CN105683752B - 基于异常活化细胞检测的恶性肿瘤的检查方法及去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置 - Google Patents

基于异常活化细胞检测的恶性肿瘤的检查方法及去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，其通过去除血液中的异常活化细胞，特别是异常活化白血球或白血病前驱细胞，对白血病的发病进行抑制或治疗。将由于原卟啉IX高浓度蓄积而能够识别的血液中的白血病细胞等异常活化细胞去除的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，具备：一端具备有采血用的穿刺针的采血用管线；从由该采血用管线供给的血液中分离红血球部分和白血球部分的离心分离器；对于分离的白血球部分，通过细胞分选仪去除异常活化细胞的细胞分选仪；对去除了异常活化细胞的正常白血球部分，照射规定波长的光的光照射器；血液循环回输由除白血球部分以外的血液成分组成的血液循环回输液和血液循环回输用的正常白血球部分的血液循环回输用管线。

Description

基于异常活化细胞检测的恶性肿瘤的检查方法及去除异常活 化细胞血液循环回输治疗装置
技术领域
本发明涉及基于异常活化细胞检测的恶性肿瘤的检查方法及去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置。更详细的，涉及通过去除异常活化细胞来抑制或治疗白血病的发病的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置。
本申请，要求通过参照而在此被引用的日本申请，特愿2013-130758号的优先权。
背景技术
近来，在日本，白血病的发生率有逐年增加的趋势。因白血病死亡的人数，在2008年约为11,156人，每10万人口中为8.8人(男性10.5人，女性7.1人)。
特别是，已知成人T细胞白血病/淋巴瘤(adult T-cell leukemia/lymphoma：ATLL)是难治性白血病/淋巴瘤。在其致病病毒的人T细胞白血病病毒I型(Human T-cellleukemia virus type I：HTLV-I)的携带者中，在日本一年约有700例发病。特别是，每1,000个HTLV-I携带者的年ATLL发病率，男性为1.0-1.5人、女性为0.5-0.7人，进一步的，30岁以上的HTLV-I携带者的终生发病率，男性为4-7％，女性为2％左右。现在，在日本约有108万携带者，全世界约有2,000万携带者。
ATLL，被认为是由于HTLV-I感染CD4阳性T细胞，并在细胞与细胞之间感染，在较长的潜伏期中逃避免疫系统而进行的克隆，积累基因异常、染色体异常、表观遗传异常等，使细胞肿瘤化而发病。HTLV-I携带者中的3-5％，在感染HTLV-I后40-60年内ATLL发病。而且，感染途径主要有母乳感染、输血、性交。
1991年，提出从预后因子分析和临床病情的特征出发，根据白血化、脏器浸润、高LDH血症、高Ca血症的有无及程度，将ATLL分成急性型、淋巴瘤型、慢性型、冒烟型这四种病型，根据最近的报告，其中位生存期为急性型11个月、淋巴瘤型20个月、慢性型24个月、冒烟型3年以上。虽然最近的化学疗法和同种造血干细胞移植(allo-HSCT)的治疗成果有所改善，但是和其他白血病相比依然预后不良。根据ATLL患者的不同临床病型的生存曲线，急性型及淋巴瘤型ATLL患者的生存率，从开始观察起一年之内降低到50％以下。患者中男性稍多，日本的发病年龄的中位值为67岁，不足40岁发病的很少。
这样的难治性ATLL的以往的诊断方法，除了鉴定患者的外周血中的感染HTLV-I的肿瘤细胞以外，以多有淋巴结肿大、肝脾肿大、高钙血症、皮肤病变，多并发有机会性感染症等的ATLL的特异性临床症状为基准。
但是，这样的方法，特别是急性型或淋巴瘤型ATLL，只有在发病且开始出现症状的阶段才能进行诊断，由于无法在早期对它们进行诊断，存在耽误治疗的可能性。而且，通过抗癌剂的治疗由于抗性而预后不良。
专利文献1公开了以下方法：在为了推定ATLL的预后而进行的数据收集中，针对外周血单个核细胞(PBMC)的特定的基因群，测定这些基因的启动子区域中的CpG岛的甲基化状态。该方法涉及制作用于ATLL预后推定的数据，通过在制作该基因的启动子区域中的CpG岛的甲基化图谱的同时，算出CIMP(CpG island methylator phenotype，即CpG岛甲基化表型)作为预后因子，并表示出根据由甲基化基因、甲基化基因数及CIMP值算出的ATLL发病/发展的危险度评分得出的危险度分级和/或特定的基因的甲基化状态，能够预测HTLV-I携带者的发病，或者惰性(indolent)型(缓慢进行型)的冒烟型及慢性型ATLL向侵袭(aggressive)型(高恶性型)的急性型及淋巴瘤型ATLL的发展。
高恶性度的急性型或淋巴瘤型ATLL及具有预后不良因子的慢性型ATLL，适合化学疗法，但是由于对非霍奇金淋巴瘤的标准治疗方法(CHOP疗法)等有抗性，因此并用G-CSF(粒细胞集落刺激因子)，在短治疗间隔下反复进行强力的化学疗法。
另一方面，对于低恶性度的冒烟型或不具有预后不良因子的慢性型ATLL，其原则是对皮肤病变进行局部处理，与慢性淋巴性白血病等疾病同样地在急性转化之前不进行化学疗法而是持续观察，但是其长期预后并不好。近年来，虽然allo-HSCT是通过宿主方抗ATL效应，可以期待长期生存，应该深入研究的治疗方法，但是通常的allo-HSCT也存在难以治疗的宿主、疾病，也存在在高龄者等中由于胸腺萎缩，T细胞的产生能力低，容易引起免疫缺陷或间质性肺炎等的问题。在接受了同种移植的情况下，还存在移植物抗宿主病(GVHD)的危险性的问题，这是常见的并发症，来自供体的淋巴细胞认为患者的脏器不是自己的而进行攻击，试图将其排除。而且，今后抗体医药等新型治疗方法的开发虽然值得期待，但是更希望开发出预后效果良好的治疗方法。
据报道，通过作为光敏感性物质的卟啉关联化合物的生理前驱体的5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid(5-ALA))的给药，经过血红素代谢途径，原卟啉IX(PpIX)在组织细胞性淋巴瘤培养细胞中大量蓄积，产生强荧光。据报道，正在研究利用该性质，将通过5-ALA的给药而产生强PpIX荧光的白血病细胞从健康正常细胞中识别出来，认为在5-ALA依存性光动力学治疗法(PDT:Photo-Dynamic Therapy)中，向蓄积在靶向肿瘤细胞中的PpIX进行光照射而生成的单重态氧等活性氧类(ROS)能够特异性诱导肿瘤细胞的细胞死亡(非专利文献1)。
另一方面，专利文献2公开了对于虽然不是白血病，但是血液中的非水溶性的间接(非结合型)胆红素代谢缺陷的患者，通过在人工透析时向从人体取出的血液照射规定波长的光，使其转换成水溶性的直接胆红素，以降低非水溶性的间接胆红素浓度的方法。在体内由血红素形成的非水溶性的间接胆红素，通常在肝脏中被转换成水溶性的直接(结合型)胆红素，并通过肾脏排出，但是已知若出现肝功能不全等则不能进行向水溶性的直接胆红素的转换，血中的非水溶性的间接胆红素浓度会升高。非水溶性的间接胆红素，通过规定波长的光的照射能够转换成水溶性的直接胆红素，对于由于肝功能不全等造成非水溶性的间接胆红素浓度升高的患者来说，通过照射该光使其转换成水溶性的直接胆红素，能够降低非水溶性的间接胆红素的浓度。
对于ATLL发病危险性高的HTLV-I携带者以及在慢性型ATLL或冒烟型ATLL这种低恶性度ATLL中向高恶性度的急性型及淋巴瘤型ATLL急性转化(发展)的可能性高的患者或具有预后不良因子的慢性型ATLL患者来说，希望开发出在早期检测出发病/发展的危险度的方法，并且在发病后也能够避免预后不良的有效的治疗方法。该方法的开发，对于发病可能性低的HTLV-I携带者及病情发展的可能性低的低恶性度ATLL患者来说，将尽可能地消除发病/发展的不安，也关系到生活质量(QOL)的改善。
现有技术文献
专利文献
专利文献1日本特开2009-254357号公报
专利文献2日本特开2004-358243号公报
非专利文献
非专利文献1冈山学院大学/冈山短期大学纪要34，1-14，2011
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的课题在于提供一种恶性肿瘤的检查方法。而且，课题在于提供一种从血液样本中去除异常活化细胞的方法、去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置及使用去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置的肿瘤的治疗方法。
在造血器官肿瘤中，成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)是极为预后不良的难治性白血病/淋巴瘤。虽然一直在进行同种造血干细胞移植(allo-HSCT)、新型抗体医药等的新型治疗方法的开发，但是对于具有在高龄者中发病频率高这一特征的本疾病来说，存在移植干细胞的供给的问题，将对患者负担大的治疗方法排除在应用之外的情况也不少见，还存在治疗抵抗性患者多的问题。
本发明的课题在于提供一种能够低侵袭性、对患者的负担小，特异性高效率地去除白血病细胞的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置。
解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明人着眼于通过使PpIX蓄积在血液中的白血病细胞等异常活化细胞中，从而能够识别该异常活化细胞，经过反复深入研究，结果完成了涉及特异性去除血液中的白血病细胞等异常活化细胞的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置的发明。
本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，具备：
一端具备有采血用的穿刺针的采血用管线；
从由该采血用管线供给的血液中分离白血球部分的离心分离器；
从由该离心分离器分离的白血球部分中去除异常活化细胞的细胞分选仪；
对由该细胞分选仪去除了异常活化细胞的正常血球部分，照射规定波长的光的光照射器；
血液回输由除离心分离器分离的白血球部分以外的血液成分所组成的血液循环回输液和用光照射器照射过光的血液循环回输用的正常白血球部分的血液循环回输用管线。
另外，本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置的特征在于，在通过采血用管线采集的血液中，通过在2-48小时前，优选在2-12小时前向患者给药5-ALA，使PpIX在含有肿瘤细胞的异常活化细胞中蓄积，并用光照射器向含有异常活化细胞的血液照射波长为350-490nm或600-700nm的光。
即，本发明由以下构成：
1.一种恶性肿瘤的检查方法，其特征在于，对采集的血液样本，分析其异常活化细胞和肿瘤标志物阳性细胞的分布模式。
2.根据前项1所述的恶性肿瘤的检查方法，异常活化细胞为PpIX阳性细胞。
3.根据前项1或2所述的恶性肿瘤的检查方法，恶性肿瘤为造血器官肿瘤、癌瘤或肉瘤，在为造血器官肿瘤的情况下，肿瘤标志物是由TSLC1、CD3、CD13、CD19、CD20、CD10、CD13、CD7、CD56及HLA-D组成的免疫学标志物中的任意一种，在为癌瘤或肉瘤的情况下，肿瘤标志物是选自细胞角蛋白19-9(CA19-9)、CEA、NSE、PSA、TPA、AFP、SCC、PTH、TSH中的任意一种。
4.根据前项1-3中任一项所述的恶性肿瘤的检查方法，造血器官肿瘤为ATLL。
5.根据前项4所述的检查方法，采集的血液样本的供体为HTLV-I携带者或ATLL患者，恶性肿瘤的检查为用于ATLL发病危险度预测和/或发展确认的检查。
6.根据前项5所述的检查方法，ATLL的发展确认，是对ATLL的(A)冒烟型、(B)慢性型或(C)急性型中的任意一种的发展确认。
7.一种从样本中去除异常活化细胞的方法，对采集的血液样本，以波长为350-490nm和/或600-700nm的光进行照射，检测出样本中存在的PpIX阳性细胞，通过对该PpIX阳性细胞的上述光照射诱发细胞死亡，从而从样本中去除异常活化细胞。
8.根据前项7所述的去除异常活化细胞的方法，包含以下的工序：
1)对采集的血液样本，通过离心分离操作，分离红血球部分和白血球部分的工序；
2)对上述分离的白血球部分，以波长为350-490nm和/或600-700nm的光进行照射，检测出PpIX阳性细胞，通过对该PpIX阳性细胞的上述光照射诱发细胞死亡，从而从血液样本中去除异常活化细胞的工序；
3)在上述2)的从白血球部分中去除了异常活化细胞的剩余白血球部分中整合上述1)中分离的红血球部分的工序。
9.根据前项8所述的去除异常活化细胞的方法，上述2)的光照射，是针对含有5-ALA的白血球部分进行的。
10.根据前项7或8所述的去除异常活化细胞的方法，异常活化细胞为恶性肿瘤细胞、慢性炎症性细胞、免疫异常细胞中的任意一种。
11.根据前项10所述的去除异常活化细胞的方法，其特征在于，异常活化细胞为恶性肿瘤细胞，对采集的血液样本，使用根据前项1-6中任一项所述的检查方法进行检查，收集分类于恶性肿瘤细胞的细胞，对该收集的细胞以波长为350-490nm或600-700nm的光进行照射。
12.根据前项10或11所述的去除异常活化细胞的方法，恶性肿瘤为造血器官肿瘤，异常活化细胞为异常活化白血球。
13.根据前项12所述的去除异常活化细胞的方法，造血器官肿瘤为ATLL。
14.一种去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，包含以下的a)～e)，并包含用于实施根据前项7-13中任一项所述的去除异常活化细胞的方法的机构：
a)一端具备有采血用的穿刺针的采血用管线；
b)从由该采血用管线供给的血液中分离红血球部分和白血球部分的离心分离器；
c)从由该离心分离器分离的上述白血球部分中去除上述异常活化细胞的细胞分选仪；
d)对由上述c)的细胞分选仪去除了上述异常活化细胞的正常白血球部分，以波长为350-490nm和/或600-700nm的光进行照射的用于照射光的光照射器。
e)血液循环回输由除上述离心分离器分离的上述白血球部分以外的血液成分所组成的血液循环回输液和用上述光照射器照射过光的血液循环回输用的正常白血球部分的血液循环回输用管线。
15.根据前项14所述的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，上述e)的血液循环回输用管线，进一步与f)人工透析装置连接。
16.一种造血器官肿瘤的治疗方法，其特征在于，使用根据前项14或15所述的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，从血液样本中去除异常活化细胞，并将去除该异常活化细胞后的血液样本回输给生物体。
发明效果
根据本发明的检查方法，能够有效地检测出恶性肿瘤细胞。通过确认恶性肿瘤细胞的流式细胞仪图谱，能够把握肿瘤的发病/发展的危险度。
根据本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，不仅是通过细胞分选仪去除白血病细胞等异常活化细胞，通过光照射器的光照射，诱导残存的恶性肿瘤细胞、慢性炎症性细胞、自身免疫疾病中的自身抗原反应细胞等的免疫异常细胞等的异常活化细胞的细胞死亡，能够将异常活化细胞残存的可能性降低到极限。也就是说，通过本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，例如能够像成分输血那样从采集自患者的血液中仅去除异常活化细胞，并将正常血球成分、血小板、血浆再次返回给患者，能够对例如白血病的治疗做出贡献。
特别是，根据本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，在由离心分离器及细胞分选仪进行的分离中，通过设定PpIX产生的荧光强度的临界值，能够在原理上基本去除异常活化细胞。假设即使在正常细胞部分中混杂有混入的异常活化细胞，由于进一步的光照射也能够通过细胞死亡诱导去除98.7％的异常活化细胞，通过连续进行两者能够高效率地去除大部分的异常活化细胞。
附图说明
图1表示的是向TLOm1(ATLL白血病细胞株)给药1mM的5-ALA后的PpIX蓄积随时间经过的测定结果。(参考例1)
图2表示的是针对健康正常人的外周血单个核细胞(PBMC)、TLOm1(ATLL白血病细胞株)及ED-40515(ATLL白血病细胞株)，对其添加1mM的5-ALA后并培养48小时后的PpIX蓄积，通过流式细胞仪进行分析的结果。(参考例1)
图3表示的是针对接触性皮肤炎患者的外周血单个核细胞(PBMC)、用CD3/CD28免疫珠(CD3/CD28immuno-beads，Dynabeads(R)human T-cell activator CD3/CD28(Invitrogen，Oregon，USA))刺激活化后的接触性皮肤炎患者的外周血单个核细胞(PBMC)、TLOm1(ATLL白血病细胞株)及ED-40515(ATLL白血病细胞株)，对其给药1mM的5-ALA后并培养48小时后的PpIX蓄积，通过流式细胞仪进行分析的结果。(参考例1)
图4表示的是针对来自(1)健康正常人、(2)低危险度HTLV-I携带者、(3)中危险度HTLV-I携带者、(4)高危险度HTLV-I携带者、(5)冒烟型ATLL患者、(6)慢性型ATLL患者及(7)急性型ATLL患者的外周血，对其PpIX荧光强度和作为白血病标志物的TSLC1表达强度的细胞分布模式，通过流式细胞仪进行分析的结果。(实施例2)
图5表示的是本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置的概念。(实施例1)
图6表示的是在本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置上连接了透析装置的概念。(实施例1)
图7表示的是对在1mM 5-ALA的存在下培养48小时后照射Na-Li灯的光，由此来实施光动力学治疗方法的TLOm1(ATLL白血病细胞株)或慢性型ATLL患者的外周血单个核细胞(PBMC)，进行PI(Propidium iodide)染色及Annexin-V-FITC染色的双重染色，用流式细胞仪调查的细胞死亡模式的结果。(实施例3)
图8表示的是使用实施例1的装置，对慢性型ATLL患者的外周血进行了5-ALA处理时的结果。表示的是在对从慢性型ATLL患者的血液中分离的外周血单个核细胞(PBMC)在1mM 5-ALA的存在下培养48小时后照射Na-Li灯的光，由此来实施光动力学治疗方法的情况下，特异性细胞死亡诱导的流式细胞仪的分析结果。表示通过该处理，正常外周血单个核细胞(PBMC)的生存率为77.5％，与此相对，ATLL白血病细胞的生存率为1.3％，ATLL白血病细胞发生了特异性的细胞死亡。(实施例4)
图9表示的是在向慢性型ATLL患者的外周血全血中添加1mM的5-ALA并培养48小时后照射Na-Li灯的光，由此来实施光动力学治疗方法的情况下，特异性细胞死亡诱导的流式细胞仪的分析结果。表示的是用流式细胞仪对慢性型ATLL白血球部分和正常单核细胞部分中PpIX荧光强度和作为白血病标志物的TSLC1表达强度的细胞分布模式进行分析的结果，通过该处理，98.83％的ATLL白血病细胞由于细胞死亡而被去除，由此成为99.50％是由正常细胞构成的外周血单个核细胞(PBMC)。(实施例5)
图10表示的是对于各种株化培养造血器官肿瘤细胞，对其涉及PpIX阳性细胞和肿瘤标志物的表达的细胞分布模式通过流式细胞仪进行分析的结果。(实施例6)
图11表示的是对于各种株化培养恶性肿瘤细胞，对其涉及PpIX阳性细胞和肿瘤标志物的表达的细胞分布模式通过流式细胞仪进行分析的结果。(实施例6)
图12表示的是对于各种株化培养癌细胞，对其涉及PpIX阳性细胞和肿瘤标志物的表达的细胞分布模式通过流式细胞仪进行分析的结果。(实施例6)
具体实施方式
本发明的恶性肿瘤的检查，可以通过以下的1)～3)的工序进行。
1)针对采集的血液样本检测出PpIX阳性细胞的工序；
2)针对采集的血液样本检测出肿瘤标志物阳性细胞的工序；
3)对在上述1)及2)中分别得到的PpIX阳性细胞及肿瘤标志物阳性细胞的分布模式进行分析的工序。
“PpIX(原卟啉IX)”是光敏感性物质的一种，是在线粒体内由卟啉关联化合物的生理前驱体合成的物质。“卟啉关联化合物的生理前驱体”，例如可列举为作为血红素合成的前驱体物质的氨基酸的5-ALA(5-氨基酮戊酸)，但是不特别限定于此，只要是光敏感性物质且产生强荧光的生理前驱体就可以。
在本说明书中，“PpIX阳性细胞”，是指通过从外部过度给药5-ALA等的卟啉关联化合物的生理前驱体而蓄积PpIX的细胞。已知PpIX选择性的蓄积在恶性肿瘤细胞、慢性炎症性细胞、自身免疫疾病中的自身抗原反应细胞等的免疫异常细胞中，特别是选择性的高浓度蓄积在恶性肿瘤细胞中。PpIX具有以下性质，通过照射在波长350-490nm，优选波长400-490nm或波长600-700nm，优选波长610-640nm处具有波峰的激发光，可呈现在波长600-700nm，优选波长620-650nm，更优选波长635nm处具有波峰的红色荧光，被临床应用在广泛领域的肿瘤组织的光动力学诊断(Photodynamic diagnosis；PDD)中。图1表示的是向TLOm1(ATLL白血病细胞株)给药1mM的5-ALA后的PpIX阳性细胞的蓄积随时间经过的测定结果。可知给药后，经过48小时PpIX浓度达到上限。
图2表示的是针对健康正常人的外周血单个核细胞(PBMC)、TLOm1(ATLL白血病细胞株)及ED-40515(ATLL白血病细胞株)，对其给药1mM的5-ALA后培养48小时后的PpIX荧光强度，通过流式细胞仪进行分析的结果。图1-3的结果是，通过5-ALA的给药，观察到肿瘤特异性的PpIX蓄积。而且，图3表示的是针对接触性皮肤炎患者的外周血单个核细胞(PBMC)、用CD3/CD28免疫珠(CD3/CD28immuno-beads，human T-cell activator CD3/CD28(Invitrogen))刺激活化后的接触性皮肤炎患者的外周血单个核细胞(PBMC)、TLOm1(ATLL白血病细胞株)及ED-40515(ATLL白血病细胞株)，对其给药1mM的5-ALA后培养48小时后的PpIX蓄积，通过流式细胞仪进行分析的结果。由此，可知在接触性皮肤炎患者的外周血单个核细胞(PBMC)中，存在正常外周血单个核细胞(PBMC)部分和稍微活化的PpIX荧光强度高的部分。进一步的，可知若使用CD3/CD28免疫珠对T细胞施加强刺激，PpIX荧光强度高的部分则被进一步诱导。图1-3的结果是，由于5-ALA的给药，观察到肿瘤细胞及活化的淋巴细胞特异性的PpIX的高度蓄积。
在本说明书中，“异常活化细胞”是指病态细胞，例如可列举为恶性肿瘤细胞、慢性炎症性细胞、自身免疫疾病中的自身抗原反应细胞等的免疫异常细胞。在本说明书中，将由于5-ALA的添加或给药而在5-ALA的存在下发出强PpIX荧光的细胞也称为“异常活化细胞”。在上述中，“恶性肿瘤”可以是“造血器官肿瘤”或“癌瘤(上皮瘤：carcinoma)、肉瘤(sarcoma)”中的任意一种，并没有特别限定，优选列举为“造血器官肿瘤”。作为“造血器官肿瘤”，可列举白血病、淋巴瘤。白血病大致分为急性白血病及慢性白血病，分别分为由骨髓系细胞发生的骨髓性白血病和由淋巴细胞系细胞发生的淋巴性白血病。具体可列举为急性骨髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia：AML)、急性淋巴性白血病(Acute LymphoblasticLeukemia：ALL)、慢性骨髓性白血病(Leukemia：CML)、慢性淋巴性白血病(ChronicLymphoblastic Leukemia：CLL)等。而且，ATLL可列举为其他白血病。在本说明书中，特别作为检查及治疗对象的是ATLL。ATLL，如背景技术一项中所示，HTLV-I是其致病病毒。
在本发明中，为了检查及治疗而采集的样本为血液样本。采集的血液样本，虽然可以直接进行光照射，但是优选通过以下的工序进行处理：
1)对采集的血液样本通过离心分离操作分离红血球部分和白血球部分。
2)对该分离的白血球部分，照射波长为350-490nm或600-700nm的光。
3)光照射后，检测出聚集的PpIX阳性细胞。在本说明书中，将含有白血病细胞等造血器官肿瘤的表现出异常增殖能力的白血球称为“异常活化白血球”。
在本说明书中，肿瘤标志物，只要是针对肿瘤的特定的肿瘤标志物就可以，并没有特别限定。例如，对于造血器官肿瘤来说，在患者的外周血单个核细胞(PBMC)或多核白血球部分中，除了作为细胞表面标志物的TSLC1以外，还可列举为CD3、CD13、CD19、CD20、CD10、CD13、CD7、CD56、HLA-DR等的免疫学标志物。作为ATLL白血病细胞特异性地表达亢进的细胞表面标志物，可列举为TSLC1。作为癌瘤(上皮瘤)、肉瘤的肿瘤标志物，可列举为本身已知的细胞角蛋白19-9(CA19-9)、CEA、NSE、PSA、EMA、AFP、SCC、PTH、TSH，但并没有特别限定。
根据将本发明的“PpIX阳性细胞的检测”及“肿瘤标志物阳性细胞的检测”组合的检查方法，与分别单独进行相比，能够更确切地检测出恶性肿瘤化的细胞。通过对“PpIX阳性细胞”及“肿瘤标志物阳性细胞”使用流式细胞仪，确认细胞分布模式(流式细胞仪图谱)，从而对于恶性肿瘤的发病/发展，能够预测或把握进度。
例如，图4表示的是针对来自ATLL患者的外周血，由PpIX测定值和作为肿瘤标志物的TSLC1的测定值，对其细胞分布模式通过流式细胞仪进行分析的结果。与(1)的健康正常人的情况下，细胞聚集在左下方的TSLC1(-)/PpIX(-)模式相对，在HTLV-I携带者中，从(2)几乎和健康正常人没有不同的TSLC1(-)/PpIX(-)模式的低危险度HTLV-I携带者、(3)TSLC1(+)/PpIX(-)的部分正在逐渐增加的中危险度HTLV-I携带者，到(4)几乎与冒烟型ATLL的模式没有差别的高危险度HTLV-I携带者，随着发病危险度逐渐增高，可看到细胞分布模式上的变化。意味着特别是在高危险度HTLV-I携带者中存在多个显示出TSLC1(+)/PpIX(+)的白血病细胞特有图谱的细胞群，可知若免疫监视机构的状态恶化，则发病危险度高。这样的携带者，通过确认血液样本中的细胞分布模式(流式细胞仪图谱)，能够预测ATLL的发病，能够在早期开始与病情发展相适应的抢先治疗。
而且，可看到ATLL的冒烟型、慢性型或急性型如图4的(5)-(7)的模式那样逐渐变化，从TSLC1(+)/PpIX(-)细胞增加，向TSLC1(+)/PpIX(+)白血病细胞的转移。对于冒烟型、慢性型这样的低恶性度ATLL，也能够通过监控从TSLC1(+)/PpIX(-)细胞向TSLC1(+)/PpIX(+)白血病细胞的转移，在早期检测出向高恶性度ATLL的急性转化(发展)。通过分析各个患者样本的模式，能够详细地把握ATLL发病/发展的危险度及进度、疾病类型，通过实施抢先治疗，还可以展望预防发病/发展的可能性。
恶性肿瘤的发病/发展的危险度或进度，例如可以将以下作为指标来进行预测或把握。将恶性肿瘤的发病/发展的危险度或进度的指标定为RF(RF：RiskFactor)，RF值可以按照以下方式导出。例如，对于图4所示的流式细胞仪图谱，认为：
(A)LL：Lower Left(PpIX(-)，TSLC1(-))(左下)区域的细胞数
(B)LR：Lower Right(PpIX(-)，TSLC1(+))(右下)区域的细胞数
(C)UR：Upper Right(PpIX(+)，TSLC1(+))(右上)区域的细胞数
RF＝0.01×(LL/total count)+10×(LR/total count)+100×(UR/total count)
总细胞数(total count)：10,000个细胞
健康正常人：LL＝100％ RF＝0.01
中危险度HTLV-I携带者：在LL＝50％，LR＝50％时RF＝5.05
高危险度HTLV-I携带者：在LL＝50％，LR＝45％，UR＝5％时RF＝9.55
急性型ATLL患者：在UR＝100％时RF＝100
另外，上述RF值为示例，可以由(A)(B)(C)的细胞数适宜决定。恶性肿瘤的发病/发展的危险度或进度的指标RF(RF：Risk Factor)，在ATLL的情况下，可以在以下的范围内评价。
健康正常人：0.01<RF<1.00
低危险度HTLV-I携带者：0.01<RF<2.50
中危险度HTLV-I携带者：2.00<RF<6.00
高危险度HTLV-I携带者：3.50<RF<20.00
冒烟型ATLL：4.00<RF<30.00
慢性型ATLL：5.00<RF<80.00
急性型ATLL：20.00<RF<100.00
另外，本发明还涉及恶性肿瘤细胞的去除方法。恶性肿瘤细胞的去除方法中的“恶性肿瘤”是指造血器官肿瘤、癌瘤或肉瘤的任意一种，但是特别优选造血器官肿瘤。对采集的样本，以波长为350-490nm或600-700nm的光进行照射，检测出PpIX阳性细胞，通过对该阳性细胞的上述光照射诱发细胞死亡，能够去除恶性肿瘤细胞。为了检测出PpIX阳性细胞，优选含有卟啉关联化合物的生理前驱体的，具体含有5-ALA的样本。含有5-ALA的样本，可以在采集样本前预先给药，也可以在采集样本后给药，但是优选在采集样本前预先给药。已证明，5-ALA即使用于口服给药或静脉注射安全性也很高。通过预先向患者给药5-ALA，能够事先产生向白血病细胞等异常活化细胞的PpIX的蓄积。由于使PpIX在白血病细胞等异常活化细胞中蓄积需要一些时间，因此最好在检查的2日前，至少2小时前给药5-ALA。
本发明还涉及用于从采集的血液样本中去除含有造血器官肿瘤的异常活化细胞的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置。本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，为去除血液中的异常活化细胞的装置，特别是，通过使PpIX蓄积，在恶性肿瘤细胞、慢性炎症性细胞、免疫异常细胞中选择性蓄积，特别是能够识别恶性肿瘤细胞等的异常活化细胞，例如白血病细胞或白血病前驱细胞，从而能够有效地去除。
本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置由以下构成：
a)一端具备有采血用的穿刺针的采血用管线；
b)从由该采血用管线供给的血液中分离红血球部分和白血球部分的离心分离器；
c)从由该离心分离器分离的上述白血球部分中去除上述异常活化细胞的细胞分选仪；
d)用于对由上述c)的细胞分选仪去除了上述异常活化细胞的正常白血球部分，照射规定波长的光的光照射器；
f)血液循环回输由除上述离心分离器分离的上述白血球部分以外的血液成分所组成的血液循环回输液和用上述光照射器照射过光的血液循环回输用的正常白血球部分的血液循环回输用管线。
进一步的，还可以连接g)人工透析装置(参照图6)。
对本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，进行更详细的说明。本发明的装置，是去除血液中的肿瘤细胞、慢性炎症性细胞或免疫异常细胞等异常活化细胞的装置，特别是通过使PpIX蓄积，能够识别异常活化细胞和正常细胞，并进行有效去除的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置。异常活化细胞中，关于肿瘤细胞，除了可在造血器官肿瘤中见到的白血病细胞以外，还可列举为从癌瘤(上皮瘤)、肉瘤等脱落到血液中的肿瘤细胞等。通过去除脱落到血液中的肿瘤细胞，能够抑制癌瘤、肉瘤等的恶性肿瘤的转移。在本发明中，异常活化细胞特别优选为白血病细胞等异常活化白血球。本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，特别是能够识别异常活化白血球或白血病前驱细胞，并进行有效去除的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置。
通过光敏感性物质的卟啉关联化合物的生理前驱体5-ALA的给药，在异常活化细胞中，由于经卟啉代谢途径，PpIX特异性地高浓度蓄积，同时受到波长为350-490nm或600-700nm的激发光照射而使其产生强荧光，从而能够识别出异常活化细胞。
光敏感性物质的卟啉关联化合物的生理前驱体5-ALA，并不特别限定于此，只要是光敏感性物质且产生强荧光的生理前驱体就可以。
5-ALA，通过预先向患者给药，能够事先产生向异常活化细胞的PpIX的蓄积。由于在异常活化细胞中蓄积PpIX需要一些时间，因此最好在使用去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置的2-48小时前，优选2-12小时前进行5-ALA的给药。
实施例
以下，为了深入理解本发明，使用实施例对本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置进行说明。虽然对为完成本发明而进行的实验结果也进行了具体的说明，但是本发明并不限定于此，可以在不脱离本发明的技术思想的范围内进行各种应用。
(实施例1)去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置
如图5所示，去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，由以下构成：一端具备有采血用的穿刺针(图中未示出)的采血用管线10；从由该采血用管线10供给的血液样本中分离白血球部分的离心分离器20；从由该离心分离器20分离的白血球部分中去除白血病细胞等异常活化细胞的细胞分选仪30；对由该细胞分选仪30去除了白血病细胞等异常活化细胞的正常白血球部分，照射规定波长的光的光照射器40；血液回输由除离心分离器20分离的除白血球部分以外的血浆成分、红血球部分及血小板部分等血液成分所组成的血液循环回输液和用光照射器40照射过光的血液循环回输用的白血球液和除白血球部分以外的血浆成分、红血球部分以及血小板部分等血液成分的血液循环回输用管线50。
在这里，“异常活化细胞”能够通过在照射波长488nm的激发光时发出的PpIX特异荧光而被检测出，检测出的PpIX(+)白血球能够用细胞分选仪去除。
采血用管线10，可以利用在一般的成分献血中使用的采血用管线。在该采血用管线10的一端，安装有采血用的穿刺针，另一端能够与离心分离器20连接。
离心分离器20也可以使用在成分献血中使用的连续离心分离器。对由采血用管线10供给的血液样本，通过离心分离器20的离心分离操作能够分离白血球部分，并将血浆成分、红血球部分以及血小板部分作为血液循环回输液，送出到血液循环回输用管线50的第一血液循环回输用管线51中。
由离心分离器20从血液中分离出的白血球部分，经第一连接管线61供给到细胞分选仪30。
细胞分选仪30，通常作为细胞分析/分离装置使用，是实施细胞分选的装置：使微细粒子的各个细胞分散在流体中，使该流体细细地流出，对各个粒子细胞以特定波长的激光进行激发，对产生的特异荧光进行光学分析并实施流式细胞术，在液滴形成后，使含有具有特定光学特性的细胞的液滴带电，通过具有电荷的偏转板使带电液滴中含有的细胞分离。
本实施方式的细胞分选仪30，在从离心分离器20供给的白血球部分中，检测出由于大量的PpIX蓄积而发出强荧光的白血病细胞等异常活化细胞，同时通过分选该白血病细胞等异常活化细胞，将白血病细胞等异常活化细胞去除。
在细胞分选仪30中，由于向由离心分离器20分离出的白血球部分中混合鞘液等的缓冲液，稀释到能够单个识别白血球的程度，因此在去除细胞分选仪30中的白血病细胞等异常活化细胞后，可去除鞘液中含有的多余成分或进行适宜的浓缩。即，虽图中未示出，但是在细胞分选仪30上，连接有利用离心分离器等的浓缩器、生理食盐水等的浓度调整器等，以对成分及浓度等进行适宜调整，生成去除了白血病细胞等异常活化细胞的血液循环回输用的正常白血球液。血液循环回输用的正常白血球部分，经第二连接管线62，供给到光照射器40。
在通过细胞分选仪30进行的分离中，通过设定PpIX发出的荧光强度的临界值，在原理上能够去除几乎100％的白血病细胞等的异常活化细胞。
通过细胞分选仪30去除的异常活化细胞，可以直接废弃，也可以在检查中利用。特别是由被去除的白血病细胞等异常活化细胞的数量，还能够在白血病的早期检查或病情监控中利用。在图5中，63是由细胞分选仪30去除的白血病细胞等异常活化细胞被排出的排出管线。
在经第二连接管线供给的血液循环回输用的正常白血球部分中，由光照射器40照射规定波长的光，通过该光使残存在血液循环回输用的正常白血球部分中的白血病细胞发生细胞死亡。
即，光照射器40，在本实施例中，由供给血液循环回输用的正常白血球部分的供给管41和向该供给管41照射光的光源42构成，供给管41由透明或半透明的配管构成，从而能够向该配管内被供给的正常白血球部分照射光。光源42是封入钠和锂的金属卤化物灯(Na-Li灯)。另外，光源42可以是能够照射350-490nm或600-700nm的波长的LED灯或者含有激光的其他光源。另外，为了能够顺利地供给血液循环回输用的正常白血球部分，例如可以在第二连接管线62的中部设置供给用的泵，也可以在光照射器40内设置供给用的泵。而且，还可以在供给管41上设置冷却装置，冷却由于光照射而产生的热。
在本实施方式中，对供给管41的长度及血液循环回输用的正常白血球部分的供给速度进行调整，以使照射时间在10分钟以上。在图5的实施方式中，虽然将光源42设置为一个，但是也可以使用多个光源。
在光照射器40中，通过用Na-Li灯对血液循环回输用的正常白血球部分照射350-490nm或600-700nm的波长的光，特别是通过照射波长为630nm的光，对于例如尽管蓄积了PpIX却没有被细胞分选仪30去除的白血病细胞等异常活化细胞，由光照射产生PpIX的激发，伴随该激发使氧气变成单重态氧，通过该单重态氧的强细胞破坏作用来诱导细胞死亡。另外，在该装置中，如图6所示，还可以连接透析装置。
(参考例1)使用株化细胞的PpIX的蓄积的确认
在本参考例中，对于在TLOm1(ATLL白血病细胞株)的培养液中添加1mM的5-ALA后的细胞内PpIX的蓄积，确认其时间经过。已确认，其结果是，添加5-ALA后，在经过48小时后细胞内还充分存在着PpIX(图1)。而且，针对健康正常人的外周血单个核细胞(PBMC)、用CD3/CD28免疫珠(CD3/CD28，immuno-bead，Dynabeads(R)human T-cell activator CD3/CD28(Invitrogen))刺激细胞，并活化后的外周血单个核细胞(PBMC)、TLOm1及ED-40515(ATLL白血病细胞株)，通过流式细胞仪对其给药1mM的5-ALA后的第48小时的细胞的PpIX蓄积进行了分析。其结果是，确认了在活化T细胞及肿瘤细胞中PpIX特异性的蓄积(图2、图3)。
(实施例2)单核细胞的流式细胞仪图谱的确认
在本实施例中，对从健康正常人、HTLV-I携带者或ATLL患者的外周血中分离出的外周血单个核细胞(PBMC)进行了流式细胞仪图谱的确认。向含有各外周血单个核细胞(PBMC)的培养液中添加1mM的5-ALA并培养48小时，针对这些细胞，确认PpIX的蓄积及TSLCI的表达，并通过流式细胞仪进行了细胞分布模式的分析。其结果是，对于来自(1)健康正常人、(2)低危险度HTLV-I携带者、(3)中危险度HTLV-I携带者、(4)高危险度HTLV-I携带者、(5)冒烟型ATLL患者、(6)慢性型ATLL患者及(7)急性型ATLL患者的外周血单个核细胞(PBMC)，确认了各自独特的细胞分布模式(图4)。虽然HTLV-I携带者在一生中ATLL发病的危险性为5％左右，但是对于HTLV-I携带者来说，知道ATLL发病的危险性对于HTLV-I携带者的生活品质(QOL)是非常重要的。根据本发明的方法，通过识别(3)及(4)的风险模式，即中危险度及高危险度HTLV-I携带者的模式，能够在即将发病之前或在发病初期选择合适的治疗方法。
将恶性肿瘤的发病/发展的危险度或进度的指标定为RF(RF：Risk Factor)，RF值按照以下方式导出。例如，对于图4所示的流式细胞仪图谱，认为：
(A)LL：Lower Left(PpIX(-)，TSLC1(-))左下区域的细胞数
(B)LR：Lower Right(PpIX(-)，TSLC1(+))右下区域的细胞数
(C)UR：Upper Right(PpIX(+)，TSLC1(+))右上区域的细胞数
RF＝0.01×(LL/total count)+10×(LR/total count)+100×(UR/total count)
总细胞数(total count)：10,000个细胞
健康正常人：LL＝100％ RF＝0.01
中危险度HTLV-I携带者：LL＝50％，LR＝50％RF＝5.05
高危险度HTLV-I携带者：LL＝50％，LR＝45％，UR＝5％RF＝9.55
急性型ATLL患者：UR＝100％RF＝100
在本实施例的情况下，健康正常人：RF＝0.014；低危险度HTLV-I携带者：RF＝0.99；中危险度HTLV-I携带者：RF＝3.49；高危险度HTLV-I携带者：RF＝6.17；冒烟型ATLL：RF＝4.68；慢性型ATLL：RF＝72.11；急性型ATLL：RF＝29.49。
(实施例3)
在本实施例中，向TLOm1(ATLL白血病细胞株)或慢性型ATLL患者的外周血单个核细胞(PBMC)的培养液中添加1mM的5-ALA培养48小时，并照射10分钟的Na-Li灯(29mW/cm2)。之后，进行PI(Propidium iodide)染色及Annexin-V-FITC染色的双重染色，通过流式细胞仪调查细胞死亡模式。作为对照，对未加入5-ALA的细胞也进行了同样的分析。判明其结果是，TLOm1在1mM5-ALA的存在下培养48小时后照射Na-Li灯的光，通过由此实施的光动力学治疗方法，几乎100％的细胞发生了AnnexinV(+)/PI(-)(凋亡)或AnnexinV(+)/PI(+)(坏死)的细胞死亡。另一方面，在0Mm 5-ALA存在下培养的对照群的TLOm1则以AnnexinV(-)/PI(-)全部生存下来。对于慢性型ATLL患者的外周血单个核细胞(PBMC)，被分离为发生AnnexinV(+)/PI(-)(凋亡)或AnnexinV(+)/PI(+)(坏死)的部分的细胞死亡的细胞群，和以AnnexinV(-)/PI(-)生存的细胞群(图7)。为了确认发生该细胞死亡的部分和生存的部分是由哪种细胞构成的而进行了实施例4。
(实施例4)
本实施例，使用实施例1的装置，向慢性型ATLL患者的外周血单个核细胞(PBMC)中给药1mM的5-ALA培养48小时，并照射10分钟的Na-Li灯(29mW/cm2)。之后，进行Annexin-V-FITC、PI、TSLC1-Alexa647的三重染色，通过流式细胞仪对细胞死亡部分进行详细的分析。确认其结果是：TSLC1(+)/AnnexinV(+)的ATLL白血病细胞发生细胞死亡的部分(右上方)的细胞，达到全ATLL白血病细胞(TSLC1(+))部分的98.7％，在正常单核细胞生存部分(TSLC1(-)/AnnexinV(-))(左下方)中，全正常单核细胞(TSLC1-)的77.5％生存了下来(图8)。该结果表明白血病细胞被特异性地诱导细胞死亡。
向慢性型ATLL患者的外周血单个核细胞(PBMC)中添加1mM的5-ALA并处理48小时后照射Na-Li灯的光，由此实施光动力学治疗方法(PDT)后，对ATLL白血病细胞部分及正常外周血单个核细胞(PBMC)的存在进行分析(图8)。如图8的A所示，诱导了98.7％(66.31％/(0.88％+66.31％)＝98.7％)的ATLL白血病细胞(ATLL白血病标志物TSLCI(+)；UL2，UR2)的细胞死亡(PI(+))。细胞死亡的明细，如图8的B所示，为坏死78.5％(Annexin V(+)，PI(+)；UR3)，凋亡21.5％(Annexin V(+)，PI(-)；UL3)。与此相对，正常外周血单个核细胞(PBMC)，如图8的A中所示，77.5％(LL2)生存下来，表明白血病细胞被高特异性的诱导细胞死亡。即，表明图4的光照射器40的方法，是一种能够以低侵袭性、高效率诱导白血病细胞死亡的方法。
因此，未在细胞分选仪30中被去除的白血病细胞等异常活性细胞，通过光照射器40使其细胞死亡，不会在血液循环回输用的正常白血球部分中残存白血病细胞等异常活化细胞，能够仅将健康正常的白血球返回给患者。
另外，发生了细胞死亡的白血病细胞等异常活化细胞，即使与血液循环回输用的正常白血球部分一起返回给患者，也能够利用患者的肝脏/脾脏的吞噬功能去除，根据需要，可通过过滤器等去除已细胞死亡的白血病细胞等异常活化细胞成分，以防止肿瘤溶解综合征的发病。
在本实施方式中，从光照射器40送出的血液循环回输用的正常白血球部分，被送到与光照射器40一端连接的血液循环回输用管线50的第二血液循环回输用管线52，通过以图中未示出的Y字连接器连接第一血液循环回输用管线51和第二血液循环回输用管线52，混合由除离心分离器20分离的白血球部分以外的正常血液成分所组成的血液循环回输液和用光照射器40照射过光的血液循环回输用的正常白血球部分。
Y字连接器的出口侧，与一端具备有送血用的穿刺针(图中未示出)的第三血液循环回输用管线53的另一端连接，将由除白血球部分以外的血液成分所组成的血液循环回输液和血液循环回输用的正常白血球部分的混合液返回给患者。
这样，本发明的特异性去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，不仅能够通过细胞分选仪30去除白血病细胞等异常活化细胞，还能够通过光照射器40的光照射消除白血病细胞等异常活化细胞残存的可能性。
本发明的特异性去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，不仅能够用于去除白血病细胞等异常活化细胞的治疗，由于能够利用在通过细胞分选仪30去除的白血病细胞等异常活化细胞的数量统计和病情分析上，也能够如上所述的利用在白血病的早期检查和病情监控中。
进一步的，认为，本发明的特异性去除异常活化白血球血液循环回输治疗装置，除了可以利用在除ATLL以外的淋巴性白血病、包括骨髓性白血病在内的骨髓增殖性疾病等以外，在对于异体脏器移植的患者免疫的移植脏器的排异反应，或者在造血干细胞移植、骨髓移植后发生的急性GVHD(移植物抗宿主病)、慢性GVHD导致的供体淋巴细胞对患者脏器的攻击中，还可以利用在去除攻击性的活化淋巴细胞克隆上。进一步的，存在能够广泛利用在各种自身免疫疾病、或过敏性疾病等的伴随活化特异性克隆的异常增殖的诸疾病中的可能性。而且，认为也能够利用在正在逐渐血行转移的血液中的上皮性癌细胞及肉瘤细胞的分离/去除中以抑制转移。
(实施例5)
在本实施例中，向慢性型ATLL患者的外周血全血中给药1mM的5-ALA，并培养48小时后，用Na-Li灯来照射光，由此来实施光动力学治疗方法的情况下，对特异性细胞死亡诱导通过流式细胞仪进行分析。针对慢性型ATLL白血病细胞部分(TSLC1(+))和正常单核细胞部分(TSLC1(-))，对其PpIX荧光强度和作为白血病标志物的TSLC1表达强度的细胞分布模式，通过流式细胞仪进行分析的结果是，通过该处理，98.83％的ATLL白血病细胞由于细胞死亡而被去除。该结果表明99.50％的外周血单个核细胞(PBMC)为正常细胞。显然，通过本实施例能够以高精度分离ATLL白血病细胞部分和正常单核细胞部分，认为通过设定PpIX的荧光强度，能够去除100％的ATLL白血病细胞(图9)。
(实施例6)
在本实施例中，对各种株化恶性肿瘤培养细胞给药1mM的5-ALA，培养48小时，对这些细胞确认其肿瘤标志物及PpIX蓄积。
各株化细胞为来自造血器官肿瘤的细胞的Ramos细胞(Burkitt淋巴瘤(恶性淋巴瘤))、K562细胞(慢性骨髓性白血病)及BALL1细胞(急性B淋巴细胞性白血病)，对于各细胞，还确认了作为肿瘤标志物的TSLC1的表达(图10)。进一步的，对Jurkat细胞(T-淋巴细胞性白血病)、FL18(滤泡性淋巴瘤(恶性淋巴瘤))也进行了同样的确认(图11)。其结果是，通过投药1mM的5-ALA，对于来自造血器官肿瘤的细胞的PpIX的蓄积及TSLC1的表达，通过流式细胞仪确认了PpIX阳性细胞及肿瘤标志物阳性细胞的分布模式(PpIX(+)/TSLCV1(+))与正常细胞(PpIX(-)/TSLCV1(-))明显不同。而且，在实体肿瘤中，对于MCF7细胞(乳癌)和HS-OS1细胞(骨肉瘤)，通过1mM的5-ALA的给药，也确认了PpIX的蓄积(图11)。进一步的，对于A549细胞(肺癌)、SCCKN细胞(舌癌)及LK79细胞(肺癌)，通过1mM的5-ALA的给药，也确认了PpIX的蓄积，确认了PpIX阳性细胞及肿瘤标志物(CK19-9)阳性上皮性癌细胞的分布模式(PpIX(+)/CK19-9(+))与正常细胞(PpIX(-)/CK19-9(-))不同(图12)。
根据上述结果，认为，对于造血器官肿瘤及实体肿瘤，通过分析其PpIX阳性细胞和肿瘤标志物阳性细胞的分布模式，确认其与正常细胞不同的细胞分布，通过对肿瘤细胞进行光照射等处理的光动力学治疗，能够去除肿瘤细胞。
符号说明
10采血用管线，20离心分离器，30细胞分选仪，40光照射器，41供给管，42光源，50血液循环回输用管线，51第一血液循环回输用管线，52第二血液循环回输用管线，53第三血液循环回输用管线，61第一连接管线，62第二连接管线，63排出管线
产业上的利用可能性
如以上详细叙述，根据本发明的检查方法，能够有效地检测出恶性肿瘤细胞。对于恶性肿瘤，通过确认其流式细胞仪图谱，能够把握肿瘤的发病/发展的危险度。例如，在恶性肿瘤为ATLL的情况下，对于HTLV-I携带者，能够预测其ATLL发病/发展的危险度。ATLL分类为(A)冒烟型、(B)慢性型、(C)急性型及(D)淋巴瘤型，通过确认流式细胞仪图谱，能够鉴定出高风险HTLV-I携带者或详细监控预计病情会发展的低恶性度ATLL患者的病情，从而能够在发病/发展前，实施更加适当的抢先治疗方法。
根据本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，例如，能够像成分输血那样从采集自患者的血液中仅去除白血病细胞等异常活化细胞，并将正常血球成分、血小板、血浆再次返回给患者，从而能够对白血病治疗做出贡献。根据本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，在离心分离器及细胞分选仪的分离中，通过设定PpIX产生的荧光强度的临界值，能够在原理上基本去除白血病细胞。假设即使在正常细胞部分中混杂有混入的白血病细胞，由于进一步的光照射也能够通过细胞死亡诱导去除98.7％的白血病细胞，通过连续进行两者能够高效率地去除大部分的白血病细胞。
而且，认为，本发明的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，除了可以利用在除ATLL以外的淋巴性白血病、包括骨髓性白血病在内的骨髓增殖性疾病等以外，在对于异体脏器移植的患者免疫的移植脏器的排异反应，或者在造血干细胞移植、骨髓移植后发生的急性GVHD(移植物抗宿主病)、慢性GVHD导致的供体淋巴细胞对患者脏器的攻击中，还可以利用在去除攻击性的淋巴细胞克隆上。进一步的，存在能够广泛利用在各种自身免疫疾病，或过敏性疾病等的伴随特异性克隆的异常增殖的淋巴增殖性疾病等诸疾病中的可能性。而且，认为也能够利用在正在逐渐血行转移的血液中的上皮性癌细胞及肉瘤细胞的分离/去除中以抑制转移。

Claims (8)

1.一种从样本中去除异常活化细胞的方法，其特征在于，包含以下的工序：
1)对采集的血液样本，通过离心分离操作，分离红血球部分和白血球部分的工序；
2)对所述分离的白血球部分，通过流式细胞仪分析作为异常活化细胞的恶性肿瘤细胞和肿瘤标志物阳性细胞的分布模式，根据分析结果使用细胞分选仪除去分类于异常活化细胞的细胞，对除去了异常活化细胞的细胞以波长为350-490nm或600-700nm的光进行照射，检测出原卟啉IX阳性细胞，通过对所述原卟啉IX阳性细胞的所述光照射诱发细胞死亡，从而从血液样本中进一步去除异常活化细胞的工序；
3)在所述2)的从白血球部分中进一步去除了异常活化细胞的剩余白血球部分中整合所述1)中分离的红血球部分的工序。
2.根据权利要求1所述的去除异常活化细胞的方法，其特征在于，所述2)的光照射，是针对含有5-氨基酮戊酸的白血球部分进行的。
3.根据权利要求1所述的去除异常活化细胞的方法，其特征在于，所述恶性肿瘤为造血器官肿瘤，所述异常活化细胞为异常活化白血球。
4.根据权利要求3所述的去除异常活化细胞的方法，其特征在于，所述造血器官肿瘤为成人T细胞白血病/淋巴瘤。
5.根据权利要求1所述的去除异常活化细胞的方法，其特征在于，所述恶性肿瘤为造血器官肿瘤、癌瘤或肉瘤，在为造血器官肿瘤的情况下，所述肿瘤标志物是由TSLC1、CD3、CD13、CD19、CD20、CD10、CD7、CD56及HLA-D组成的免疫学标志物中的任意一种，在为癌瘤或肉瘤的情况下，所述肿瘤标志物是选自细胞角蛋白19-9、CEA、NSE、PSA、TPA、AFP、SCC、PTH、TSH中的任意一种。
6.一种去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，包含以下的a)～e)，并包含用于实施根据权利要求1-5中任一项所述的去除异常活化细胞的方法的机构：
a)一端具备有采血用的穿刺针的采血用管线；
b)从由所述采血用管线供给的血液中分离红血球部分和白血球部分的离心分离器；
c)从由所述离心分离器分离的所述白血球部分中去除通过原卟啉IX特异荧光检测出的异常活化细胞的细胞分选仪；
d)用于对通过所述c)的细胞分选仪去除了所述异常活化细胞的白血球部分，以波长为350-490nm和/或600-700nm的光进行照射，通过诱发在细胞分选仪中未去除的异常活化细胞的细胞死亡，从而从所述白血球部分中进一步去除异常活化细胞的光照射器；
e)血液循环回输由除所述离心分离器分离的所述白血球部分以外的血液成分所组成的血液循环回输液和通过所述光照射器照射过光的血液循环回输用的正常白血球部分的血液循环回输用管线。
7.根据权利要求6所述的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，其特征在于，在所述去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置中，所述e)的血液循环回输用管线，进一步与f)人工透析装置连接。
8.根据权利要求6或7所述的去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置，其特征在于，在所述去除异常活化细胞血液循环回输治疗装置中，含有用于从在上述c)中的白血球部分中检测出异常活化细胞的流式细胞仪。
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