩ−２４、ＩＸ−１、ＩＸ−１Ａ、ＩＸ−３、またはＸＩＩ−１で、また
はセクションＶＩＩＩで、本明細書に記載される遺伝子または経路の、両側に生成されて
、２つの切断で核酸配列が除去されてもよい（例えば、２つの切断間の領域が欠失される
）。一実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲ
ＮＡである２つのｇＲＮＡは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置させるように構成され
る（例えば、第１のｇＲＮＡが使用されて、本明細書に記載される遺伝子または経路の変
異の上流（すなわち、５’）が標的化され、第２のｇＲＮＡが使用されて、本明細書に記
載される遺伝子または経路の変異の下流（すなわち、３’）が標的化される）。交互の実
施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡであ
る３つのｇＲＮＡは、二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがｃａｓ９ヌクレアーゼと
複合体形成する）と、２つの一本鎖切断または対の一本鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮ
ＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）とが、標的位置の両側に配置されるように構
成される（例えば、第１のｇＲＮＡが使用されて、本明細書に記載される遺伝子または経
路の変異の上流（すなわち、５’）が標的化され、第２のｇＲＮＡが使用されて、本明細
書に記載される遺伝子または経路の変異の下流（すなわち、３’）が標的化される）。別
の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ
である４つのｇＲＮＡは、２対の一本鎖切断（すなわち、２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ
９ニッカーゼと複合体形成する）が、標的位置の両側に生じるように構成される（例えば
、第１のｇＲＮＡが使用されて、本明細書に記載される遺伝子または経路の変異の上流（
すなわち、５’）が標的化され、第２のｇＲＮＡが使用されて、本明細書に記載される遺
伝子または経路の変異の下流（すなわち、３’）が標的化される）。二本鎖切断、または
対の２つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位置の０〜５００ｂｐ以内（
例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１０
０、５０または２５ｂｐ以下）にある。ニッカーゼが使用される場合、対の２つのニック
は、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜
３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３
０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐの
間）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３
０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
［ＩＶ．３ 標的化ノックダウン］
遺伝子をＤＮＡレベルで変異させることで発現を恒久的に排除するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓ媒介性の遺伝子ノックアウトとは異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓノックダウンは、人工
転写因子の使用を通じて、一時的な遺伝子発現の低下を可能にする。Ｃａｓ９タンパク質
の双方のＤＮＡ切断ドメインで重要な残基を変異させることは（例えば、Ｄ１０Ａおよび
Ｈ８４０Ａ変異）、触媒能のないＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９、死滅Ｃａｓ９またはｄＣａｓ
９としてもまた知られている）の生成をもたらす。触媒能のないＣａｓ９はｇＲＮＡと複
合体形成して、ｇＲＮＡの標的化ドメインによって特定化されたＤＮＡ配列に局在するが
、それは標的ＤＮＡを切断しない。ｄＣａｓ９と、例えば、転写抑制ドメインなどのエフ
ェクタードメインとの融合は、ｇＲＮＡによって特定化された任意のＤＮＡ部位へのエフ
ェクターの動員を可能にする。ｅｉＣａｓ９それ自体は、コード配列中の早期領域に動員
された場合に、転写を妨げ得ることが示されている一方で、より堅固な抑制は、転写抑制
ドメイン（例えばＫＲＡＢ、ＳＩＤまたはＥＲＤ）をＣａｓ９に融合させて、それを遺伝
子のプロモーター領域に動員することで達成され得る。プロモーターのＤＮＡｓｅＩ高感
受性領域は、Ｃａｓ９タンパク質にアクセスできる可能性が高く、また内在性転写因子の
ための部位を保有する可能性も高いので、これらの領域を標的化することで、おそらくよ
り効率的な遺伝子抑制または活性化がもたらされてもよい。特に遺伝子抑制については、
内在性転写因子の結合部位をブロックすることで、遺伝子発現の下方制御を助けることが
、本明細書で検討される。別の実施形態では、ｅｉＣａｓ９は、クロマチン改変タンパク
質に融合され得る。改変クロマチン状態は、標的遺伝子の発現低下をもたらし得る。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、既知の転写応答要素（例えば、プロモーター、エン
ハンサーなど）に、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）に、および／または標的ＤＮＡの発
現を調節できることが疑われる未知のまたは既知の機能がある配列に、標的化され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性の遺伝子ノックダウンを使用して、望まれない対立遺伝子
または転写物の発現を低下させ得る。本明細書で検討されるのは、遺伝子の恒久的な破壊
が、理想的でない筋書きである。これらの筋書きでは、部位特異的抑制を使用して、発現
が一時的に低下または排除されてもよい。ヌクレアーゼが任意のＤＮＡ配列を切断して変
異を引き起こし得るのに対し、Ｃａｓリプレッサーは、活発に転写される遺伝子のプロモ
ーター領域に標的化された場合にのみ効果を有してもよいので、Ｃａｓリプレッサーのオ
フターゲット効果が、Ｃａｓヌクレアーゼのものよりも重篤性が低いこともまた本明細書
で検討される。しかし、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトが恒久的である一方で、抑制は、
Ｃａｓリプレッサーが細胞内に存在する場合に限り持続してもよい。リプレッサーがもは
や存在しなくなると、内在性転写因子および遺伝子制御要素は、発現をその天然状態に復
元する可能性が高い。
［ＩＶ．４ ゲノム編集法におけるｇＲＮＡの例］
本明細書に記載されるようなｇＲＮＡ分子を二本鎖切断または一本鎖切断を生成するＣ
ａｓ９分子と共に使用して、例えば、標的位置または標的遺伝子シグネチャなどの標的核
酸の配列が改変され得る。これらの方法で有用なｇＲＮＡ分子は、以下に記載される。
一実施形態では、例えば、キメラｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、それが以下の特性の１つ
または複数を含むように構成される。
ａ）それは、例えば、二本鎖切断を生じるＣａｓ９分子の標的化に際して、二本鎖切断
が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０または２００ヌクレオチド以内にあるように
、または（ｉｉ）標的位置が末端切除領域内にあるように十分に密接して配置され得る、
ｂ）それは、例えば、（ｉ）１７、（ｉｉ）１８、または（ｉｉｉ）２０ヌクレオチド
の標的化ドメインなどの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチ
ドの標的化ドメインを有する、
ｃ）（ｉ）隣接およびテールドメインは、両者あわせて、例えば、天然起源のＳ．ピオ
ゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉ
ｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５
、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少な
くとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５
３個のヌクレオチドを含み、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または
１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、
（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源のＳ
．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、
２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの
少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、また
は５３個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９ま
たは１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある、
（ｉｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源の
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１
、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドなど
の第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９
、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチ
ドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌク
レオチドが異なる配列がある、
（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４
０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ
．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テー
ルドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレ
オチドを含み；またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下の
ヌクレオチドが異なる配列を含み、または
（ｖ）テールドメインが、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ
）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールドメ
インなどの天然起源のテールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチ
ド、または全ての対応する部分を含む。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａおよびｂ（ｉ）の特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａおよびｂ（ｉｉ）の特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａおよびｂ（ｉｉｉ）の特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａおよびｃの特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ、ｂ、およびｃの特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含むよう
に構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含むよ
うに構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含む
ように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含
むように構成される。
一実施形態では、例えば、キメラｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、それが以下の特性の１つ
または複数を含むように構成される。
ａ）それは、例えば、一本鎖切断を生じるＣａｓ９分子の標的化に際して、一本鎖切断
が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０または２００ヌクレオチド以内にあるように
、または（ｉｉ）標的位置が末端切除領域内にあるように十分に密接して配置され得る、
ｂ）それは、例えば、（ｉ）１７、（ｉｉ）１８、または（ｉｉｉ）２０ヌクレオチド
の標的化ドメインなどの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチ
ドの標的化ドメインを有する、
ｃ）（ｉ）隣接およびテールドメインは、両者あわせて、例えば、天然起源のＳ．ピオ
ゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉ
ｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５
、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少な
くとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５
３個のヌクレオチドを含み、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または
１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、
（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源のＳ
．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、
２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの
少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、また
は５３個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９ま
たは１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある、
（ｉｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源の
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１
、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドなど
の第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９
、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドが
あり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオ
チドが異なる配列がある、
（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４
０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ
．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テー
ルドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレ
オチドを含み、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下の
ヌクレオチドが異なる配列を含み、または
（ｖ）テールドメインが、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ
）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールドメ
インなどの天然起源のテールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチ
ド、または全ての対応する部分を含む。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａおよびｂ（ｉ）の特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａおよびｂ（ｉｉ）の特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａおよびｂ（ｉｉｉ）の特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａおよびｃの特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ、ｂ、およびｃの特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含むよう
に構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含むよ
うに構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含む
ように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含
むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｄ１０Ａ変異などの変異をＤ１０に有するＣａ
ｓ９分子のような、ＲｕｖＣ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＨＮＨ活性を
有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｈ８４０Ａなどの変異をＨ８４０に有するＣａ
ｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を
有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
一実施形態では、例えば、第１および第２のｇＲＮＡを含む１対のキメラｇＲＮＡなど
の１対のｇＲＮＡは、それらが、以下の特性の１つまたは複数を含むように構成される。
ａ）ｇＲＮＡの片方または双方が、例えば、一本鎖切断を生じるＣａｓ９分子の標的化
に際して、一本鎖切断が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０または２００ヌクレオ
チド以内にあるように、または（ｉｉ）標的位置が末端切除領域内にあるように十分に密
接して位置し得る、
ｂ）片方または双方が、例えば、（ｉ）１７または（ｉｉ）１８ヌクレオチドの標的化
ドメインなどの少なくとも１７ヌクレオチドの標的化ドメインを有する、
ｃ）以下の片方または双方：
（ｉ）隣接およびテールドメインは、両者あわせて、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネ
ス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇ
ｉｔｉｄｉｓ）テールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３
０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくと
も１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個
のヌクレオチドを含み、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０
個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、
（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源のＳ
．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、
２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの
少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、また
は５３個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９ま
たは１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある、
（ｉｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源の
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１
、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドなど
の第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９
、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドが
あり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオ
チドが異なる配列がある、
（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４
０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ
．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テー
ルドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレ
オチドを含み；または（ｏｒ，ｏｒ）それと、１、２、３、４、５、６、７、８、９また
は１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含み、または
（ｖ）テールドメインが、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ
）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールドメ
インなどの天然起源のテールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０個のヌクレ
オチド、または全ての対応する部分を含む、
ｄ）ｇＲＮＡが、標的核酸とハイブリダイズする際に、それらが、０〜５０、０〜１０
０、０〜２００、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５
０ヌクレオチドによって隔てられるように構成される、
ｅ）第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡによって生成される切断が、異なる鎖上にあ
る、
ｆ）ＰＡＭが外側を向く。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａおよびｂ（ｉ）の特性を含むように
構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａおよびｂ（ｉｉ）の特性を含むよう
に構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａおよびｂ（ｉｉｉ）の特性を含むよ
うに構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａおよびｃの特性を含むように構成さ
れる。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ、ｂ、およびｃの特性を含むように
構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）
の特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ
）の特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、およびｄの
特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、およびｅの
特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、ｄ、および
ｅの特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（
ｉ）の特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（
ｉｉ）の特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、および
ｄの特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、および
ｅの特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、ｄ、お
よびｅの特性を含むように構成される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｄ１０Ａ変異などの変異をＤ１０に有するＣａ
ｓ９分子のような、ＲｕｖＣ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＨＮＨ活性を
有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｈ８４０Ａなどの変異をＨ８４０に有するＣａ
ｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を
有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
［Ｖ．コンストラクト／構成要素］
例えば、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子、またはその双方などの構成要素は、多様な
形式で送達、調合、または投与されることができ、例えば、表Ｖ−１ａおよび表Ｖ−１ｂ
を参照されたい。構成要素がＤＮＡにコードされて送達される場合、ＤＮＡは、典型的に
制御領域を含み、例えば、プロモーターを含み、発現をもたらす。Ｃａｓ９分子配列のた
めの有用なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ調節
プロモーターが挙げられる。ｇＲＮＡのための有用なプロモーターとしては、Ｈ１、ＥＦ
−１ａ、およびＵ６プロモーターが挙げられる。同様のまたは異なる強度があるプロモー
ターを選択して、構成要素の発現が調整され得る。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、例
えば、ＳＶ４０ＮＬＳなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。一実施形態では、
Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、ま
たは細胞特異的であり得る。
表Ｖ−１ａおよび表Ｖ−１ｂは、構成要素がどのように調合、送達、または投与され得
るかという例を提供する。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
一実施形態では、Ｃａｓシステムの構成要素は、例えば、本明細書に記載される方法を
使用してインビボで送達される。別の実施形態では、Ｃａｓシステムの構成要素は、例え
ば、本明細書に記載される方法を使用して、インビトロで送達される。
表Ｖ−２は、Ｃａｓシステムの構成要素の様々な送達方法を要約しており、例えば、Ｃ
ａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素は、例えば、表Ｖ−２で本明細書に記載
される。
Figure 2021192615
＜Ｃａｓ９分子およびまたはｇＲＮＡ分子のＤＮＡベースの送達＞
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子）をコードするＤＮ
Ａ、ｇＲＮＡ分子、および／またはテンプレート核酸は、当該技術分野で周知の方法によ
って、または本明細書に記載されるようにして、対象に投与されまたは細胞内に送達され
得る。例えば、Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例
えば、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方
法（例えば、むきだしのＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）、またはそれらの組み合
わせによって、送達され得る。
一実施形態では、ＤＮＡは、支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含む。支配ｇＲＮＡ
分子は、Ｃａｓ９分子と複合体形成して、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸または
ｇＲＮＡ分子をコードする核酸などのシステムの構成要素を不活性化し、またはサイレン
シングし得る。どちらの状況でも、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮ
Ａ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体媒介遺伝子ター
ゲッティングの効果を制限して、活性に時間的制限を課し、またはオフターゲット活性を
低下させ得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤ
ＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルスまたはプラスミド）によって送
達される。
ベクターは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードする配列を含み得る。
ベクターはまた、例えば、Ｃａｓ９分子配列と融合した、（例えば、核局在化、核小体局
在化、ミトコンドリア局在化のための）シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。
例えば、ベクターは、Ｃａｓ９分子をコードする配列に融合された、（例えば、ＳＶ４０
からの）核局在化配列を含み得る。
例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザッ
クコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、およびスプライ
ス受容体またはドナーなどの１つまたは複数の調節的／制御要素が、ベクターに包含され
得る。一実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識される（
例えば、ＣＭＶプロモーター）。一実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ
ＩＩＩによって認識される（例えば、Ｕ６プロモーター）。一実施形態では、プロモータ
ーは、調節プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。一実施形態では、プロ
モーターは、構成的プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、組織特異的
プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。
一実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。
一実施形態では、ベクターまたは送達ビヒクルは、（例えば、組換えウイルス生成のた
めの）ウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば
、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。一実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡ
ウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。代表的なウイルスベクター／ウイルス
としては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイ
ルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルス
が挙げられる。一実施形態では、例えば、ＡＡＶなどのウイルスベクターは、例えば、Ｃ
ａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子を
コードする配列を含む。
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織型の認識能力を有す
る。例えば、ウイルスベクターは、異種／代替ウイルス外被糖タンパク質によるシュード
タイプであり得て；細胞型特異的受容体（例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、成長
因子などの標的化リガンドを組み込むためのウイルス外被糖タンパク質の遺伝的修飾）に
よって改変され；および／または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識して、
もう一方の末端が標的細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有する
（例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン、および化学的結
合）。
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、組織特
異的プロモーターが構築されて、標的細胞のみで導入遺伝子（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）
の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存
性の調節によって媒介され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクタ
ーと標的細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素（Ｈ
Ａ）などの融合タンパク質が組み込みまれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得
る。一実施形態では、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、（細胞分裂
中に）細胞壁の分解を要する特定のウイルスは、非分裂細胞には感染しない。ウイルスの
マトリックスタンパク質に組み込まれた核局在化ペプチドは、非増殖性細胞への形質導入
を可能にする。
一実施形態では、ウイルスは、分裂細胞に感染する。一実施形態では、ウイルスは、非
分裂細胞に感染する。一実施形態では、ウイルスは、分裂および非分裂細胞の双方に感染
する。一実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。一実施形態では、ウ
イルスは、例えば、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。一実施形態では、
ウイルスは、複製能力がある。一実施形態では、ウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビ
リオン複製および／またはパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１
つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。一実施形態
では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の一過性の発現を引き起こ
す。一実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の例えば、
少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１年
間、２年間、または恒久的などの持続性の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング
容量は、例えば、少なくとも約４ｋｂ〜少なくとも約３０ｋｂ、例えば、少なくとも約５
ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５
ｋｂ、または５０ｋｂなどで変動してもよい。
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤ
ＮＡは、組換えレトロウイルスによって送達される。一実施形態では、レトロウイルス（
例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組み込みを可能に
するものなどの逆転写酵素を含む。一実施形態では、レトロウイルスは、複製能力がある
。一実施形態では、レトロウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製およびパッ
ケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、
その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤ
ＮＡは、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、例えば
、ウイルス複製に必要な１つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤ
ＮＡは、組換えアデノウイルスによって送達される。一実施形態では、アデノウイルスは
、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤ
ＮＡは、組換えＡＡＶによって送達される。一実施形態では、ＡＡＶは、例えば、本明細
書に記載されるような標的細胞などの宿主細胞に、そのゲノムを組み込むことができる。
一実施形態では、ＡＡＶは、例えば、共にアニールされて二本鎖ＤＮＡを形成する双方の
鎖をパッケージするｓｃＡＡＶなどの、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）で
ある。例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、修飾ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、
Ｙ７３０Ｆおよび／またはＳ６６２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ３、修飾ＡＡＶ３（例えば
、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ
５、ＡＡＶ６、修飾ＡＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修
飾）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ１０、そしてＡＡＶ２／８、Ａ
ＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６などのシュードタイプＡＡＶをはじめとする、開示され
る方法で使用されてもよいＡＡＶ血清型はまた、開示される方法で使用され得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤ
ＮＡは、例えば、本明細書に記載されるウイルスの１つまたは複数のハイブリッドなどの
ハイブリッドウイルスによって送達される。
パッケージング細胞が使用されて、宿主または標的細胞を感染させる能力があるウイル
ス粒子が形成される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージし得る２９
３細胞、およびレトロウイルスをパッケージし得るψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げ
られる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス
粒子内にパッケージする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケ
ージングと（妥当な場合）引き続く宿主または標的細胞への組み込みに必要な最小のウイ
ルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カ
セットによって置換される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、典型的
に、パッケージングおよび宿主または標的細胞内の遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノムから
の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。欠損しているウイルス機能は、パッケー
ジング細胞株によってトランスに提供される。この後、ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺
伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパー
プラスミドを含有する、細胞株内にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしての
アデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからのＡＡＶベク
ター複製とＡＡＶ遺伝子発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のた
めに、顕著な量でパッケージされない。アデノウイルスの混入は、例えば、それに対して
アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い、加熱処理によって低下させ得る。
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織型の認識能力を有す
る。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代案のウイルス外被糖タンパク質によるシュ
ードタイプであり得て；細胞型特異的受容体によって改変され（例えば、ペプチドリガン
ド、一本鎖抗体、成長因子などの標的化リガンドに組み込むためのウイルス外被糖タンパ
ク質の遺伝子修飾）；および／または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識し
て、もう一方の末端が標的細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有
する（例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン、および化学
的結合）。
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、組織特
異的プロモーターが構築されて、標的細胞のみで導入遺伝子（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）
の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存
性調節によって媒介され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクター
と標的細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素（ＨＡ
）などのが組み込みまれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得る。一実施形態で
は、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、（細胞分裂中に）細胞壁の分
解を要し、したがって非分裂細胞に感染しない特定のウイルスは、ウイルスのマトリック
スタンパク質に核局在化ペプチドを組み込むように改変されることができ、それによって
非増殖性細胞への形質導入が可能になる。一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ
および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、（例えば、むきだしのＤＮＡまたはＤＮ
Ａ複合体を使用して）非ウイルスベクターまたは非ベクターベースの方法によって送達さ
れる。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、
電気穿孔、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介形質移入、デ
ンドリマー、無機ナノ粒子、カルシウムリン酸塩、またはそれらの組み合わせによって送
達され得る。一実施形態では、ＤＮＡは、無機ナノ粒子によって送達される（例えば、ナ
ノ粒子表面へのペイロードに付着する）。代表的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性
ナノ粒子（例えば、Ｆｅ３ＭｎＯ２）；シリカ（例えば、ナノ粒子の外面をペイロードお
よび内部磁性構成要素の付着（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）を可能にする、
正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）にコンジュゲ
ートするなど、多官能価を組み込むことができる；インビトロで非ウイルスベクターの形
質移入を促進するためのクロロキンが負荷された正荷電ポリマーがある、メソ多孔質シリ
カナノ粒子；高密度リポタンパクおよび金ナノ粒子；ナノ粒子が近赤外光への曝露によっ
て温度上昇に曝露すると放出されるペイロードで被覆されている、金ナノ粒子；表面がポ
リリジンまたは別の電荷ポリマーで修飾されて、核酸カーゴを捕捉する金、鉄または銀ナ
ノ粒子が挙げられる。一実施形態では、ＤＮＡは、有機ナノ粒子によって送達される（例
えば、ナノ粒子内部のペイロード捕捉）。代表的な有機ナノ粒子としては、例えば、ポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆されている中性ヘルパー脂質に加えてカチオン性脂
質を含有する、ＳＮＡＬＰリポソーム；および脂質コーティングで被覆されている、プロ
タミンおよび核酸複合体が挙げられる。
一実施形態では、送達ビヒクルは、物理的ビヒクルである。一実施形態では、ビヒクル
は、低密度超音波である。例えば、ペイロードを含有するマイクロバブル（例えば、タン
パク質、界面活性剤、または生体適合性ポリマーまたは脂質シェルなどの生体適合性素材
からできている）が使用されることができ、微小血管通過中に超音波ビームの焦点を合わ
せることで、マイクロバブルが破壊され得る。一実施形態では、ビヒクルは電気穿孔され
る。例えば、むきだしの核酸またはタンパク質は、例えば、細胞懸濁液中にまたは、網膜
および胚組織などの組織環境内に、電気穿孔によって送達され得る。一実施形態では、ビ
ヒクルは、ニードルまたはジェット注射される。例えば、むきだしの核酸またはタンパク
質は、例えば、筋肉、肝臓、皮膚、脳または心臓組織内に注射され得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤ
ＮＡは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。例え
ば、ビロソームは、不活性化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス）
と組み合わされたリポソームを構成し、それは、ウイルス法単独またはリポソーム法単独
のいずれよりも効率的な遺伝子移入を例えば、呼吸器上皮細胞内にもたらし得る。
一実施形態では、送達ビヒクルは、非ウイルスベクターである。一実施形態では、非ウ
イルスベクターは、無機ナノ粒子である（例えば、ナノ粒子表面へのペイロードに付着す
る）。代表的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子（例えば、Ｆｅ３ＭｎＯ２
）、またはシリカが挙げられる。ナノ粒子の外面は、ペイロードの付着（例えば、コンジ
ュゲーションまたは捕捉）を可能にする正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、
ポリリジン、ポリセリン）にコンジュゲートされ得る。一実施形態では、非ウイルスベク
ターは、有機ナノ粒子である（例えば、ナノ粒子内部のペイロード捕捉）。代表的な有機
ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆されている中性ヘ
ルパー脂質に加えてカチオン性脂質を含有する、ＳＮＡＬＰリポソーム；および脂質コー
ティングで被覆されている、プロタミンおよび核酸複合体が挙げられる。
遺伝子移入のための代表的な脂質は、表Ｖ−３に示される。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
遺伝子移入のための代表的なポリマーは、下で表Ｖ−４に示される。
Figure 2021192615
一実施形態では、ビヒクルは、標的化修飾を有して、例えば、細胞特異的抗原、モノク
ローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖、および細胞透過性ペプチドなど
のナノ粒子およびリポソームの標的細胞取り込みが増大される。一実施形態では、ビヒク
ルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを利用する。一実施形態で
は、ビヒクルは、酸誘発性立体構造変化を受ける（例えば、カーゴのエンドソーム漏出を
加速するために）。一実施形態では、例えば、細胞区画内の放出のために、刺激切断可能
ポリマーが使用される。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカ
チオン性ポリマーが、使用され得る。
一実施形態では、例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）および始原細胞を標的化する方法とし
て、例えば、血液または骨髄への送達のために、リポソームが使用される。例えば、ＨＳ
Ｃを得ることが困難な（例えば、ＨＳＣが不安定であり、またはＨＳＣが稀である）病状
では、リポソームを使用する直接送達によって、長期治療が可能になり得る。これらの病
状としては、例えば、鎌状赤血球貧血、ファンコーニ貧血、および再生不良性貧血が挙げ
られる。一実施形態では、標的臓器またはその血流への静脈内送達を介してまたは局所注
射を介して、例えば、肝臓または肺などの局在性の特定組織への送達のためにリポソーム
が使用される。例えば、長期治療が可能になり得て、その特定の臓器または組織型内で効
果が濃縮される。これらの病状としては、尿素サイクル障害、α−１−抗トリプシンまた
は嚢胞性線維症が挙げられる。
一実施形態では、送達ビヒクルは、生物学的非ウイルス送達ビヒクルである。一実施形
態では、ビヒクルは、弱毒型細菌（例えば、侵入性であるが弱毒化されて発病を予防して
導入遺伝子を発現するように、天然にまたは人工的に改変されている（例えば、リステリ
ア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、特定のサル
モネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、および改変大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉ）；栄養および組織特異的親和性を有して特定組織を標的化する細菌；修飾表面タン
パク質を有して標的組織特異性を改変する細菌）である。一実施形態では、ビヒクルは、
遺伝子修飾されたバクテリオファージである（例えば、改変ファージは、大きなパッケー
ジング容量を有し、免疫原性がより低く、哺乳類プラスミド維持配列を含有して、組み込
まれた標的化リガンドを有する）。一実施形態では、ビヒクルは、哺乳類ウイルス様粒子
である。例えば、修飾ウイルス粒子が生成され得る（例えば、「空の」粒子精製と、それ
に続く、所望のカーゴがあるウイルスのインビトロ構築によって）。ビヒクルはまた改変
されて、標的化リガンドが組み込まれ、標的組織特異性が改変され得る。一実施形態では
、ビヒクルは、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞（
例えば、対象に由来する球状構造に分解された赤血球である赤血球ゴーストに由来するリ
ン脂質ベースの粒子（例えば、組織標的化が、様々な組織または細胞特異的リガンドの付
着によって達成され得る）；またはエンドサイトーシス起源の分泌型エキソソーム−対象
（すなわち、患者）由来膜結合ナノ小胞（３０〜１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型か
ら生成されることができ、したがってリガンド標的化の必要なしに細胞に取り込まれ得る
）である。
一実施形態では、骨髄中のナノ粒子によるＣａｓ構成要素の送達は、血液および免疫疾
患の治癒のためのインビボアプローチである。
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ
分子構成要素などのＣａｓシステムの構成要素は、ヌクレオフェクションによって送達さ
れる。例えば、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ Ｃｏｌｏｇｎｅ ＡＧ
）は、初代細胞および形質移入困難な細胞株への送達に使用され得る、形質移入技術であ
る。これは、電気的パラメータと細胞型特異的溶液との組み合わせに基づく、非ウイルス
法である。これは、（例えば、核内への核酸移入のための細胞分裂に依存することなく）
直接核に入る核酸の形質移入を可能にして、ニューロンおよび休止血液細胞などの非分裂
細胞に形質移入する能力を提供する。一実施形態では、ヌクレオフェクションが、インビ
トロ送達方法として使用される。
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ
分子構成要素などのＣａｓシステムの構成要素は、例えば、抗体ベースの分子Ｔｒｏｊａ
ｎ Ｈｏｒｓｅｓ（ＡｒｍａＧｅｎ）などの内在性受容体媒介輸送体を使用する方法によ
って送達される。このような方法は、他の様式で到達するのが難しい、例えば、脳などの
（例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する、例えば、内在性受容体媒介性の輸送過程を
介する）部位への治療薬の非侵襲性送達を可能にし得る。
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子構成要素および／または
ｇＲＮＡ分子構成要素などの、Ｃａｓシステムの構成要素以外の１つまたは複数の核酸分
子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステム
の構成要素の１つまたは複数が送達されるのと同時に、送達される。一実施形態では、核
酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数が送達される（例えば、約３０分
間、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週
間、２週間、または４週間未満）前または後に送達される。一実施形態では、核酸分子は
、例えば、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシス
テムの構成要素の１つまたは複数が送達されるのとは、異なる手段によって送達される。
核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達され得る。例えば、
核酸分子は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性が低下され得
るように、例えば、組み込み欠損レンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達さ
れることができ、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素は、電気穿
孔によって送達され得る。一実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載される
タンパク質などの治療用タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、例えば
、本明細書に記載されるＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子をコードする。
＜Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達＞
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合
タンパク質）をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の
方法によって、または本明細書に記載されるようにして、例えば、本明細書に記載される
標的細胞などの細胞内に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９−をコードするおよび／または
ｇＲＮＡ−をコードするＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、脂質
媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
＜Ｃａｓ９分子タンパク質送達＞
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合
タンパク質）は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるよう
にして、細胞内に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、マイクロ
インジェクション、電気穿孔、脂質媒介形質移入、ペプチド介形送達、またはそれらの組
み合わせによって送達され得る。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはｇＲＮＡ
を伴い得る。
＜投与経路＞
全身性の投与法としては、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路としては、
一例として、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が
挙げられる。全身投与される構成要素は、特定の臓器または細胞型に構成要素を標的化す
るように、修飾または調合されてもよい。
局所投与法としては、一例として、クモ膜下腔内、脳室内、脳実質内（例えば、線条体
への（例えば、尾状核内へのまたは被殻内への）局在性脳実質内送達）、大脳皮質、中心
前回、海馬（例えば、歯状回またはＣＡ３領域内）、側頭皮質、小脳扁桃、前頭皮質、視
床、小脳、毛髄質、視床下部、中脳蓋、中脳被蓋または黒質、眼内、眼窩内、結膜下、硝
子体内、結膜下または経強膜経路が挙げられる。一実施形態では、局所的に（例えば、脳
実質内または硝子体内に）投与された場合、全身投与（例えば、静脈内）と比較して、有
意により少量の構成要素（全身性のアプローチと比較して）が、効果を発揮してもよい。
局所投与法は、治療有効量の構成要素が全身投与された場合に起こることもある、潜在的
に毒性の副作用の発生を低下させまたは排除し得る。
一実施形態では、本明細書に記載される構成要素は、例えば、中型有棘ニューロンを含
む領域、または皮質ニューロンを含む領域をはじめとする、脳の離散領域内に、脳実質内
注射によって送達される。注射は、脳の２つ以上の領域内で、直接実施されてもよい。
一実施形態では、本明細書に記載される構成要素は、例えば、結膜下注射によって、網
膜下に送達される。結膜下注射は、例えば、黄斑下注射など、黄斑中で直接実施されても
よい。
一実施形態では、本明細書に記載される構成要素は、硝子体内注射によって送達される
。硝子体内注射は、網膜離脱リスクの相対的に低いリスクを有する。一実施形態では、ナ
ノ粒子またはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ２ベクター、
例えば、修飾ＡＡＶ２ベクターは、硝子体内送達される。
一実施形態では、ナノ粒子またはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターでは、送
達は脳実質内注射を介する。
眼への薬剤投与法は、医療技術分野で公知であり、本明細書に記載される構成要素を投
与するのに使用され得る。代表的な方法としては、眼内注射（例えば、球後、結膜下、黄
斑下、硝子体内および脈絡膜内）、イオン注入、点眼薬、および眼内移植（例えば、硝子
体内、テノン下、および結膜下）が挙げられる。
投与は、周期的ボーラス（例えば、網膜下、静脈内または硝子体内）として、または内
部リザバーからの（例えば、眼球内または眼球外部位に配置されるインプラント（米国特
許第５，４４３，５０５号明細書および米国特許第５，７６６，２４２号明細書を参照さ
れたい）からの）または外部リザバーからの（例えば、静注バッグからの）持続注入とし
て提供されてもよい。構成要素は、例えば、眼の内壁に固定化された徐放薬物送達装置か
らの連続的放出によって、または脈絡膜内への標的化経強膜制御放出を介して、局所的に
投与されてもよい（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ００／００２０７号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ０２
／１４２７９号明細書、Ａｍｂａｔｉ ｅｔ ａｌ．，（２０００）ＩＮＶＥＳＴ．ＯＰ
ＨＴＨＡＬＭＯＬ．ＶＩＳ．ＳＣＩ．４１：１１８１−１１８５、およびＡｍｂａｔｉ
ｅｔ ａｌ．，（２０００）ＩＮＶＥＳＴ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．ＶＩＳ．ＳＣＩ．４
１：１１８６−１１９１を参照されたい）。構成要素を眼内に局所的に投与するのに好適
な多様な装置が、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，２５１，０９０号
明細書、米国特許第６，２９９，８９５号明細書、米国特許第６，４１６，７７７号明細
書、米国特許第６，４１３，５４０号明細書、およびＰＣＴ／ＵＳ００／２８１８７号明
細書を参照されたい）。
加えて、構成要素は、長時間にわたって放出されるように調合されてもよい。放出系は
、生分解性材料、または拡散によって組み込まれた構成要素を放出する材料のマトリック
スを含み得る。構成要素は、放出系内で均一にまたは不均一に分布し得る。多様な放出系
が有用であってもよいが、適切なシステムの選択は、特定用途によって要求される放出速
度に左右される。非分解性および分解性放出系の双方が使用され得る。適切な放出系とし
ては、ポリマーおよびポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、または炭酸カル
シウムおよび砂糖（例えば、トレハロース）などであるが、これに限定されるものではな
い、無機および有機賦形剤および希釈剤が挙げられる。放出系は、天然または合成であっ
てもよい。しかし、通常、より信頼でき、より再現可であり、より限定される放出プロフ
ァイルを生じることから、合成放出系が好ましい。放出系材料は、異なる分子量を有する
構成要素が、材料を通過するまたは材料の分解による、拡散によって放出されるように選
択され得る。
典型的な合成生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（アミノ酸）およびポリ（ペプ
チド）などのポリアミド；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリ
コール酸）、およびポリ（カプロラクトン）などのポリエステル；ポリ（酸無水物）；ポ
リオルトエステル；ポリカーボネート；およびその化学的誘導体（置換、例えば、アルキ
ル、アルキレンなどの化学基の付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によって慣例
的に加えられるその他の修飾）、共重合体、およびそれらの混合物が挙げられる。典型的
な合成非分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エチレングリ
コール）、およびポリ（テトラメチレンオキシド）などのポリエーテル；メチル、エチル
、その他のアルキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルおよびメタクリル酸、
およびポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびポリ（酢酸ビニル
）などのビニルポリマー−ポリアクリレートおよびポリメタクリレート；ポリ（ウレタン
）；セルロースと、アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロ
ース、および様々な酢酸セルロースなどのその誘導体；ポリシロキサン；および任意のそ
の化学的誘導体（置換、例えば、アルキル、アルキレンなどの化学基の付加、ヒドロキシ
ル化、酸化、および当業者によって慣例的に加えられるその他の修飾）、共重合体、およ
びそれらの混合物が挙げられる。
ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）微小球もまた、眼内注射のために使用され得る。典
型的に、微小球は、中空球を形成するように構造化された、乳酸およびグリコール酸ポリ
マーから構成される。球は、直径がおよそ１５〜３０ミクロンであり得て、本明細書に記
載される構成要素が負荷され得る。
＜構成要素の二相性またはディファレンシャル送達＞
例えば、Ｃａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステムの構
成要素の別個の送達、より特には、異なるモードによる構成要素の送達は、例えば、組織
特異性および安全性を改善することで、性能を向上させ得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、本明細書で差動様式と称される
こともある、異なる様式によって送達される。異なるまたは差別的な様式は、本明細書の
用法では、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはテンプレート核酸などの対象構
成要素分子に、異なる薬力学または薬物動態特性与える送達様式を指す。例えば、送達様
式は、例えば、選択された区画、組織、または臓器に、異なる組織分布、異なる半減期、
または異なる時間的分布をもたらし得る。
例えば、自律複製または細胞核酸内への挿入によって、細胞内に、または細胞子孫内に
残留する核酸ベクターによる送達などのいくつかの送達様式は、構成要素のより持続性の
発現および存在をもたらす。例としては、例えば、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイ
ルスなどのウイルス送達が挙げられる。
一例として、例えば、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの構成要素は、得られる半
減期、または身体、または特定の区画、組織または臓器に送達される構成要素の持続性に
関して、異なる様式によって送達され得る。一実施形態では、このような様式によってｇ
ＲＮＡ分子が送達され得る。Ｃａｓ９分子構成要素は、身体または特定の区画または組織
または臓器でのより低い持続性またはより少ない曝露をもたらす様式によって、送達され
得る。
より一般的には、一実施形態では、第１の送達様式が使用されて、第１の構成要素が送
達され、および第２の送達様式が使用されて、第２の構成要素が送達される。第１の送達
様式は、第１の薬力学的または薬物動態学的特性を与える。第１の薬力学的特性は、例え
ば、身体、区画、組織または臓器内における、構成要素の、または構成要素をコードする
核酸の、分布、持続性、または曝露であり得る。第２の送達様式は、第２の薬力学または
薬物動態学的特性を与える。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、区画、組織または臓
器内における、構成要素の、または構成要素をコードする核酸の、分布、持続性、または
曝露であり得る。
一実施形態では、例えば、分布、持続性または曝露などの第１の薬力学的または薬物動
態学的特性は、第２の薬力学的または薬物動態学的特性よりも限定的である。
一実施形態では、第１の送達様式は、例えば、分布、持続性または曝露などの薬力学的
または薬物動態学的特性を最適化する、例えば、最小化するように選択される。
一実施形態では、第２の送達様式は、例えば、分布、持続性または曝露などの薬力学的
または薬物動態学的特性を最大化する、例えば、最適化するように選択される。
一実施形態では、第１の送達様式は、例えば、核酸、例えば、プラスミドまたはウイル
スベクター、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスなどの相対的に持続性の要素の使用を
含む。このようなベクターは比較的持続性であるので、それらから転写される生成物は、
比較的持続性になる。
一実施形態では、第２の送達様式は、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質などの比較的一
過性の要素を含む。
一実施形態では、第１の構成要素はｇＲＮＡを含み、送達様式は比較的持続性であり、
例えば、ｇＲＮＡは、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスなどのプラスミドまたはウイ
ルスベクターから転写される。これらの遺伝子はタンパク質生成物をコードせず、ｇＲＮ
Ａは単独で作用できないため、これらの遺伝子の転写は、生理学的に重要でない。第２の
構成要素であるＣａｓ９分子は、例えば、ｍＲＮＡとしてまたはタンパク質として一過性
様式で送達され、完全なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、短時間のみ存在して活性
であることが確実にされる。
さらに、構成要素は、互いに補完して安全性および組織特異性を高める、異なる分子形
態で、または異なる送達ベクターで、送達され得る。
差動送達様式の使用は、性能、安全性、および有効性を高め得る。例えば、最終的なオ
フターゲット修飾の可能性が、低下され得る。細菌由来Ｃａｓ酵素からのペプチドは、Ｍ
ＨＣ分子によって細胞表面に提示されるので、例えば、Ｃａｓ９分子などの免疫原性構成
要素のより低持続性様式による送達は、免疫原性を低下させ得る。二部送達系は、これら
の欠点を軽減し得る。
差動送達様式を使用して、異なるが重複する標的領域に、構成要素が送達され得る。形
成活性複合体は、標的領域の重なりの外で最小化される。したがって、一実施形態では、
例えば、ｇＲＮＡ分子などの第１の構成要素は、第１の送達様式によって送達され、例え
ば、組織分布などの第１の空間的分布がもたらされる。例えば、Ｃａｓ９分子などの第２
の構成要素は、第２の送達様式によって送達され、例えば、組織分布などの第２の空間的
分布がもたらされる。一実施形態では、第１の様式は、リポソーム、例えば、ポリマーナ
ノ粒子などのナノ粒子、および例えば、ウイルスベクターなどの核酸から選択される、第
１の要素を含む。第２の様式は、群から選択される、第２の要素を含む。一実施形態では
、第１の送達様式は、例えば、細胞特異的受容体または抗体などの第１の標的化要素を含
み、および第２の送達様式は、その要素を含まない。一実施形態では、第２の送達様式は
、例えば、第２の細胞特異的受容体または第２の抗体などの第２の標的化要素を含む。
Ｃａｓ９分子が、ウイルス送達ベクター、リポソーム、またはポリマーナノ粒子中で送
達される場合、単一組織のみを標的化することが望ましくあってもよい場合に、複数組織
への送達とその中での治療活性の可能性がある。二部送達系は、この難題を解決して、組
織特異性を高め得る。ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子が、別個であるが重複する組織向
性がある分離した送達ビヒクルにパッケージされれば、完全に機能的な複合体は、双方の
ベクターによって標的化される組織内のみに形成される。
［ＶＩ．ペイロード］
例えば、ｅｉＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などの典型的にｅｉＣａｓ９分子およ
びｇＲＮＡ分子であるＣａｓ９分子を使用して、多種多様なペイロードが送達され得る。
一実施形態では、ペイロードは、標的核酸またはクロマチンまたは標的核酸の近くにある
またはそれと結合するその他の構成要素に送達される。
理論による拘束は望まないが、ｅｉＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のｇＲＮＡ分子
の配列特異性が標的配列との特異的相互作用に寄与し、それによって、Ｃａｓ９分子／ｇ
ＲＮＡ分子複合体と結合する、例えば、共有結合または非共有結合するペイロードの送達
がもたらされると、考えられる。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、ｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９と共有結合
または非共有結合する。一実施形態では、ペイロードは、ｇＲＮＡ分子と、共有結合また
は非共有結合する。一実施形態では、ペイロードは、例えば、生理的条件下で切断可能な
結合を含むリンカーなどのリンカーによって、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子と連結す
る。一実施形態では、結合は、生理的条件下で切断可能でなく、または不十分にのみ切断
可能である。一実施形態では、「共有結合する」は、融合タンパク質の一部として、Ｃａ
ｓ９分子を含有することを意味する。
＜複数ペイロードの送達＞
一実施形態では、第１のペイロード分子は第１のＣａｓ９分子によって送達され、第２
のペイロード分子は第２のＣａｓ９分子によって送達される。一実施形態では、第１およ
び第２のペイロードは同一である。一実施形態では、第１および第２のＣａｓ９分子は同
一であり、例えば、同一生物種に由来し、同一ＰＡＭを有し、かつ／または同一配列を有
する。一実施形態では、第１および第２のＣａｓ９分子は異なり、例えば、異なる生物種
に由来し、異なるＰＡＭを有し、かつ／または異なる配列を有する。構成の例は、表ＶＩ
−１に提供される。典型的に、表ＶＩ−１のＣａｓ９分子はｅｉＣａｓ９分子である。一
実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ペイロード送達および切断の双方がもたらされるように
選択される。一実施形態では、単一Ｃａｓ９分子によって、例えば、２つのペイロードな
どの複数ペイロードが送達される。
Figure 2021192615
一実施形態では、２つの異なる薬剤が送達される。一実施形態では、例えば、第１のリ
ンカーによって第１のＣａｓ９分子に結合する薬剤などの第１のペイロードと、例えば、
第２のリンカーによって第２のＣａｓ９分子に結合する薬剤などの第２のペイロードとが
送達される。一実施形態では、第１および第２のペイロードは同一であり、一実施形態で
は、例えば、異なる放出動態を有する異なるリンカーによって、それぞれのＣａｓ９分子
と結合する。一実施形態では、第１および第２のペイロードは異なり、一実施形態では、
同一リンカーによってそれぞれのＣａｓ９分子と結合する。一実施形態では、第１および
第２のペイロードは相互作用する。例えば、第１および第２のペイロードは、例えば、二
量体タンパク質のような、二量体または多量体複合体などの複合体を形成する。一実施形
態では、第１のペイロードは第２のペイロードを活性化し得て、例えば、第１のペイロー
ドは第２のペイロードを修飾し得て、例えば、切断しまたはリン酸化する。一実施形態で
は第１のペイロードは第２のペイロードと相互作用して、第２のペイロードの活性を修飾
し、例えば増大または低下させる。
ペイロードは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで送達され得る。
＜ペイロードのクラス＞
ペイロードは、大分子または生物製剤（例えば、抗体分子）；融合タンパク質；例えば
、ｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子に融合パートナーとして融合したアミノ酸配列；
酵素；小分子（例えば、ＨＤＡＣおよびその他のクロマチン修飾因子／阻害剤、エクソン
スキッピング分子、転写阻害剤）；マイクロサテライト伸長阻害剤；炭水化物；およびＤ
ＮＡ分解因子（例えば、感染症または「外来性」ＤＮＡ状況における）；例えば、ＤＮＡ
、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉなどの核酸；またはアンチセンスオリゴヌク
レオチドを含み得る。
表ＶＩ−２は、代表的なペイロードのクラスを提供する。
Figure 2021192615
＜大分子＞
一実施形態では、ペイロードは、例えば、タンパク質、核酸、または炭水化物のような
生物学的ポリマーなどのポリマーを含む。
一実施形態では、ペイロードは、タンパク質、生物学的、またはその他の大分子（すな
わち、少なくとも、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
または１００ｋＤの分子量を有する分子）を含む。一実施形態では、ペイロードは、例え
ば、タンパク質、核酸、または炭水化物のような生物学的ポリマーなどのポリマーを含む
。ポリマーは、天然起源または非天然起源ポリマーであり得る。一実施形態では、ペイロ
ードは、天然物である。例えば、天然物は、大分子または小分子であり得る。
＜ポリペプチド、タンパク質＞
一実施形態では、ペイロードは、例えば、Ｃａｓ９分子と共有結合または非共有結合す
る、タンパク質またはポリペプチドなどのタンパク質またはポリペプチドを含む。
一実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは二量体または多量体であり、各サブ
ユニットはＣａｓ９分子によって送達される。一実施形態では、第１のタンパク質および
第２のタンパク質は、１つまたは複数のＣａｓ９分子によって送達され、例えば、それぞ
れ別個のＣａｓ９分子によって送達され、またはどちらも同一Ｃａｓ９分子によって送達
される。
一実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、例えば、生理的条件下で切断可能
な結合を構成するリンカーなどのリンカーによって、Ｃａｓ９分子と連結する。一実施形
態では、リンカーは、本明細書のセクションＸＩからのリンカーである。一実施形態では
、結合は、生理的条件下で切断可能でない。
＜特異的結合リガンド、抗体＞
一実施形態では、ペイロードは、例えば、カウンターリガンドに対する特異的親和性を
有する、タンパク質などのリガンドを含む。一実施形態では、リガンドは、受容体（また
は受容体に対するリガンド）、または抗体であり得る。
一実施形態では、ペイロードは、抗体分子を含む。代表的な抗体分子としては、例えば
、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域を含む、タンパク質またはポリペプチドが挙
げられる。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書でＶＨと略記される）、およ
び軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書でＶＬと略記される）を含み得る。別の実施例では、抗
体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。「抗体」とい
う用語は、抗体の抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（
ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（ｄｅ
Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＵＲ Ｊ ＩＭＭＵＮＯＬ．１９９６；２６（３）：６
２９−６３９））を包含する。例えば、抗体の抗原結合断片は、例えば、（ｉ）ＶＬ、Ｖ
Ｈ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ
領域のジスルフィド架橋によって連結する２つのＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ
（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗
体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨ領域からなるｄ
Ａｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＮＡＴＵＲＥ ３４１：５４４−５４
６）；および（ｖｉ）機能性を保つ単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。さ
らに、Ｆｖ断片であるＶＬとＶＨの２つのドメインは、別個の遺伝子によってコードされ
るが、それらは、組換え法を使用して、その中でＶＬおよびＶＨ領域が対合して、その中
で一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている一価の分子を形成する単一タンパク質鎖に
なるようにする、合成リンカーによって連結され得る。例えば、米国特許第５，２６０，
２０３号明細書、米国特許第４，９４６，７７８号明細書、および米国特許第４，８８１
，１７５号明細書；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＳＣＩＥＮＣＥ ２４２：４
２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．
ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照されたい。抗体は、ＩｇＡ
、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそれらのサブタイプ）の構造的特徴を有し
得る。抗体は、任意の起源に由来してもよいが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）およ
び霊長類化起源が好ましい。一実施形態では、抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である
。
一実施形態では、抗体分子は、例えば、単一単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片
などの単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、例えば、ナノボディ）である。一実施形態
では、単一ドメイン抗体の分子量は、約１２〜１５ｋＤａである。例えば、単一ドメイン
抗体は、ラクダ科動物に見られる重鎖抗体（例えば、ＶＨＨ断片）から改変され得る。軟
骨魚もまた、それから、ＶＮＡＲ断片と称される単一ドメイン抗体が得られ得る、重鎖抗
体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）を有する。代案のアプローチは、
例えば、ヒトまたはマウス由来などの通常の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）からの二量体可
変領域を単量体に分割することである。標的エピトープに特異的に結合する、重鎖または
軽鎖のどちらかに由来する単一ドメイン抗体が得られ得る。例えば、単一ドメイン抗体は
、重鎖抗体の、または通常のＩｇＧの可変領域（ＶＨ）を含む、約１１０アミノ酸長のペ
プチド鎖であり得る。
単一ドメイン抗体は、抗原に対して全抗体と同様の親和性を有し得る。それらは、また
、より耐熱性でありおよび／または洗剤および高濃度の尿素に対して安定であり得る。例
えば、ラクダ科動物および魚類抗体に由来するものは、常態では軽鎖と結合する親油性部
位を覆う、伸展したループを形成するそれらの相補性決定領域３（ＣＤＲ３）のために、
より低親油性かつより水溶性であり得る。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、例えば
、Ｆｃ領域を欠くために、補体系誘発性細胞傷害性を示さない。例えば、ラクダ科動物お
よび魚類由来ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体は、例えば、酵素の活性部位などの全抗体
がアクセスできなくてもよい、隠された抗原に結合し得る。この性質は、このような部位
を透過できる、それらの伸展したＣＤＲ３ループに起因し得る。
単一ドメイン抗体は、例えば、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカまたはサメを
所望の抗原で免疫化し、引き続いて重鎖抗体をコードするｍＲＮＡを単離することで、得
られ得る。逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応によって、数百万個のクローンを含有する
単一ドメイン抗体の遺伝子ライブラリーが生成される。ファージディスプレイおよびリボ
ソームディスプレイのようなスクリーニング技術が、抗原に結合するクローンを同定する
のを助ける。
異なる方法では、前もって免疫化されていない動物に由来する、遺伝子ライブラリーが
利用される。このような未感作ライブラリーは、通常は、所望の抗原に対する親和性が低
い抗体のみを含有し、追加的なステップとして、ランダム変異誘発によって親和性成熟さ
せることが、必要になる。
最も強力なクローンが同定されたら、例えば、酵素に対するそれらの安定性を改善する
ために、それらのＤＮＡ配列が最適化され得る。別の目的は、抗体に対するヒト生物の免
疫学的反応を阻止するためのヒト化である。最終ステップは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ま
たはその他の適切な生物中における、最適化単一ドメイン抗体の翻訳である。
代案としては、単一ドメイン抗体は、４本の鎖がある通常のマウスまたはヒトＩｇＧか
ら作成され得る。工程は同様であり、免疫化または未感作ドナーからの遺伝子ライブラリ
ーと、最も特異的な抗原を同定するための提示技術とを含む。単量体化は、通常は、親水
性アミノ酸で親油性アミノ酸を置換することで達成される。親和性が保持されれば、単一
ドメイン抗体も同様に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）またはその他の生物中で生成され得る。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、ＶＰ１６タンパク質またはドメイン、または
転写リプレッサータンパク質またはドメインなどの転写アクチベータータンパク質または
ドメインを含む。
＜融合タンパク質および融合パートナー＞
一実施形態では、ペイロードは、融合タンパク質を含む。代表的な融合タンパク質とし
ては、異なる機能的性質を有し得る、または異なるタンパク質に由来し得る、第１および
第２の融合パートナーが挙げられる。一実施形態では、融合タンパク質は、酵素活性を含
む、または遺伝子発現を促進または阻害する、核酸および第２の融合パートナーに結合す
る第１の融合パートナーを含み得る。一実施形態では、ペイロードそれ自体が融合タンパ
ク質である。一実施形態では、ペイロードは、Ｃａｓ９分子に融合される。
例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質に安定性および／または送達性を付加する
断片を含有し得る。一実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリン断片（例えば、
Ｆｃ断片）に融合された本明細書に記載されるタンパク質（例えば、受容体）；輸送タン
パク質；または例えば、アルブミンなどの血漿タンパク質であり得る。融合タンパク質は
また、融合タンパク質に、（例えば、毒素、酵素またはサイトカインによって運ばれる）
毒性を付加する断片を含有し得る。融合タンパク質はまた、（例えば、ＨＩＶ−１ ＴＡ
Ｔタンパク質によって）送達および／または経路標的化を可能にするために、使用され得
る。その他の例としては、例えば、ストレプトアビジン融合物などの多価を可能にする融
合物、または（例えば、その間に切断可能なリンカーがあるまたはない）２つの活性成分
の融合物が挙げられる。
一実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、例えば、ｅｉＣａｓ９分子などの
Ｃａｓ９分子との融合パートナーである。
一実施形態では、ペイロードは、例えば、ＶＰ１６タンパク質またはドメイン、または
転写リプレッサータンパク質またはドメインなどの転写アクチベータータンパク質または
ドメインを含むＣａｓ９分子との融合パートナーを含む。
＜酵素＞
一実施形態では、ペイロードは、酵素を含む。代表的な酵素としては、例えば、酸化還
元酵素（例えば、酸化／還元反応を触媒する）、トランスフェラーゼ（例えば、官能基（
例えば、メチルまたはリン酸基）を移動させる）、ヒドロラーゼ（例えば、様々な結合の
加水分解を触媒する）、リアーゼ（例えば、加水分解および酸化以外の手段によって様々
な結合を切断する）、イソメラーゼ（単一分子中の異性化変化を触媒する）、およびリガ
ーゼ（例えば、共有結合によって２つの分子を連結する）が挙げられる。一実施形態では
酵素は、例えば、ＤＮＡ合成、転写、ＤＮＡおよびヒストンのエピジェネティックな修飾
、ＲＮＡ転写後修飾、細胞周期制御、ＤＮＡ損傷修復、またはゲノム不安定性などの細胞
核内の１つまたは複数の機能を媒介し、またはそれと関連する。
＜小分子＞
一実施形態では、ペイロードは、小分子化合物を含む。
一実施形態では、小分子は、生物学的過程の調節物質である。例えば、小分子は、例え
ば、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、または核酸のような生体高分子などの第２の
分子と結合し得て、一実施形態では、第２の分子の構造、分布、活性、または機能の１つ
または複数を改変する。一実施形態では、小分子のサイズは、１０−９ｍ程度である。一
実施形態では、小分子の分子量は、例えば、２００ａｍｕ〜５００ａｍｕ、３００ａｍｕ
〜７００ａｍｕ、５００ａｍｕ〜７００ａｍｕ、７００ａｍｕ〜９００ａｍｕ、または５
００ａｍｕ〜９００ａｍｕである。
代表的な小分子としては、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、スベ
ロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、またはロミデプシン）、ヒストンメチルト
ランスフェラーゼ阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、アザシチジ
ン（または５−アザシチジン）、デシタビン（または５−アザ−２’−デオキシシチジン
）、またはＤＮＡ複製阻害剤が挙げられる。小分子はまた、例えば、小型核酸分子（塩基
次第で、例えば、２ｋＤ未満などの１〜４個の塩基）およびペプチドも含み得る。
＜マイクロサテライト伸長阻害剤＞
一実施形態では、ペイロードは、マイクロサテライト伸長阻害剤を含む。一実施形態で
は、マイクロサテライト伸長阻害剤は、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質である。本明細
書に記載される分子および方法によって送達され得る代表的なＤＮＡミスマッチ修復タン
パク質としては、例えば、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ
１、ＰＭＳ２が挙げられる。
＜シグナル発生器、放射性核種、レポーター分子、診断プローブ＞
一実施形態では、ペイロードは、シグナルを生じる分子を含む。このようなペイロード
は、例えば、研究、治療（例えば、がん治療）、および診断用途において、有用である。
一実施形態では、シグナルは、例えば、赤外線、可視、または紫外線領域における電磁放
射；例えば、α、β、またはγ粒子のような放射性崩壊生成物などの粒子；例えば、有色
基質などの検出可能基質；例えば、酵素反応生成物などの反応生成物；または例えば、抗
体などの特異的結合因子によって検出可能なリガンド；または色素を含む。一実施形態で
は、シグナルは、例えば、蛍光タンパク質による蛍光放射を含む。代表的な蛍光タンパク
質としては、Ｂｌｕｅ／ＵＶタンパク質（例えば、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ、Ａｚ
ｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓ
ａｐｐｈｉｒｅ）、シアンブルータンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｓ
ＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃＭｉ
ｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１）、緑色タンパク質（例えば、
ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＳｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒＧＦＰ、ＭｏｎｏｍｅｒｉｃＡｚａ
ｍｉＧｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏ
ｎＧｒｅｅｎ）、黄色タンパク質（例えば、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、Ｓ
ＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ）、橙色タンパク質（例えば、ＭｏｎｏｍｅｒｉｃＫｕｓａｂｉ
ｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２）、赤色
タンパク質（ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａ
ｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、
ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２）、遠赤色タンパク質（例えば、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔ
ａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦ
Ｐ１．４、ｉＲＦＰ）、ロングストークスシフトタンパク質（例えば、ｍＫｅｉｍａＲｅ
ｄ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２、ｍＢｅＲＦＰ）、光活性化可能タン
パク質（例えば、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、ＰＡＴａｇＲＦＰ）、Ｐｈｏｔ
ｏｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅタンパク質（例えば、Ｋａｅｄｅ（緑色）、Ｋａｅｄｅ（赤色
）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）、ＫｉｋＧＲ１（赤色）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑色
）、ｍＥｏｓ２（赤色）、ｍＥｏｓ３．２（緑色）、ｍＥｏｓ３．２（赤色）、ＰＳｍＯ
ｒａｎｇｅ）、光切り替え可能タンパク質（例えば、Ｄｒｏｎｐａ）が挙げられる。
一実施形態では、シグナル生成部分は、例えば、ｅｉＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子
の融合パートナーとして提供される。
シグナル発生器またはレポーターは、例えば、放射性同位体または放射性核種（例えば
、インジウム（１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０
Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、ビスマス（２１２Ｂｉ
または２１３Ｂｉ）、イオウ（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、ロジウ
ム（１８８ＲＨ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、プラセオジム、または亜リン酸（３２
Ｐ）または例えば、炭素−１１（１１Ｃ）、カリウム−４０（４０Ｋ）、窒素−１３（１
３Ｎ）、酸素−１５（１５Ｏ）、フッ素−１８（１８Ｆ）、およびヨウ素−１２１（１２
１Ｉ）などの陽電子放出放射性核種）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ラン
タニドリン光体）、酵素的標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、（例えば、光学的また
は熱量測定方法によって検出され得る、ストレプトアビジン部分と蛍光マーカーまたは酵
素活性とを含有する分子などの標識されたアビジンによって検出され得る）ビオチニル基
、および二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対合配列、二次抗体の結合部位、金
属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープを
はじめとするが、これに限定されるものではないポリペプチドを標識するために有用であ
る。一実施形態では、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって付着して、可能な
立体障害を軽減する。
一実施形態では、ペイロードは、放射性核種を含む。放射性核種は、ｇＲＮＡ分子、Ｃ
ａｓ９分子、またはペイロード分子に組み込まれ得る。代表的な放射性核種としては、例
えば、β放射体、α放射体またはγ放射体が挙げられる。一実施形態では放射性核種は、
例えば１３１Ｉまたは１２５Ｉなどのヨウ素、例えば９０Ｙなどのイットリウム、例えば
１７７Ｌｕなどのルテチウム、例えば２２５Ａｃなどのアクチニウム、例えば２１２Ｂｉ
または２１３Ｂｉなどのビスマス、例えば３５Ｓなどのイオウ、例えば１４Ｃなどの炭素
、トリチウム、３Ｈ、例えば１８８ＲＨなどのロジウム、例えば、９９Ｔｃなどのテクネ
チウム、プラセオジム、または例えば３２Ｐなどの亜リン酸である。
＜ＤＮＡおよびクロマチン構造の修飾物質＞
一実施形態では、ペイロードは、ＤＮＡ構造の内在性または外来性修飾物質を含む。ペ
イロードの典型例である修飾物質は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで送達さ
れ得る。
一実施形態では、ペイロードは、ＤＮＡのエピジェネティックな状態または特性の修飾
物質を含む。一実施形態では、エピジェネティックな状態または特性は、障害を治療する
ように、または細胞の発達またはその他の状態に影響を与えるように、改変され得る。
一実施形態では、エピジェネティックな状態または特性は、ＤＮＡメチル化を含む。例
えば、本明細書に記載されるペイロードはＤＮＡへのメチル基の付加を調節し、例えば、
ＣｐＧ部位で、例えば、シトシンを５−メチルシトシンに変換し得る。
異常なＤＮＡメチル化パターン（例えば、正常組織と比較した過剰メチル化および低メ
チル化）は、例えば、がんなどの様々な疾患および病状に関連する。本明細書に記載され
る修飾物質を使用して、例えば、がんなどの疾患を治療するために、転写が消失した遺伝
子が再活性化され、または転写的機能亢進遺伝子が阻害され得る。
ＤＮＡメチル化は、遺伝子転写に影響を及ぼし得る。例えば、それらのプロモーター領
域に高レベルの５−メチルシトシンがある遺伝子は、転写的により低活性またはサイレン
トであり得る。したがって、本明細書に記載される方法を使用して、例えば、本明細書に
記載される遺伝子の転写活性が標的化され抑制され得る。
一実施形態では、修飾物質は、ＤＮＡメチル化の維持を促進する。例えば、修飾物質は
、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）活性を有し、またはＤＮＭＴ活性を調節
し得て、例えば、ＤＮＡ複製後に、例えば、ＤＮＡメチル化を維持しまたは受動的ＤＮＡ
脱メチル化を低下させる。
一実施形態では、修飾物質は、新規ＤＮＡメチル化を促進する。例えば、本明細書に記
載される修飾物質は、新規ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）（例えば、ＤＮ
ＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ）活性を有し、または新規ＤＮＭＴ（例えばＤＮ
ＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ）活性を調節し得て、例えば、発達初期において
ＤＮＡメチル化パターンを生じる。
ＤＮＡのエピジェネティックな変化（例えば、メチル化）は、当該技術分野で周知の方
法によって、または本明細書に記載されるようにして評価され得る。ＤＮＡメチル化の代
表的な検出方法としては、例えば、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、全ゲノム亜硫酸水
素塩配列決定（ＢＳ−Ｓｅｑ）、ＨＥＬＰ（ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ
極小断片濃縮）アッセイ、チップ−オンチップアッセイ、制限ランドマークゲノムスキャ
ン、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法（ＭｅＤＩＰ）、亜硫酸水素塩処理ＤＮＡのピロシーケン
ス、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ活性のための分子ブレーク光アッセイ、メ
チル感受性サザンブロット法、ＭｅｔｈｙｌＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＰ）とメチル結
合領域（ＭＢＤ）のみを含有する融合タンパク質とを使用した、天然ＤＮＡのメチル化お
よび非メチル化画分への分離が挙げられる。
一実施形態では、修飾物質は、ＤＮＡを切断する。例えば、修飾物質は、ＤＮＡ骨格中
のリン酸ジエステル結合の加水開裂を触媒し得る。一実施形態では、修飾物質（例えば、
ＤＮａｓｅＩ）は、ピリミジンヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合で優先的に
ＤＮＡを切断して、３’位に遊離ヒドロキシル基がある５’−リン酸末端ポリヌクレオチ
ドを生じる。一実施形態では、修飾物質（例えば、ＤＮａｓｅＩＩ）は、ＤＮＡ中のデオ
キシリボヌクレオチド結合を加水分解して、３’−リン酸塩がある生成物を生じる。一実
施形態では、修飾物質は、エンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を含む。一実施形態では
、修飾物質は、エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性を含む（例えば、３’から５’方向
または５’から３’方向のエキソデオキシリボヌクレアーゼ活性を有する）。一実施形態
では、修飾物質は、特定のＤＮＡ配列を認識する（例えば、制限酵素）。一実施形態では
、修飾物質は、配列特異的様式中のＤＮＡを切断しない。修飾物質は、一本鎖ＤＮＡ（例
えば、ニッカーゼ活性を有する）、二本鎖ＤＮＡ、またはその双方を切断し得る。
一実施形態では、修飾物質は、三次または四次ＤＮＡ構造に影響を及ぼし、例えば、変
化させまたは維持する。例えば、本明細書に記載される修飾物質は、例えば、左右像（右
または左）、らせんターン長、ターンあたりの塩基対数、および／または主溝と副溝間の
サイズの差異などの三次構造を調節し得る。一実施形態では、修飾物質は、Ｂ−ＤＮＡ、
Ａ−ＤＮＡ、および／またはＺ−ＤＮＡの形成を媒介する。本明細書に記載される修飾物
質はまた、例えば、ＤＮＡと、例えば、クロマチンの形態その他の分子（例えば、ヒスト
ンなどのＤＮＡまたは非ＤＮＡ分子）との相互作用などの四次構造を調節し得る。一実施
形態では、三次的または四次ＤＮＡ構造を媒介または修飾する修飾物質は、ＤＮＡヘリカ
ーゼ活性を含み、またはＤＮＡヘリカーゼ活性を調節する。
一実施形態では、修飾物質は、ＤＮＡ損傷反応および／または修復を促進または阻害す
る。例えば、修飾物質は、例えば、直接回復、塩基切除修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド切
除修復（ＮＥＲ）（例えば、ゲノム全体の修復（ＧＧ−ＮＥＲ）、転写共役修復（ＴＣ−
ＮＥＲ））、不一致修復（ＭＭＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー
媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同組換え、および／または損傷乗り越え（ＴＬＳ）などの
１つまたは複数のＤＮＡ損傷反応および修復機構を促進し得る。一実施形態では、修飾物
質は、障害認識ステップを促進する。一実施形態では、修飾物質は、ＤＮＡ修復ステップ
を促進する。
異常なＤＮＡ損傷修復は、例えば、老化、遺伝性ＤＮＡ修復障害、およびがんなどの様
々な疾患および病状に関連する。例えば、がんリスクを増大させ得るＤＮＡ修復遺伝子変
異としては、例えば、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２（例えば、乳がんおよび卵巣がんにお
いて、例えば、二本鎖切断および娘鎖ギャップの相同組換え修復（ＨＲＲ）に関与する）
；ＡＴＭ（例えば、白血病、リンパ腫、および乳がんにおいて、例えば、異なる変異は、
ＨＲＲ、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、ＮＨＥＪまたは相同性指向ＤＳＢＲ（ＨＤＲ）
を低下させる）；ＮＢＳ（例えば、リンパ系悪性腫瘍において、例えば、ＮＨＥＪに関与
する）；ＭＲＥ１１（例えば、乳がんにおいて、例えば、ＨＲＲに関与する）；ＢＬＭ（
例えば、白血病、リンパ腫、結腸、乳房、皮膚、内耳道、舌、食道、胃、扁桃、喉頭、肺
、および子宮がんにおいて、例えば、ＨＲＲに関与する）；ＷＲＮ（例えば、軟部組織肉
腫、結腸直腸、皮膚、甲状腺、および膵臓がんにおいて、例えば、ＨＲＲ、ＮＨＥＪ、ロ
ングパッチＢＥＲに関与する）；ＲＥＣＱ４（ＲＥＣＱＬ４）（例えば、ＨＲＲに関与し
、例えば、ロートムンド・トムソン症候群（ＲＴＳ）、ラパデリノ症候群またはバラー・
ゲロルト症候群、そして基底細胞がん、扁平上皮がん、およびボーエン病をはじめとする
皮膚がんなどを引き起こす）；ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、Ｆ
ＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＪ、ＦＡＮＣ
Ｌ、ＦＡＮＣＭ、およびＦＡＮＣＮ（例えば、白血病、肝臓腫瘍、多数の部位の固形腫瘍
において、例えば、ＨＲＲおよびＴＬＳに関与する）；ＸＰＣおよびＸＰＥ（ＤＤＢ２）
（例えば、皮膚がん（メラノーマおよび非メラノーマ）において、例えば、ＮＥＲ（ＧＧ
Ｒ型）に関与する）；ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、およびＸＰＧ（例えば、皮膚が
ん（メラノーマおよび非メラノーマ）、および中枢神経系において、例えば、ＮＥＲ（Ｇ
ＧＲ型およびＴＣＲ型の双方）に関与する）；ＸＰＶ（ＰＯＬＨ）（例えば、皮膚がん（
メラノーマおよび非メラノーマ）において、例えば、ＴＬＳに関与する）；ｈＭＳＨ２、
ｈＭＳＨ６、ｈＭＬＨ１、およびｈＰＭＳ２（例えば、結腸直腸、子宮内膜、および卵巣
がんにおいて、ＭＭＲに関与する）；ＭＵＴＹＨ（例えば、結腸がんにおいて、例えば、
８ＯＨ−ｄＧと誤対合し、ならびにＧ、ＦａｐｙｄＧ、およびＣと誤対合するＡのＢＥＲ
に関与する）が挙げられる。
修飾物質を使用して、例えば、本明細書に記載される１つまたは複数のＤＮＡ損傷修復
機構を調節することで、異常なＤＮＡ損傷修復に関連する疾患または病状が治療され得る
。
一実施形態では、修飾物質は、例えば、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（Ｍ
ＧＭＴ）などの、直接回復に関与する１つまたは複数のタンパク質から選択され、または
それを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、例えば、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰエンドヌクレアー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどの、ＢＥＲに関与する１つまたは複数のタ
ンパク質から選択され、またはそれを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、例えば、ＸＰＣ、ＨＲ２３ｂ、ＣＡＫ、ＴＦＩＩＨ、Ｘ
ＰＡ、ＲＰＡ、ＸＰＧ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＴＦＩＩＨ、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ＡＤＮ
Ｐｏｌ、およびリガーゼＩなどの、ＧＧ−ＮＥＲに関与する１つまたは複数のタンパク質
から選択され、またはそれを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、例えば、ＣＳＢ、ＸＰＡ、ＲＰＡ、ＸＰＧ、ＸＰＦ、Ｅ
ＲＣＣ１、ＣＳＡ−ＣＮＳ、ＴＦＩＩＨ、ＣＡＫ、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、リガーゼＩ、およ
びＲＮＡポリメラーゼＩＩなどの、ＴＣ−ＮＥＲに関与する１つまたは複数のタンパク質
から選択され、またはそれを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、１つまたは複数のＤＮＡミスマッチ修復タンパク質から
選択され、またはそれを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、例えばＫｕ７０／８０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＤＮＡリガ
ーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡポリメラーゼｍｕ、ＤＮＡポリ
メラーゼλ、ＰＮＫＰ、Ａｐｒａｔａｘｉｎ、およびＡＰＬＦなどの、ＮＨＥＪに関与す
る１つまたは複数のタンパク質から選択され、またはそれを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、例えば、本明細書に記載されるような、相同組換えに関
与する１つまたは複数のタンパク質から選択され、またはそれを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼη、ι、κ、ｚｅｔａ、お
よびＰＣＮＡなどの、ＴＬＳに関与する１つまたは複数のタンパク質から選択され、また
はそれを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、例えば、ＤＮＡ損傷チェックポイントおよび／またはＤ
ＮＡ損傷に対する転写応答などの、ＤＮＡ損傷に対する包括的反応を調節し得る。例えば
、ＤＮＡ損傷チェックポイントは、Ｇ１／ＳおよびＧ２／Ｍ境界で起こり得る。Ｓ内チェ
ックポイントもまた、存在し得る。チェックポイント活性化は、ＡＴＭおよびＡＴＲの２
つのマスターキナーゼによって調節され得る。ＡＴＭは、クロマチン構造中のＤＮＡ二本
鎖切断および破壊に応答し得て、ＡＴＲは、停止複製フォークに応答し得る。これらのキ
ナーゼは、シグナルトランスダクションカスケード中の下流標的をリン酸化し得て、例え
ば、細胞周期停止をもたらす。チェックポイント活性化シグナルを下流タンパク質に伝送
する、チェックポイント媒介タンパク質のクラス（例えば、ＢＲＣＡ１、ＭＤＣ１、およ
び５３ＢＰ１）は、調節され得る。調節され得る代表的な下流タンパク質としては、例え
ば、ｐ５３、ｐ２１、およびサイクリン／サイクリン依存性キナーゼ複合体が挙げられる
。
一実施形態では、修飾物質は、核ＤＮＡ損傷反応および修復を調節する。一実施形態で
は、修飾物質は、ミトコンドリアＤＮＡ損傷反応および修復を調節する。
一実施形態では、修飾物質は、ＤＮＡ複製を促進または阻害する。例えば、修飾物質は
、例えば、開始（例えば、複製前複合体および／または開始複合体のアセンブリー）、伸
長（例えば、複製フォークの形成）、および終結（例えば、複製フォーク関門の形成）な
どの、ＤＮＡ複製の１つまたは複数の段階を促進または阻害し得る。一実施形態では、修
飾物質は、例えば、起点認識複合体（ＯＲＣ）、ＣＤＣ６、ＣＤＴ１、ミニ染色体維持タ
ンパク質（例えば、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、お
よびＭＣＭ１０）、ＣＤＣ４５、ＣＤＫ、ＤＤＫ、ＣＤＣ１０１、ＣＤＣ１０２、ＣＤＣ
１０３、およびＣＤＣ１０５などの、開始に関与する１つまたは複数のタンパク質から選
択され、またはそれを調節する。一実施形態では、修飾物質は、例えば、ＤＮＡヘリカー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＮＡ、ＣＤＣ４５−ＭＣＭ−ＧＩＮＳヘリカーゼ複合体、
および複製因子Ｃ複合体などの、伸長に関与する１つまたは複数のタンパク質から選択さ
れ、またはそれを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、例えば、ＩＩ型トポイソメラーゼおよびテロメラーゼな
どの、終結に関与する１つまたは複数のタンパク質から選択されまたはそれを調節する。
一実施形態では、修飾物質は、例えば、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＴＲＩＰ、ＴＯＰＢＰ１、Ｒ
ＡＤ９、ＨＵＳ１、Ｒａｄ１、およびＣＨＫ１などの、１つまたは複数の複製チェックポ
イントタンパク質から選択され、またはそれを調節する。
一実施形態では、ペイロードは、核ＤＮＡ複製の修飾物質を含む。一実施形態では、修
飾物質は、ミトコンドリアＤＮＡ複製を促進または阻害する。
ＤＮＡ複製の欠陥は、例えば、がんおよび神経学的疾患（例えば、アルツハイマー病）
などの様々な疾患および病状に関連し得る。ミトコンドリアＤＮＡ複製の欠陥はまた、例
えば、ｍｔＤＮＡ枯渇症候群（例えば、アルパーズ病または早期幼児肝脳症候群）および
ｍｔＤＮＡ欠失障害（例えば、進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）、運動失調神経障害、または
ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ））などの疾患および病状に関連し得
る。修飾物質を使用して、例えば、本明細書に記載されるようにＤＮＡ複製を調節するこ
とで、異常なＤＮＡ複製に関連する疾患または病状が治療され得る。
ＤＮＡ構造の代表的な内在性または外来性修飾物質は、例えば、表ＶＩ−３で、本明細
書に記載される。
Figure 2021192615
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Figure 2021192615
Figure 2021192615
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一実施形態では、ペイロードは、例えば、ヒストンのようなクロマチン関連タンパク質
などのクロマチンの構成要素のエピジェネティックな状態または特性の修飾物質を含む。
例えば、エピジェネティックな状態または特性は、ヒストンアセチル化、脱アセチル化、
メチル化（例えば、モノ、ジ、またはトリメチル化）、脱メチル化、リン酸化、脱リン酸
化、ユビキチン化（例えば、モノまたはポリユビキチン化）、脱ユビキチン化、ＳＵＭＯ
化、ＡＤＰ−リボース化、脱イミノ化、またはそれらの組み合わせを含み得る。
一実施形態では、修飾物質は、１つまたは複数のヒストン修飾酵素から選択され、また
はそれを調節する。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、ヒストンメチルトランスフェ
ラーゼ（ＨＭＴ）である。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、ヒストンデメチルトラ
ンスフェラーゼ（ＨＤＭＴ）である。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、ヒストンア
セチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）である。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、ヒ
ストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）である。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、キナ
ーゼである。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、ホスファターゼである。一実施形態
では、ヒストン修飾酵素は、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２
）、またはユビキチンリガーゼ（Ｅ３）である。一実施形態では、ヒストン修飾酵素は、
脱ユビキチン化（ＤＵＢ）酵素である。
一実施形態では、遺伝子転写制御に関与するヒストン修飾が調節される。例えば、Ｈ３
Ｋ４、Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ２７、Ｈ３Ｋ７９、Ｈ４Ｋ２０、Ｈ２ＢＫ５のモノメチル化、Ｈ
３Ｋ７９のジメチル化、Ｈ３Ｋ４、Ｈ３Ｋ７９、Ｈ３Ｋ３６のトリメチル化、およびＨ３
Ｋ９、Ｈ３Ｋ１４、Ｈ３Ｋ２７のアセチル化が、転写活性化に関連し得る。別の例として
、Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ２７のジメチル化、およびＨ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ２７、Ｈ３Ｋ７９、Ｈ２
ＢＫ５のトリメチル化が、転写抑制に関連し得る。一実施形態では、修飾物質は、例えば
、活性遺伝子中で、Ｈ３リジン４（Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３）のトリメチル化および／またはＨ３
リジン３６（Ｈ３Ｋ３６Ｍｅ３）トリメチル化を調節する。一実施形態では、修飾物質は
、例えば、抑制された遺伝子中で、Ｈ３リジン２７（Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３）のトリメチル化
、Ｈ３リジン９（Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２／３）のジおよびトリメチル化、および／またはＨ４リ
ジン２０（Ｈ４Ｋ２０Ｍｅ３）のトリメチル化を調節する。一実施形態では、修飾物質は
、例えば、幹細胞内で、活性化（例えば、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３）および抑制（例えば、Ｈ３Ｋ
２７Ｍｅ３）標識の双方を調節する。
一実施形態では、ＤＮＡ損傷反応および修復に関与するヒストン修飾が調節される。例
えば、本明細書に記載される修飾物質は、セリン１３９におけるＨ２ＡＸのリン酸化およ
び／またはＨ３リジン５６のアセチル化（Ｈ３Ｋ５６Ａｃ）を調節し得る。
異常なヒストン修飾は、例えば、がん、心血管疾患、および神経変性疾患などの様々な
疾患および病状に関連する。本明細書に記載される修飾物質を使用して、例えば、本明細
書に記載されるように１つまたは複数のヒストン修飾を調節することで、本明細書に記載
される疾患または病状が治療され得る。
ヒストンのエピジェネティックな変化は、当該技術分野で周知の方法によって、または
本明細書に記載されるようにして評価され得る。ヒストン修飾検出する代表的な方法とし
ては、例えば、定量ＰＣＲがそれに続く、修飾ヒストンに対する抗体を使用するクロマチ
ン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）が挙げられる。
クロマチン構造の代表的な内在性または外来性修飾物質は、例えば、表ＶＩ−４で、本
明細書に記載される。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
＜遺伝子発現の修飾物質＞
一実施形態では、ペイロードは、遺伝子発現の修飾物質を含む。遺伝子発現の修飾物質
は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで送達され得る。
一実施形態では、ペイロードは、転写因子を含む。転写因子は、それらが制御する遺伝
子に隣接する、特定のＤＮＡ配列（例えば、エンハンサーまたはプロモーター領域）に結
合し得る。例えば、転写因子は、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡの結合を安定化または阻害
し、（例えば、直接、またはこのような触媒活性があるその他のタンパク質を動員するこ
とで）ヒストンタンパク質びアセチル化または脱アセチル化を触媒し、または活性化補助
因子またはコリプレッサータンパク質を転写因子／ＤＮＡ複合体に動員し得る。遺伝子発
現の修飾物質はまた、例えば、転写因子と直接または間接的に相互作用する、任意のタン
パク質も含む。
一実施形態では、転写因子は基本転写因子であり、例えば、遍在性であり、多数の、大
多数のまたは全てのクラスＩＩ遺伝子の転写開始部位周囲のコアプロモーター領域と相互
作用する。代表的な基本転写因子としては、例えば、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩ
Ｄ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、およびＴＦＩＩＨが挙げられる。一実施形態では、転写因
子は上流転写因子であり、例えば、開始部位上流に結合して、転写を刺激または抑制する
。一実施形態では、転写因子は、例えば、遺伝子近くに存在する認識配列に依存する転写
因子などの、特定の転写因子である。代表的な特定の転写因子としては、例えば、ＳＰ１
、ＡＰ−１、Ｃ／ＥＢＰ、熱ショック因子、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ、−Ｍｙｃ、ＯＣＴ−１、
およびＮＦ−１が挙げられる。
一実施形態では、転写因子は、構成的活性型であり、例えば、基本転写因子、ＳＰ１、
ＮＦ−１、またはＣＣＡＡＴである。一実施形態では、転写因子は条件的活性であり、例
えば、それは、発達（例えば、ＧＡＴＡ、ＨＮＦ、ＰＩＴ−１、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｈ
ｏｘ、翼状らせん）、シグナル依存性（例えば、細胞外リガンド（内分泌またはパラクリ
ン）依存性、細胞内リガンド（自己分泌）依存性（例えば、ＳＲＥＢＰ、ｐ５３、オーフ
ァン核受容体）、細胞膜受容体依存性（例えば、常在核因子（例えば、ＣＲＥＢ、ＡＰ−
１、Ｍｅｆ２）または潜在細胞質因子（例えば、ＳＴＡＴ、Ｒ−ＳＭＡＤ、ＮＦ−κＢ、
Ｎｏｔｃｈ、ＴＵＢＢＹ、ＮＦＡＴ）の活性化を必要とする。
その他の代表的な転写因子は、例えば、表ＶＩ−５で、本明細書に記載される。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
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Figure 2021192615
＜選択的スプライシングの修飾物質＞
一実施形態では、遺伝子発現の修飾物質は、スプライシングを調節する。例えば、修飾
物質は、相互に排他的なエクソンであるエクソンスキッピングまたはカセットエクソン、
代案のドナー部位、代案の受容体部位、イントロン保持、またはそれらの組み合わせを調
節し得る。一実施形態では、修飾物質は、例えば、ＡＳＦ１などの、１つまたは複数の一
般的または選択的スプライシング因子から選択されまたはそれを調節する。一実施形態で
は、修飾物質は、濃度依存様式で、選択的スプライシングを調節する（例えば、スプライ
ス部位選択に影響を及ぼす）。
＜転写後修飾の修飾物質＞
一実施形態では、遺伝子発現の修飾物質は、転写後修飾を調節する。例えば、本明細書
に記載される修飾物質は、５’キャッピング、３’ポリアデニル化、およびＲＮＡスプラ
イシングを促進または阻害し得る。一実施形態では、修飾物質は、例えば、ホスファター
ゼおよびグアノシルトランスフェラーゼなどの、５’キャッピングに関与する１つまたは
複数の要素から選択され、またはそれを調節する。一実施形態では、修飾物質は、例えば
、ポリアデニル化ポリメラーゼ、切断・ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）、および
ポリ（Ａ）結合タンパク質などの、３’ポリアデニル化に関与する１つまたは複数の要素
から選択され、またはそれを調節する。一実施形態では、修飾物質は、例えば、一般的ま
たは選択的スプライシング要素などの、ＲＮＡスプライシングに関与する１つまたは複数
の要素から選択され、またはそれを調節する。
転写後修飾の代表的な内在性または外来性修飾物質は、例えば、表ＶＩ−６で、本明細
書に記載される。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
＜阻害剤＞
一実施形態では、ペイロードは、例えば酵素転写因子の阻害剤などの上に記載されるペ
イロードの阻害剤を含む。一実施形態では、ペイロードは、前述のペイロード分子、過程
、機能または機構のいずれかの阻害剤を含む。一実施形態では、阻害剤は、本明細書に記
載されるペイロード分子の１つに対して特異的な抗体分子（例えば、完全抗体またはその
抗原結合断片）である。一実施形態では、阻害剤は、小分子化合物である。一実施形態で
は、阻害剤は、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス−オ
リゴヌクレオチド、およびアプタマー）である。例えば、ペイロードは、例えば、転写因
子、翻訳後修飾酵素、転写後修飾酵素など標的の阻害剤、または前述のいずれかをコード
する核酸配列である。
＜オルソログ＞
非ヒト遺伝子またはタンパク質が本明細書で列挙される場合、本発明はまた、ヒト対応
物またはオルソログおよびその使用も含むものと理解される。
［ＶＩＩＡ．標的：細胞］
例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を
使用して、細胞（例えば、動物細胞または植物細胞）が操作されることができ、例えば、
多種多様な細胞内でペイロードが送達されまたは標的核酸が編集される。典型的に、ｅｉ
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用してペイロードが送達され、ｅａＣａｓ９分子
／ｇＲＮＡ複合体を使用して標的核酸の構造が編集または改変される。送達または編集は
、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施され得る。
一実施形態では、細胞は、例えば、本明細書に記載されるような１つまたは複数の標的
遺伝子を編集する（例えば、変異を導入または修正する）ことで操作される。一実施形態
では、細胞は、（例えば、本明細書に記載されるような）１つまたは複数の修飾物質を含
むペイロードを、細胞、例えば、細胞ゲノム内の標的配列などに送達することで操作され
る。一実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子（例えば、本明細書に記載される１つ
または複数の標的遺伝子）の発現が、例えば、インビボで調節される。一実施形態では、
１つまたは複数の標的遺伝子（例えば、本明細書に記載される１つまたは複数の標的遺伝
子）の発現が、例えば、エクスビボで調節される。
一実施形態では、細胞は、１つの細胞型から別の細胞型に操作される（例えば、変換ま
たは分化される）。一実施形態では、膵臓細胞を操作してβ膵島細胞にする。一実施形態
では、線維芽細胞を操作してｉＰＳ細胞にする。一実施形態では、前脂肪細胞を操作して
褐色脂肪細胞にする。その他の代表的な細胞としては、例えば、筋肉細胞、神経細胞、白
血球、およびリンパ球が挙げられる。
一実施形態では、細胞は、病的または変異保有細胞である。このような細胞を操作して
、疾患が治療され、例えば、変異が修正され、または細胞表現型が改変され、例えばがん
細胞の増殖が阻害され得る。例えば、細胞は、本明細書に記載される１つまたは複数の疾
患または病状に関連する。一実施形態では、細胞は、がん幹細胞である。例えば、がん幹
細胞は、ＴＷＩＳＴ（ＴＦ）、ＨＩＦ−１α、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｓｎａｉｌ（ＴＦ）、
またはＷｎｔから選択される１つまたは複数の遺伝子の発現を調節することで、操作され
得る。
一実施形態では、操作される細胞は、正常細胞である。
一実施形態では、操作される細胞は、幹細胞または前駆細胞（例えば、ｉＰＳ、胚性、
造血性、脂肪、生殖細胞系、肺、または神経性幹または前駆細胞）である。
一実施形態では、操作される細胞は、組換え生物学的産物を生成するのに好適である。
例えば、細胞は、ＣＨＯ細胞または線維芽細胞であり得る。一実施形態では、操作される
細胞は、タンパク質を発現するように操作されている細胞である。
一実施形態では、操作される細胞は、線維芽細胞、単球前駆体、Ｂ細胞、外分泌細胞、
膵前駆細胞臓、内分泌前駆細胞臓、肝芽細胞、筋芽細胞、または前脂肪細胞から選択され
る。一実施形態では、細胞は操作されて（例えば、変換または分化されて）、筋肉細胞、
赤血球系−巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島β細胞、ニ
ューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆細胞臓、外分泌前駆細胞臓、乳管細胞、腺房
細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝実質細胞、胆管細胞、または褐色脂肪細胞
になる。
一実施形態では、細胞は、筋肉細胞、赤血球系−巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マ
クロファージ、Ｔ細胞、膵島β−細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆細
胞、外分泌前駆細胞、乳管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝実質
細胞、胆管細胞、または白色または褐色脂肪細胞である。
本明細書に記載されるＣａｓ９およびｇＲＮＡ分子は、標的細胞に送達され得る。一実
施形態では、標的細胞は、正常細胞である。
一実施形態では、標的細胞は、幹細胞または前駆細胞（例えば、ｉＰＳ、胚性、造血性
、脂肪、生殖細胞系、肺、または神経性幹または前駆細胞）である。
一実施形態では、標的細胞は、ＣＨＯ細胞である。
一実施形態では、標的細胞は、線維芽細胞、単球前駆体、Ｂ細胞外分泌細胞、膵前駆細
胞臓、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、または前脂肪細胞である。
一実施形態では、標的細胞は、筋肉細胞、赤血球系−巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞
、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島β−細胞、ニューロン（例えば、脳内のニューロン、例
えば、線条体内のニューロン（例えば、中型有棘ニューロン）、大脳皮質、中心前回、海
馬（例えば、海馬の歯状回またはＣＡ３領域内のニューロン）、側頭皮質、小脳扁桃、前
頭皮質、視床、小脳、毛髄質、被殻、視床下部、中脳蓋、中脳被蓋または黒質）、心筋細
胞、血液細胞、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、乳管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞
、δ細胞、ＰＰ細胞、肝実質細胞、胆管細胞、または褐色脂肪細胞である。
一実施形態では、標的細胞は、１つまたは複数の標的遺伝子を編集する（例えば、変異
を導入または修正する）および／または１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節するこ
とで、インビトロで操作されて、対象に投与される。
操作され得る代表的な細胞、および調節され得る代表的な遺伝子は、表ＶＩＩ−８に記
載される。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
がん幹細胞（ＣＳＣ）の代表的な内在性または外来性修飾物質は、例えば、表ＶＩＩ−
１３で、本明細書に記載される。
Figure 2021192615
例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を
使用して、細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）が操作されることができ、例えば
、ペイロードが送達され、または標的核酸が編集され、例えば、細胞生着が増大され、例
えば、天然微小環境内の細胞の安定した生着が達成される。生着細胞、天然微小環境内の
細胞、またはその双方が操作され得る。典型的に、ｅｉＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合
体を使用してペイロードが送達され、ｅａＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ複合体を使用して標的
核酸の構造が編集または改変される。
例えば、細胞生着効率の増大は、例えば、自動誘導遺伝子、接着遺伝子、生存遺伝子、
増殖性遺伝子、免疫逃避遺伝子、および／または細胞保護遺伝子などの本明細書に記載さ
れる遺伝子の１つまたは複数の発現を増大させることで、および／または例えば、休止遺
伝子、死滅／アポトーシス遺伝子、および／または免疫認識遺伝子などの本明細書に記載
される遺伝子の発現の１つまたは複数を低下させることで達成され得る。
一実施形態では、遺伝子は、例えば、組織発現リガンドに結合する組織へのまたは可溶
性サイトカインに富んだ領域への細胞遊走の誘導に関与する、自動誘導受容体または接着
分子をコードする。一実施形態では、自動誘導受容体または接着分子は、例えば、リンパ
球または造血幹細胞などの白血球上で発現される。一実施形態では、組織は、例えば、細
胞外マトリックスまたは間質細胞などの骨髄である。一実施形態では、自動誘導受容体ま
たは接着分子は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体型４（ＣＸＣＲ４；フーシンまたはＣＤ１
８４としてもまた知られている）である。例えば、造血幹細胞上のＣＸＣＲ４の発現は、
上方制御されている。一実施形態では、リガンドは、間質由来因子−１（ＳＤＦ−１；Ｃ
ＸＣＬ１２としてもまた知られているである）。一実施形態では、自動誘導受容体または
接着分子は、ＣＤ３４である。一実施形態では、リガンドは、アドレシン（粘膜血管アド
レシン細胞接着分子１（ＭＡｄＣＡＭ−１）としてもまた知られている）である。
一実施形態では、遺伝子は、例えば、ケモカインまたはサイトカインなどのリガンドと
結合する、幹細胞または前駆細胞上で発現される受容体をコードする。例えば、受容体は
、細胞の幹細胞性と関連しおよび／または細胞を所望の微小環境に誘引し得る。一実施形
態では、受容体は、造血幹細胞上で発現される。一実施形態では、受容体は、神経幹細胞
上で発現される。一実施形態では、受容体はマスト／幹細胞成長因子受容体（ＳＣＦＲ；
プロトオンコジーンｃ−キットまたはチロシン−タンパク質キナーゼキットまたはＣＤ１
１７としてもまた知られている）である。一実施形態では、リガンドは幹細胞因子（ＳＣ
Ｆ；スティール因子またはｃ−キットリガンドとしてもまた知られている）である。一実
施形態では、受容体は、骨髄増殖性白血病ウイルス発がん遺伝子（ＭＰＬ；ＣＤ１１０と
してもまた知られている）である。一実施形態では、リガンドは、トロンボポエチン（Ｔ
ＰＯ）である。
一実施形態では、遺伝子は、例えば、そのマーカーを発現する細胞の生存または増殖を
促進し、またはそのマーカーを発現する細胞が免疫応答を逃避できるようにし、または例
えば、細胞死をもたらす有害な環境から保護されるようにする、マーカーをコードする。
例えば、ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）としてもまた知られているを
発現する細胞は、例えば、細胞移動中に食作用を回避し得る。別の例として、ＢＣＬ２を
発現する細胞は、アポトーシスから保護され得る。一実施形態では、細胞は、例えば、赤
血球または白血球などの血液細胞である。一実施形態では、細胞は、造血幹細胞または前
駆細胞である。
一実施形態では、例えば、造血幹細胞または前駆細胞などの幹細胞または前駆細胞中に
おいて、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ１、ＣＤ１１７、ＭＰＬ、ＣＤ４７、またはＢＣＬ２の１つ
または複数の発現が上方制御される。
例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を
使用して、細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）が操作されることができ、例えば
、ペイロードが送達され、または標的核酸が編集され、例えば、関心のあるより良い標的
特異性細胞型に、および／または自殺機序として、標的細胞の運命が操作される（例えば
、決定される）。典型的に、ｅｉＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用してペイロー
ドが送達され、および／またはｅａＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ複合体を使用して標的核酸の
構造が編集または改変される。調節され得る代表的な遺伝子としては、例えば、本明細書
に記載されるような、化学療法耐性遺伝子、化学療法感受性遺伝子、抗生物質耐性遺伝子
、抗生物質感受性遺伝子、および細胞表面受容体遺伝子の１つまたは複数が挙げられる。
一実施形態では、化学療法耐性遺伝子、化学療法感受性遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、
および／または抗生物質感受性遺伝子は、例えば、修飾されたまたは望ましくない細胞（
例えば、骨髄中の例えば、修飾されたまたは望ましくない造血幹細胞（ＨＳＣ））が、例
えば、化学療法薬または抗生剤治療によって、減少しまたは除去され得るように調節され
る。
例えば、化学療法抵抗性または抗生物質耐性を調節する（例えば、増大させる）遺伝子
または遺伝子産物が、細胞内に送達され得る。化学療法または抗生物質耐性遺伝子または
遺伝子産物によって修飾された細胞は、化学療法薬または抗生剤治療後に、このような修
飾がない細胞よりも高い（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、２５、５０、７５、または１００倍高い）生存率を有し得る。一実施形態では、化学療
法薬または抗生剤治療は、インビボで実施される。一実施形態では、化学療法薬または抗
生剤治療は、インビトロまたはエクスビボで実施される。一実施形態では、化学療法耐性
遺伝子は、Ｏ６−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）をコ
ードする遺伝子である。一実施形態では、化学療法は、テモゾロマイドを含む。
別の例では、化学療法感受性または抗生物質感受性を調節する（例えば、増大させる）
遺伝子または遺伝子産物が、細胞内に送達され得る。化学療法感受性または抗生物質感受
性を与える遺伝子または遺伝子産物は、例えば、細胞のアポトーシスを引き起こす、自殺
シグナルとして使用され得る。化学療法または抗生物質感受性遺伝子または遺伝子産物に
よって修飾された細胞は、化学療法薬または抗生剤治療後に、このような修飾がない細胞
よりも低い（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０
、７５、または１００倍低い）生存率を有し得る。一実施形態では、化学療法薬または抗
生剤治療は、インビボで実施される。一実施形態では、化学療法薬または抗生剤治療は、
インビトロまたはエクスビボで実施される。
本明細書に記載される方法を使用して、例えば、化学療法耐性および／または抗生物質
耐性などの修飾されたまたは所望の表現型を有する細胞が、選択または濃縮され得る。本
明細書に記載される方法はまた、例えば、化学療法感受性および／または抗生物質感受性
を有する、修飾されまたは望まれない表現型を有する細胞数を除去しまたは減少させるた
めに使用され得る。例えば、望まれないゲノムの部位または細胞型における核酸の編集に
よって引き起こされる、例えば、オフターゲット効果などの望まれない効果、またはがん
表現型を示す細胞が除去され得る。
一実施形態では、治療薬（例えば、治療用抗体）を使用して、細胞表面受容体の発現の
増大または低下を有する細胞が標的化（例えば、細胞を殺滅）され得るように、細胞表面
受容体遺伝子が調節される（例えば、細胞表面受容体の発現が増大または低下される）。
一実施形態では、細胞表面受容体は、ＣＤ２０である。一実施形態では、治療用抗体は、
リツキシマブである。
一実施形態では、細胞表面受容体は、例えば、ＣＤ５２、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ３０、ＥＧ
ＦＲ、ＣＤ３３、またはＥｒｂＢ２から選択される。一実施形態では、治療用抗体は、例
えば、アレムツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、パニツマブ、ゲムツズマブ、およ
びトラスツズマブから選択される。一実施形態では、細胞表面受容体はＣＤ５２であり、
治療用抗体はアレムツズマブである。一実施形態では、遺伝子はＶＥＧＦをコードし、治
療用抗体はリツキシマブである。一実施形態では、細胞表面受容体はＥＧＦＲであり、治
療用抗体はセツキシマブまたはパニツマブである。一実施形態では、細胞表面受容体はＣ
Ｄ３３であり、治療用抗体はゲムツズマブである。一実施形態では、細胞表面受容体はＥ
ｒｂＢ２であり、治療用抗体はトラスツズマブである。
一実施形態では、例えば、細胞が、例えば、インビボで、例えば、抗生物質などの薬剤
で処理された場合に、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子発現または活性が、誘導
または抑制される。例えば、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の発現または活性
の誘導または抑制を利用して、例えば、特定の組織内で、毒性および／またはオフターゲ
ット効果を低下させ得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその双
方の発現は、誘導性プロモーターによって駆動される。一実施形態では、薬剤（例えば、
抗生物質）のＣａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子への結合は、Ｃａｓ９分子および
／またはｇＲＮＡ分子の活性を活性化しまたは阻害する。一実施形態では、薬剤（例えば
、抗生物質）は、局所的に投与される。一実施形態では、薬剤（例えば、抗生物質）で処
理される細胞は、眼、耳、鼻、口、または皮膚の中に位置する。
例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を
使用して、細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）が操作されることができ、例えば
、指向性酵素プロドラッグ療法（ＤＥＰＴ）において、例えば、ペイロードが送達され、
または標的核酸が編集される。典型的に、ｅｉＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用
してペイロードが送達され、ｅａＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ複合体を使用して標的核酸の構
造が編集または改変される。
指向性酵素プロドラッグ療法（ＤＥＰＴ）は、体内に人工的に導入された酵素を利用し
て、生物学的活性が皆無でありまたは乏しいプロドラッグを体内所望の部位で活性形態に
変換する。例えば、指向性酵素プロドラッグ療法を使用して、所望の部位のみで、活性薬
剤の高レベルを達成することで、薬剤の全身毒性を低下させ得る。
一実施形態では、プロドラッグ変換に必要な酵素、またはこのような酵素をコードする
遺伝子が、例えば、がん細胞などの標的細胞に送達される。例えば、酵素または遺伝子が
、本明細書に記載される方法によって送達され得る。一実施形態では、プロドラッグ変換
に必要な酵素をコードする遺伝子は、ウイルスベクターによって送達される。
例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を
使用して、細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）が操作されることができ、例えば
、ペイロードが送達され、または標的核酸が編集されて、例えば、がん免疫療法などの免
疫療法が改善される。典型的に、ｅｉＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用してペイ
ロードが送達され、ｅａＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ複合体を使用して標的核酸の構造が編集
または改変される。調節され得る代表的な遺伝子としては、例えば、ＰＤ−Ｌ１および／
またはＰＤ−Ｌ２遺伝子などの本明細書に記載される遺伝子の１つまたは複数が挙げられ
る。
［ＶＩＩＢ．標的：経路および遺伝子］
例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を
使用して、例えば、経路のＲＮＡまたはタンパク質をコードする配列、または経路のＲＮ
Ａまたはタンパク質の発現を調節する配列を標的化することで、１、２、３つ以上の要素
または経路が操作され得る。一実施形態では、第１の経路の要素および第２の経路の要素
が操作される。一実施形態では、操作は、標的核酸へのペイロードの送達または標的核酸
の編集を含む。典型的に、ｅｉＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用してペイロード
が送達され、ｅａＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ複合体を使用して標的核酸の構造が編集または
改変される。送達または編集は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施され得
る。
経路要素は、上方または下方制御されることができ、例えば、経路のタンパク質をコー
ドする遺伝子の発現は増大または低下させ得る。増大または低下は、ペイロード（例えば
、転写因子または転写因子阻害剤）の送達によって、または標的核酸の編集によって（例
えば、調節またはコード領域内に、例えば、変異を修正または導入することで、配列を改
変するテンプレート核酸の使用）、もたらされ得る。
代表的な経路は、細胞増殖；細胞周期；炭素代謝；エネルギー代謝；解糖、嫌気呼吸、
嫌気呼吸；膜貫通シグナルトランスダクション、血管新生、ＤＮＡ複製または修復、また
は疼痛に関連する経路を含む。
代表的な経路および遺伝子は、本明細書で考察される。経路または遺伝子は、細胞また
は生命体の機能の１つまたは複数の態様に関連し得るものと理解され、例えば、経路また
は遺伝子は、がんおよびエネルギー代謝の双方に関与し得る。経路または遺伝子の操作は
、下に列挙される代表的な細胞または生命体の機能に限定されない。一実施形態では、経
路は、１つまたは複数の疾患または病状に関連する。
一実施形態では、経路は、がんに関連し、例えば、増殖（例えば、ＲＡＦ経路）に関連
し、増殖抑制因子を回避し、細胞死に抵抗し、複製不死／老化を可能にし、血管新生を誘
導し、浸潤および転移、エネルギー代謝を活性化し、およびがん幹細胞、サイトカイン受
容体相互作用、または腫瘍抑制因子を回避する。一実施形態では、経路は、細胞周期制御
に関連する。一実施形態では、経路は、血管新生に関連する。
がんに関連する経路および遺伝子は、本明細書に記載され、例えば以下が挙げられる。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
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Figure 2021192615
Figure 2021192615
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Figure 2021192615
Figure 2021192615
表ＶＩＩ−１６に提供される以下のがん関連遺伝子のいずれも、標的化され得る。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
エネルギー代謝に関連する代表的な経路および遺伝子は、表ＶＩＩ−１７に提供される
。本明細書で開示される代表的な代謝標的は、本明細書に記載されるようにＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓ９を使用して調節されてもよい。調節を使用して、対象遺伝子がノックダウンさ
れ、遺伝子中の欠陥または変異が修正され、または対象遺伝子が活性化されてもよい。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
一実施形態では、例えば、表ＶＩＩ−１７で、本明細書に記載される経路および遺伝子
はまた、糖尿病、肥満症、および／またはコレステロールおよび脂質にも関連する。
細胞周期に関連する代表的な経路および遺伝子は、表ＶＩＩ−１８に提供される。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
それらの機能によって特徴付けられる代表的な細胞周期遺伝子は、表ＶＩＩ−１９に提
供される。
Figure 2021192615
血管新生に関連する代表的な経路および遺伝子は、表ＶＩＩ−２０に記載提供される。
Figure 2021192615
ミトコンドリア機能に関連する代表的な経路および遺伝子は、表ＶＩＩ−２４に提供さ
れる。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
ＤＮＡ損傷およびゲノムの不安定性に関連する経路および遺伝子としては、表ＶＩＩ−
２１に提供される、以下のメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチル化、ヘリカーゼ活
性、ヌクレオチド切除修復、組換え修復、または不一致修復が挙げられる。表ＶＩ−２２
もまた参照されたい。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
この表中の疼痛に関連がある受容体およびイオノフォアをはじめとする遺伝子は、編集
またはペイロード送達によって標的化され得る。疼痛に関連する経路および遺伝子は、例
えば、以下の表ＶＩＩ−２３中のものをはじめとして、本明細書に記載される。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
［ＶＩＩＩ．標的：疾患を引き起こす生物に関連する障害］
例えば、ｅｉＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体、例えば、ｅａＣａｓ９分子／ｇＲＮ
Ａ分子複合体などの、典型的にｅｉＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９分子であるＣａｓ９
分子とｇＲＮＡ分子とを使用して、疾患を引き起こす生物に関連する疾患が治療または制
御されることができ、例えば、伝染性疾患が治療される。一実施形態では、感染症は、例
えば、生物または対象の標的遺伝子の１つまたは複数を編集（例えば、修正）することで
治療される。一実施形態では、感染症は、例えば、標的遺伝子などの疾患を引き起こす生
物の細胞に、または対象の感染細胞に、（例えば、本明細書に記載されるような）１つま
たは複数のペイロードを送達することで治療される。一実施形態では、標的遺伝子は、伝
染性病原体内にある。代表的な伝染性病原体としては、例えば、ウイルス、細菌、真菌、
原虫、または多細胞寄生生物が挙げられる。
一実施形態では、標的遺伝子は、宿主細胞内にある。例えば、宿主細胞中の標的遺伝子
の調節は、伝染性病原体に対する抵抗性をもたらし得る。伝染性病原体の生活環の任意の
段階（例えば、侵入、複製、潜伏期）に関与する宿主遺伝子が、調節され得る。一実施形
態では、標的遺伝子は、伝染性病原体のための細胞受容体または共受容体をコードする。
一実施形態では、伝染性病原体は、例えば、ＨＩＶのような、本明細書に記載されるウイ
ルスなどのウイルスである。一実施形態では、標的遺伝子は、例えば、ＣＣＲ５またはＣ
ＸＣＲ４などのＨＩＶの共受容体をコードする。
本明細書に記載される分子および方法によって治療され得る代表的な伝染性疾患として
は、例えば、ＡＩＤＳ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペス、ＨＰＶ感染症、
またはインフルエンザが挙げられる。
代表的な標的は、表ＶＩＩＩ−１に提供される。疾患および原因となる生物が、提供さ
れる。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
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Figure 2021192615
Figure 2021192615
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＜ＡＩＤＳ／ＨＩＶ＞
＜ＨＩＶゲノムの構造要素＞
長鎖末端反復配列（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ：ＬＴＲ）は、プロウ
イルスに組み込まれたゲノム隣接領域に位置するＤＮＡ配列を指す。それは、特に転写開
始およびポリアデニル化に重要な、調節領域を含有する。
ウイルストランス活性化のための標的配列（ＴＡＲ）、Ｔａｔタンパク質および細胞タ
ンパク質のための結合部位は、ＨＩＶ−１中のウイルスｍＲＮＡの最初のおよそ４５ヌク
レオチド（またはＨＩＶ−２およびＳＩＶ中の最初の１００ヌクレオチド）からなる。Ｔ
ＡＲ−ＲＮＡは、サイドバルジがあるヘアピンステムループ構造を形成し；バルジはＴａ
ｔ結合および機能に必要である。
Ｒｅｖ応答性要素（ＲＰＥ）は、ＨＩＶ−１のｅｎｖ領域内でコードされるＲＮＡ要素
を指す。それは、およそ２００ヌクレオチドからなる（ＨＩＶ−１の転写開始部位から７
３２７〜７５３０位、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の境界に及ぶ）。ＲＲＥは、Ｒｅｖ機能
に必要であり；それは、Ｒｅｖに対する高親和性部位を含有し；合計、およそ７個のＲｅ
ｖ結合部位が、ＲＲＥ ＲＮＡ内に存在する。その他のレンチウイルス（ＨＩＶ−２、Ｓ
ＩＶ、ｖｉｓｎａ、ＣＡＥＶ）が、ｅｎｖ内の同様の部位に同様のＲＲＥ要素を有する一
方で、ＨＴＬＶは、それらのＬＴＲ内で同一目的を果たす、相似性のＲＮＡ要素（ＲＸＲ
Ｅ）を有し；ＲＲＥがＲｅｖタンパク質の結合部位である一方で、ＲＸＲＥは、Ｒｅｘタ
ンパク質の結合部位である。ＲＲＥ（およびＲＸＲＥ）は、特異的タンパク質結合に必要
な複合体二次構造を形成する。
Ｐｓｉ要素（ＰＥ）は、システインヒスチジンボックスによって認識される部位である
Ｇａｇ開始コドンに先行して重なる、４つのステムループ構造の組であり、Ｇａｇ ｐ７
ＭＣタンパク質内に存在する、正順配列ＣｙｓＸ２ＣｙｓＸ４ＨｉｓＸ４Ｃｙｓ（配列番
号４１）がある保存モチーフである。Ｐｓｉ要素は、スプライシングされていないゲノム
の転写物中に存在するが、スプライスされたウイルスｍＲＮＡには存在しない。
ステムループ構造がそれに続く、ＴＴＴＴＴＴ−ｓｌｉｐｐｅｒｙ部位であるＳＬＩＰ
は、Ｇａｇ読み枠からＰｏｌ読み枠への−１リボソームフレームシフトの制御に関与する
。
シス作用制御配列（ＣＲＳ）は、Ｒｅｖ不在下で構造タンパク質発現を阻害することが
想定された。このような１つの部位が、ＨＩＶ−１のｐｏｌ領域内にマッピングされた。
正確な機能は確定されておらず；スプライス部位は、ＣＲＳ配列の機能を果たすことが想
定されている。
抑制／不安定性ＲＮＡ配列（ＩＮＳ）は、ＨＩＶ−１およびその他の複合型レトロウイ
ルスの構造遺伝子内に見られる。複数のＩＮＳ要素がゲノム中に存在し、独立して機能す
ることができ；最も良く特徴付けられる要素の１つは、ＨＩＶ−１のｇａｇ領域のヌクレ
オチド４１４から６３１に及ぶ。ＩＮＳ要素は、機能アッセイによって、転写後に発現を
阻害する要素として定義される。ＲＮＡ要素の変異は、ＩＮＳ不活性化と遺伝子発現の上
方制御とを引き起こすことが示された。
＜複製に必須の遺伝子および遺伝子産物＞
ゲノム領域（ＧＡＧ）は、キャプシドタンパク質（群特異的抗原）をコードする。前駆
体は、ｐ５５ミリストイル化タンパク質であり、それは、ウイルスプロテアーゼによって
、ｐ１７（マトリックス）、ｐ２４（キャプシド）、ｐ７（ヌクレオカプシド）、および
ｐ６タンパク質にプロセシングされる。Ｇａｇは、ウイルス構築がそこで起きる、原形質
膜と結合する。５５ｋＤａのＧａｇ前駆体はアセンブリンと称されて、ウイルス構築にお
けるその役割が示唆される。
ゲノム領域ＰＯＬは、ウイルス酵素プロテアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ、およびイ
ンテグラーゼをコードする。これらの酵素は、Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体ポリタンパク質とし
て生成され、それはウイルスプロテアーゼによってプロセシングされ；Ｇａｇ−Ｐｏｌ前
駆体は、ｇａｇ末端近くのリボソームフレームシフトによって生成される。
ウイルス糖タンパク質（例えば、ＥＮＶ）は、前駆体（ｇｐ１６０）として生成され、
それはプロセシングされて、外部糖タンパク質ｇｐ１２０と膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１
との非共有結合複合体を与える。成熟ｇｐ１２０−ｇｐ４１タンパク質は、非共有結合相
互作用によって結合され、細胞表面上の三量体として結合される。かなりの量のｇｐ１２
０が、培地中に放出されるのが見られ得る。ｇｐ１２０は、ＣＤ４受容体の結合部位と、
ＨＩＶ−１共受容体の役割を果たす７回膜貫通ドメインケモカイン受容体とを含有する。
ＨＩＶ遺伝子発現のトランス活性化因子（ＴＡＴ）は、ＨＩＶ遺伝子発現のための２つ
の必須ウイルス調節要素（ＴａｔおよびＲｅｖ）の１つである。７２個のアミノ酸のＴａ
ｔ−１エクソン（マイナー形態）、および８６個のアミノ酸のＴａｔ−２エクソン（主要
形態）の２つの形態が知られている。双方のタンパク質の低レベルが、持続性感染細胞に
見られる。Ｔａｔは、免疫蛍光によって、主に核小体／核内に局在化されている。それは
、ＴＡＲ−ＲＮＡ要素に結合することで機能し、ＬＴＲプロモーターからの転写開始およ
び伸長を活性化して、ＬＴＲのＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルが、転写およびポリ
アデニル化の早期終結を引き起こすのを妨げる。それは、ＤＮＡでなくＲＮＡと相互作用
することが知られた最初の真核生物転写因子であり、原核生物抗終結因子との類似性を有
してもよい。細胞外Ｔａｔは、培養中の細胞に見られ、それに取り込まれ得る。
ＨＩＶ発現のための第２の必要な調節因子は、ＲＥＶである。主に、核小体／核に局在
性の１９ｋＤａのリンタンパク質であるＲｅｖは、ＲＲＥに結合することで機能し、ＲＲ
Ｅを含有するスプライシングされていないウイルスｍＲＮＡの核外搬出、安定化、および
利用促進する。Ｒｅｖは、レンチウイルスの最も機能的に保存された調節タンパク質と見
なされる。Ｒｅｖは、核と細胞質との間で迅速にサイクルする。
＜その他＞
ウイルス感染因子（ＶＩＦ）は、典型的に２３ｋＤａの塩基性タンパク質である。感染
性を促進するが、ウイルス粒子の生成は促進しない。Ｖｉｆ不在下で生成されたウイルス
粒子は、欠陥がある一方で、ウイルスの細胞間感染は、顕著に影響を受けない。ほぼ全て
のレンチウイルスに見られるＶｉｆは、細胞質内タンパク質であり、可溶性細胞質形態お
よび膜結合形態の双方で存在する。後者の形態のＶｉｆは、細胞膜の細胞質側と密接に結
合する辺縁膜タンパク質である。２００３年に、Ｖｉｆは、細胞質内でＤＮＡ：ＲＮＡヘ
テロ二本鎖を脱アミノ化する細胞ＡＰＯＢＥＣ−３Ｇタンパク質の作用を妨げることが発
見された。
ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）は、ビリオンに組み込まれた、９６個のアミノ酸（１
４ｋＤａ）のタンパク質である。それは、Ｐｒ５５ Ｇａｇ前駆体のｐ６ Ｇａｇ部分と
相互作用する。細胞内で検出されるＶｐｒは、核局在性である。Ｖｐｒに提案された機能
としては、組込み前複合体の核内搬入標的化、細胞成長停止、細胞遺伝子のトランス活性
化、および細胞分化の誘導が挙げられる。ＨＩＶ−２、ＳＩＶ−ＳＭＭ、ＳＩＶ−ＲＣＭ
、ＳＩＶ−ＭＮＤ−２、およびＳＩＶ−ＤＲＬでは、Ｖｐｘ遺伝子は、おそらくは組換え
によるＶｐｒ遺伝子重複事象の結果のようである。
ウイルスタンパク質Ｕ（ＶＰＵ））は、ＨＩＶ−１、ＳＩＶｃｐｚ（ＨＩＶ−１に最も
近いＳＩＶ近縁種）、ＳＩＶ−ＧＳＮ、ＳＩＶ−ＭＵＳ、ＳＩＶ−ＭＯＮ、およびＳＩＶ
−ＤＥＮに特有である。ＨＩＶ−２、ＳＩＶ−ＳＭＭまたはその他のＳＩＶには、同様の
遺伝子はない。Ｖｐｕは、（ａ）小胞体内におけるＣＤ４分解、および（ｂ）ＨＩＶ−１
−感染細胞の原形質膜からのビリオン放出亢進の少なくとも２つの異なる生物学的機能が
ある、１６ｋＤａ（８１個のアミノ酸）のＩ型内在性膜タンパク質である。Ｅｎｖおよび
Ｖｐｕは、バイシストロニックｍＲＮＡから発現される。Ｖｐｕは、恐らくは、Ｎ末端疎
水性膜アンカーと親水性部分とを有する。それは、Ｓｅｒ５２およびＳｅｒ５６の位置で
、カゼインキナーゼＩＩによってリン酸化される。ＶｐｕはＥｎｖ成熟に関与し、ビリオ
ンには見られない。Ｖｐｕは、Ｆａｓ死滅に対するＨＩＶ−１感染細胞の感受性を増大さ
せることが分かっている。
ＮＥＦは、霊長類レンチウイルスの３０末端に位置するＯＲＦによって生成される、多
機能２７−ｋＤａミリストイル化タンパク質である。非ミリストイル化変異型をはじめと
する、Ｎｅｆのその他の形態が知られている。Ｎｅｆは、主に細胞質内にあり、保存され
た第２のアミノ酸（Ｇｌｙ）と連結するミリスチル残基を介して、原形質膜と結合する。
Ｎｅｆは、いくつかの実験において、核内で同定され、細胞骨格と結合することが分かっ
ている。それは、感染細胞内で産生される最初のＨＩＶタンパク質の１つであり、アクセ
サリータンパク質中で最も免疫原性である。ＨＩＶおよびＳＩＶのｎｅｆ遺伝子は、イン
ビトロでは不必要であるが、インビボの効率的なウイルス拡散および疾患進行には必須で
ある。Ｎｅｆは、マカクにおける高ウイルス負荷の維持とＡＩＤＳ進行に必要であり、い
くらかのＨＩＶ−１感染長期生存者では、Ｎｅｆに欠陥のあるウイルスが検出されている
。Ｎｅｆは、一次ウイルス受容体であるＣＤ４、およびＭＨＣクラスＩ分子を下方制御し
、これらの機能は、タンパク質の異なる部分にマッピングされる。Ｎｅｆは、宿主細胞シ
グナルトランスダクションおよびクラスリン依存性タンパク質選別経路の構成要素と、相
互作用する。それは、ウイルス感染性を高める。Ｎｅｆは、Ｓｒｃキナーゼのサブセット
のＳＨ３ドメインと結合するＰｘｘＰモチーフを含有し、ＨＩＶの増殖促進に必要である
が、ＣＤ４の下方制御には必要ない。
ＶＰＸは、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ−ＳＭＭ、ＳＩＶ−ＲＣＭ、ＳＩＶ−ＭＮＤ−２および
ＳＩＶ−ＤＲＬに見られるが、ＨＩＶ−１またはその他のＳＩＶには見られない、１２ｋ
Ｄａのビリオンタンパク質である。このアクセサリー遺伝子はＨＩＶ−１ ｖｐｒのホモ
ログであり、Ｖｐｘがあるウイルスは、ｖｐｒおよびｖｐｘの双方を保有する。Ｖｐｒと
の関連でＶｐｘ機能は、完全に解明されておらず、どちらもＧａｇ ｐ６との相互作用を
通じてＧａｇタンパク質と比較できるレベルで、ビリオンに組み込まれる。Ｖｐｘは、Ｐ
ＢＭＣ中のＳＩＶ−ＳＭＭの効率的複製に必要である。ＳＩＶ感染動物におけるＡＩＤＳ
の進行および死亡は、ＶｐｒまたはＶｐｘの不在下で起こり得る。ｖｐｒおよびｖｐｘの
双方を欠く二重変異体ウイルスが弱毒化された一方で、単一変異体は弱毒化されず、ウイ
ルス病原性に関連があるＶｐｒおよびＶｐｘの機能の重複性が示唆された。
＜Ａ型肝炎ウイルス標的配列＞
５’非翻訳領域は、ＩＲＥＳ−配列内リボソーム進入部位を含有する。
ゲノム−キャプシドタンパク質のＰ１領域
ＶＰ１
ＶＰ２
ＶＰ３
ＶＰ４
ゲノムのＰ２領域
２Ａ
２Ｂ
２Ｃ
ゲノムのＰ３領域
３Ａ
３Ｂ
３Ｃ−ウイルスプロテアーゼ
３Ｄ−ＲＮＡポリメラーゼ
＜Ｂ型肝炎ウイルス標的配列＞
全てのＨＣＶタンパク質をコードする前駆体ポリペプチドが生成され、次に機能的タン
パク質にスプライスされた。以下は、コードされるタンパク質（コード領域）である。
Ｃ−プレ−Ｃおよびコアコード領域からなるコアタンパク質コード領域
Ｘ−機能は不明確であるが、ウイルス転写過程活性化における役割を有することが疑われ
る
Ｐ−ＲＮＡポリメラーゼ
Ｓ−Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２、および表面抗原コード領域からなる、表面抗原コード
領域
＜Ｃ型肝炎ウイルス標的配列＞
全てのＨＣＶタンパク質をコードする前駆体ポリペプチドが生成され、次に機能的タン
パク質にスプライスされた。以下は、コードされるタンパク質（コード領域）である。
ＲＥＳ−非コード配列内リボソーム進入部位（ポリタンパク質コード配列に対して５’）
３’非コード配列
Ｃ領域−ヌクレオカプシドタンパク質であるｐ２２をコードする
Ｅ１領域−細胞侵入に重要なｇｐ３５外被糖タンパク質をコードする
Ｅ２領域−細胞侵入に重要なｇｐ７０外被糖タンパク質をコードする
ＮＳ１−複製には必要でないが、ウイルス形態形成に重要なｐ７をコードする
ＮＳ２−プロテアーゼ活性があある膜貫通タンパク質であるｐ２３をコードする
ＮＳ３−セリンプロテアーゼおよびＲＮＡヘリカーゼ活性の双方を有するｐ７０をコード
する
ＮＳ４Ａ−ｐ８補因子をコードする
ＮＳ４Ｂ−その他のウイルスタンパク質動員に重要なｐ２７補助因子をコードする
ＮＳ５Ａ−ウイルス複製に重要なｐ５６／５８インターフェロン耐性タンパク質をコード
する
ＮＳ５Ｂ−ＲＮＡポリメラーゼをコードする
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
Figure 2021192615
＜Ａ型インフルエンザ標的配列＞
Ａ型インフルエンザは、ヒトに感染する最も一般的な流感ウイルスである。Ａ型インフ
ルエンザビリオンは、１１〜１４個のタンパク質をコードする、８つの異なる一本鎖ＲＮ
Ａ部分で構成される。これらの部分は、順に変動し得て、ほとんどの多様性は、赤血球凝
集素（ＨまたはＨＡ）表面タンパク質およびノイラミニダーゼ（ＮＡまたはＮ）中に起き
る。８つのＲＮＡ部分（およびそれらをコードするタンパク質）は、次のとおり：
ＨＡ−赤血球凝集素をコードする（１個のビリオンを生成するためには、約５００個の赤
血球凝集素分子が必要である）。
ＮＡ−ノイラミニダーゼをコードする（１個のビリオンを生成するためには、約１００個
のノイラミニダーゼ分子が必要である）。
ＮＰは、核タンパク質をコードする。
Ｍが、同一ＲＮＡ断片からの異なる読み枠を使用して、２つのマトリックスタンパク質（
Ｍ１およびＭ２）をコードする（１個のビリオンを生成するためには、約３０００個のマ
トリックスタンパク質分子が必要である）。Ｍ４２は、選択的スプライシングによって作
成され、Ｍ２を部分的に置換し得る。
ＮＳは、同一ＲＮＡ断片からの異なる読み枠を使用して、２つの別個の非構造的タンパク
質（ＮＳ１およびＮＥＰ）をコードする。
ＰＡは、ＲＮＡポリメラーゼをコードし；次の停止コドンまで読み取る、＋１フレームシ
フトがあるリボソームスキップを通じて、交互の形態が生成されることもある。
ＰＢ１は、同一ＲＮＡ断片からの異なる読み枠を使用して、ＲＮＡポリメラーゼに加えて
、交互の開始部位から読み取られ、ＰＢ１−Ｎ４０およびＰＢ１−Ｆ２タンパク質（アポ
トーシスを誘導する）と命名された２つのその他の転写物をコードする。
ＰＢ２は、ＲＮＡポリメラーゼをコードする。
＜Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）標的配列＞
本明細書に記載される方法および組成物を使用して、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が標的化され、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ）感染症に罹患している対象が治療され得る。
＜その他＞
一実施形態では、標的遺伝子は、例えば、細菌感染症における多剤耐性（ＭＤＲ）に関
連する。伝染性病原体は、多剤耐性を獲得する上で、例えば、もはや糖タンパク質細胞壁
に依存することなく、抗生物質の酵素的不活性化、抗生物質に対する細胞壁透過性の低下
、抗生物質標的部位の改変、抗生物質を除去する排出ポンプ、ストレス応答としての変異
速度の増大、またはそれらの組み合わせなどのいくつかの機構を利用し得る。
［ＩＸ．標的：遺伝子編集／修正］
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、および／または候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分
子複合体を使用して、疾患の原因である遺伝子（例えば、変異遺伝子）が調節され得る。
一実施形態では、遺伝子は、例えば、本明細書に記載されるようにして、標的遺伝子を編
集または修正することで調節される。一実施形態では、ヒト遺伝子は、細胞内で、（例え
ば、本明細書に記載されるようにして）１つまたは複数の調節因子／エフェクターの標的
遺伝子への送達によって調節される。例えば、本明細書に記載される遺伝子は、インビト
ロ、エクスビボ、またはインビボで調節され得る。
Figure 2021192615
トリヌクレオチドリピート病（トリプレットリピート疾患、トリヌクレオチドリピート
伸長障害、トリプレットリピート伸長障害、またはコドン反復障害としてもまた知られて
いる）は、トリヌクレオチドリピート伸長によって引き起こされる、遺伝障害のセットで
あり、例えば、特定遺伝子中のトリヌクレオチド反復が、正常なおよび／または安定な閾
値を超える変異の一種である。変異は、複数のまたは全てのゲノム配列に生じる、不安定
マイクロサテライト反復のサブセットであり得る。変異は、反復数を増大させ得て（例え
ば、追加のまたは伸長した反復をもたらし）、例えば、異常なタンパク質を生じる、欠陥
遺伝子をもたらす。トリヌクレオチドリピートは、挿入変異、または別のクラスの変異に
分類され得る。候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、および／または候補Ｃａｓ９分子
／ｇＲＮＡ分子複合体を使用して、例えば、正常なまたは野生型遺伝子産物（例えば、タ
ンパク質）が、生成され得るように、追加のまたは伸長された反復の数を低下させる（例
えば、除去する）ことで、トリヌクレオチドリピート病に関連する１つまたは複数の遺伝
子（例えば、変異型遺伝子）が調節され得る。
代表的なトリヌクレオチドリピート病およびトリヌクレオチドリピート病に関与する標
的遺伝子は、表ＩＸ−１Ａに示される。
Figure 2021192615
代表的な標的遺伝子としては、例えば、がん（例えば、キナーゼ）、エネルギー代謝、
嚢胞性線維症（例えば、ＣＦＴＲ）、色盲、ヘモクロマトーシス、血友病、フェニルケト
ン尿症、多発性嚢胞腎、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、シデリウスＸ連鎖精神遅滞症
候群、リソソーム貯蔵障害（例えば、α−ガラクトシダーゼＡ欠乏症）、アンダーソン・
ファブリー病、びまん性体部被角血管腫、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、多発晩発性カルボキシ
ラーゼ欠乏症、家族性小脳網膜血管腫症、皮質下梗塞および白質脳症を伴う脳動脈障害、
皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症脳、セレブロシドリピドーシス症
候群、舞踏病アテトーゼ自傷高尿酸血症症候群、古典的ガラクトース血症、クローン病、
線維性狭窄、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠乏性疾患、ファブリー病、遺伝性コプ
ロポルフィリン症、色素失調症、小頭症、多発性嚢胞腎、レット（Ｒｅｔｔ’ｓ）、α１
アンチトリプシン欠損症、ウィルソン病、チロシン血症、フレームシフト関連疾患、およ
びトリプレットリピート疾患などの様々な疾患または病状に関与する遺伝子が挙げられる
。
追加的な例示的標的遺伝子としては、例えば、クリグラー・ナジャー（Ｃｒｉｇｌｅｒ
−Ｎａｊｊｅｒ）症候群、グリコーゲン蓄積症ＩＶ型（ＧＳＤ ＩＶ型）、家族性血球貪
食性リンパ組織球症（ＦＨＬ−パーフォリン欠損症）、オルニチントランスカルバミラー
ゼ欠損症（ＯＴＣ欠損症）またはその他の尿素サイクル障害、原発性高シュウ酸尿症、レ
ーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、バッテン病、慢性肉芽腫症、ウィスコット・アルドリッチ
症候群、アッシャー症候群、および異常ヘモグロビン症（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏａｐｔ
ｈｉｅｓ）をはじめとする疾患に関連する遺伝子が挙げられる。
クリグラー・ナジャー（Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊｅｒ）症候群．クリグラー・ナジャ
ー（Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊｅｒ）症候群は、高レベルの血中ビリルビン（高ビリルビ
ン血症）によって特徴付けられる重篤な病状である。ビリルビンは、赤血球が分解される
際に生じる。この物質は、肝臓内で、有毒形態のビリルビン（非結合ビリルビン）を無毒
形態（抱合型ビリルビン）に変換する化学反応を経て、初めて身体から除去される。クリ
グラー・ナジャー症候群がある人々は、血中に非結合ビリルビンの蓄積（非結合高ビリル
ビン血症）を有する。クリグラー・ナジャー症候群は、２つの型に分類される。１型（Ｃ
Ｎ１）は非常に重篤であり、２型（ＣＮ２）は重篤性がより低い。
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の変異は、クリグラー・ナジャー症候群を引き起こし得る。この遺
伝子は、主に肝細胞内にあり、身体からのビリルビン除去に必要であることが分かった、
ビリルビンウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ビリルビン−ＵＧＴ）
酵素を産生する指令を提供する。ビリルビン−ＵＧＴ酵素は、酵素がグルクロン酸を非結
合ビリルビンに転移して、それを抱合型ビリルビンに変換する、グルクロン酸抱合に関与
する。グルクロン酸抱合は、ビリルビンが身体から除去され得るように、それを水溶性に
する。
クリグラー・ナジャー症候群を引き起こすＵＧＴ１Ａ１遺伝子の変異は、ビリルビン−
ＵＧＴ酵素機能の低下または不在をもたらす。ＣＮ１がある人々は、酵素機能を有しない
一方で、ＣＮ２がある人々は、通常の機能の２０パーセント未満を有し得る。ビリルビン
−ＵＧＴ機能の喪失は、非結合ビリルビンのグルクロン酸抱合を低下させる。次にこの毒
性物質は、体内で蓄積し、非結合高ビリルビン血症および黄疸を引き起こす。
グリコーゲン蓄積症ＩＶ型．グリコーゲン蓄積症ＩＶ型（ＧＳＤ ＩＶ型、糖原病ＩＶ
型、グリコーゲン分枝酵素欠損症（ＧＢＥＤ）、ポリグルコサン小体病、またはアミロペ
クチン症としてもまた知られている）は、体の細胞内のグリコーゲンと称される複合糖類
の蓄積によって引き起こされる、遺伝性疾患である。蓄積したグリコーゲンは、構造的に
異常であり、特定の臓器および組織、特に肝臓および筋肉の機能を損なう。
ＧＢＥ１遺伝子の変異は、ＧＳＤ ＩＶを引き起こす。ＧＢＥ１遺伝子は、グリコーゲ
ン分枝酵素を産生する指令を提供する。この酵素は、体内の貯蔵エネルギーの大きな供給
源である、グリコーゲンの生成に関与する。ＧＳＤ ＩＶを引き起こすＧＢＥ１遺伝子変
異は、グリコーゲン分枝酵素の不足（欠乏）をもたらす。その結果、グリコーゲンは、適
切に形成されない。ポリグルコサン小体と称される異常なグリコーゲン分子は、細胞内に
蓄積して障害と細胞死をもたらす。細胞内のポリグルコサン小体蓄積は全身体に及ぶが、
ＧＳＤ ＩＶでは肝細胞および筋肉細胞が、最も激しく影響を受ける。肝臓内のグリコー
ゲン蓄積は、肝腫大をもたらし肝臓機能を妨害する。筋肉細胞が、エネルギーのためにグ
リコーゲンを分解できないことで、筋力低下および衰弱がもたらされる。
概して、障害の重症度は、生成される機能的グリコーゲン分枝酵素の量と関連する。致
命的な周産期神経筋型がある個人は、５パーセント未満の利用可能な酵素を生じる傾向が
ある一方で、小児期神経筋型がある個人は、酵素機能の２０パーセント前後を有してもよ
い。ＧＳＤ ＩＶの他のタイプは、通常は、５〜２０パーセントの機能性酵素に随伴する
。しかしこれらの推定値は、異なるタイプ間で変動する。
家族性血球貪食性リンパ組織球症．家族性血球貪食性リンパ組織球症（ＦＨＬ）は、免
疫系が、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ（組織
球）などの活性化免疫細胞（リンパ球）を過剰に産生する障害である。過剰な量のサイト
カインもまた、産生される。この免疫系の過剰活性化は、発熱を引き起こして肝臓および
脾臓を損傷し、これらの臓器の腫脹がもたらされる。
家族性血球貪食性リンパ組織球症はまた、血球貪食と称される過程で、骨髄中の血液産
生細胞も破壊する。脳もまた、家族性血球貪食性リンパ組織球症において、影響を受ける
こともある。神経学的問題に加えて、家族性血球貪食性リンパ組織球症は、心臓、腎臓、
およびその他の臓器、そして組織の異常を引き起こし得る。罹患した個人はまた、造血細
胞のがん（白血病およびリンパ腫）を発症するリスクの増大も有する。
家族性血球貪食性リンパ組織球症は、いくつかの遺伝子のいずれかの変異によって引き
起こされてもよい。これらの遺伝子は、もはや必要ないリンパ球の破壊または不活性化を
助けるタンパク質を産生する指令を提供する。活性化リンパ球の数を制御することで、こ
れらの遺伝子は、免疫系機能を調節するのを助ける。
およそ４０〜６０パーセントの家族性血球貪食性リンパ組織球症の症例は、ＰＲＦ１ま
たはＵＮＣ１３Ｄ遺伝子の変異によって引き起こされる。より少数の症例は、ＳＴＸ１１
またはＳＴＸＢＰ２などのその他の公知の遺伝子の変異によって引き起こされる。家族性
血球貪食性リンパ組織球症を引き起こす遺伝子変異は、免疫系を調節する身体の能力を損
ない得る。これらの変更は、この病状の誇張された免疫応答特性をもたらす。
オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症．オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症
（ＯＴＣ）は血中のアンモニア蓄積を引き起こす遺伝性疾患である。
ＯＴＣ遺伝子の変異が、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症を引き起こす。
オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症は、尿素サイクル障害と称される遺伝性疾患
のクラスに属する。尿素サイクルは、肝細胞内で起こる一連の反応である。それは、身体
によってタンパク質が使用される際に生じる過剰な窒素を処理して、尿素と称される化合
物を産生し、それは腎臓によって排出される。
オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症では、尿素サイクル内の特定の反応を開始す
る酵素が損傷を受け、または欠損している。尿素サイクルは、正常に進行し得ず、血流内
にアンモニアの形態で窒素が蓄積する。
アンモニアは、神経系に特に損害を与えるので、オルニチントランスカルバミラーゼ欠
損症は、神経学的問題ならびに最終的な肝臓障害を引き起こす。
その他の尿素サイクル障害および関連遺伝子としては、例えば、Ｎ−アセチルグルタミ
ンシンターゼ欠損症（ＮＡＧＳ）、カルバモイルリン酸シンセターゼＩ欠損症（ＣＰＳ１
）、「ＡＳ欠損症」またはシトルリン血症（ＡＳＳ）、「ＡＬ欠損症」またはアルギニノ
コハク酸尿症（ＡＳＬ）、および「アルギナーゼ欠損症」またはアルギニン血症（ＡＲＧ
）が挙げられる。
原発性高シュウ酸尿症．例えば、原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）などの原発性高
シュウ酸尿症は、稀な常染色体性劣性遺伝性の遺伝的病状であり、肝臓内のグリオキシル
酸代謝経路の誤りがシュウ酸塩の過剰産生をもたらして、それが、腎臓、骨髄、および眼
をはじめとする軟組織内で結晶化する。疾患は、腎臓の進行性劣化として現れ、治療法は
、腎臓（損傷を受けた臓器）と肝臓（病的臓器）の複雑な二重移植である。
原発性高シュウ酸尿症は、常態ではシュウ酸塩の蓄積を防止する酵素の欠損によって引
き起こされる。欠損している酵素によって区別される、２つの型の原発性高シュウ酸尿症
がある。１型原発性高シュウ酸尿症がある人々には、アラニン−グリオキシル酸アミノト
ランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）と称される肝臓酵素が不足している。２型原発性高シュウ
酸尿症は、グリオキシル酸還元酵素／ヒドロキシピルビン酸還元酵素（ＧＲＨＰＲ）と称
される酵素の不足によって特徴付けられる。
ＡＧＸＴおよびＧＲＨＰＲ遺伝子の変異は、原発性高シュウ酸尿症を引き起こす。特定
の糖およびアミノ酸の分解およびプロセッシングは、グリオキシル酸を生成する。常態で
は、グリオキシル酸は、２つの酵素、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラー
ゼおよびグリオキシル酸還元酵素／ヒドロキシピルビン酸還元酵素作用を通じて、アミノ
酸グリシンに、またはグリコール酸にそれぞれ変換される。ＡＧＸＴまたはＧＲＨＰＲ遺
伝子の変異は、これらの酵素不足を引き起こし、それは、グリオキシル酸からグリシンへ
のまたはグリコール酸への変換妨げる。グリオキシル酸レベルが増大すると、それはシュ
ウ酸塩に変換される。シュウ酸塩は、カルシウムと組み合わせさってシュウ酸カルシウム
沈着を形成し、それは腎臓およびその他の臓器を損傷し得る。
一実施形態では、ＡＧＸＴ中の遺伝的欠陥は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９
分子およびｇＲＮＡ分子を使用して、相同組換えによって修正される。例えば、修正され
たＡＧＸＴ遺伝子によってコードされた機能性酵素が、その適切な細胞内細胞小器官に再
誘導され得る。＞５０個の変異が遺伝子中で同定されているが、最も頻度が高い（白人で
は４０％）のは、ミスセンスＧ１７０Ｒ変異である。この変異は、ＡＧＴ酵素が機能を実
行するためにその中に存在すべきであるペルオキシソームでなく、ミトコンドリアにＡＧ
Ｔ酵素を局在化させる。その他の一般的変異としては、例えば、Ｉ２４４Ｔ（カナリア諸
島）、Ｆ１５２Ｉ、Ｇ４１Ｒ、Ｇ６３０Ａ（イタリア）、およびＧ５８８Ａ（イタリア）
が挙げられる。
一実施形態では、グリオキシル酸代謝経路内の上流の酵素をコードする１つまたは複数
の遺伝子が、本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を使用して標的化さ
れる。代表的な標的としては、例えば、グリコール酸オキシダーゼ（遺伝子ＨＡＯ１、Ｏ
ＭＩＭ ＩＤ ６０５０２３）が挙げられる。グリコール酸オキシダーゼは、ＡＧＴの基
質であるグリコール酸をグリオキシル酸に変換する。グリコール酸オキシダーゼは、肝臓
でのみ発現されて、ペルオキシソームに局在することから、この代謝経路内の適切な標的
になる。一実施形態では、ＨＡＯ１遺伝子に二本鎖切断が導入されて、ＮＨＥＪによる修
復時に、フレームシフトがトランケート型タンパク質をもたらす。一実施形態では、転写
リプレッサー（例えば、本明細書に記載される転写リプレッサー）が、ＨＡＯ１遺伝子へ
のペイロードとして送達されて、ＨＡＯ１の発現を低下させる。
レーバー先天黒内障．レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）は、主に網膜に影響を及ぼす眼の
障害である。この障害がある人々は、典型的に、乳児期に開始する重度の視力障害を有す
る。視力障害は、安定する傾向があるが、それは経時的に非常に緩慢に悪化することもあ
る。少なくとも１３種類のレーバー先天黒内障が記載されている。種類は、それらの遺伝
性原因、失明パターン、および関連する眼の異常によって区別される。
レーバー先天黒内障は、それらの全てが正常な視覚に必要である少なくとも１４個の遺
伝子の変異に起因し得る。これらの遺伝子は、網膜の発達と機能において、多様な役割を
果たす。例えば、この障害に関連するいくつかの遺伝子は、光受容体の正常な発達に必要
である。その他遺伝子は、光情報伝達に関与する。なおも別の遺伝子は、視覚をはじめと
する数種類の感覚入力の知覚に必要である繊毛機能において、役割を有する。
レーバー先天黒内障に関連する遺伝子（例えば、ＡＩＰＬ１、ＣＥＰ２９０、ＣＲＢ１
、ＣＲＸ、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＩＭＰＤＨ１、ＬＣＡ５、ＬＲＡＴ、ＲＤ３、ＲＤＨ１２、Ｒ
ＰＥ６５、ＲＰＧＲＩＰ１、ＳＰＡＴＡ７、ＴＵＬＰ１）のいずれかの変異は、網膜の発
達と機能を妨害し得て、早期失明をもたらす。ＣＥＰ２９０、ＣＲＢ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、
およびＲＰＥ６５遺伝子の変異は、最も頻度の高い障害原因である一方で、その他の遺伝
子の変異は、一般に、症例のより小さな割合を占める。
バッテン病．バッテン病または若年性バッテン病は、主に神経系に影響を及ぼす遺伝性
疾患である。わずか数年間の正常な発達の後、この病状がある小児は、進行性失明、知的
および運動機能障害、および痙攣を発症する。
幼若バッテン病は、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）として知られている、一群
の障害の１つである。これらの障害は全て神経系に影響を及ぼし、典型的に、視覚、動作
、および思考能力に関する進行性問題を引き起こす。一部の人々がバッテン病としてＮＣ
Ｌのグループ全体を指す一方で、その他の人々は、名称を若年性形態の障害に限定する。
異なるタイプのＮＣＬは、徴候および症状が、最初に出現した年齢によって区別される。
若年性バッテン病の大多数の症例は、ＣＬＮ３遺伝子の変異によって引き起こされる。
これらの変異は、リソソームと称される細胞構造の機能を妨害し得る。リソソーム機能障
害は、これらの細胞構造内に脂肪色素の蓄積をもたらす。これらの蓄積は、全身体に及ぶ
細胞内で起こるが、脳内ニューロンは、脂肪色素によって引き起こされる障害に対して、
特に易損性のようである。特に脳内における、細胞の進行性死滅は、若年性バッテン病が
ある人々に、失明、痙攣、および知性低下をもたらす。
若年バッテン病の症例のごく一部は、その他の遺伝子（例えば、ＡＴＰ１３Ａ２、ＣＬ
Ｎ５、ＰＰＴ１、ＴＰＰ１）の変異によって引き起こされる。これらの遺伝子の多くはリ
ソソーム機能に関与して、変異すると、この形態またはその他の形態のＮＣＬを引き起こ
し得る。
慢性肉芽腫症．慢性肉芽腫症は、免疫系に機能障害を引き起こす障害であり、免疫不全
症の一形態がもたらされる。慢性肉芽腫症がある個人は、再発性細菌および真菌感染症を
有する。この病状がある人々は、様々な組織に、それらの組織を損傷し得る炎症領域（肉
芽腫）を有することが多い。慢性肉芽腫症の特徴は、通常は、最初に小児期い出現するこ
とであるが、いくらかの個人は、後年まで症状を示さない。
ＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２、またはＮＣＦ４遺伝子の変異は、慢性肉芽
腫症を引き起こし得る。この病状には、関与する遺伝子によって区別される５つのタイプ
がある。影響を受けた遺伝子から生じるタンパク質は、免疫系で重要な役割を果たすＮＡ
ＤＰＨオキシダーゼのサブユニットである。特に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、主に貪食
細胞内で活性である。貪食細胞内では、ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、外来性侵入者を死滅
させてそれらが体内で繁殖し病気を引き起こすのを防止する役割を果たす、超酸化物の生
成に関与する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼはまた、治癒最適化と身体損傷低下のために炎症
応答を調節する役割を有する、好中球の活性も調節する。
ＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２、およびＮＣＦ４遺伝子の変異は、機能がわ
ずかまたは皆無であるタンパク質の生成をもたらし、またはタンパク質の生成を全くもた
らさない。そのサブユニットタンパク質のいずれか１つがなければ、ＮＡＤＰＨオキシダ
ーゼは、適切に構築されまたは機能し得ない。その結果、貪食細胞は、外来性侵入者を殺
滅できず、好中球活性は調節されない。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの欠如は、罹患した個人
を多くのタイプの感染症および過剰な炎症に対して易損性にする。
ウィスコット・アルドリッチ症候群．ウィスコット・アルドリッチ症候群は、異常な免
疫系機能（免疫不全）および血餅形成能力の低下によって特徴付けられる。この病状は、
主に男性に影響を及ぼす。ウィスコット・アルドリッチ症候群がある個人は、凝固に関与
する血液細胞（血小板）の数およびサイズの低下であるマイクロ血小板減少症を有し、そ
れは、容易な挫傷、または軽微な外傷に続く長時間の出血の出現をもたらし得る。ウィス
コット・アルドリッチ症候群は、白血球細胞の多くのタイプに異常または非機能性を引き
起こし、いくつかの免疫および炎症性疾患のリスク増大をもたらす。この病状がある多く
の人々は、炎症を起こした皮膚の異常なパッチによって特徴付けられる炎症性皮膚疾患で
ある、湿疹を発症する。罹患した個人はまた、感染症に対する感受性増大も有する。ウィ
スコット・アルドリッチ症候群がある人々には自己免疫障害を発症する、より大きなリス
クがある。免疫系細胞のがん（リンパ腫）などのいくつかのタイプのがんを発症する見込
みもまた、ウィスコット・アルドリッチ症候群がある人々ではより大きい。
ＷＡＳ遺伝子の変異が、ウィスコット・アルドリッチ症候群を引き起こす。ＷＡＳ遺伝
子は、全ての血液細胞に見られるＷＡＳＰタンパク質を産生する指令を提供する。ＷＡＳ
Ｐは、ｆ血液細胞表面からアクチン細胞骨格へのシグナル中継に関与する。ＷＡＳＰシグ
ナル伝達は、必要な場合に細胞を活性化して、その他の細胞および組織への移動と付着（
癒着）を引き起こす。白血球細胞内では、このシグナル伝達は、アクチン細胞骨格が、細
胞とそれらが標的化する外来性侵入者の間の相互作用を確立できるようにする（免疫シナ
プス）。
ウィスコット・アルドリッチ症候群を引き起こすＷＡＳ遺伝子変異は、任意の機能的Ｗ
ＡＳＰの欠如を引き起こす。ＷＡＳＰシグナル伝達の損失は、発達中の血液細胞内のアク
チン細胞骨格機能を妨害する。ＷＡＳＰを欠く白血球細胞は、それらの環境に応答して、
免疫シナプスを形成する能力の低下を有する。その結果、白血球細胞は、外来性侵入者に
応答できなくなり、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する免疫問題の多くを引き
起こす。同様に、内血小板の機能的ＷＡＳＰの欠如は、それらの発達を損い、サイズ低下
および早期細胞死をもたらす。
アッシャー症候群．アッシャー症候群は、聴力損失または聴覚消失および進行性失明に
よって特徴付けられる病状である。視力喪失は、眼の背後の感光性組織層（網膜）に影響
を及ぼす、色素性網膜炎（ＲＰ）によって引き起こされる。失明は、網膜の光検出細胞が
、徐々に劣化するにつれて起こる。
Ｉ型（ＩＡ〜ＩＧ亜型）、ＩＩ型（ＩＩＡ、ＩＩＢ、およびＩＩＣ亜型）、およびＩＩ
Ｉ型と称されるアッシャー症候群の３つの主要な型が同定されている。これらの型は、そ
れらの重症度と、徴候および症状が出現した年齢とによって区別される。
ＣＤＨ２３、ＣＬＲＮ１、ＧＰＲ９８、ＭＹＯ７Ａ、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳ
Ｈ１Ｇ、およびＵＳＨ２Ａ遺伝子の変異は、アッシャー症候群を引き起こし得る。アッシ
ャー症候群に関連する遺伝子は、正常な聴力、均衡、および視覚に重要な役割を果たすタ
ンパク質を産生する指令を提供する。それらは、音および運動シグナルを脳に伝達するの
を助ける、内耳中の感覚細胞である有毛細胞の発達および維持において機能する。網膜内
では、これらの遺伝子はまた、桿体および錐体と称される光検出細胞の構造および機能決
定にも関与する。場合によっては、聴力および視覚におけるこれらの遺伝子の正確な役割
は、知られていない。アッシャー症候群に関与するほとんどの変異は、内耳の有毛細胞の
損失と、網膜内の桿体および錐体の漸進的損失とを引き起こす。これらの感覚細胞の変性
は、この病状に特徴的な、聴力損失、平衡を保つ困難さ、および失明を引き起こす。
アッシャー症候群Ｉ型は、ＣＤＨ２３、ＭＹＯ７Ａ、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ１Ｃ、また
はＵＳＨ１Ｇ遺伝子の変異に起因し得る。アッシャー症候群ＩＩ型は、例えば、ＵＳＨ２
ＡまたはＧＰＲ９８（ＶＬＧＲ１とも称される）遺伝子の変異によって引き起こされ得る
。アッシャー症候群ＩＩＩ型は、例えば、ＣＬＲＮ１の変異によって引き起こされ得る。
異常ヘモグロビン症．異常ヘモグロビン症は、ヘモグロビン分子のグロビン鎖の１つの
異常な構造をもたらす、一群の遺伝的欠陥である。代表的な異常ヘモグロビン症としては
、例えば、鎌状赤血球症、αサラセミア、およびβサラセミアが挙げられる
一実施形態では、αグロブリンまたはβグロブリン中の遺伝的欠陥は、例えば、相同組
換えによって、本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を使用して修正さ
れる。
一実施形態では、異常ヘモグロビン症関連遺伝子は、本明細書に記載されるＣａｓ９分
子およびｇＲＮＡ分子を使用して標的化される。代表的な標的としては、例えば、γ−グ
ロビン遺伝子の調節に関連する遺伝子が挙げられる。一実施形態では、標的は、ＢＣＬ１
１Ａである。
胎児ヘモグロビンは（そしてヘモグロビンＦまたはＨｂＦまたはα２γ２も）、２つの
成人α−グロビンポリペプチドと、２つの胎児β様γ−グロビンポリペプチドとの四量体
である。ＨｂＦは、ヒト胎児では子宮内発達の最後の７ヶ月間の、新生児ではほぼ６ヶ月
間齢までの主要酸素輸送タンパク質である。機能的に、胎児ヘモグロビンは、成人形態よ
りも大きな親和力で酸素と結合できることで、成人ヘモグロビンと最も異なり、母親の血
流中の酸素へのより良いアクセスを発達中の胎児に与える。
新生児では、胎児ヘモグロビンは、およそ出生後に６ヶ月目までに、成人ヘモグロビン
でほぼ完全に置き換えられる。成人では、胎児ヘモグロビン産生が薬理学的に再活性化さ
れ得で、それは異常ヘモグロビン症などの疾患の治療において有用である。例えば、異常
ヘモグロビン症がある特定の患者では、より高レベルのγ−グロビン発現が、欠陥または
障害のあるβ−グロビン遺伝子産生を部分的に代償し得て、それは、これらの疾患の臨床
的重症度を改善し得る。ＨｂＦレベルまたはＦ細胞（ＨｂＦ含有赤血球）数の増大は、例
えば、β重症型サラセミアおよび鎌状赤血球貧血などの異常ヘモグロビン症の疾患重症度
を改善し得る。
ＨｂＦレベルまたはＦ細胞の増大は、細胞内のＢＣＬ１１Ａ発現低下と関連があり得る
。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子は、マルチジンクフィンガー転写因子をコードする。一実施形態で
は、ＢＣＬ１１Ａの発現は調節され、例えば、下方制御される。一実施形態では、ＢＣＬ
１１Ａ遺伝子は、編集される。一実施形態では、細胞は、造血幹細胞または前駆細胞であ
る。
鎌状赤血球症
鎌状赤血球症は、ヘモグロビンに影響を及ぼす一群の障害である。この障害がある人々
は、異型ヘモグロビン分子（ヘモグロビンＳ）を有して、それは、赤血球をｉｎｔｏａ鎌
状または三日月状に歪め得る。この障害の特性としては、低赤血球数（貧血）、反復性感
染症、および周期的疼痛発作が挙げられる。
ＨＢＢ遺伝子の変異が、鎌状赤血球症を引き起こす。ＨＢＢ遺伝子は、β−グロビンを
産生する指令を提供する。β−グロビンの様々なバージョンが、ＨＢＢ遺伝子の異なる変
異から得られる。１つの特定のＨＢＢ遺伝子変異が、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）として知
られている、β−グロビンの異常なバージョンを生成する。ＨＢＢ遺伝子のその他の変異
は、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）およびヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）などのβ−グロビンの追
加的な異常なバージョンをもたらす。ＨＢＢ遺伝子変異はまた、異常に低いβ−グロビン
レベル、すなわち、βサラセミアをもたらし得る。
鎌状赤血球症がある人々では、ヘモグロビン中のβ−グロビンサブユニットの少なくと
も１つがヘモグロビンＳで置き換えられている。で鎌状赤血球症の一般的形態である鎌状
赤血球貧血では、ヘモグロビンＳが、ヘモグロビン中の双方のβ−グロビンサブユニット
を置き換える。その他の各種鎌状赤血球症では、ヘモグロビン中の１つのβ−グロビンサ
ブユニットのみがヘモグロビンＳで置き換えられる。もう一方のβ−グロビンサブユニッ
トは、ヘモグロビンＣなどの異なる異常な変異型で置き換えられる。例えば、鎌状ヘモグ
ロビンＣ（ＨｂＳＣ）病がある人々は、β−グロビンの代わりにヘモグロビンＳおよびヘ
モグロビンＣがある、ヘモグロビン分子を有する。ヘモグロビンＳおよびβサラセミアを
生じる変異が同時に発生した場合、個人は、ヘモグロビンＳ−βサラセミア（ＨｂＳＢｅ
ｔａＴｈａｌ）病を有する。
αサラセミア
αサラセミアは、ヘモグロビンの生成を低下させる血液障害である。αサラセミアの特
性がある人々では、ヘモグロビン量の低下が、身体の組織に十分な酸素が到達するのを妨
げる。罹患した個人はまた、赤血球不足（貧血）も有して、それは、蒼白な皮膚、脱力感
、疲労、およびさらに重篤な合併症を引き起こし得る。
２つの型のαサラセミアが、健康問題を引き起こし得る。より重症な型は、ヘモグロビ
ンＢａｒｔ胎児水腫症候群またはＨｂ Ｂａｒｔ症候群である。より穏やかな形態は、Ｈ
ｂＨ疾患である。Ｈｂ Ｂａｒｔ症候群は、例えば、出生前に過剰な体液が体内に蓄積す
る病状である、胎児水腫によって特徴付けられる。ＨｂＨ疾患は、例えば、軽度から中等
度の貧血、肝脾腫大、および眼と皮膚の黄変（黄疸）を引き起こし得る。
αサラセミアは、典型的に、ＨＢＡ１およびＨＢＡ２遺伝子が関与する欠失に起因する
。これらのどちらの遺伝子も、ヘモグロビンのサブユニットであるα−グロビンを産生す
る指令を提供する。異なる型のαサラセミアは、これらの対立遺伝子のいくつかのまたは
全ての欠損に起因する。
Ｈｂ Ｂａｒｔ症候群は、４つのα−グロビン対立遺伝子の全ての欠損に起因し得る。
ＨｂＨ疾患は、４つのα−グロビン対立遺伝子の３つの欠損によって引き起こされ得る。
これらの２つの病状では、α−グロビンの不足が、細胞が正常なヘモグロビンを産生する
のを妨げる。それに代えて、細胞は、身体の組織に効果的に酸素を輸送し得ない異常な形
態のヘモグロビン、すなわち、ヘモグロビンＢａｒｔ（ＨｂＢａｒｔ）またはヘモグロビ
ンＨ（ＨｂＨ）を産生する。ＨｂＢａｒｔまたはＨｂＨによる正常なヘモグロビンの置き
換えは、αサラセミアに関連する貧血およびその他の深刻な健康問題を引き起こし得る。
αサラセミアの２つの追加的な変異型は、α−グロビン量の低下に関連する。４つのα
−グロビン対立遺伝子の２つの欠損は、αサラセミア体質をもたらし得る。αサラセミア
体質がある人々は、異常に小さく淡赤色の血球および軽度の貧血を有することもある。α
−グロビン対立遺伝子の１つの欠損は、αサラセミア無症状キャリアに見られる。
βサラセミア
βサラセミアは、ヘモグロビンの生成を低下させる血液障害である。βサラセミアがあ
る人々では、低レベルのヘモグロビンが、多くの身体部分における酸素の欠如を引き起こ
す。罹患した個人はまた、赤血球不足（貧血）も有して、それは、蒼白な皮膚、脱力感、
疲労、およびさらに重篤な合併症を引き起こし得る。βサラセミアがある人々は、異常な
血餅を発生するリスクの増大を有する。
βサラセミアは、症状の重症度に応じて、重症型サラセミア（クーリー貧血としてもま
た知られている）および中間型サラセミアの２つの型に分類される。２つの型の内、重症
型サラセミアがより重篤である。
ＨＢＢ遺伝子の変異が、βサラセミアを引き起こす。ＨＢＢ遺伝子は、β−グロビンを
産生する指令を提供する。ＨＢＢ遺伝子のいくつかの変異は、任意のβ−グロビンの生成
を妨げる。β−グロビンの不在は、βゼロ（Ｂ０）サラセミアと称される。その他のＨＢ
Ｂ遺伝子の変異は、いくつかのβ−グロビンの生成を許すが、量は低下し、すなわち、β
プラス（Ｂ＋）サラセミアである。双方の型がある人々は、重症型サラセミアおよび中間
型サラセミアと診断されている。
一実施形態では、第１の遺伝子を標的化するＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が使用
されて、例えば、第２の遺伝子中の変異などの第２の遺伝子によって特徴付けられる障害
が治療される。一例として、例えば、編集またはペイロード送達による第１の遺伝子の標
的化は、例えば、変異した第２の遺伝子などの第２の遺伝子の影響からのさらなる障害を
代償し、または阻害し得る。一実施形態では、対象によって保有される第１の遺伝子の対
立遺伝子は、障害の原因でない。
Figure 2021192615
Figure 2021192615
一実施形態では、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、および／またはＣａｓ９分子／ｇＲＮ
Ａ分子複合体を使用して、ＲＢＣ生成を駆動するためのＥｐｏの上方制御など、成長因子
を制御する遺伝子を活性化し得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、および／またはＣａｓ９分子／ｇＲＮ
Ａ分子複合体を使用して、例えば、鎌状赤血球貧血およびサラセミアの治療のためなど、
胎児ヘモグロビンの上方制御のために、例えば、ＢＣＬ１１ＡおよびＫＬＦ１などの重要
な転写因子のプロモーターが標的化されることができ、その抑制、ノックアウト、または
改変がもたらされる。
本明細書に記載されるような候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、および／または候
補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用して、例えば、本明細書に記載されるように
して、標的遺伝子が編集／修正されることができ、または調節物質／エフェクターが、様
々な細胞内部位で細胞内に送達される。一実施形態では、部位は、核内にある。一実施形
態では、部位は、例えば、染色体領域染色体、核小体、核スペックル、カハール体、Ｇｅ
ｍｓ（カハール体の対）、または前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）核小体などの核内のドメイ
ンにある。一実施形態では、部位は、ミトコンドリア内にある。
本明細書に記載されるような候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、および／または候
補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用して、本明細書に記載されるようにして、標
的遺伝子が編集／修正されることができ、または調節物質／エフェクターが、様々な時点
で細胞内に送達される。
例えば、編集／修正または送達は、例えば、Ｇ０期、間期（例えば、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ
２期）、またはＭ期などの細胞周期の異なる段階で実施され得る。別の例として、編集／
修正または送達は、例えば、障害（例えば、ウイルス感染症）の潜伏期または活性期など
の疾患進行の異なる病期で、または障害（例えば、がん）の任意の病期または細分類で、
実施され得る。
発明の方法は、例えば、がんなどの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を
治療できるようにする。一実施形態では、がん細胞が操作されて、治療または内在性免疫
監視の影響をより受け易くなる。一実施形態では、がん細胞が調節されて、治療薬に対す
る感受性がより高くなる。一実施形態では、免疫系ががん細胞を認識または殺滅する能力
を高める遺伝子の発現が増大されるように、がん細胞が操作される。例えば、がん細胞が
下方制御された抗原の発現を有する場合、抗原の発現が増大されるように、Ｃａｓ９分子
／ｇＲＮＡ分子複合体を使用して、ペイロードが送達され、または標的核酸が編集され得
る。一実施形態では、例えば、転写因子またはその他の発現アクチベーターを含むペイロ
ードなどのペイロードが、がん細胞に送達される。一実施形態では、発現の増大は、例え
ば、テンプレート核酸による標的核酸の切断などの標的核酸の切断と、修正または改変と
によってもたらされる。一実施形態では、例えば、メチル化の修飾物質などの、エピジェ
ネティックなサイレンシングを無効化するペイロードが送達される。
一実施形態では、治療は、例えば、上方制御された抗原に結合する抗体のような、免疫
療法などの第２の抗がん療法を投与するステップをさらに含む。
一実施形態では、例えば、体細胞転座などのゲノムシグネチャの標的化などの本明細書
に記載される方法を使用して、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子ががん細胞に標的化され得る
。
別の態様では、本発明は、対象を抗原に対して免疫化する方法を特徴とする。方法は、
本明細書に記載される方法を使用して、抗原が免疫応答を促進するように、例えば、血液
細胞などの細胞からの抗原の発現を促進するステップを含む。一実施形態では、細胞はイ
ンビトロで操作されて、次に対象に戻されまたは導入される。
［Ｘ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸］
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、例えば、特にｇＲＮＡなどの核酸中に存
在し得るが、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡなどのその他の形態のＲＮ
Ａにもまた存在し得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、５つの炭素砂糖分子
（ペントースまたはリボース）またはその誘導体と、１つの有機塩基、プリンまたはピリ
ミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌ
クレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含み得る：
（ｉ）例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および
／または結合リン酸酸素の１つまたは複数の置換などの改変；
（ｉｉ）例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換な
どの改変；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる全面的な置換；
（ｉｖ）天然起源の核酸塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボースリン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーション
などのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾；および
（ｖｉｉ）糖の修飾。
上に列挙される修飾を混合して、２、３、４つ以上の修飾を有し得る、修飾ヌクレオシ
ドおよびヌクレオチドが提供され得る。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは
、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。一実施形態では、ｇＲＮＡまたはテンプレート
核酸の各ヌクレオチドは修飾され、例えば、全てのヌクレオチドが、例えば、全てホスホ
ロチオエート基であるなど、修飾リン酸基を有する。一実施形態では、単分子またはモジ
ュラーｇＲＮＡ分子またはテンプレート核酸の全ての、または実質的に全てのリン酸基は
、ホスホロチオエート基で置換される。
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような修飾を有するヌクレオチドなど
の修飾ヌクレオチドが、例えば、「修飾核酸」などの核酸に組み込まれ得る。一実施形態
では、修飾核酸は、１、２、３つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、修飾
核酸内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少な
くとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少な
くとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少な
くとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少な
くとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少な
くとも約９５％、または約１００％）は、修飾ヌクレオチドである。
未修飾核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解されやすい場合がある。例えば
、ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様で
は、本明細書に記載される修飾核酸は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレ
オチドを含有することができ、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性が導入される。
一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および
修飾核酸は、インビボおよびインビトロの双方で細胞集団内に導入されると、先天性免疫
応答の低下を示し得る。「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌
起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、
具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内
包する。一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、
および修飾核酸は、主溝相互作用パートナーの核酸との結合を妨害し得る。一実施形態で
は、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、イ
ンビボおよびインビトロの双方で、細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を
示して、そしてまた主溝相互作用パートナーの核酸との結合も妨害し得る。
一実施形態では、支配ｇＲＮＡは、例えば、本明細書に記載される、修飾ヌクレオチド
、骨格修飾、およびその他の修飾などの修飾を含む。
一実施形態では、テンプレート核酸は、例えば、本明細書に記載される、修飾ヌクレオ
チド、骨格修飾、およびその他の修飾などの修飾を含む。一実施形態では、修飾は、例え
ば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ耐性を増大させることで、テ
ンプレート核酸の安定性を改善する。
一実施形態では、修飾を含むテンプレート核酸は、二本鎖であり、例えば、二本鎖ＤＮ
Ａである。このような実施形態では、全ての修飾は、１本の鎖に限定される。一実施形態
では、修飾は双方の鎖上に存在する。修飾は、５’相同性アーム、３’相同性アーム、ま
たは置換配列、またはそれらの任意の組み合わせに存在してもよい。一実施形態では、修
飾は、相同性アームの片方または双方に存在するが、置換配列には存在しない。
一実施形態では、修飾を含むテンプレート核酸は、一本鎖であり、例えば、一本鎖ＤＮ
Ａである。
＜化学基の定義＞
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すこと
が意図される。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（
例えば、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル
、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）など
が挙げられる。アルキル基は、１〜約２０個、２〜約２０個、１〜約１２個、１〜約８個
、１〜約６個、１〜約４個、または１〜約３個の炭素原子を含有し得る。
本明細書の用法では、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル
、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどの単環または多環（例えば、２、３ま
たは４つの融合環を有する）芳香族炭化水素を指す。一実施形態では、アリール基は、６
〜約２０個の炭素原子を有する。
本明細書の用法では、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族
基を指す。
本明細書の用法では、「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含有し、１つまたは
複数の三重結合を有することで特徴付けられる、直鎖または分枝炭化水素鎖を指す。アル
キニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、および３−ヘキシニルが挙げられるが
、これに限定されるものではない。
本明細書の用法では、「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル水素原
子がアリール基で置換された、アルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子
がアリール基で置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の
例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル
、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
本明細書の用法では、「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する環式、二環式
、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、
シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられるが、これに限定さ
れるものではない。
本明細書の用法では、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価の基を指す。典型的なヘ
テロシクリルとしては、制限なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピ
ロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、
ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモルホリニルが
挙げられる。
本明細書の用法では、「ヘテロアリール」は、複素環式芳香族環系の一価の基を指す。
ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾ
リル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジ
ニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノ
リル、およびプテリジニルが挙げられる、が、これに限定されるものではない。
＜リン酸塩骨格修飾＞
＜リン酸基＞
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、１つまたは複
数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌク
レオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、
未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。一実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非
荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含
み得る。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸
、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリー
ルホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。一実施形態では、リン酸骨格部
分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置換され得る：イオ
ウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリ
ールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒ
は、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、またはＯＲ（式中、Ｒは、
例えば、アルキルまたはアリールであり得る）。未修飾リン酸基中の亜リン酸原子は、ア
キラルである。しかし、上の原子または原子群の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、
亜リン酸原子をキラルにし得て；すなわち、このようにして修飾されたリン酸基中の亜リ
ン酸原子が、立体中心である。ステレオジェン亜リン酸原子は、「Ｒ」構造（本明細書の
Ｒｐ）または「Ｓ」構造（本明細書のＳｐ）のどちらかを有し得る。
ホスホロジチオエートは、双方の非架橋酸素がイオウで置換されている。ホスホロジチ
オエートのリン中心はアキラルであり、それは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマ
ーの形成を排除する。一実施形態では、非架橋酸素の片方または双方の修飾はまた、Ｓ、
Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る
）から独立して選択される基による、非架橋酸素の置換も含み得る。
リン酸塩リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、イオウ（架橋ホスホロチ
オエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による、架橋酸素（すなわち、リ
ン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の置換によって修飾され得る。置換は、どちらかの
連結酸素で、または双方の連結酸素で起こり得る。
＜リン酸基の置換＞
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。一実施形態では、荷電リン
酸基は、中性部分によって置換され得る。
リン酸基を置換し得る部分の例としては、制限なしに、例えば、メチルホスホネート、
ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、
チオエーテル、酸化エチレンリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセ
タール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレ
ンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられ
る。
＜リボリン酸骨格の置換＞
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築されることができ、その中では、リン酸
リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲ
ートによって置換される。一実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留さ
れ得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプ
チド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
＜糖修飾＞
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に１つまたは複数の修飾を含み得る
。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキ
シ」置換基で、修飾または置換され得る。一実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は
核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、２’−
アルコキシドイオンを形成し得ないためである。２’−アルコキシドは、リンカーリン原
子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ
（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、
ヘテロアリールまたは糖であり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２
ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択的に置換された
アルキルであり得て、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、
１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６
、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数であり得る）が挙げ
られる。一実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾は、「ロックド」核酸（
ＬＮＡ）を含むことができ、その中では、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１〜６アルキ
レンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同一リボース糖の４’炭素に連結され
ることができ、代表的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ
架橋；Ｏ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミ
ノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、また
はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、および
アミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ、（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アル
キルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、
ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリ
アミノであり得る）が挙げられる。一実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修
飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ
誘導体）が挙げられる。
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、例えば、部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハ
ング部分のデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨ
ード）；アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ
、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテ
ロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２Ｃ
Ｈ２−アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書に記載されるようであり得る）、−Ｎ
ＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル
、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキ
ル；チオアルコキシ；および本明細書に記載されるようなアミノで任意選択的に置換され
てもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げ
られる。
糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、１つまたは複数の
炭素もまた含有し得る。したがって、修飾核酸としては、例えば、糖としてアラビノース
を含有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチド「単量体」は、例えば、αヌクレオ
シドなど、糖の１’位にα結合を有し得る。修飾核酸としては、Ｃ−１’の核酸塩基を欠
失している「脱塩基」糖もまた挙げられる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の１つ
または複数でさらに修飾され得る。修飾核酸はとしてはまた、例えばＬ−ヌクレオシドな
どのＬ形態の１つまたは複数の糖も挙げられる。
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖類リボースを含む。代表的な修飾ヌク
レオシドおよび修飾ヌクレオチドとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例え
ば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアル
キレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘ
キセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員
環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、
マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、ホスホロアミダート骨格もまた有
するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する
）が挙げられる。一実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、多環形態（例えば、トリ
シクロ；および（例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で
置換されるＲ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡなどの）グリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アン
ロックド」形態、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３
’→２’）で置換される）が挙げられる。
＜核酸塩基上の修飾＞
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレ
オチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン
（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得
る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は
、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。一
実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられ
る。
＜ウラシル＞
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的
な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、シュードウリジン（ψ）、ピリジ
ン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−
５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、
４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン
（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード
−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メト
キシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オ
キシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ
）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリ
ジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃ
ｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカ
ルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ
−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−
メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル
−２−セレン含有−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン
（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−
カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピ
ニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（
τｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ
−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−
メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍ
ｉｎｅ）を有する）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ
−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、
４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、
２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン
、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジ
ヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（
ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メ
トキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジ
ン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３
−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−
（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソ
ペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル
）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−
ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル
−シュードウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５
−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カル
バモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチル
アミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチ
ル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−
ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−
ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキ
シビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３
，４−ｄ］ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
＜シトシン＞
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的
な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、５−アザ−シチジン、６−アザ−
シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−
シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ
４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−
シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソ
シチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ
２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ
−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイ
ソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−
ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼ
ブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキ
シ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リシジ
ン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−
Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（
ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’
−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（
ｍ４ ２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、
および２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
＜アデニン＞
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的
な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、２−アミノ−プリン、２，６−ジ
アミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリ
ン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プ
リン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニ
ン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７
−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、
１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−
アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、
Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル
−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン
（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン
（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシジルカルバモイル（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏ
ｙｌ）−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）
、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチ
ルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジ
メチル−アデノシン（ｍ６ ２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシ
ン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシ
ン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニ
ン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’
−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ
）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−ア
デノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ
−リボシルアデノシン（リン酸塩）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン
、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’
−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペン
タオキサノンアデシル）−アデノシンが挙げられる。
＜グアニン＞
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的
な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イ
ノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチ
ル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ウィブトシン（ｙＷ）
、ペルオキシウィブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ）、低修飾
ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、
エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−ク
エオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミ
ノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デア
ザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン
、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、
６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン
、１−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ
２−ジメチル−グアノシン（ｍ２ ２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ
）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシ
ン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−ｍｅｔＨチオ−グアノシン、Ｎ２−メチ
ル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−
グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル
−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ
２ ２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメ
チル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（
Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ’Ｉｍ）、Ｏ６−フェニル−２’−デオ
キシイノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−
グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、Ｏ６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２
’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
＜修飾ｇＲＮＡ＞
一実施形態では、修飾核酸は、修飾ｇＲＮＡであり得る。一実施形態では、ｇＲＮＡは
、３’末端で修飾され得る。この実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端Ｕリボースで修飾
され得る。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され
ることができ、同時のリボース環の開環が、下に示される修飾ヌクレオシドをもたらす：
Figure 2021192615
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。
別の実施形態では、３’末端Ｕが、下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで
修飾され得る：
Figure 2021192615
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの
１つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含
有してもよい。この実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、５−（２−アミノ）プ
ロピルウリジン、および５−ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジ
ンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換されることができ；アデノシンおよびグアノシン
は、例えば、８−ブロモグアノシンなどの例えば、８位の修飾によって、修飾アデノシン
およびグアノシンで、または本明細書に記載される修飾アデノシンまたはグアノシンのい
ずれかによって、置換され得る。一実施形態では、例えば、７−デアザ−アデノシンなど
のデアザヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。一実施形態では、例えば、Ｎ６−
メチルアデノシン（ａｎｄｅｎｏｓｉｎｅ）などのＯ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチ
ドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。一実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドが組み込ま
れることができ、例えば、２’ＯＨ基が、Ｈ、−ＯＲ、−Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アル
キル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、
ハロ、−ＳＨ、−ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、ア
ラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、Ｎ
Ｈ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリー
ルアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る
）；またはシアノ（−ＣＮ）から選択される基によって置換される。一実施形態では、リ
ン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）基で、本明
細書に記載されるように修飾され得る。一実施形態では、ｇＲＮＡのオーバーハング領域
内のヌクレオチドは、それぞれ独立して、２−Ｆ２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２
’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルア
デノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、
およびそれらの任意の組み合わせなどの修飾２’−糖をはじめとするが、これに限定され
るものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。
一実施形態では、例えば、ｇＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子の一本鎖オーバーハング中の
１つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。
［ＸＩ．リンカー］
一実施形態では、ペイロードは、例えば、共有結合リンカーによって、Ｃａｓ９分子ま
たはｇＲＮＡと結合し得る。このリンカーは、切断可能または切断不能であってもよい。
一実施形態では、切断可能なリンカーが使用されて、所望の標的への輸送後にペイロード
が放出されてもよい。
リンカーは、直接結合；または例えば、酸素（Ｏ）またはイオウ（Ｓ）などの原子；−
ＮＲ−（式中、Ｒは、水素またはアルキルである）、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−
Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、ＳＯ、ＳＯ２、−ＳＯ２ＮＨ−などの単位；または置換または非置換ア
ルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル
、ヘテロアリールアルキルなどの原子鎖を含み得る。一実施形態では、原子鎖中の１つま
たは複数のメチレンは、の１つまたは複数Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、−ＳＯ２ＮＨ−、
−ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、ａ切断可能連結基、置換
または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換複素
環で置換され得る。
＜切断不能結合＞
一実施形態では、ペイロードは、アルキレン鎖などのそれ自体が生理的条件下で安定し
ているリンカーを介して、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡに付着し、対象に投与されると、
少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２４または４８時間にわたり、または少なくと
も１、２、３、４、５、または１０日間にわたり、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ
からのペイロードの放出をもたらさない。一実施形態では、ペイロードおよびＣａｓ９分
子および／またはｇＲＮＡは、それを通じて、ペイロードと、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮ
Ａとの反応および連結が得られた官能基残基を含む。一実施形態では、同一であってもま
たは異なっていてもよく、末端または内部であってもよい、ペイロードまたはＣａｓ９分
子および／またはｇＲＮＡの官能基は、アミノ、酸、イミダゾール、ヒドロキシル、チオ
、アシルハロゲン化物、−ＨＣ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−基、またはその誘導体を含む。一実
施形態では、リンカーは、１つまたは複数のメチレン基が、（Ｙ基のいずれもが互いに隣
接しないという条件で）Ｙ基によって任意選択的に置き換えられるヒドロカルビレン基を
含み、各Ｙは、各出現についてそれぞれ独立して、置換または非置換アリール、ヘテロア
リール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、または−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｘ）−（式中
、Ｘは、ＮＲ１、ＯまたはＳである）、−ＮＲ１−、−ＮＲ１Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ
Ｒ１−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−、−ＮＲ１Ｓ（Ｏ）ｎ−、−Ｓ（Ｏ）ｎＮＲ１−、−ＮＲ１Ｃ（
Ｏ）−ＮＲ１−；および各出現についてそれぞれ独立して、Ｈまたは低級アルキルに相当
するＲ１から選択され、式中、ｎは０、１、または２である。
一実施形態では、リンカーは、アルキレン部分またはヘテロアルキレン部分（例えば、
エチレングリコールなどのアルキレングリコール部分）を含む。一実施形態では、リンカ
ーは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ乳酸、ポリ（エチレンイミン）、オリゴ糖、アミノ
酸（例えば、グリシン）、アミノ酸鎖、または任意のその他の適切な連結を含む。リンカ
ー基は、ＰＥＧ、ポリグリコール酸、またはポリ乳酸鎖などのように、生物学的に不活性
であり得る。一実施形態では、リンカー基は、誘導体化または非誘導体化アミノ酸（例え
ば、グリシン）に相当する。
＜切断可能な結合＞
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて
、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。一実施形態では、切断
可能連結基は、対象の血中または（例えば、血中のまたは血清中に見られる条件を模倣し
またはに相当するように選択され得る）第２の標準状態下よりも、標的細胞内または（例
えば、細胞内条件を模倣しまたはに相当するように選択され得る）第１の標準状態下で、
少なくとも１０倍以上、または少なくとも１００倍より迅速に切断される。
切断可能な連結基は、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断
剤に対する感受性が高い。このような分解剤の例としては、例えば、酸化または還元酵素
、または還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞内に存在するメルカプ
タンなどの還元剤をはじめとする、特定基質のために選択される、または基質特異性を有
さない酸化還元剤；エステラーゼ；例えば、５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境
を生成し得る、エンドソームまたは作用因子；一般酸として作用することで酸切断可能連
結基を加水分解または分解し得る酵素、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、および
ホスファターゼが挙げられる。
ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）などの切断可能な連結基は、ｐＨの影響を受けやすい
場合がある。ヒト血清のｐＨが７．４である一方で、平均細胞内ｐＨは、わずかにより低
く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは５．５〜６．０の範囲のより酸性の
ｐＨを有し、リソソームは、５．０前後のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリ
ンカーは、好適なｐＨで切断される、切断可能連結基を有する。リンカーは、特定の酵素
によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。
一般に、候補切断可能連結基の適切さは、分解剤（または条件）が候補連結基を切断す
る能力を試験することで、評価され得る。候補切断可能連結基はまた、血中における、ま
たはその他の非標的組織と接触した際における、切断に抵抗する能力についても試験され
得る。したがって、第１および第２の条件間の切断に対する相対感受性が判定されること
ができ、第１の条件は、標的細胞内の切断の指標となるように選択され、第２の条件は、
例えば、血液または血清などのその他の組織または生体液における切断の指標となるよう
に選択される。評価は、無細胞系内で、細胞内で、細胞培養物内で、臓器または組織培養
物内で、または動物の全身で、実施され得る。それは、無細胞条件または培養条件におい
て最初の評価をする上で、および動物の全身でのさらなる評価によって確認する上で、有
用であってもよい。
一実施形態では、切断可能リンカーとしては、ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）などの酸
化還元切断可能リンカーや、例えば、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（
ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−
Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）−Ｓ
−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒ
）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）
（Ｒ）−Ｓ−、−ＯＰ（Ｓ）（Ｒ）−Ｓ−（式中、Ｒは、水素またはアルキルである）な
どのリン酸切断可能リンカーが挙げられる。
＜酸切断可能連結基＞
酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。一実施形態では、酸切断
可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境
内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。酸
切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げら
れるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式−Ｃ（＝Ｎ−）Ｎ−、
−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）−を有し得る。
＜エステルベースの連結基＞
エステルベースの切断可能連結基は、細胞内で、エステラーゼおよびアミダーゼなどの
酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、
アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。エステル切断可能連結基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有
する。
［ＸＩＩ．ゲノムシグネチャの標的化］
Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、そして特に、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用
して、選択されたゲノムシグネチャを含む標的核酸との配列特異的相互作用によって、細
胞を標的化し得る。これは、選択されたゲノムシグネチャを有する細胞の標的破壊を提供
する。本明細書で開示される方法および組成物を使用して、例えば、生殖細胞系内に存在
するゲノムシグネチャ、または例えば、がん細胞内における生殖細胞系または後天性変異
、ウイルス感染症、またはその他の生殖細胞系または後天性のゲノム変化など、ゲノム内
の散発性変化または体細胞変化の結果として生じる、ゲノムシグネチャなどの選択された
ゲノムシグネチャによって特徴付けられる、障害が治療され得る。
理論による拘束は望まないが、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと標的核酸の標的配列の
間の相補性が、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と標的配列との標的配列特異的相互作
用を媒介すると考えられる。これは、例えば、転座、挿入、欠失、および反転、およびそ
の他の変異などの再配置によって、特異的配列またはゲノムシグネチャを標的化できるよ
うにする。Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用して、例えば、生殖細胞系、ミトコ
ンドリア、または体細胞の変異などの特定の配列を標的化し得る。使用されるＣａｓ９分
子／ｇＲＮＡ分子複合体次第で、特定の編集、ペイロード送達、またはその双方が実施さ
れ得る。一実施形態では、切断およびペイロード送達の双方が実施される。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、その標的ゲノム配列認識に際
して、細胞死を促進する。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、
標的核酸を切断する。一実施形態では、それは、ペイロードを送達しない。理論による拘
束は望まないが、これらの実施形態では、例えば、ＤＮＡ損傷アポトーシスシグナル伝達
カスケードの要素などの内在性細胞要素が、アポトーシスを促進すると考えられる。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、標的核酸を切断して、ペ
イロードを送達する。ペイロードは、増殖または細胞分裂を阻害する化合物、または例え
ば、ＤＮＡ損傷アポトーシスシグナル伝達カスケードの要素などのアポトーシスを促進す
る化合物を含み得る。一実施形態では、第２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用
して、増殖または細胞分裂を阻害する第２の化合物、または例えば、ＤＮＡ損傷アポトー
シスシグナル伝達カスケードの要素などのアポトーシスを促進する第２の化合物を含むペ
イロードが送達される。第２のペイロードを送達するＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体
は、ｅｉＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９分子を含み得る。追加的な、例えば、第３のま
たは第４のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用して、例えば、増殖または細胞分裂
を阻害する追加的な化合物、または例えば、ＤＮＡ損傷アポトーシスシグナル伝達カスケ
ード促進の追加的な要素などのアポトーシスを促進する追加的な化合物などの追加的なペ
イロードが送達され得る。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、増殖または細胞分裂を阻害す
る化合物、または例えば、ＤＮＡ損傷アポトーシスシグナル伝達カスケードの要素などの
アポトーシスを促進する化合物を含むペイロードを送達するが、標的核酸を切断しない。
理論による拘束は望まないが、これらの実施形態では、例えば、ＤＮＡ損傷アポトーシス
シグナル伝達カスケードの要素などの内在性細胞要素が、アポトーシスを促進すると考え
られる。
増殖または細胞分裂を阻害する代表的な化合物、または例えば、ＤＮＡ損傷アポトーシ
スシグナル伝達カスケードの要素などのアポトーシスを促進する代表的な化合物は、例え
ば、表ＸＩＩ−１で本明細書に記載される。
Figure 2021192615
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、例えば、転座、反転、挿入、
または欠失などの再配置の切断点を含む、またはその近くにある配列を標的化する。一実
施形態では、再配置は、細胞に、例えば、望まれない増殖などの望まれない特性を与える
。一実施形態では、再配置を保有する細胞は、がん細胞である。一実施形態では、再配置
は、キナーゼ遺伝子を含み、キナーゼ活性の望まれない増大または構成的発現がもたらさ
れる。一実施形態では、再配置は、腫瘍抑制因子の発現を妨害する。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、
例えば、再配置の切断点または接合部などの変異を標的化することで、再配置を含む細
胞のゲノムを特異的に標的化して、例えば、切断し；または
例えば、切断またはペイロード送達のために、例えば、再配置切断点などの変異から２
００、１００、１５０、１００、５０、２５、１０、または５ヌクレオチド以内のヌクレ
オチド配列を標的化する。
本発明は、前記ゲノムシグネチャを標的化する、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を
投与するステップと、それによって前記細胞を操作するステップとを含む、ゲノムシグネ
チャを含む細胞を操作する方法を含む。
一実施形態では、操作するステップは、前記細胞の増殖または分裂を阻害しまたはそれ
を死滅させるステップを含む。
一実施形態では、前記細胞は、がん細胞であり、またはウイルス感染を有する細胞であ
る。
一実施形態では、方法は、例えば、がんまたはウイルス感染などの前記ゲノムシグネチ
ャを有する細胞によって特徴付けられる障害のために、例えば、ヒト対象などの対象を治
療するステップを含む。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、例えば、テンプレート核酸か
らの停止コドンの導入によって再配置を妨害し、例えば、停止コドンが融合タンパク質中
に挿入され、例えば、融合タンパク質がキナーゼ活性を含む。
本発明は、転座を標的化するＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を投与するステップを
含む、キナーゼドメインを非キナーゼ遺伝子制御領域の制御下に置く、キナーゼ遺伝子か
ら非キナーゼ遺伝子への転座を有する、がんを治療する方法を含む。一実施形態では、例
えば、キナーゼ転座のプロモーターなどの制御領域、またはそのコード配列が編集されて
、発現が低下れる。
［ＸＩＩＩ．併用療法］
Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、そして特に、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、例
えば、抗がん剤などの第２の治療薬と組み合わせて使用され得る。一実施形態では、第２
の治療薬（例えば、抗がん剤）およびＣａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、そして特に、Ｃａｓ
９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、異なる（例えば。非重複）経路を標的化する。一実施形
態では、第２の治療薬（例えば、抗がん剤）およびＣａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、そして
特に、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、同一または重複経路を標的化する。
代表的な併用療法としては、例えば、以下が挙げられる：
−ＡＫＴ特異的Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子と合わせた、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、テムシ
ロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））またはエベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録
商標）））；
−ＨＤＡＣ特異的Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子と合わせた、イマチニブメシレート（グリベ
ック（登録商標））；ダサチニブ（スプリセル（登録商標））；ボスチニブ（ボシュリフ
（登録商標））；トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））；ペルツズマブ（パージ
ェタ（商標））；ラパチニブ（タイケルブ（登録商標））；ゲフィチニブ（イレッサ（登
録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））などのチロシンキナーゼ阻害剤；お
よび
−ＭＤＲ１遺伝子などの多剤耐性遺伝子に対する１つまたは複数のＣａｓ９／ｇＲＮＡ
と合わせた、任意の化学療法剤。
［ＸＩＶ．例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）などの遺伝障害の治療］
別の態様では、本発明は、例えば、早期停止コドンのような停止コドンなどの遺伝子シ
グネチャの効果を低下させるまたは無効化するなど、細胞を改変する方法を特徴とする。
この方法は、例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャで、またはその上流で切断
する、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に、前記細胞を接触させるステップと、それに
よって細胞を改変するステップとを含む。
理論による拘束は望まないが、一実施形態では、切断および引き続くエキソヌクレアー
ゼ作用、および非相同末端結合が、改変された配列をもたらすと考えられ、その中では、
例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャが例えば、異なるフレーム内に配置され
ることで、除去される。一実施形態では、同じ一連の事象が、例えば、早期停止コドンな
どのシグネチャに続く配列に、適切な読み枠を回復させる。
早期停止コドンを除去するために、方法が実施されて、フレームシフト変異が修正され
る場合、修復は、ＤＮＡの様々な部位で実施され得る。変異で直接切断がなされてもよく
、それによってフレームシフトが完全に修正されて、タンパク質がその野生型（またはほ
ぼ野生型）配列に戻される。また、修復が実施される、コドンのタンパク質Ｃ末端の全て
の（またはほぼ全ての）アミノ酸が野生型になるように、早期停止コドンで、またはその
近くで、直接切断がなされてもよい。後者の場合、得られたタンパク質は、変異と修復部
位の間に、１つまたは複数のフレームシフトされたアミノ酸を有することもあるが、しか
しタンパク質は完全長であり、大部分の長さ全体にわたり野生型配列を有するので、それ
はなおも機能性であってもよい。
遺伝子シグネチャは、（遺伝性疾患またはその症状などの）表現型を引き起こす、ゲノ
ムの特別な部分の特別なＤＮＡ配列である。例えば、遺伝子シグネチャは、タンパク質発
現を妨げる早期停止コドンであってもよい。この筋書きでは、早期停止コドンは、停止コ
ドンを直接作り出す変異から、または早期停止コドンが下流で形成されるようにする、フ
レームシフトを引き起こす変異から生じ得る。遺伝子シグネチャはまた、タンパク質中の
重要なアミノ酸の同一性を変化させ、タンパク質の機能を妨害する、点変異であってもよ
い。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、前記標的核酸中の二本鎖切断
を媒介する。
一実施形態では、例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャは、点変異、挿入、
欠失、または再配置によって生じる。一実施形態では、変異は、フレームシフトを引き起
こして、例えば、変異の下流に早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャをもたらす。
一実施形態では、早期停止コドンは、標的核酸内にある。一実施形態では、標的核酸は
、早期停止コドンの上流にある。変異は、標的核酸上流、標的核酸内、または標的核酸下
流であってもよい。
一実施形態では、二本鎖切断は、変異の５００、２００、１００、５０、３０、２０、
１０、５、または２ヌクレオチド以内である。一実施形態では、二本鎖切断は、例えば、
早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャの５００、２００、１００、５０、３０、２０、
１０、５、または２ヌクレオチド以内にある。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、標的核酸のエキソヌクレアー
ゼ消化を媒介する。一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、二本鎖切断
で、１、２、３、４、または５ヌクレオチドを除去する。
一実施形態では、二本鎖切断は、非相同末端結合によって分離される。
一実施形態では、例えば、早期停止コドンなどの変異および／または遺伝子シグネチャ
は、ジストロフィン遺伝子中にあり、例えば、エクソン５１中、またはエクソン５１に先
行しまたは続くイントロン中にある。早期停止コドンはまた、コドン５４、６４５、７７
３、３３３５、および３３４０の１つまたは複数における、ジストロフィン遺伝子の変異
によって引き起こされてもよい。一実施形態では、ジストロフィン遺伝子の早期停止コド
ンは、コドン２３０５〜２３６６の欠失に起因する。
一実施形態では、細胞をＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に接触させるステップは、
細胞をＣａｓ９分子をコードする核酸に接触させるステップを含む。一実施形態では、細
胞をＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に接触させるステップは、細胞を例えば、プラス
ミドなどの核酸で、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターを使用
して、形質移入するステップを含む。
一実施形態では、方法は、その中に例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャが
あらかじめ位置する、タンパク質のレベル増大をもたらす。例えば、タンパク質レベル（
例えば、ジストロフィンレベル）は、細胞内または組織内で、少なくとも３％、４％、５
％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％増大してもよい。一実施形態では、
方法は、例えば、ｍＲＮＡがナンセンス媒介ｍＲＮＡ分解を受けるのを妨げることで、そ
の中に早期停止コドンがあらかじめ位置するｍＲＮＡのレベル増大をもたらす。
一実施形態では、標的核酸、例えば早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャ、および変
異の１つまたは複数は、（ＤＭＤにおいて変異する）ジストロフィン遺伝子に位置する。
標的核酸、例えば早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャ、および変異の１つまたは複数
はまた、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子（において変異するＶＩＩ型関連ジストロフィー型表皮水疱
症）、ＦＫＴＮ遺伝子（福山型先天性筋ジストロフィーにおいて変異する）、ジスフェリ
遺伝子肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型において変異する）、ＣＦＴＲ遺伝子（嚢胞性線維
症において変異する）、ＨＥＸＡ（テイ・サックス病において変異する）、ＩＤＳ遺伝子
（ハンター症候群において変異する）、ＦＶＩＩＩ遺伝子（血友病において変異する）、
ＩＤＵＡ遺伝子（ハーラー症候群において変異する）、ＰＰＴ１遺伝子（小児神経性セロ
イドリポフスチン症において変異する）、ＡＴＭ遺伝子などの腫瘍抑制因子（がん様神経
膠腫およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病において変異する）、ＲＰ２（Ｘ連鎖色素性網膜
炎において変異する）、ＣＴＮＳ遺伝子（腎障害シスチン症において変異する）、および
ＡＶＰＲ２遺伝子（先天性腎性尿崩症において変異する）に位置してもよい。
一実施形態では、方法は、培養細胞内で実施される。一実施形態では、この方法は、細
胞を患者に投与するステップをさらに含む。細胞は、例えば、誘導多能性幹細胞、骨髄由
来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＣＤ１３３＋細胞、中胚葉性血管芽細胞、またはＭｙｏＤ
−形質導入皮膚線維芽細胞であってもよい。
一実施形態では、方法は、標的核酸とテンプレート核酸の間で相同指向修復ができるよ
うにする条件下で、細胞をテンプレート核酸に接触させて、変異または早期停止コドンを
修正するステップを含む。
別の態様では、本発明は、
１）早期停止コドンでまたはその上流で切断するＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体、
または、
２）このような複合体に接触されている細胞をヒト対象に提供して、
それによって対象を治療するステップを含む、例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグ
ネチャに関連する、例えば、ＤＭＤのなどの障害を有するヒト対象を治療する方法を特徴
とする。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、前記標的核酸中の二本鎖切断
を媒介する。
一実施形態では、例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャは、点変異、挿入、
欠失、または再配置によって生じる。一実施形態では、変異は、フレームシフトを引き起
こし、変異の下流に早期停止コドンをもたらす。
一実施形態では、二本鎖切断は、変異の５００、２００、１００、５０、３０、２０、
１０、５、または２ヌクレオチド以内である。一実施形態では、二本鎖切断は、早期停止
コドンの５００、２００、１００、５０、３０、２０、１０、５、または２ヌクレオチド
以内である。
一実施形態では、例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャは、Ｃａｓ９分子／
ｇＲＮＡ分子の複合体標的核酸内にある。一実施形態では、標的核酸は、例えば、早期停
止コドンなどの遺伝子シグネチャの上流にある。変異は、標的核酸上流、標的核酸内、ま
たは標的核酸下流であってもよい。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、標的核酸のエキソヌクレアー
ゼ消化を媒介する。一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、二本鎖切断
で、１、２、３、４、または５ヌクレオチドを除去する。
一実施形態では、二本鎖切断は、非相同末端結合によって分離される。
一実施形態では、例えば、早期停止コドンなどの変異および／または遺伝子シグネチャ
は、ジストロフィン遺伝子中にあり、例えば、エクソン５１中、またはエクソン５１に先
行しまたは続くイントロン中にある。早期停止コドンはまた、コドン５４、６４５、７７
３、３３３５、および３３４０の１つまたは複数における、ジストロフィン遺伝子の変異
によって引き起こされてもよい。一実施形態では、ジストロフィン遺伝子の早期停止コド
ンは、コドン２３０５〜２３６６の欠失に起因する。
一実施形態では、細胞をＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に接触させるステップは、
細胞をＣａｓ９分子をコードする核酸に接触させるステップを含む。一実施形態では、細
胞をＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に接触させるステップは、細胞を例えば、プラス
ミドなどの核酸で、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターを使用
して、形質移入するステップを含む。
一実施形態では、方法は、その中に例えば、早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャが
あらかじめ位置する、タンパク質のレベル増大をもたらす。例えば、タンパク質レベル（
例えば、ジストロフィンレベル）は、細胞内または組織内で、少なくとも３％、４％、５
％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％増大してもよい。一実施形態では、
方法は、例えば、ｍＲＮＡがナンセンス媒介ｍＲＮＡ分解を受けるのを妨げることで、そ
の中に早期停止コドンがあらかじめ位置するｍＲＮＡのレベル増大をもたらす。
一実施形態では、標的核酸、例えば早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャ、および変
異の１つまたは複数は、（ＤＭＤにおいて変異する）ジストロフィン遺伝子に位置する。
標的核酸、例えば早期停止コドンなどの遺伝子シグネチャ、および変異の１つまたは複数
はまた、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子（において変異するＶＩＩ型関連ジストロフィー型表皮水疱
症）、ＦＫＴＮ遺伝子（福山型先天性筋ジストロフィーにおいて変異する）、ジスフェリ
遺伝子肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型において変異する）、ＣＦＴＲ遺伝子（嚢胞性線維
症において変異する）、ＨＥＸＡ（テイ・サックス病において変異する）、ＩＤＳ遺伝子
（ハンター症候群において変異する）、ＦＶＩＩＩ遺伝子（血友病において変異する）、
ＩＤＵＡ遺伝子（ハーラー症候群において変異する）、ＰＰＴ１遺伝子（小児神経性セロ
イドリポフスチン症において変異する）、ＡＴＭ遺伝子などの腫瘍抑制因子（がん様神経
膠腫およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病において変異する）、ＲＰ２（Ｘ連鎖色素性網膜
炎において変異する）、ＣＴＮＳ遺伝子（腎障害シスチン症において変異する）、および
ＡＶＰＲ２遺伝子（先天性腎性尿崩症において変異する）に位置してもよい。
一実施形態では、方法は、培養細胞内で実施される。一実施形態では、方法は、細胞を
患者に投与するステップをさらに含む。細胞は、例えば、誘導多能性幹細胞、骨髄由来前
駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＣＤ１３３＋細胞、中胚葉性血管芽細胞、またはＭｙｏＤ−形
質導入皮膚線維芽細胞であってもよい。
一実施形態では、方法は、標的核酸とテンプレート核酸の間で相同指向修復ができるよ
うにする条件下で、細胞をテンプレート核酸に接触させて、変異または早期停止コドンを
修正するステップを含む。
一実施形態では、対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、コラーゲンＶ
ＩＩ型関連ジストロフィー型表皮水疱症、福山型先天性筋ジストロフィー、および肢帯型
筋ジストロフィー型の２Ｂ、嚢胞性線維症、リソソーム貯蔵障害（テイ・サックス病、ハ
ンター症候群、および腎障害シスチン症など）、血友病、ハーラー症候群、小児神経性セ
ロイドリポフスチン症、Ｘ連鎖色素性網膜炎（ＲＰ２）、がん（神経膠腫およびＢ細胞慢
性リンパ球性白血病など）、および先天性腎性尿崩症から選択される障害を有する。
［ＸＶ．例えば、有毛細胞、支持細胞、またはらせん神経節ニューロンの損失がある聴覚
障害；またはβ膵島細胞の損失がある糖尿病などの成熟特殊化細胞の欠如によって特徴付
けられる障害の治療］
別の態様では、本発明は、細胞を改変する方法を特徴とし、例えば、再生療法において
、例えば、その他の成熟特殊化細胞の発達が促進される。例えば、増殖遺伝子が上方制御
されることができおよび／またはチェックポイント阻害剤が阻害されることができ、例え
ば、１つまたは複数の分化経路が抑制される。
一実施形態では、上記方法は、増殖および特定の系統成熟の誘導を含む。
一実施形態では、上記方法は、例えば、聴力の回復または改善のために、有毛細胞発達
を促進する遺伝子を上方制御しまたは有毛細胞発達を阻害する遺伝子を下方制御するＣａ
ｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に、前記細胞を接触させるステップと、それによって細胞
を改変するステップとを含む。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子は、有毛細胞発達を促進する遺伝子を上
方制御するペイロードを送達する。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子は、毛髪成長を阻害する遺伝子を下方制
御するペイロードを送達する。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、細胞のゲノムを編集して、毛
髪成長を促進する遺伝子を上方制御する。一実施形態では、テンプレート核酸を使用して
、毛髪成長を促進する遺伝子を上方制御するゲノムに、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合
体改変がもたらされる。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、細胞のゲノムを編集して、毛
髪成長を阻害する遺伝子を下方制御する。一実施形態では、テンプレート核酸を使用して
、毛髪成長を促進する遺伝子を下方制御するゲノムに、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合
体改変がもたらされる。
一実施形態では、前記細胞は、ｉＰＳ細胞、天然有毛細胞前駆細胞、または成熟有毛細
胞である。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子は、例えば、遺伝子の構造を改変するこ
とで（例えば、ゲノムを編集することで）、または遺伝子を調節するペイロードの送達に
よって、遺伝子の発現を修飾する。一実施形態では、遺伝子は、転写因子またはその他の
調節遺伝子である。
一実施形態では、方法は、有毛細胞またはその他の成熟細胞再生のために、以下の１つ
または複数のまたは全てを含む：
細胞増殖のために、細胞をＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に接触させて、ｃ−Ｍｙ
ｃ、ＧＡＴＡ３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｗｎｔ、ＴＣＦ３の上方制御の１つまたは複数が
もたらされるステップと；
チェックポイントのために、細胞をＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に接触させて、
ＢＣＬ２、ＢＭＰ、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５、Ｎｏｔｃｈ、ｐ２７、Ｐｒｏｘ１、ＴＧＦβの
下方制御の１つまたは複数がもたらされるステップと；および
細胞をＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に接触させて、成熟経路の活性化がもたらさ
れるステップ。有毛細胞では、これは、Ａｔｏｈ１（Ｍａｔｈ１）、Ｂａｒｈｌ１、Ｇｆ
ｉ１、Ｍｙｏ７ａ、ｐ６３、ＰＡＸ２、ＰＡＸ８、Ｐｏｕ４ｆ３の１つまたは複数を含み
、ニューロンでは、これは、ＮＥＦＨ、Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｎｅｕｒｏｇ１、ＰＯＵ４Ｆ１
の１つまたは複数を含む。
一実施形態では、方法は、内耳有毛細胞、外耳有毛細胞、らせん神経節ニューロン、お
よび耳支持細胞を生成するステップを含む。
一実施形態では、１つまたは複数の成長因子が調節されることができ、例えば、上方制
御され、例えば、血小板生成のためにＴＰＯが上方制御されることができ、好中球生成の
ためにＧＣＳＦが上方制御され得る。
別の態様では、本発明は、例えば、このセクションＸＶで本明細書に記載される改変を
細胞提供する。
別の態様では、本発明は、聴覚障害を治療する方法を特徴とする。方法は、例えば、こ
のセクションＸＶで本明細書に記載される改変細胞を前記対象に投与するステップを含む
。一実施形態では、細胞は自己細胞である。一実施形態では、細胞は同種異系である。一
実施形態では、細胞は異種である。
別の態様では、本発明は、例えば、聴覚障害について、対象を治療する方法を特徴とす
る。この方法は、毛髪の増殖を促進する遺伝子を上方制御し、または毛髪の増殖を阻害す
る遺伝子を下方制御するＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を前記対象に投与し、それに
よって細胞を改変するステップを含む。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子は、毛髪成長を促進する遺伝子を上方制
御するペイロードを送達する。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子は、毛髪成長を阻害する遺伝子を下方制
御するペイロードを送達する。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、細胞のゲノムを編集して、毛
髪成長を促進する遺伝子を上方制御する。一実施形態では、テンプレート核酸を使用して
、毛髪成長を促進する遺伝子を上方制御するゲノムに、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合
体改変がもたらされる。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、細胞のゲノムを編集して、毛
髪成長を阻害する遺伝子を下方制御する。一実施形態では、テンプレート核酸を使用して
、毛髪成長を促進する遺伝子を下方制御するゲノムに、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合
体改変がもたらされる。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子は、例えば、遺伝子の構造を改変するこ
とで（例えば、ゲノムを編集することで）、または遺伝子を調節するペイロードの送達に
よって、遺伝子の発現を修飾する。一実施形態では、遺伝子は、転写因子またはその他の
調節遺伝子である。
一実施形態では、上記方法は、以下の１つまたは複数のまたは全てを含む：
ｃ−Ｍｙｃ、ＧＡＴＡ３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｗｎｔ、またはＴＣＦ３の１つまたは複
数の上方制御をもたらす、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を投与するステップと；
成熟経路活性化をもたらす、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を投与するステップ。有
毛細胞では、これは、Ａｔｏｈ１（Ｍａｔｈ１）、Ｂａｒｈｌ１、Ｇｆｉ１、Ｍｙｏ７ａ
、ｐ６３、ＰＡＸ２、ＰＡＸ８、またはＰｏｕ４ｆ３の１つまたは複数を含み、ニューロ
ンでは、これは、ＮＥＦＨ、Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｎｅｕｒｏｇ１、またはＰＯＵ４Ｆ１の１
つまたは複数を含む。
［ＸＶＩ．支配ｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９システムの活性を制限するためのそれらの
使用］
本明細書で考察されるように、例えば、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子をコードする
ＤＮＡなどの核酸を使用しまたはそれを含む、方法および組成物は、支配ｇＲＮＡ分子を
さらに使用しまたはそれを含み得る。支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子と複合体形成し
て、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸などの
システムの構成要素を不活性化し、またはサイレンシングさせ得る。どちらの状況でも、
例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇ
ＲＮＡは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体媒介遺伝子ターゲッティングの効果を制限して、活
性に時間的制限を課し、またはオフターゲット活性を低下させ得る。支配ｇＲＮＡ分子は
、阻害するように作用しえて、例えば、Ｃａｓ９システムの構成要素の生成を完全にまた
は実質的に阻害し、それによってその活性を制限し、またはそれに影響を与える。
典型的に、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする
核酸配列は、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸などのそれが負に調節する構成要素
とは異なる、例えば、プロモーターなどの制御領域の制御下にある。一実施形態では、異
なるは、単に、例えば、調節される双方の配列と機能的に連結するプロモーターなどの１
つの制御領域の制御下にないことを指す。一実施形態では、異なるは、種類またはタイプ
が異なることを指す。例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコ
ードする配列は、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸などのそれが負に調節する構成
要素をコードする配列よりも低い発現レベルを有し、またはそれよりも後に発現される、
例えば、プロモーターなどの制御領域の制御下にある。
一例として、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードす
る配列は、例えば、ヒトＵ６核内低分子プロモーター、またはヒトＨ１プロモーターなど
の本明細書に記載される制御領域（例えば、プロモーター）の制御下にあり得る。一実施
形態では、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸などのそれが負に制御する構成要素を
コードする配列は、例えば、ヒトＵ６核内低分子プロモーター、ヒトＨ１プロモーター、
またはＰｏｌＩＩプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター
、またはＣＢプロモーターなどの本明細書に記載される制御領域（例えば、プロモーター
）の御下にあり得る。
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲または内容をどのようにも限定するこ
とは意図されない。
＜実施例１：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を標的化する支配ｇＲＮＡ配列のコンピュータシミュレーションによ
る設計＞
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）
Ｃａｓ９を標的化する支配ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、ＤＮＡ配列探すアルゴリズムを
使用して同定された。ＰＡＭ配列に隣接する可能なｇＲＮＡ部位を同定するのに加えて、
ソフトウェアはまた、ヒトゲノム中の選択されたｇＲＮＡ部位から、１、２、３つ以上の
ヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。各Ｃａｓ９遺伝子のゲノムの
ＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ、配列は、一般に利用可能なＲｅｐｅ
ａｔＭａｓｋｅｒプログラムを使用して、反復要素についてスクリーニングされる。Ｒｅ
ｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、インプットＤＮＡ配列
を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
同定に続いて、支配ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９コード配列中のそれらの切断位置、それらの
直交性および５’Ｇの存在（ＰＡＭを含有するヒトゲノム中の近いマッチの同定に基づく
）に基づいて、階層に格付けされた。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを
含有するヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「優れた直交性」は
、例えば、ヒトゲノム中に意図される標的以外の同一配列を有さず、または標的配列中に
１つまたは２つのミスマッチを含有する任意の配列を有さない、２０量体ｇＲＮＡを指し
てもよい。優れた直交性がある標的化ドメインが選択されて、オフターゲットＤＮＡ切断
が最小化される。
階層１は、Ｃａｓ９のコード配列の最初の５００ヌクレオチドを標的化して、優れた直
交性を有し、５’Ｇで開始する全てのｇＲＮＡを含む。階層２は、Ｃａｓ９のコード配列
の最初の５００ヌクレオチドｑを標的化して、優れた直交性を有するが、５’Ｇで開始し
ない全てのｇＲＮＡを含む。階層３は、Ｃａｓ９のコード配列の最初の５００ヌクレオチ
ドを標的化して、直交性に劣り、５’Ｇで開始する全てのｇＲＮＡを含む。階層４は、Ｃ
ａｓ９のコード配列の最初の５００ヌクレオチドｑを標的化して、直交性に劣るが、５’
Ｇで開始しない全てのｇＲＮＡを含む。階層５は、残りのコード配列を標的化する全ての
ｇＲＮＡを含む。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の場合、それらの標的がＮＮＧＲ
ＲＶの非最適ＰＡＭを有する全てのｇＲＮＡを含む、第６の階層がある。
全てのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）標的で、１７量体、または２０量体ｇ
ＲＮＡが設計された。全てのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）標的で、２０量体ｇＲ
ＮＡが設計された。単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカー
ゼ」ストラテジーの双方で、ｇＲＮＡが同定された。設計された支配ｇＲＮＡは、表Ｅ−
１〜Ｅ−１２に収載されている。
Figure 2021192615
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＜実施例２：２９３Ｔ細胞内におけるＶＥＧＦを標的化するｇＲＮＡによって同時形質移
入されたＣａｓ９を標的化する支配ｇＲＮＡの有効性＞
この試験では、２９３Ｔ細胞（２４ウェルプレート内のウェルあたり１２０，０００個
の細胞）が、ＶＥＧＦ遺伝子（ｇＲＮＡ配列ＧＧＴＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ
（配列番号１５１０）を標的化するｇＲＮＡを発現する１２５ｎｇのコンストラクト共に
、エピトープ標識（３×フラグ標識）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９
を発現する７５０ｎｇのプラスミドで形質移入され、Ｆｕ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｐｒｏｖｉ
ｎｇ ＣＩＲＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ
ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３２，
２７９−２８４（２０１４））の図１ｄからのＶＥＧＦＡ部位３（標的部位３）の２０量
体を参照されたい。同時に、細胞は、（対照としての）ＣＣＲ５遺伝子を標的化するｇＲ
ＮＡを発現するコンストラクト、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を標
的化する支配ｇＲＮＡ抗ＳＰＣａｓ９−１７５（実施例１を参照されたい）を発現するコ
ンストラクト、またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を標的化する支
配ｇＲＮＡ抗ＳＰＣａｓ９−１（実施例１を参照されたい）を発現するコンストラクトの
３つのｇＲＮＡ発現コンストラクトの１つ（１２５ｎｇ）で形質移入された。細胞は、形
質移入の１日、２日、３日、６日および９日後に、分析のために収集された。
内在性ＶＥＧＦおよびプラスミド媒介性Ｃａｓ９遺伝子の変異率を定量化するために、
全ゲノムＤＮＡが各時点で単離され、配列を標的化するＶＥＧＦ ｇＲＮＡおよびＣａｓ
９支配ｇＲＮＡを包含する領域が、ＰＣＲによって増幅された。増幅ＰＣＲ産物は、変性
および再アニールされ、Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼによる処理がそれに続いた。変異率（イン
デル頻度）は、Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｔ
ＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ
．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２）に記載されるよう
にして、キャピラリー電気泳動法装置を使用して測定された。３つの処置群のＶＥＧＦお
よびＣａｓ９の変異頻度（％インデル±標準偏差）は、表Ｅ−１３に示される。これらの
結果は、同時形質移入Ｃａｓ９標的化支配ｇＲＮＡの存在または不在下で、Ｃａｓ９標的
化支配ｇＲＮＡの双方がＣａｓ９遺伝子の変異を誘導し、内在性ＶＥＧＦ遺伝子座が同程
度に変異されることを立証する。
実験経過中に、Ｃａｓ９タンパク質のレベルを評価するために、総タンパク質量溶解産
物が、各処置群から各時点で調製された。タンパク質サンプル（１５μｇ）がＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって分離されて、ＰＶＤＦ膜にブロットされ、３×Ｆｌａｇエピトープタグに
対して特異的な抗体によってプローブされた。細胞骨格アクチンに対して特異的な抗体が
、ローディング対照として使用された。図７に示されるように、Ｃａｓ９標的化される支
配ｇＲＮＡのそれぞれによる同時形質移入は、特に、形質移入後６日および９日目に、Ｃ
ａｓ９タンパク質のレベル低下をもたらす。
Figure 2021192615
＜実施例３：様々な長さのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの活性比較＞
この試験では、ＧＦＰを安定して発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞が、Ｓ．アウレウス（
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を発現するコンストラクトと共に、様々な長さ（１５〜２０
ヌクレオチド）の標的ドメインがあるｇＲＮＡを発現するコンストラクトで、同時形質移
入された。ｇＲＮＡは、ＶＥＧＦ（合計２２ｇＲＮＡ）、ＣＣＲ５（合計１５ｇＲＮＡ）
、およびＧＦＰ（合計１０ｇＲＮＡ）のいくつかの異なる遺伝子を標的化した。試験され
た全てのｇＲＮＡの標的ドメインはＧヌクレオチドで開始され、全てのｇＲＮＡ標的部位
は、ＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭ配列と結合した。
ＶＥＧＦおよびＣＣＲ５標的化ｇＲＮＡの活性を定量化するために、形質移入に続いて
２日目に、細胞から全ゲノムＤＮＡが単離され、ＶＥＧＦおよびＣＣＲ５ ｇＲＮＡ標的
部位を包含する領域が、ＰＣＲによって増幅された。増幅ＰＣＲ産物は、変性および再ア
ニールされ、Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼによる処理がそれに続いた。変異率（インデル頻度）
は、Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮ
ｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３０，４６０−４６５（２０１２）に記載されるようにして、
キャピラリー電気泳動法装置を使用して測定された。ＧＦＰ標的化ｇＲＮＡの活性を定量
化するために、形質移入に続いて３日目に細胞が収集されて、ＧＦＰ陰性細胞（ＧＦＰ遺
伝子の変異を示す）の百分率が、フローサイトメトリーによって測定された。各標的化ド
メイン長の全てのｇＲＮＡの平均活性が計算され、２０ヌクレオチド標的化ドメインがあ
るｇＲＮＡの平均活性と比較された。表Ｅ−１４に示されるように、より短い標的化ドメ
インがあるｇＲＮＡは、２０ヌクレオチド標的化ドメインがあるものよりも、低い平均活
性を有する。
Figure 2021192615
＜参照による援用＞
全本明細書で言及される全ての文献、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物
、特許または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかの
ように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書の任
意の定義をはじめとして、本出願が優先される。
＜同等物＞
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形
態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。本発明は、特定の態
様を参照して開示された一方で、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、他
の当業者によって、本発明のその他の態様および多様性が考案されてもよいことは明らか
である。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような外観および同等の多様性を含むもの
と解釈されることが意図される。
その他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (102)

  1. Ｃａｓ９分子を標的化する、ｇＲＮＡ分子。
  2. 前記ｇＲＮＡ分子が、前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列を標的化し、前記Ｃａｓ
    ９分子をコードする前記核酸配列が、Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列をコードする配列、非
    翻訳配列を含むＣａｓ９分子のアミノ酸配列をコードする配列、または非転写配列を含む
    Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列をコードする配列の１つまたは複数を含む、請求項１に記載
    のｇＲＮＡ分子。
  3. 前記Ｃａｓ９分子が、ｅａＣａｓ９分子である、請求項１または２に記載のｇＲＮＡ分
    子。
  4. 前記Ｃａｓ９分子が、ｅｉＣａｓ９分子である、請求項１または２に記載のｇＲＮＡ分
    子。
  5. 前記ｇＲＮＡ分子が、前記Ｃａｓ９分子をコードする前記核酸配列中におけるＣａｓ９
    分子が媒介する切断事象を提供するように構成される、請求項１〜４のいずれか一項に記
    載のｇＲＮＡ分子。
  6. 前記ｇＲＮＡ分子が、前記Ｃａｓ９分子をコードする前記核酸配列中におけるＣａｓ９
    分子が媒介する切断事象を提供するように構成される標的化ドメインを含む、請求項１〜
    ５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  7. 前記ｇＲＮＡ分子が、
    前記核酸配列の前記Ｃａｓ９分子−アミノ酸コード配列を標的化する；
    前記核酸配列の前記Ｃａｓ９分子−アミノ酸コード配列中におけるＣａｓ９分子が媒介
    する切断事象を提供するように構成される；または
    前記核酸配列の前記Ｃａｓ９分子−アミノ酸コード配列中におけるＣａｓ９分子が媒介
    する切断事象を提供するように構成される標的化ドメインを含む、請求項１〜６のいずれ
    か一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  8. 前記ｇＲＮＡ分子が、
    前記核酸配列の非コード配列を標的化する；
    前記核酸配列の非コード配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するよ
    うに構成される；または
    前記核酸配列の非コード配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するよ
    うに構成される標的化ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分
    子。
  9. 前記ｇＲＮＡ分子が、
    前記核酸配列の非翻訳配列を標的化する；
    前記核酸配列の非翻訳配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するよう
    に構成される；または
    前記核酸配列の非翻訳配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するよう
    に構成される標的化ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子
    。
  10. 前記ｇＲＮＡ分子が、
    前記Ｃａｓ９分子−アミノ酸コード領域の５’核酸配列を標的化する；
    前記Ｃａｓ９分子−コード領域の５’核酸配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断
    事象を提供するように構成される；または
    前記核酸配列の前記Ｃａｓ９分子−コード領域の５’Ｃａｓ９分子が媒介する切断事象
    を提供するように構成される標的化ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載
    のｇＲＮＡ分子。
  11. 前記ｇＲＮＡ分子が、
    前記Ｃａｓ９分子−コード領域の３’のＣａｓ９分子をコードする核酸配列を標的化す
    る；
    前記Ｃａｓ９分子−コード領域の３’核酸配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断
    事象を提供するように構成される；または
    前記核酸配列の前記Ｃａｓ９分子−コード領域の３’Ｃａｓ９分子が媒介する切断事象
    を提供するように構成される標的化ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載
    のｇＲＮＡ分子。
  12. 前記ｇＲＮＡ分子が、
    前記核酸配列のプロモーター領域を標的化する、
    前記核酸配列のプロモーター領域中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供す
    るように構成される；または
    前記核酸配列のプロモーター領域中のＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供するよう
    に構成される標的化ドメインを含み、前記プロモーター領域が前記Ｃａｓ９分子アミノ酸
    コード領域と機能的に連結する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  13. 前記ｇＲＮＡ分子が、
    前記核酸配列のＣａｓ９分子イントロン配列を標的化する；
    前記核酸配列のＣａｓ９分子イントロン配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事
    象を提供するように構成される；または
    前記核酸配列のＣａｓ９分子イントロン配列中におけるＣａｓ９分子が媒介する切断事
    象を提供するように構成される標的化ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記
    載のｇＲＮＡ分子。
  14. 前記Ｃａｓ９分子が、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子である、
    請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  15. 前記Ｃａｓ９分子が、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求
    項１〜１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  16. 前記ｇＲＮＡがキメラｇＲＮＡである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｇＲＮ
    Ａ分子。
  17. 前記ｇＲＮＡがモジュラーｇＲＮＡである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｇ
    ＲＮＡ分子。
  18. 支配ｇＲＮＡ分子をコードする配列を含む、核酸。
  19. 前記支配ｇＲＮＡ分子が、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１８に記載
    の核酸。
  20. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子をコードする配列を含む核酸。
  21. 前記核酸が精製されている、請求項２０に記載の核酸。
  22. 請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  23. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２２に記載のベクター。
  24. 前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項２３に記載のベクター。
  25. ａ）支配ｇＲＮＡ分子をコードする第１の核酸配列；および
    ｂ）Ｃａｓ９分子をコードする第２の核酸配列
    を含む核酸。
  26. 前記支配ｇＲＮＡ分子が、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子を含む、請求項２５に記載
    の核酸。
  27. 前記Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子が、前記Ｃａｓ９分子をコードする前記第２の核
    酸配列を標的化する、請求項２６に記載の核酸。
  28. 前記Ｃａｓ９分子がｅａＣａｓ９分子である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載
    の核酸。
  29. 前記Ｃａｓ９分子がｅｉＣａｓ９分子である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載
    の核酸。
  30. 前記ｇＲＮＡ分子が、前記第２の核酸配列中でＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供
    するように構成される、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の核酸。
  31. 前記ｇＲＮＡ分子が、前記第２の核酸配列中でＣａｓ９分子が媒介する切断事象を提供
    するように構成される標的化ドメインを含む、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の
    核酸。
  32. 前記ｇＲＮＡ分子が、請求項７〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子であり、前
    記第２の核酸配列を標的化する、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の核酸。
  33. 構成要素ａ）および構成要素ｂ）が、同一核酸分子上に提供される、請求項２５〜３２
    のいずれか一項に記載の核酸。
  34. 構成要素ａ）および構成要素ｂ）が、異なる核酸分子上に提供される、請求項２５〜３
    ２のいずれか一項に記載の核酸。
  35. 前記核酸から転写されたＣａｓ９標的化ｇＲＮＡが、前記核酸から生成されたＣａｓ９
    分子と複合体を形成するように構成される、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の核
    酸。
  36. 前記複合体が、前記Ｃａｓ９分子配列を含むまたはそれをコードする核酸配列を不活性
    化できる、請求項３５に記載の核酸。
  37. 前記不活性化するステップが、切断するステップを含む。請求項３６に記載の核酸。
  38. 前記第１の核酸配列が第１の制御領域の制御下にあり、前記第２の核酸配列が第２の制
    御領域の制御下にあり、前記第１および第２の制御領域が異なる、請求項２５〜３７のい
    ずれか一項に記載の核酸。
  39. 前記第１および第２の制御領域の１つが構成的プロモーターであり、１つが誘導性プロ
    モーターである、請求項３８に記載の核酸。
  40. 前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が、差次的に発現される、請求項２５〜
    ３９のいずれか一項に記載の核酸。
  41. 前記差次的発現が、発現レベルに関して差次的発現であり、または時間的差次的発現で
    ある、請求項４０に記載の核酸。
  42. ｃ）標的核酸と相補的な標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子をコードする第３の
    核酸配列をさらに含み、前記第２のｇＲＮＡがｂ）を標的化しない、請求項２５〜４１の
    いずれか一項に記載の核酸。
  43. 前記第１の核酸配列が第１の制御領域の制御下にあり；
    前記第２の核酸配列が第２の制御領域の制御下にあり；
    前記第３の核酸配列が第３の制御領域の制御下にあり、
    前記第１の制御領域が前記第２および／または前記第３の制御領域と異なる、
    請求項４２に記載の核酸。
  44. テンプレート核酸配列をさらに含む、請求項２５〜４３のいずれか一項に記載の核酸。
  45. 前記核酸が精製される、請求項２５〜４４のいずれか一項に記載の核酸。
  46. 請求項２５〜４５のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  47. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項４６に記載のベクター。
  48. 前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項４７に記載のベクター。
  49. ａ）支配ｇＲＮＡ分子または支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸
    を含む、組成物。
  50. ｂ）Ｃａｓ９分子または前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列；
    ｃ）第２のｇＲＮＡ分子または前記第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸；および
    ｄ）テンプレート核酸
    の１つまたは複数を含む、請求項４９に記載の組成物。
  51. 前記支配ｇＲＮＡ分子が、Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子を含む、請求項４９または
    ５０に記載の組成物。
  52. 前記Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡが、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ
    分子を含む、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記支配ｇＲＮＡ分子が、前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列中におけるＣａｓ９
    分子が媒介する切断事象を提供するように構成される、請求項５０〜５２のいずれか一項
    に記載の組成物。
  54. Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子と、前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸とを含む、請
    求項４９〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
  55. Ｃａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子と、前記Ｃａｓ９分子とを含む、請求項４９〜５４の
    いずれか一項に記載の組成物。
  56. ｃ）第２のｇＲＮＡ分子または前記第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸
    をさらに含む、請求項４９〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
  57. 前記第２のｇＲＮＡが、Ｃａｓ９分子を標的核酸に標的化する、請求項５６に記載の組
    成物。
  58. ｄ）テンプレート核酸
    をさらに含む、請求項４９〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
  59. 前記テンプレート核酸が、前記第２のｇＲＮＡによって配置された切断の修復を媒介す
    るように構成される、請求項５８に記載の組成物。
  60. ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）のそれぞれが、核酸として存在し、同一核酸分子上でコ
    ードされる、請求項４９〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
  61. ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）から選択される第１の配列が、第１の核酸分子上でコー
    ドされ、ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）から選択される第２の配列が、第２の核酸分子上
    でコードされる、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
  62. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子；
    請求項１８〜２１または２５〜４５のいずれか一項に記載の核酸；
    請求項２２〜２４または４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター；または
    請求項４９〜６１のいずれか一項に記載の組成物
    を含む医薬品。
  63. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子；
    請求項１８〜２１または２５〜４５のいずれか一項に記載の核酸；
    請求項２２〜２４または４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター；または
    請求項４９〜６１のいずれか一項に記載の組成物
    を含む、細胞。
  64. 前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列と、
    支配ｇＲＮＡ分子と
    を含み、前記Ｃａｓ９分子をコードする配列が、前記Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列をコー
    ドする配列、非翻訳配列を含む前記Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列をコードする配列、およ
    び非転写配列を含む前記Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列をコードする配列の１つまたは複数
    を含む、請求項６３に記載の細胞。
  65. 前記支配ｇＲＮＡ分子が、前記Ｃａｓ９分子をコードする前記核酸配列を標的化するｇ
    ＲＮＡ分子を含む、請求項６４に記載の細胞。
  66. 前記ｇＲＮＡ分子が、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子である、請
    求項６３〜６５のいずれか一項に記載の細胞。
  67. Ｃａｓ９分子をさらに含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の細胞。
  68. 第２のｇＲＮＡ分子または前記第２のｇＲＮＡをコードする核酸分子をさらに含む、請
    求項６３〜６７のいずれか一項に記載の細胞。
  69. 前記第２のｇＲＮＡが、Ｃａｓ９分子を標的核酸に標的化する、請求項６８に記載の細
    胞。
  70. テンプレート核酸をさらに含む、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の細胞。
  71. 前記テンプレート核酸が、前記第２のｇＲＮＡ分子によって配置された前記標的核酸中
    の切断の修復を媒介するように構成される、請求項７０に記載の細胞。
  72. 第２のｇＲＮＡ分子により媒介された前記Ｃａｓ９分子の標的化によって切断される標
    的核酸を含む、請求項６８〜７１のいずれか一項に記載の細胞。
  73. 切断および修復されている標的核酸を含む、請求項６３〜７２のいずれか一項に記載の
    細胞。
  74. 前記修復が、テンプレート核酸媒介修復を含む、請求項７３に記載の細胞。
  75. 前記Ｃａｓ９分子をコードする前記核酸配列が切断されていない、請求項６３〜７４の
    いずれか一項に記載の細胞。
  76. 前記Ｃａｓ９分子をコードする前記核酸配列が、Ｃａｓ９分子を発現する、請求項７５
    のいずれか一項に記載の細胞。
  77. 前記Ｃａｓ９分子をコードする前記核酸配列が、Ｃａｓ９分子のｇＲＮＡ媒介標的化に
    よって切断されている、請求項６３〜７４のいずれか一項に記載の細胞。
  78. 前記Ｃａｓ９分子をコードする前記切断された核酸配列が、切断されていない同一分子
    と比較して、Ｃａｓ９分子を発現する低下した能力を有する、請求項７７に記載の細胞。
  79. 前記Ｃａｓ９分子をコードする前記切断された核酸配列が、実質的にＣａｓ９分子を発
    現できない、請求項７７に記載の細胞。
  80. 前記Ｃａｓ９分子をコードする切断された核酸配列；および
    Ｃａｓ９分子が媒介する切断事象が修復されている標的核酸
    を含む、請求項７９に記載の細胞。
  81. 前記細胞が、脊椎動物、哺乳類、齧歯類、ヤギ、ブタ、鳥類、ニワトリ、シチメンチョ
    ウ、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、霊長類、またはヒト細胞である、請求項６３〜８０のい
    ずれか一項に記載の細胞。
  82. 前記細胞が植物細胞である、請求項６３〜８０のいずれか一項に記載の細胞。
  83. 前記植物細胞が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項８２に記載の細胞。
  84. 前記細胞がヒト細胞である、請求項６３〜８０のいずれか一項に記載の細胞。
  85. 前記細胞が、体細胞、胚芽細胞、または出生前細胞である、請求項８１に記載の細胞。
  86. 前記細胞が、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減
    数分裂コンピテント細胞である、請求項８１に記載の細胞。
  87. 前記細胞を
    請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子；
    請求項１８〜２１または２５〜４５のいずれか一項に記載の核酸；
    請求項２２〜２４または４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター；または
    請求項４９〜６１のいずれか一項に記載の組成物
    の有効量に接触させるステップを含む、細胞または細胞の標的核酸を改変する方法。
  88. 前記改変するステップが、前記標的核酸の構造を改変するステップを含む、請求項８７
    に記載の方法。
  89. 前記改変するステップが、前記標的核酸の配列を改変するステップを含む、請求項８８
    に記載の方法。
  90. 細胞または対象を
    請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子；
    請求項１８〜２１または２５〜４５のいずれか一項に記載の核酸；
    請求項２２〜２４または４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター；または
    請求項４９〜６１のいずれか一項に記載の組成物
    の有効量に接触させるステップを含む、対象を治療する方法。
  91. 前記細胞または前記対象内で、標的核酸の構造を改変するステップを含む、請求項９０
    に記載の方法。
  92. 前記標的核酸の配列を改変するステップを含む、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記細胞が、脊椎動物、哺乳類、齧歯類、ヤギ、ブタ、鳥類、ニワトリ、シチメンチョ
    ウ、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、霊長類、またはヒト細胞である、請求項８７〜９２のい
    ずれか一項に記載の方法。
  94. 前記細胞が植物細胞である、請求項８７〜９２のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記植物細胞が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記細胞がヒト細胞である、請求項８７〜９２のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記細胞が、体細胞、胚芽細胞、または出生前細胞である、請求項９３に記載の方法。
  98. 前記細胞が、接合体、胚盤胞または胎芽細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減
    数分裂コンピテント細胞である、請求項９３に記載の方法。
  99. 前記対象が、哺乳類、霊長類、またはヒトである、請求項９０〜９９のいずれか一項に
    記載の方法。
  100. 前記標的核酸が染色体核酸である、請求項８７〜９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 細胞と、
    請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子；
    請求項１８〜２１または２５〜４５のいずれか一項に記載の核酸；
    請求項２２〜２４または４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター；または
    請求項４９〜６１のいずれか一項に記載の組成物と
    を含む反応混合物。
  102. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子；
    請求項１８〜２１または２５〜４５のいずれか一項に記載の核酸；
    請求項２２〜２４または４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター；または
    請求項４９〜６１のいずれか一項に記載の組成物
    を含む、キット。
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